Embed Size (px)
Citation preview
DV
KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN FACULTEIT GENEESKUNDE BIOMEDISCHE WETENSCHAPPEN
Selectieve inhibitie van flavivirus (dengue koorts virus en gele koorts virus)
replicatie
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen door Natacha COEN
Promotor: Prof. Dr. Johan NEYTS Faculteit Geneeskunde Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie Begeleider: Dr. Suzanne KAPTEIN Faculteit Geneeskunde Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie
Leuven, 2009
Dit proefschrift is een examendocument dat na verdediging niet werd gecorrigeerd voor eventueel vastgestelde fouten. In publicaties mag naar dit werk gerefereerd worden, mits schriftelijke toelating van de promotor(en) die met naam vermeld zijn op de titelpagina.
KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN FACULTEIT GENEESKUNDE BIOMEDISCHE WETENSCHAPPEN
Selectieve inhibitie van flavivirus (dengue koorts virus en gele koorts virus)
replicatie
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen door Natacha COEN
Promotor: Prof. Dr. Johan NEYTS Faculteit Geneeskunde Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie Begeleider: Dr. Suzanne KAPTEIN Faculteit Geneeskunde Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie
Leuven, 2009
I
Woord vooraf
Oef, na meer dan zeven maanden praktisch werk en intensief schrijven, permitteer ik me een
weltevreden zuchtje. Gedurende die tijd heb ik niet alleen mezelf volledig gegeven, maar ook een
enorme aandacht opgeëist van de mensen rondom mij. Daarom wil ik me even richten tot deze
personen, die mij hebben in alle tijden hebben bijgestaan en tevens mijn oprechte dankbaarheid
tonen.
Allereerst wil ik Prof. Dr. Johan Neyts bedanken, die mij de kans heeft gegeven mijn
eindwerkonderzoek te mogen volbrengen in zijn laboratorium. Tevens waren zijn accurate
verbeteringen en verdere adviezen meer dan welkom.
Dr. Suzanne Kaptein, die me de hele weg door heeft begeleid en me getoond heeft wat onderzoek
doen nu werkelijk is, verdient een dikke merci. Niet te vergeten, Tine De Burghhraeve, bij wie ik altijd
terecht kon. Het dengue team ‘forever’! Maar helaas, aan alle mooie dingen komt een eind…
Niet te vergeten was de toffe sfeer in het labo te danken aan de aanwezigheid van een aantal
personen met elk hun unieke karakteristieken. Bedankt Pieter, Kai, Leen, Susan, Stijn en Tom. De
‘Koen’ zal jullie rake opmerkingen niet snel vergeten!
Annemie, Lesley, Julie, Tinneke, Marijke en Vicky, onze vriendschap is voor mij van onschatbare
waarde. De nodige steun die jullie mij hebben gegeven, maar ook de momenten van ontspanning op
de welgekende plaatsen, waren onmisbaar.
Mijn ouders en familie wil ik ten zeerste bedanken dat ze mij de kans hebben gegeven om verder te
studeren en mij in alle tijden gesteund te hebben. Merci de tout coeur.
Natacha
II
Samenvatting
Het dengue virus wordt beschouwd als het belangrijkste hemorragische koorts virus in termen van
humane morbiditeit en mortaliteit. Desondanks is er nog altijd geen vaccin of antivirale therapie
beschikbaar. De ontwikkeling van veilige en effectieve antivirale middelen is absoluut noodzakelijk.
Met dit doel voor ogen werd allereerst een DENV cel-gebaseerde assay geoptimaliseerd door het
opkweken van het DENV serotype 2 voor drie passages in C6/36 cellen. In Vero cellen werd het
cytopathogeen effect geanalyseerd met een luminescentie ATP detectie systeem om een zo groot
mogelijke signaal/ruis verhouding te verkrijgen. Door gebruik te maken van deze methode werden in
vitro twee analoge moleculen, CHI104 en CHI105, geïdentificeerd en bevestigd als selectieve
inhibitoren van het DENV-2/NGC [gemiddelde 50 % effectieve concentratie (EC50) van respectievelijk
0,9 µg/ml en 0,8 µM]. Evaluatie van CHI104 in een dengue reporter virus assay onthulde een tijds- en
dosis-afhankelijke inhibitie van de replicatie van het virus. Verdere karakterisatie van de CHI104
antivirale werking op basis van een DENV replicon assay en een ‘time-of-addition’ assay toont aan dat
de inhibitorisch activiteit zich situeert tijdens de virale RNA synthese door directe of indirecte werking
op de niet-structurele genen van het DENV. Verdere studies zijn nodig om de precieze moleculaire
interactie van het molecule met het virale doelwit te identificeren.
We ontdekten tevens dat beide moleculen een nog krachtigere remming uitoefenen op het verwante
gele koorts virus (17D vaccin stam) [EC50 = 0,2 µg/ml (CHI104) en 0,3 µM (CHI105)]. Een verdere
bevestiging van de anti-flavivirus activiteit werd verkregen door aan te tonen dat beide moleculen ook
werkzaam zijn tegen het muizen flavivirus, Modoc M544 stam, en het Modoc/gele koorts chimeer
virus. Dit opent perspectieven voor de evaluatie van de werkzaamheid in kleine proefdiermodellen
voor flavivirus infecties.
