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Small interfering RNA ( siRNA ). Cristina Teixidó Febrero. Historia. En los 90. Las primeras observaciones de silenciamiento de genes se hicieron al querer mejorar cultivos de interés económico - PowerPoint PPT Presentation
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Small interfering RNA ( siRNA )
Cristina Teixidó Febrero
Historia
En los 90. Las primeras observaciones de silenciamiento de genes se hicieron al querer mejorar cultivos de interés económico
1990 R. Jorgensen “Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans.” Plant Cell
1997 David Baulcombe Intentar frenar la infección vírica en la planta del tabaco. Introducir genes virales en plantas transgénicas las protegía de la infección por el virus. “A Species of Small Antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants” Science
1998 Andrew Fire y Craig Mello C. elegans. Se puede silenciar la expresión de un gen a través de la introducción del dsRNA correspondiente. Andrew Fire denominó este fenómeno RNAi
2001 Thomas Tuschl. Demostró que siRNAs sintéticos eran capaces de inducir RNAi en células de mamífero “Duplexes of 21-nucleotide RNAmediate RNA interference incultured mammalian cells” Nature
Introducción La ribointerferencia es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes
específicos, ejercido por moléculas de RNA que, siendo complementarias a un RNA mensajero, conducen a la degradación de éste
ARNi es una molécula de RNA que suprime la expresión de genes específicos
El siRNA, ARN pequeño de interferencia, es también conocido como RNA de silenciamiento. Es uno de los tipos de RNA interferente y se produce mediante el procesamiento de la enzima Dicer
Es altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su RNA mensajero diana, interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo
Imagen de Dicer
Estructura
Doble cadena de 21-23 pb
Cada hebra de RNA tiene un grupo fosfato 5’ y un grupo hidroxilo (-OH) en 3’
Los siRNA no están presentes en organismos unicelulares, sino que son propios de células eucariotas. Esto sugiere que se trata de una función biológica bastante nueva, que han adoptada las células más avanzadas durante la evolución
Aplicaciones y funciones
Mecanismo de control de la expresión génica Permite estudiar la función de cada gen e identificar genes esenciales en procesos
celulares Regulación del desarrollo y el mantenimiento del genoma Funcionan como un sistema de defensa contra virus, control de transposones o
elementos génicos anómalos. Estrategia terapéutica potencial en enfermedades virales, descubrimiento de
fármacos diana y terapia del cáncer Validar dianas terapéuticas Suelen utilizarse precursores de RNAi, ya sea RNA doble cadena del gen diana a
reprimir o directamente RNA monocatenario complementario al RNAm a silenciar Con cultivos celulares, generalmente el vehículo utilizado son liposomas
.
Vía del RNAi
RNAi transitivo
En plantas, hongos y Caenorhabditis elegans La molécula de siRNA provoca, tras el corte del mRNA diana, la síntesis de nuevos siRNA a
partir de secuencias que están en dirección 5’ del punto de corte, con lo que se amplifica la señal
RNA polimerasas dirigidas por RNA, las cuales aparentemente no existen en humanos
Vía del RNAi
Dicer puede cortar dsRNA a siRNAs de: (A) secuencias propias, (B) virus o (C) miRNAs. Algunos virus generan dsRNA dentro de las células a las que infectan. Las células
infectadas detectan estos dsRNA y montan una respuesta de defensa, que termina con la degradación del RNA invasor
Diseños de los siRNA
Diseño aleatorio.- Selección de 21 bases del ARNm diana sin tener en cuenta la secuencia que tiene en el transcrito - Uso por los investigadores del mecanismo de acción de los ARNi para identificar posibles nuevos parámetros o atributos relacionados con la funcionalidad del ARNi
Diseño racional- Procedimiento informático dirigido a identificar las dianas óptimas del siRNA en un ARNm- Empleo de un complejo algoritmo que incluye amplios análisis bioinformáticos para identificar siRNAs funcionales únicos con efectos secundarios mínimos - Permite elegir un siRNA altamente funcional- Lleva a cabo comparaciones sistemáticas de secuencias- Elimina de forma efectiva los siRNA no funcionales del conjunto de candidatosEl algoritmo emplea un sistema de criterios como el contenido GC, perfiles de estabilidad interna, estructura interna, presencia de bases en posiciones clave, etc
Diseño convencional
Las tres primeras pautas: extremo 5 ’ de la cadena antisentido sea el termodinámico menos estable
Elegir el sitio diana del siRNA Longitud de 21-23 pb sense/antisense con los extremos 3’ salientes y los 5’ fosforilados. AA(N19)TT. En los 3’ va bien usar 2 dt seguidos La cadena con el 5’ termodinámicamente menos estable es la incorporada en el RISC
5’ cadena guía: Tm menos estable (rico en A/U) 5’ cadena pasajera: Tm más estable (rica en G/C)
Diseño convencional Evitar:
Diana esté en un intrón Los 5’ y 3’ de UTRs (untranslated regions) Los primeros 75 - 100 pb des del codón de inicio Secuencias con > 50% GC (30-70%) Secuencias que contengan repeticiones internas
Comparar el candidato con marcadores de secuencia expresados en bases de datos públicas (ej BLAST) para asegurar la especificidad (IMPORTANTE)
Modificaciones químicas haciéndolos más estables Modificar posición 2’ de ERI-1, una ribonucleasa que tiene una actividad 3' 5'
exonucleasa que está implicada en la regulación y en la degradación de los siRNAs
La eficiencia debe ser > 90% a 1-20 nM Recomendación: knockdown del gen con dos siRNAs independientes para controlar la
especificidad del efecto del silenciamiento
Ventajas
Puede sustituir tres métodos: knock-out, dominantes negativos e inhibidores químicos
Disminuye tiempo, coste y aumenta la especificidad
Técnica fácil y rápida
Facilita los análisis sobre tratamientos nuevos para el cáncer, enfermedades inflamatorias o infecciosas
Se pueden realizar experimentos en cualquier tipo celular de interés
Se puede realizar in vivo e in vitro
La eficacia del sistema de interferencia radica en que RISC cataliza múltiples ciclos de interferencia in vivo
Desventajas
Estabilidad Administración
Off-target effects (OTEs) Material foráneo por el SI: respuesta IFN Genes con complementariedad incompleta son downregulados sin darse cuenta
dando problemas en la interpretación de los datos
Los liposomas catiónicos muchas veces son tóxicos para la célula Baja eficiencia de la transfección
Saturación del complejo RISC por un uso de múltiples siRNAs no funcionales Para hacer el knockdown se necesitan dosis muy elevadas. OTE son dosis
dependientes
Ninguno es 100% efectivo (eficiencia 50-90%) Inactivos por tener un SNP o una mutación puntual en el sitio diana
En un futuro Avance de la investigación biomédica
Descubrir funciones biológicas nuevas para comprender mejor los mecanismos de las enfermedades humanas
Tecnologías para aumentar la especificidad, estabilidad y el rendimiento real del silenciamiento
Mínimos efectos secundarios con el mayor silenciamiento específico
Tratamientos nuevos para el cáncer, enfermedades inflamatorias o infecciosas
Desarrollo de nuevas terapias génicas
Descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos
Nueva clase de fármacos
Bibliografía Design of active small interfering RNAs. Andrew S Peek & Mark A Behlke. Current Opinion in Molecular Therapeutics 2007 9(2):110-118 A Species of Small Antisense RNA in Posttranscriptional Gene Silencing in
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Nanoparticles and siRNA-Partners on the Pathway to New Cancer Therapies Joe Alper NCI Alliance for Nanotechnology in Cancer August 2006
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Bibliografía
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http://www.encuentros.uma.es/encuentros101/rnai.htm http://es.wikipedia.org/wiki/SiRNA http://www.alnylam.com http://www.prnewswire.co.uk/cgi/news/release?id=159958 http://www.dharmacon.com/ http://www.nature.com/focus/rnai/animations (vídeo)