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Genomic Characterization of Listeria monocytogenes
Strains Involved in a Multistate Listeriosis Outbreak
Associated with Cantaloupe in US
Carolina Estrella and Jerónimo Escobar RMedical students UPB
Molecular BiologyAugust 25th 2012
Genomic Characterization of Listeria monocytogenes
Strains Involved in a Multistate Listeriosis Outbreak
Associated with Cantaloupe in US
Pongpan Laksanalamai1, Lavin A. Joseph2, Benjamin J. Silk2, Laurel S. Burall1, Cheryl L. Tarr2, Peter Gerner-
Smidt2, Atin R. Datta1*
INTRODUCTION .
Genus: listeria•Are a genus of six species of bacteria in which the most representative is L. monocytogenes. They are characterized by regular bacilli, Gram-positive and non sporulated.•The genus is defined by a DNA G+ C of 36-38% and a layer of murein and specific peptidoglycan
INTRODUCTION .
Species: Monocytogenes•Small bacilli (from 0.5 to 0.5 microns wide x 0.5 - 1.2 long). It is a facultative anaerobic species,exhibits no capsule or spore. It has functional flagella at 30 ° C. and survives wide temperature spectra (1-45 ° C). It is the kind that causes listeriosis.
INTRODUCTION .
The L. monocytogenes produces an uncommon zoonoses in humans but having serious consequences with a mortality of 20-30%. The route of infection is usually by eating improperly stored food or poorly prepared. The main infected products are milk, cheese, meat, sausages and canned products and fruits as Cantalupe melon.
INTRODUCTION .
Vulnerable population
Pregnancy Children
Cancer
Aged people H.I.V
Listeriosis can be classified in two different pathologies:
• non-invasive: which courses mild symptoms such as fever, headache and diarrhea and •Invasive: that can have severe consequences as septicemia, encephalitis, meningitis and death.
MAIN OBJETIVE .
Demonstrate the genetic characterization of Listeria monocytogenes strains found in
outbreaks associated with cantaloupe Melon.
MATERIALES Y METODOS .
Serotipificación
• se realizó por medio de la utilización de anticuerpos específicos para antígenos bacterianos de la L.monocytogenes y por medio de este procedimiento hacer su clasificacion y caracterizacion.
Electroforesis de Campos Pulsantes-PFGE
Un primer campo eléctrico se aplica al gel con ADN cortado por enzimas de restricción (AscI y ApaI), y las moléculas se alargan en dirección al campo y migran en el gel. Luego se suprime el primero y se forma un segundo campo eléctrico, entonces el ADN cambia su conformación y se reorienta para poder migrar en la dirección del segundo campo eléctrico.
El tiempo en que tarda activo cada campo se denomina pulso y su duración depende del tamaño de las moléculas que se quieran separar.
MATERIALES Y METODOS .
MATERIALES Y METODOS .
• La hibridación se utilizó para la identificación de cadenas o segmentos de DNA específicos de la L. monocytogenes por medio de sondas especificas que reconocieran segmentos únicos del genoma del microrganismo y así lograr su caracterización.
MATERIALES Y METODOS .
Hibridación 1.
PREPARACION PARA LA HIBRIDACION:Los aislados de esta epidemia crecieron en BHI agar. 10 ml de ADN fueron aislados del cultivo tras estar en incubación a 170 rpm. µl de ADN se fragmentó con ADN asa (37°C), seguido de una inactivación por calor a 95°C. El ADN fragmentado se marcó en el extremo 3’ para ser usado en la hibridación.
MATERIALES Y METODOS .
RESULTADOS Serotipación de aislados de L.
monocytogenes
La determinación final del serotipo por reacción de aglutinación positiva, combinada con los resultados de la PCR permitieron distinguir que es una epidemia de múltiples cepas y múltiples serotipos (1/2 a y 1/2 b).
Podría ser el primer reporte de listeriorsis con dos serotipos diferentes en un solo producto contaminado.
Comparación de combinaciones del patrón de epidemia por L.monocytogenes en la base de
datos nacional, CDC PulseNet• Todos los aislados pertenecientes al patrón de combinación II
fueron serotipo 1/2b y aislados con patrón de combinación I, III y IV fueron serotipo 1/2 a.
• Todos los pacientes tenían 1 de los 4 tipos de patrones de combinación.
PC I: 48 PC II: 40 PC III: 28 PC IV: 30
RESULTADOS
Comparación de combinaciones del patrón de epidemia por L.monocytogenes en la base de
datos nacional, CDC PulseNetLos aislados humanos en cada patrón de combinación va de 30 a 48 mientras que los no humanos va de 6 a 60, siendo el principal el correspondiente al PCII.
El PCII fue encontrado en el 2010 como un aislado no humano y con esta investigación aparece como un aislado humano, lo que indica que puede estar aumentando su capacidad de supervivencia en comidas y el medio ambiente.
RESULTADOS
RESULTADOS
Análisis por Microarreglo de los aislados relacionados con epidemia
por melónEntre 18.360 sonda-sets en la Listeria ® GeneChip, 7.823 conjuntos de sonda se conservaron, y quedaron 4.041 (21,7%) y 6.766 conjuntos de sonda(36,3%) como presente y ausente, respectivamente.
RESULTADOS
RESULTADOS
Aislados asociados con epidemia de melón con serotipo 1/2 a (PC I, III y IV)
La comparación del contenido genético entre cepas 1/2 a previamente caracterizadas, aislados de camarón y la perteneciente a la epidemia por melón, muestra una separación entre la cepa PC I de la III y IV, que coincide con los resultados de la PFGE.
RESULTADOS
RESULTADOS
Comparación de intensidades según el resumen del RMA
RESULTADOS
El análisis por MAS5.0 mostró que 7.643 conjuntos de sonda estaban presentes y 10.415 conjuntos de sonda estaban ausentes, que comprendía 97% de los conjuntos de sonda conservados.
Aislados asociados con epidemia por melón con serotipo 1/2 a (PC I, III y IV)
RESULTADOS
RESULTADOS
DISCUSSIONAUTHOR QUOTE YES/NO
Laksanalamai P, et al. The 1/2a strains are well separated from 1/2b strains with the latter forming a much more closely related group.
No
Fleming DW, et al. Strains LS742 and LS743, two clinical isolates from the PC I grouped closely with LS18 and LS21, isolated during the 1983 milk outbreak in Massachusetts, and branched away from all of the cantaloupe outbreaks strains from the PCs III and IV
Yes
AUTHOR QUOTE YES/NO
Chen J, Novick RP L. monocytogenes serotype 1/2a strains were most amenable to phage transduction compared to other serotypes, including 1/2b and 4b
Yes
Norton DM, Braden CR Serotype 1/2a and 1/2b isolates have also been involved in several FG listeriosis outbreaks
Yes
DISCUSSION
CONCLUSIONS• Continuous molecular analysis of L. monocytogene, is
essential for the development of new defense methods against this type of outbreaks, given its high capability of mutation and alteration in their strains, as well as its ability to survive in different foods and environment.
• The genomic characterization of the L. monocytogenes distinguishes the symptoms of this outbreak according to the DNA content. The cantaloupe outbreak DNA content, which caused Invasive listeriosis, is similar to unrelated strains that previously caused sporadic Invasive listeriosis, and seems to be different from most of the febrile gastroenteritis outbreak strain.