III
Summary
The dengue viruses are considered the most important hemorrhagic fever viruses in terms of morbidity
and mortality. However, no vaccine or antiviral therapy is available. The development of safe and
effective antiviral drugs becomes imperative. To accomplish this objective, we cultured the DENV
serotype 2 for three passages in C6/36 cells in order to optimize a DENV cell-based assay. The
cytopathogenic effect in Vero cells was measured with a luminescence ATP read-out system to obtain
a higher signal-to-noise ratio. Using this method, two analogous molecules, CHI104 and CHI105, were
identified and confirmed in vitro as selective inhibitors of DENV-2/NGC [mean 50 % effective
concentration (EC50) of 0,9 µg/ml en 0,8 µM, respectively]. The evaluation of CHI104 in a dengue
reporter virus assay revealed a time- and doses-dependent inhibition on viral replication. Furthermore,
characterization of the antiviral mechanism of CHI104 was assessed by a DENV replicon assay and a
time-of-addition assay, demonstrating the inhibitory effect of CHI104 during the viral RNA synthesis,
probably by interacting directly or indirectly with the non-structural genes of the DENV genome.
Additional studies are required to fully determine the interplay between the molecule and the viral
target.
We discovered that both molecules exhibited a more pronounced inhibition of the related yellow fever
virus (17D vaccine strain) [YFV EC50 = 0,2 µg/ml (CHI104) en 0,3 µM (CHI105)]. An additional
confirmation of the anti-flavivirus activity was obtained by demonstrating the activity of both molecules
against the murine flavivirus, Modoc M544 strain, and the Modoc/yellow fever chimeric virus. This
provides a perspective for the evaluation of de activity in small animal models for flavivirus infections.
IV
Lijst met afkortingen
ADE ‘antibody dependent enhancement’
AL antilichamen
AMP adenosine monofosfaat
APC antigen presenterende cellen
ARDS ‘acute respiratory distress syndrome’
ATP adenosine trifosfaat
ATPlite luminescentie ATP detectie assay systeem
AZ aminozuren
BHK ‘Baby Hamster Kidney’
C6/36 cellen muggencellen (Ae. albopictus)
CC celcontrole
CC50 50% cytotoxische concentratie
CHI Chimirri
Ct-waarde “Cycle threshold” waarde
CTL cytotoxische T-lymfocyt
CPE cytopathogeen effect
DC-SIGN ‘Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin’
DENV dengue virus
DHK dengue hemorragische koorts
DK dengue koorts
DMEM ‘Dulbecco’s minimum essential medium’
DNA desoxyribonucleïnezuur
DSS dengue shock syndroom
EMCV encefalomyocarditis virus
EC50 50% effectieve concentratie
ER endoplasmatisch reticulum
FAM ‘6-carboxyfluorescein’
FCS foetaal kalfsserum
GKV gele koorts virus
GMP guanosine monofosfaat
GRP78/BiP ‘glucose-regulating protein 78’
GTP guanosine trifosfaat
HCV Hepatitis C virus
HIV Humaan immuundeficiëntie virus
Hsp ‘heat shock proteins’
ICAM ‘intercellular adhesion molecule’
IV
i.p. intra-peritoneaal
IRES ‘internal ribosomal entry site’
MEM ‘Minimum Essential Medium’
MGB ‘minor groove binder’
MODV Modoc virus
MOI ‘multiplicity of infection’
MTS 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy -
phenyl) -2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium
NAD(P)H nicotinamide adenine dinucleotide (fosfaat)
NKV ‘not-known vector’
NGC Nieuw-guinea C stam
NTP nucleotide trifosfaat
OD optische densiteit
PAC puromycine N-acetyltransferase
PBS fosfaat gebufferd fysiologisch zout
PFU ‘plaque forming unit’
p.i. post-infectie
PMS ‘phenzine methosulfate’
PPi pyrofosfaat
RBV ribavirine
RC replicon controle
RNA ribonucleïnezuur
rpm rotaties per minuut
RSV respiratoir syncytiaal virus
RT-qPCR ‘Reverse transcriptase-quantitative Polymerase Chain
Reaction’
SI selectiviteitsindex
S/R signaal/ruis
Th1 T-helpercel 1
TOA ‘Time-of-addition’
UTR onvertaalde regio
VC viruscontrole
Vero ‘African Green Monkey’
vRNA viraal RNA
ZO-Azië Zuidoost- Azië
V
Inhoudstafel
Woord vooraf ......................................................................................................................................... I
Samenvatting......................................................................................................................................... II
Summary ............................................................................................................................................... III
Lijst met afkortingen .............................................................................................................................. IV
Inhoudstafel ...........................................................................................................................................V
1 INLEIDING ......................................................................................................................... 1
2 LITERATUURSTUDIE ....................................................................................................... 2
2.1 Epidemiologie.................................. ................................................................................. 2 2.2.1 Geschiedenis............................................................................................................... 2 2.2.2 Huidige status .............................................................................................................. 3 2.2.3 Transmissie ................................................................................................................. 4 2.2.4 Dengue, een escalerend probleem ............................................................................. 5 2.2 Virus structuur en compositie ................. ....................................................................... 6 2.2.1 Het genoom ................................................................................................................. 6 2.2.2 Structurele proteïnen .................................................................................................. 7 2.2.2.1 Enveloppe (E) proteïne ....................................................................................... 7 2.2.2.2 Membraan (M) proteïne ...................................................................................... 8 2.3.2.3 Capside (C) proteïne........................................................................................... 