Strukturális genomikaStrukturális genomikaGyakorlati feladatok

SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk

SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk

SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk

SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk

SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk

SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk

SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk

Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA

(wt)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA

(m)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC

TGA

Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA

(wt)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC

TGA

(m)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC

TGA

Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA

(wt)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC

TGA

(m)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC

TGA

Tervezzünk primerpárt!

Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA

(wt)◦

5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’

◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’

(m)◦

5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’

◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’

Hány primerre lesz szükségünk?

Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA

(wt)◦

5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’

◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’

(m)◦

5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’

◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’

Hány primerre lesz szükségünk?

3

Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA

(wt)

◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’

◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’

(m)

◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ………… TAT GTA CGT AGC TGA3’

◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .………… ATA CAT GCA TCG ACT5’

Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA

(wt)

◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’

◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’

(m)

◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ………… TAT GTA CGT AGC TGA3’

◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .………… ATA CAT GCA TCG ACT5’

Primer tervezés programmalPrimer tervezés programmal

FAST PCR

Ellenőrzés: MultAlin◦ www.multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html

Reverz primer ellenőrzéséhez◦ www.bioinformatics.org/SMS/rev_comp.html

Emésztés RE-velEmésztés RE-vel

(wt) CGT AAT GAA TTC AGT TGC

EcoRI akcióban

SNP van az RE helyenSNP van az RE helyen

(m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC

EcoRI akcióban

Emésztés RE-velEmésztés RE-vel

(m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC

EcoRI akcióban

GélelektroforézisGélelektroforézis

GélelektroforézisGélelektroforézis

m wt

ESE ESE

Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben

Exon 1Exon 2

Exon 3

ESE ESE

Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben

Mi történik az RNS érés során? És mi történne, ha nem lenne mutáció?

Exon 1Exon 2

Exon 3

ESE ESE

Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben

Exon 1 Exon 2 Exon 3

Exon 1 Exon 2 Exon 3

Kromoszóma séta PCR-ralKromoszóma séta PCR-ral

5 tagú DNS könyvtár (mi a DNS könyvtár?)

Állítsuk sorba a tagjait (mi a módszer alapja?)

◦AGT TGA ………GCT CGT GAA◦GTA CGT AGT ….CGT TGC CGT◦GTG AAT…..CGT AGT ◦TAG TAG CTT…..CTG TAC GTA◦CGT ATG ….TGA AGT

1 2 3 4 5 6

2.: ligálás plazmid vektorba1.: emésztés restrikciós endonukleázzal

1

2 53 4 6

1

2 5

3

4

6

Genomkönyvtár készítésGenomkönyvtár készítés

Genomkönyvtár készítésGenomkönyvtár készítés

3.: transzformáció Escherichia coli-ba

3

1

2

4

5

6

3

1

2

4

5

6

2.: ligálás plazmid vektorba

Sanger-módszerSanger-módszer

Milyen sorrend olvasható le a gélfotóról?Melyik DNS band melyik szekvenciával

azonosítható?

n A C G T10987654321

GGCCAGGCCATCGTTGA

GGCGGCCGGCCATC

GGCCATCGGGCCATCGTTG

GGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTT

Sanger-módszerSanger-módszer

Milyen sorrend olvasható le a gélfotóról?Melyik DNS band melyik szekvenciával

azonosítható?

n A C G T10987654321

GGCCAGGCCATCGTTGA

GGCGGCCGGCCATC

GGCCATCGGGCCATCGTTG

GGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTT

A3’GTTGCTACC5’

Sanger-módszerSanger-módszer

A leolvasott szekvencia alapján mi a templát DNS bázissorrendje?

n A C G TA3’GTTGCTACC5’

10987654321

A leolvasott szekvencia alapján mi a templát DNS bázissorrendje?

GGTAGCAACT

Sanger-módszerSanger-módszer

n A C G TA3’GTTGCTACC5’

10987654321

PiroszekvenálásPiroszekvenálás

A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok?

Mi a templát DNS bázissorrendje?

PiroszekvenálásPiroszekvenálás

A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? G C T A

Mi a templát DNS bázissorrendje?

PiroszekvenálásPiroszekvenálás

A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? G C T A

Mi a templát DNS bázissorrendje?CGTCCGGA

KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással

KRAS onkogén 12p12

RAS család tagja, GTPáz

21kD-s fehérjét kódol (p21ras, vagy K-Ras)

K-Ras funkció: molekuláris kapcsoló

◦intracelluláris jelutak szabályozása◦pl: EGFR közvetítette jelátvitel során „downstream” jelátviteli

affektor.

KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással

A KRAS gén

BIOMARKERJelzi, hogy hogyan fognak reagálni a

betegek a kezelésreSzabályozza egyes fehérjék működését

befolyásolja a sejt túlélését, a daganat érképzését, az áttétképződési folyamatot.

KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással

KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással

• Mutáció a KRAS génben -> folyamatosan aktív K-Ras protein -> szabályozatlan sejtosztódás -> számos rák alapja • Leggyakoribb mutációk:12., 13., 61. kodon

KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással

KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással

KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással