Lupusni antikoagulanti

Martina Fink

Specializirani hematološki laboratorij, Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana

Google.images

Antifosfolipidni sindrom - APS

Klinični kriteriji * Lupusni antikoagulanti v plazmi : podaljšan PTČ, dRVVT, SCT... * Anti-kardiolipinska protitelesa (IgG in / ali IgM v serumu ali plazmi v srednje ali visokem titru) ali Anti-beta2-glikoprotein-I protitelesa (IgG in / ali IgM v serumu ali

plazmi). * Pozitiven rezultat ob dveh ali več preiskovanjih, ki so vsaj 12 tednov narazen in ne v času akutne bolezni (Pogosto se prehodno pojavijo tudi pri zdravih) !

* Sistemska pridobljena avtoimuna bolezen, ki jo spremljajo venske in / ali arterijske tromboze ter komplikacije v nosečnosti. * Za potrditev diagnoze morata biti prisotna vsaj en klinični in en laboratorijski kriterij.

* Prisotnost trombotičnega dogodka: venski ali arterijski. * Ponavljajoče prekinitve nosečnosti, prezgodnja smrt fetusa, prezgodnje rojstvo.

Laboratorijski kriteriji

* Lupusni antikoagulanti so heterogena skupina antifosfolipidnih avtoprotiteles, ki so usmerjena proti negativno nabitim proteinsko fosfolipidnim kompleksom (beta-2-glikoprotein-1,kardiolipin, koagulacijski faktorji...). * LA se najpogosteje pojavljajo pri antifosfolipidnem sindromu (APS) in sistemskem lupusu eritematozusu (SLE). * Ime lupusni antikoagulanti izhaja iz metuljastega izpuščaja na obrazu bolnikov, ki spominja na obarvanost volkove dlake.

Lupusni antikoagulanti - LA

Google.images

* Ime lupusni antikoagulanti je zavajujoče saj lupusni antikoagulanti v pogojih in vivo povzročajo tromboze in ne krvavitev.

* V pogojih in vitro, v laboratoriju, pa opazimo podaljšanje časov koagulacije, ki so odvisni od fosfolipidov, ker ti motijo aktivacijo faktorjev IX, X in protrombina.

* LA delujejo nespecifično.

* LA običajno odkrijemo z uporabo koagulacijskih testov, ki so odvisni od

fosfolipidov (parcialni tromboplastinski čas - PTČ, protrombinski čas (PČ), silica clotting time (SCT), kaolinski čas (KČ) in test z razredčenim Russell‘s Viper strupom (dRVVT).

* Podaljšani koagulacijski čas, ki ga ne moremo normalizrati z dodatkom

normalne plazme bolnikovi, običajno opozarja na prisotnost LA.

Lupusni antikoagulanti

Google.images

* Anti kardiolipinska protitelesa in anti β2 glikoproteinska I protitelesa večinoma določamo s testi ELISA.

* Zaradi velike heterogenosti lupusnih antikoaguantov referenčna

metoda (zlati standard) za določitev lupusnih antikoagulantov ne obstaja.

* ISTH je pripravil priporočila za ugotavljanje lupusnih

antikoagulantov (Sapporo criteria 1999, Sydney 2009 – veljavna).

* Laboratoriji so na osnovi ISTH priporočil pripravili algoritme za

določitev prisotnosti lupusnih antikoagulantov.

Laboratorijske preiskave lupusnih antikoagulantov

ARUP laboratory QUEST laboratory

Vpogled v spletne strani laboratorijev 16. 10. 2013

Algoritmi za določitev prisotnosti lupusnih antikoagulantov.

Priporočajo postopke v predanalitski, analitski in postanalitski fazi Predanalitika : čas in vrsta odvzema, ravnanje z vzorci. Analitika : izbira preiskav, izbira dodatnih preiskav. Postanalitika : podajanje rezultatov, interpretacija rezultatov.

Priporočila ISTH

Priporočila 1 1. Odvzem krvi pred začetkom antikoagulantne

terapije ali pa ustrezen čas po njenem prenehanju.

2. Venska kri naj se odvzame v citratne – svetlo modre epruvete.

3. Plazma naj se dvakrat centrifugira (št. trombocitov < 10 x 109 / l).

4. Če se vzorci ne analizirajo takoj, naj se hitro zamrznejo in pred uporabo hitro odtajajo.

5. Uporabi naj se vsaj dva testa, ki imata različen princip delovanja.

6. Eden od testov naj bo dRVVT, drugi pa od fosfolipidov odvisen PTČ ali njemu sorodni test.

Priporočila 2 1. Rezultat določitve prisotnosti LA je

pozitiven, če je vsaj eden od testov pozitiven.

2. Za mešalne teste naj se uporabi v laboratoriju pripravljen ‘ pool ‘ normalne plazme - PNP .

3. Mešalni testi naj se izvedejo v razmerju 1 : 1 (bolnikova / PNP). Mešanice pa naj se analizirajo takoj in po 1 – 2 h.

4. Potrditveni testi naj se izvedejo z višjimi koncentracijami fosfolipidov, kot so v presejalnih testih.

5. Rezultati naj se podajajo kot razmerje preiskovanec / PNP.

Integrirani test

* Priporočila ISTH dovoljujejo tudi uporabo integriranega testa, ko se sočasno izvede presejalno in potrditveno testiranje, pri tem pa se lahko izognemo mešalnemu testu.

* Rezultate se podaja kot razmerje med presejalnim in potrditvenim testom ali kot % korekcije.

Google.images

Priporočila 3 – določitev mejnih vrednosti

1. Mejne vrednosti presejalnih testov naj bodo določene na zdravi populaciji.

2. Mejno vrednost naj predstavlja 99 percentil vrednosti zdrave populacije.

3. Rezultati lupusnih antikoagulantov so pozitivni, ko so časi nastanka strdka daljši od mejne vrednost.

4. Tudi mejne vrednosti potrditvenih testov naj se določijo na zdravi populaciji. Izvedejo nas se s višjimi koncentracijami fosfolipidov, kot so le te v presejalnih testih.

5. Rezultati naj se podajajo kot normalizirano razmerje (preiskovanec / normalna ‘ poolirana ‘ plazma.

dRVVT test – test razredčenega strupa kače Russell viper 1

* Osnova testa je uporaba razredčenega strupa kače Russell’s Viper, ki neposredno aktivira faktorja V in X, in tako zaobide faktor VII v ekstrinznični poti in antihemofilični faktor v intrinznični poti. * V normalni plazmi (odsotnost LA) se faktorja V in X aktivirata, kar vodi do nastanka strdka. * Pri bolnikih z LA pa antifosfolipidna avtoprotitelesa vežejo epitope fosfolipidov v reagentu in tako preprečijo nastanek strdka – čas nastanka strdka je podaljšan.

* Na dRVVT test ne vpliva pomanjkanje faktorjev VII, VIII, IX, XI in XII ali prisotnost njihovih inhibitorjev.

Google.images

* Test sestavljata dve reakcijski mešanici – presejalna (screen) in potrditvena (confirm), ki se medsebojno razlikujeta v koncentraciji fosfolipidov. * V presejalni mešanici je koncentracija fosfolipidov nižja, zato v vzorcu prisotna antifosfolipidna protitelesa motijo nastanek strdka. * V reagentu potrditvenega ( confirm) testa pa je koncentracija fosfolipidov višja, kar delno nevtralizira delovanje antifosfolipidnih protiteles, zato je čas nastanka strdka pri potrditvenem testu krajši. * Na ta način se potrdi prisotnost antifosfolipidnih protiteles. * Rezultati se podajajo kot normalizirano razmerje presejalnega in potrditvenega testa LA = dRVVT screen / dRVVT confirm.

dRVVT test – test razredčenega strupa kače Russell viper 2

Silica clotting time - SCT

Google.images

* Silica clotting time je v osnovi parcialni trombolpastinski čas, kjer silika (silicijev dioksid – SiO2) nadomesti kaolin. * Koloidni raztopini SiO2 dodamo calcij in s trombociti osiromačeno plazmo. Reagent v osnovi vsebuje tudi nizko koncentracijo fosfolipidov in je zato zelo občutljiv na prisotnost lupusnih antikoagulantov – presejalni test. * V reagentu potrditvenega (confirm) testa pa je koncentracija fosfolipidov višja, kar delno nevtralizira delovanje antifosfolipidnih protiteles, zato je čas nastanka strdka pri potdritvenem testu krajši. * Na ta način se potrdi prisotnost antifosfolipidnih protiteles. * Rezultati se podajajo kot normalizirano razmerje presejalnega in potrditvenega testa LA = SCT screen / SCT confirm.

Pristop za določitev LA v SHL * Integriran pristop – istočasna uporaba presejalnega in potrditvenega testa * Uporabljena testa silica clotting time (SCT) in dRVVT. * Primerjava vseh rezultatov na normalno ‘ poolirano ‘ plazmo - PNP. * Podajanje rezultatov kot normalizirano razmerje R presejalni / R potrditveni

Bolnikova plazma preverjena z osnovnimi testi hemostaze – PČ, TČ, PTČ, D-dimer, fibrinogen, da se izključi pomanjkanje faktorjev koagulacije in fibrinogena, ter obstoj tromboze (naše priporočilo), ker to omogoča lažjo in bolj pravilno interpretacijo rezultatov. Trenutne omejitve – priprava normalne ‘ poolirane ‘ plazme - PNP.

R presejalni = Čas nastanka strdka bolnik

Čas nastanka strdka PNP

Pristop za določitev LA v SHL

Osnovni testi hemostaze

SCT dRVVT

TČ

PČ

PTČ

Fibrinogen

D-dimer

presejalni in potrditveni test

presejalni in potrditveni test ?

Primer rezultatov in izgled izvida

NR (po E(R)) = R presejalnega/ R potrdilnega NR večje od 2,0 močno prisotni LA od 1,5 do 2,0 zmerno prisotni LA od 1,2 do 1,5 šibko prisoti LA manj od 1,2 LA niso prisotni

Preiskava Rezultat Ref. vred. Enota

P - Lupusni antikoagulanti

Mejni rezultat Negativen Pozitiven

P - Lupusni antikoagulanti – SCT 0,76 - 1,26 po E (R)

Negativen Po E

P - Lupusni antikoagulanti – dRVVT 0,8 - 1,2 po E (R)

Vir : Naš laboratorij, literatura in podatki reagenčnih kompletov.

‘ Take home message ‘ * Za potrditev diagnoze antifosfolipidnega sindroma morata obstajati vsaj en klinični in en laboratorijski kriterij. * Vzorce se odvzame v neaktivni fazi bolezni, v citratno epruveto v času, ko bolnik ne uživa antikoagulantne terapije. * Pozitivne rezultate prisotnosti lupusnih antikoagulantov je potrebno potrditi po najmanj 12 tednih. * V laboratoriju je potrebno uporabiti vsaj dva različna testa za potrditev prisotnosti lupusnih antikoagulantov. * Preiskava se izvaja v s trombociti osiromašeni plazmi.