8 2.2.3 Niet-structurele proteïnen ........................................................................................... 8 2.2.3.1 Niet-structureel proteïne 1 (NS1) ........................................................................ 8 2.2.3.2 Niet-structureel proteïne 2 (NS2) ........................................................................ 8 2.2.3.3 Niet-structureel proteïne 3 (NS3) ........................................................................ 9 2.2.3.4 Niet-structureel proteïne 4 (NS4) ........................................................................ 9 2.2.3.5 Niet-structureel proteïne 5 (NS5) ........................................................................ 9 2.3 Virale replicatie............................. .................................................................................... 9 2.3.1 Adsorptie, penetratie en ontmanteling......................................................................... 9 2.3.2 Translatie en RNA replicatie........................................................................................ 10 2.3.3 Virus assemblage, maturatie en vrijstelling ................................................................ 10 2.4 Klinische presentatie ......................... .............................................................................. 11 2.5 Pathogenese................................... .................................................................................. 12 2.6 Behandeling.................................... .................................................................................. 13 2.7 Preventie ..................................... ...................................................................................... 13 2.7.1 Vector controle ............................................................................................................ 13 2.7.2 Vaccin.......................................................................................................................... 14 2.8 Therapeutische benadering ..................... ....................................................................... 15 2.8.1 Ontwikkeling van antivirale middelen .......................................................................... 15 2.8.2 Specifieke antivirale therapie....................................................................................... 15 2.8.2.1 NS3 protease-helicase........................................................................................ 16 2.8.2.2 NS5 methyltransferase-polymerase.................................................................... 17 2.8.2.3 Gastheercel proteïnen ........................................................................................ 18 2.8.2.4 Morfolino oligomeren en andere antisense oligonucleotiden.............................. 18 2.8.3 Breed-spectrum moleculen ......................................................................................... 19 2.8.3.1. Ribavirine ............................................................................................................ 19 2.8.3.2 Interferon............................................................................................................. 20 2.8.3.3 Andere ................................................................................................................ 20 2.9 Diermodellen .................................. .................................................................................. 21
V
3 EXPERIMENTEEL WERK ................................................................................................. 22
3.1 Materiaal en Methoden .......................... .......................................................................... 22 3.1.1 Materiaal ...................................................................................................................... 22 3.1.1.1 Cellen en virus .................................................................................................... 22 3.1.1.2 Media en oplossingen ......................................................................................... 22 3.1.1.3 Antivirale moleculen............................................................................................ 23 3.1.2 Methoden..................................................................................................................... 23 3.1.2.1 Subcultiveren van cellen ..................................................................................... 23 3.1.2.2 Virusstock ........................................................................................................... 23 3.1.2.3 Virustitratie .......................................................................................................... 24 3.1.2.4 Plaque assay....................................................................................................... 25 3.1.2.5 Antivirale en cytotoxische assay ......................................................................... 25 3.1.2.5.1 Manuele assay......................................................................................... 26 3.1.2.5.2 Semi-automatische assay........................................................................ 27 3.1.2.6 MTS assay.......................................................................................................... 27 3.1.2.7 ATP detectie assay............................................................................................. 28 3.1.2.8 Dengue reporter antivirale assay ........................................................................ 29 3.1.2.9 Virus yield assay ................................................................................................. 30 3.1.2.10 RT-qPCR ............................................................................................................ 30 3.1.2.11 DENV replicon assay .......................................................................................... 31 3.1.2.12 Time-of-addition assay........................................................................................ 32 3.1.2.12.1 GKV.......................................................................................................... 32 3.1.2.12.2 DENV ....................................................................................................... 33 3.2 Resultaten..................................... .................................................................................... 34 3.2.1 Optimalisatie van een DENV assay............................................................................. 34 3.2.1.1 Optimale testcondities......................................................................................... 34 3.2.1.2 MTS- versus ATPlite-methode............................................................................ 36 3.2.2 Hit identificatie ............................................................................................................. 37 3.2.2.1 Evaluatie DENV antivirale activiteit ..................................................................... 37 3.2.2.2 Evaluatie GKV antivirale activiteit ....................................................................... 39 3.2.3 Hit validatie .................................................................................................................. 39 3.2.3.1 Dengue reporter virus ......................................................................................... 40 3.2.3.2 DENV virus yield assay....................................................................................... 41 3.2.3.3 DENV replicon assay .......................................................................................... 41 3.2.3.4 Time-of-addition met dengue repoter virus......................................................... 42 3.2.3.5 GKV virus yield assay ......................................................................................... 43 3.2.3.6 Time-of-addition met GKV .................................................................................. 43 3.2.3.7 Virus yield assay met MOD/GK chimeer virus .................................................... 45 3.2.3.8 MODV virus yield assay...................................................................................... 46 4 ALGEMEEN BESLUIT................................................................................................. 47
Literatuurlijst
Bijlage I: Optimalisatie DENV screening assay: percentage CPE ........................................................ I
Inleiding 1
De hemorragische koorts virussen, dengue en het verwante gele koorts, behoren tot de familie van de
Flaviviridae, in het genus flavivirus. Transmissie van deze RNA virussen naar de mens kan
voortkomen uit een beet van een besmette vrouwelijke Aedes mug (Ae. aegypti als voornaamste
vector). In het geval van het dengue virus (DENV) kunnen er zich milde symptomen ontwikkelen
genaamd dengue koorts en kan de ziekte verder ontwikkelen tot het ernstige dengue hemorragische
koorts/ dengue shock syndroom (DHK/DSS). Jaarlijks worden wereldwijd meer dan 100 miljoen
individuen geïnfecteerd met het virus, waarbij het voor 20.000 fataal wordt (voornamelijk kinderen). De
incidentie van het DENV stijgt dramatisch over de laatste decennia, vanwege de populatiegroei, de
falende vector controle, de vector distributie door de effecten van de opwarming van de aarde en tal
van andere factoren die de transmissie bevorderen. Omdat muggen niet kunnen worden uitgeroeid,
moeten andere maatregelingen genomen worden om de aandoening te voorkomen of te behandelen.
Een kosteneffectief vaccin is nodig voor de preventie en controle van dengue op lang termijn, maar
het ontwikkelen van een DENV vaccin blijkt bijzonder moeilijk en een werkzaam vaccin wordt dan ook
niet verwacht in de nabije toekomst. Daarnaast lijkt het idee van wereldwijde vaccinatie
onwaarschijnlijk gezien de gebrekkige gezondheidsinfrastructuur in de ontwikkelingslanden. De nood
is hoog om krachtige antivirale middelen tegen flavivirussen, zoals het DENV en het GKV te
ontwikkelen. De nieuwe therapeutica dienen reizigers en de bevolking in (hyper)endemische landen te
beschermen tegen ziekte, alsook de viremie te reduceren in patiënten om de kans op een ernstiger
ziekteverloop (nl. DHK/DSS) te verminderen.
Globaal zijn over de jaren heen een tal van antivirale middelen op de markt gebracht, grotendeels
werden ze ontwikkeld voor HIV, HBV en herpesvirus infecties. Specifieke therapieën voor hoog
pathogene RNA virale infecties zijn eerder gelimiteerd en strekt zich voornamelijk uit tot de
ontwikkeling van antivirale middelen voor het influenza virus, in het vooruitzicht om mensen te
behandelen tijdens een pandemie. Daarentegen, bezit geen enkel flavivirus, inclusief het DENV, een
gevalideerd antiviraal middel, desondanks de verscheidene potentieel geconserveerde doelwitten die
aantrekkelijk zijn voor de ontwikkeling van krachtige inhibitoren. Dit sluit niet uit dat een aanzienlijk
aantal producten potentiële activiteit in vitro vertonen tegen deze RNA virussen. Ribavirine, een
molecule waaraan nagenoeg alle RNA virussen gevoelig zijn, toont doorgaans weinig potentie als
antiviraal middel, ook tegen flavivirussen.
Het doel van deze studie was een bijdrage te leveren tot de ontwikkeling van inhibitoren van het
DENV. We optimaliseerden de nodige assays en karakteriseerden de antivirale activiteit van twee
potentiële inhibitoren met behulp van verscheidene andere assays, o.a. DENV reporter assay, virus
yield assay, RT-qPCR, DENV replicon assay en een ‘time-of-addition’ assay.
Hoofdstuk 1 Inleiding
Literatuurstudie 2
Dengue is een ziekte die, door de laatste twee eeuwen heen, verscheidene pseudoniemen verworven
heeft. ‘Break-bone fever’, ‘dandy fever’, ‘denguero’, ‘bouquet fever’, ‘giraffe fever’, ‘polka fever’ en
knokkelkoorts verwijzen allen naar dengue [1]. De ziekte wordt veroorzaakt door een RNA virus
behorend tot het genus Flavivirus, familie Flaviviridae. De familie bestaat uit drie genera, Flavivirus,
Pestivirus en Hepacivirus. Het genus Flavivirus omvat meer dan 70 virussen die verder kunnen
opgedeeld worden in drie clusters, (i) virussen die worden overgedragen door muggen zoals het
dengue virus (DENV), het Japanse encefalitis virus (JEV), het West Nijl virus (WNV) en het gele
koorts virus (GKV), het prototype van de familie, (ii) virussen die worden overgedragen door teken o.a.
het Tick-borne encefalitis virus (TBEV) en (iii) virussen geïsoleerd uit (vleer)muizen waarvoor nog
geen natuurlijke transmissie route is aangetoond, bijvoorbeeld het Modoc virus (MODV) (Figuur 1) [2].
Het DENV verspreidt zich over de meeste tropische en subtropische regio’s in de wereld en wordt
beschouwd als het belangrijkste arbovirus (transmissie via muggen of teken) in termen van humane
morbiditeit en mortaliteit [1, 3]. Er circuleren vier dengue serotypes (DENV-1 tot -4) die de oorzaak zijn
van verscheidene ziektebeelden in de mens, van dengue koorts (DK) tot de levensbedreigende
dengue hemorragische koorts/dengue shock syndroom (DHK/DSS) [4].
2.1 Epidemiologie
2.2.1 Geschiedenis
In 1779-1780 vonden er grote epidemieën van een ziekte, vermoedelijk dengue, plaats op drie
continenten (Azië, Afrika en Noord-Amerika). Er zijn echter eerdere rapporteringen van dengue-
achtige ziekte achterhaald. Tot op heden dateert het vroegst geregistreerde gelijkaardig ziektebeeld
van ongeveer 1000 jaar geleden, teruggevonden in een Chinese encyclopedie van ziektesymptomen
Hoofdstuk 2 Literatuurstudie
Figuur 1 | Fylogenetische boom van enkele flavivirussen. Virussen,
behorende tot de cluster die wordt overgedragen door muggen: het
dengue virus (DENV), gele koorts virus (YFV), St. Louis encephalitits
virus (SLEV) , West nile virus (WNV), Murray Valley encephalitis virus
(MVEV), Japanese encephalitis virus (JEV) en het Banzi virus. Virussen
overgedragen door teken: Louping ill virus ( LIV) en Tick-borne
encephalitis virus (TBEV). Virussen waar nog geen natuurlijke vector
voor omschreven is: het Modoc virus (MODV) en Myotis
leukoencephalitis virus (MMLV) [2].
Literatuurstudie 3
en remedies. Deze ziekte werd door de Chinezen watervergif genoemd en werd gerelateerd met
vliegende insecten in associatie met water [5]. Men veronderstelt dat het DENV een Aziatische
oorsprong heeft en geen Afrikaanse. Deze hypothese baseert zich op fylogenetische studies, alsook
op de hoge prevalentie van de verschillende dengue serotypes in Azië [6, 7].
Van de 17de tot de vroege 20ste eeuw veroorzaakte het DENV wijdverspreide epidemieën. Sinds
de eerst werkelijk geregistreerde dengue epidemie in Philadelphia (1780) wordt het ziektepatroon
gekarakteriseerd als relatief infrequent (10-40 jaren interval), maar hevig. Verscheidene van de
destijds grote epidemieën waren de weerslag van de groeiende scheepvaartindustrie (17de-18de
eeuw), die verantwoordelijk was voor de introductie van nieuwe dengue serotypes [5].
Het patroon wijzigt dramatisch tijdens en na de tweede wereldoorlog. Het binnendringen van de
geallieerden en de Japanse soldaten in endemisch Aziatische regio’s (o.a. Stille Zuidzee),
gecombineerd met populatiegroei, creëerde ideale condities voor de reproductie van Ae. aegypti, de
primaire vector van het DENV. Dit heeft als resultaat dat het DENV in nieuwe geografische gebieden
voorkomt en hyperendemische (co-circulatie van multipele dengue serotypes) infecties in ZO-Azië
veroorzaakt. Hoogstwaarschijnlijk heeft dit bijgedragen tot het ontstaan van DHK epidemieën in de
jaren 1950. De allereerste gerapporteerde DHK epidemie deed zich voor in Manilla, Filippijnen in
1953-54 [5, 7-9]. In 1981, toen het DENV-2 vanuit ZO-Azië zich introduceerde in Cuba, bleef Amerika
ook niet gespaard van een DHK epidemie [10].
2.2.2 Huidige status
De voorbije 30 jaar is de geografische verspreiding van het DENV dramatisch veranderd, zowel
binnen een land, als tussen gebieden en continenten. Dit resulteert in een toename van DK
epidemieën in alle tropische regio’s van de wereld en het zich voordoen van epidemisch DHK in de
Stille Zuidzee en tropisch Amerika [7].
In Azië kunnen jaarlijkse epidemieën en de stijgende frequentie aan sequentiële infecties bij
kinderen verklaard worden door het endemisch voorkomen van de vier DENV serotypes in de steden
en door de epidemische DK frequentie in de eerste 50 jaar van de 20ste eeuw [7, 8]. In Zuid-Afrika
werden epidemieën van DK gerapporteerd aan het begin van de 20ste eeuw. Sinds 1980 wordt een
dramatische stijging van DK waargenomen, veroorzaakt door de vier serotypes. Echter, omwille van
de povere monitoring is de ware prevalentie op dit continent onduidelijk [6, 7, 11]. Vooral Zuid-Amerika
lijdt onder het probleem van de opkomende DK/DHK. De ‘Pan American Health Organization’ (PAHO)
heeft, in een poging om gele koorts te bestrijden, een campagne opgericht voor de eradicatie van Ae.
aegypti (eveneens verantwoordelijk voor de transmissie van het GKV). In centraal en Zuid-Amerika
werden hierdoor nog enkel sporadisch epidemieën waargenomen in 1950-1960. Echter, na de
stopzetting van de campagne in 1970 raakte de distributie van de mug nog wijder verspreid dan voor
de aanvang van het eradicatie programma [11]. Rond 1970-1980 volgde hieruit een verhoogde
epidemische activiteit en DHK, dit in tegenstelling tot ZO-Azië, waar het fenomeen zich reeds in de
jaren ’50 en ’60 voordeed [12]. In Rio de Janeiro werden dit jaar nog zo’n 75.399 mensen geïnfecteerd
met het DENV. Tijdens die periode zouden 80 mensen zijn omgekomen, waarvan meer dan de helft
kinderen jonger dan 13 jaar [13].
Literatuurstudie 4
Vandaag de dag leeft meer dan twee vijfde van de wereldbevolking (2,5 biljoen mensen) in
potentiële DENV risicogebieden (Figuur 2) [9]. Het DENV infecteert jaarlijks 50-100 miljoen mensen,
waarbij 500.000 gevallen van DHK en meer dan 20.000 doden, voornamelijk kinderen [3, 14]. De
mortaliteit voor DHK bedraagt 5% en kan gereduceerd worden tot 1% bij correct medisch handelen.
Het aantal rapporteringen van patiënten tijdens een epidemie (1 per 100 tot 1 per 1000 van de
populatie) ligt 5 à 10 keer lager dan het aantal daadwerkelijke infecties, omdat mensen met een mild
ziektebeeld niet om medische zorgen vragen [11]. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) meldt
dat ongeveer de helft van de risicopatiënten in ZO-Azië leeft, waarvan Indonesië in 2006
verantwoordelijk was voor 57% van de dengue-gevallen [15]. Het aantal geregistreerde DENV
gevallen blijft stijgen. Zo kende Indonesië in 2006-2007 een stijging van 10%, wat neerkomt op meer
dan 100.000 patiënten. Verscheidene andere landen ondervinden dit zelfde scenario, o.a. in Thailand
en Myanmar met een respectievelijke stijging van 27% en 33% [18]. [16]
2.2.3 Transmissie
In tegenstelling tot de meeste andere flavivirussen is voor het DENV en het GKV de mens de
natuurlijke gastheer [17]. Het DENV wordt overgebracht door de vrouwelijke Aedes mug (subgenus
Stegomyia) o.a. Ae. aegypti, Ae. albopictus en Ae polynesiensis. De virussen overleven door een
urbane (mug-humane) cyclus met periodieke epidemieën die hoofdzakelijk onderhouden wordt door
Ae. aegypti, ruraal soms lokale andere Aedessoorten. Daarnaast bestaat er nog een sylvatische
(mug-primaten) cyclus in de regenwouden van Azië en Afrika [3, 5].
Ae. aegypti is een geacclimatiseerde mug die wordt teruggevonden dicht bij menselijke
leefomgevingen. Ze bijt hoofdzakelijk overdag (vooral in de vroege ochtend en namiddag) binnen of in
beschutte gebieden. Broedplaatsen voor de larven van Ae. aegypti omvatten artificiële
Figuur 2 | WHO 2007. De risicogebieden voor dengue transmissie. DENV transmissie in tropische en subtropische
gebieden zijn weergegeven in het groen. Een geografische uitbreiding van dengue werd waargenomen door de
internationale handel tussen 2000 en 2007 (donker groen). De januari- en juli-isotherm 10°C bakent het leefgebied van de
dengue vector (Ae. Aegypti) af [16].
Literatuurstudie 5
watercontainers zoals banden, dakgoten, bloempotten, gebrekkig afvalbeheer, enzovoort [8]. Virus
transmissie impliceert bloedopname door muggen tijdens de viremische fase en de passage naar een
volgende ontvankelijke gastheer. Door het onderbreken van de bloedmaaltijd als gevolg van de
kleinste bewegingen kan Ae. aegypti meerdere personen per bloedmaaltijd infecteren. Dit gedrag
maakt Ae. aegypti een efficiënte epidemische vector [5]. Bovendien kan het DENV transovarieel in de
mug worden doorgegeven naar de volgende generatie [8].
Ae. albopictus (tijgermug) is een wit-zwart gestreepte mug die oorspronkelijk afkomstig is uit ZO-
Azië, maar zich de laatste decennia over alle continenten heeft verspreid. De import van goederen
heeft bijgedragen aan de geografische expansie van Ae. albopictus naar Amerika, Frankrijk, Spanje
en Italië. Tevens wordt het Chikungunya virus (Togaviridae, Alfavirus), evenals minstens 21 andere
virussen, overgedragen door de tijgermug. De mug kan zowel verscheidene diersoorten als de mens
infecteren en onderhoudt op die manier de transmissie tussen de sylvatische en urbane cyclus van
het DENV [18].
2.2.4 Dengue, een escalerend probleem
Vandaag de dag is dengue één van de belangrijkste opkomende tropische virale ziektes in de wereld.
De laatste 50 jaar steeg de morbiditeit en mortaliteit aanzienlijk, waardoor de impact vergelijkbaar
wordt met die van malaria, tuberculose en bacteriële meningitis [19]. Dit manifesteert zich in een
dramatische stijging van de frequentie van DK, de verspreiding van hyperendemische transmissie en
de verhoogde incidentie van DHK met bovendien het voorkomen van DHK in nieuwe regio’s (Figuur 3)
[9]. Aan de basis van dit gezondheidsprobleem liggen de veranderingen in menselijke demografie en
het gedrag [8, 14]. Beïnvloedende factoren betreffen (i) de ongekende globale populatiegroei, welke
geassocieerd gaat met ongecontroleerde verstedelijking (vooral in de ontwikkelingslanden), (ii) een
stijging in het aantal broedplaatsen voor de larven door een verslechtering van behuizing, water, riool
en vuilbeheer [5, 7, 8, 19] en (iii) het gebrek aan effectieve vector controle in endemische gebieden en
Figuur 3 | Het jaarlijks gemiddeld aantal DK/DHK -gevallen gerapporteerd aan de WHO en het jaarlijks gemiddeld
aantal landen dat dengue rapporteert . De toename in het aantal dengue-gevallen per decennia is te wijten aan een
stijging in DK/DHK incidentie, maar ook aan een verbeterde rapportering. Vóór 1970 waren er slechts 9 landen waar DHK
voorkwam; sindsdien is het aantal toegenomen met een factor 4 en deze trend zet zich nog steeds voort. [16]
Literatuurstudie 6
de achteruitgang van de medische infrastructuur (met het tekort aan getrainde specialisten). Daarbij is
de toename aan mobiliteit, voornamelijk via vliegtuigen, een ideaal mechanisme voor de transmissie
van dengue tussen verschillende menselijke populaties in de wereld. Het geheel creëert ideale
condities voor de transmissie van arbovirussen en bevordert sterk de wereldwijde geografische
distributie en populatiedensiteit van Ae. aegypti. De opwarming van de aarde zou mogelijk ook kunnen
bijdragen aan de verdere spreiding van Ae. albopictus naar warmere regio’s in Amerika en Europa
[20]. Ondanks de relatief lage wintertemperaturen heeft de tijgermug zich al weten te vestigen in
Noord-Amerika, Noord-Japan en Noord-Italië. De zomertemperaturen zijn daar geschikt voor de
overleving en de succesvolle reproductiecyclus van Ae. albopictus [18]. Desondanks vormt het klimaat
niet de voornaamste factor in de toename van DENV transmissie. Het menselijk handelen en de
impact hiervan op de lokale ecologie speelt een meer significante rol [9, 21]. [22]
2.2 Virus structuur en compositie
Gelijk andere flavivirussen beschikt het DENV over een positief, enkelstrengs RNA ((+)ssRNA). Het
eicosahedraal nucleocapside (NC) kapselt het ~10,7kb RNA in een lipide enveloppe met 180 kopijen
van twee glycoproteïnen, het enveloppe en het precursor membraan proteïne. Het complete virion is
ongeveer 50 nm in diameter met een densiteit van 1,23 g/cm3 (Figuur 4) [1, 3].
2.2.1 Het genoom
Het viraal RNA (vRNA) gelijkt op een messenger RNA (mRNA) vermits het een type I cap bevat aan
het 5’-uiteinde; anderzijds ontbreekt de poly(A)-staart aan het 3’-uiteinde [1, 3]. Het genoom bevat één
open leesraam met als resultaat de vorming van slechts één polyproteïne (Figuur 5). De amino(N)-
terminus codeert voor drie structurele proteïnen: het caspide (C) proteïne, het membraan precursor
(prM) proteïne en het enveloppe (E) proteïne. Deze zijn essentieel voor de vorming van het
viruspartikel. Verder codeert het genoom voor zeven niet-structurele proteïnen NS1, NS2A, NS2B,
NS3, NS4A, NS4B en NS5. Deze maken de virale replicatie mogelijk [3, 23]. De individuele
functionele proteïnen worden verkregen door de activiteit van gastheercel proteasen in het
endoplasmatisch reticulum (ER), zoals signalase en furine, en door het virale protease (serine
protease) dat zich in het cytoplasma bevindt [3]. Het open leesraam wordt geflankeerd door een 5’- en
Figuur 4 | Het dengue virion . (A) Cryo-electronenmicroscopische opname van het dengue virion. (B) Schematische
representatie van een matuur virion. E, enveloppe proteïne; prM, precursor membraan proteïne; M, membraan proteïne; C,
capside proteïne [1].
B A
Literatuurstudie 7
Figuur 5 | Het DENV genoom en de verwerking van het polyproteï ne. Het genoom is onderverdeeld in structurele (rood)
en niet-structurele (grijs) genen. Het 5’-uiteinde bevat een type I cap en aan het 3’-uiteinde ontbreekt een poly-(A)-staart.
Proteolytische verwerking van het polyproteïne door virale (NS2b/NS3pro) en gastheercel proteasen (signalase en furine)
resulteert in drie structurele proteïnen (C, capside of prM, precursor membraan of E, enveloppe proteïne) en zeven niet-
structurele proteïnen (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b en NS5). NS3pro klieft op de juncties NS2a/NS2b, NS2b/NS3,
NS3/NS4a en NS4b/NS5 en nog bijkomende sites in de virale proteïnen zelf. De N-terminus bevat een 5’ UTR en de C-
terminus een 3’ UTR [31].
3’-onvertaalde regio (UTR) die secundaire structuren bevat en cruciaal zijn voor de initiatie en
regulatie van translatie, replicatie en virus assemblage [4].
2.2.2 Structurele proteïnen
2.2.2.1 Enveloppe (E) proteïne
Het E-glycoproteïne (~53 kD) is van belang voor de opname van het virus in de doelwitcel. Het
fusieproces en de interactie met oppervlaktereceptoren zijn geassocieerd met het E-proteïne en
bepalen het celtropisme [1]. Voor het correct functioneren van het glycoproteïne bevat deze drie
domeinen. Domein I is een centraal structureel domein, deze bevat de N-terminus en wordt
geflankeerd door domein II en III. Aan het distale eind van domein II bevindt zich een fusiepeptide. Het
immunoglobuline-achtig domein III bevat vermoedelijk de receptor bindingsplaats [23]. Epitopen in het
E-proteïne zijn verantwoordelijk voor het generen van mogelijk neutraliserende antilichamen tegen het
DENV. De horizontale organisatie van de E-proteïne dimeren op het virion-oppervlak is cruciaal voor
het functioneren van de dimeren en creëert een binnen- en buitenoppervlak, waardoor enkel de
buitenste AZ blootgesteld worden aan mogelijke neutraliserende antilichamen. Tijdens het fusieproces
bevordert de lage pH conformatieveranderingen in de organisatie van de dimeren. Dit resulteert in de
blootstelling van AZ die oorspronkelijk binnen in het dimeer lagen en nu meer toegankelijk worden
voor antilichamen, waardoor nieuwe epitopen tot stand gebracht worden [24].
Literatuurstudie 8
2.2.2.2 Membraan (M) proteïne
De specifieke proteolytische klieving van het geglycosyleerd prM-proteïne (~26 kD) tijdens
virusmaturatie resulteert in de vorming van het membraan (M)-proteïne. Deze cruciale stap in de
morfogenese van het virion gebeurt in de zure vesikels van het trans-Golgi netwerk door het gastheer
furine, die de N-terminus vrijstelt van het prM-proteïne. Dit proces is verantwoordelijk voor een
toename van de infectiviteit van het virus en de reorganisatie van het E-proteïne op het virus
oppervlak die essentieel is voor het fusieproces [1, 3]. Op die manier zou het prM-proteïne een
chaperonne functie bezitten voor de vouwing en assemblage van het E-proteïne [4, 23].
2.2.2.3 Capside (C) proteïne
Het C-proteïne (~11 kD) is het eerste virale polypeptide dat gesynthetiseerd wordt tijdens translatie.
Het is rijk aan lysine en arginine residuen (25%). Het basisch karakter van dit membraan-
geassocieerde proteïne is waarschijnlijk nodig om een interactie aan te gaan met het vRNA [1].
Bijgevolg is het verantwoordelijk voor het verpakken van het vRNA en de vorming van het NC [3, 23].
2.2.3 Niet-structurele proteïnen
2.2.3.1 Niet-structureel proteïne 1 (NS1)
NS1, het eerste niet-structurele proteïne, heeft een molecuulgewicht van ~46 kD en wordt
gesynthetiseerd in het ruw endoplasmatisch reticulum (rER) als een hydrofiel monomeer
glycoproteïne. Na het passeren van het Golgi-apparaat kan het gesecreteerd worden als oplosbaar
NS1 (sNS1) proteïne, membraan-gebonden blijven of deel uitmaken van het viraal replicatie-complex
[1, 4]. De functie van NS1 is nog niet volledig opgehelderd, maar blijkt betrokken te zijn in de synthese
van negatief strengs-RNA [25]. Experimenten op muggencellen toonden aan dat de glycosylatie op 2
residuen van belang zijn voor virus-replicatie [4]. Op immunologisch vlak speelt het ook zijn rol,
aangezien cellen die NS1 op hun oppervlak tot expressie brengen, een doelwit zijn voor cytolyse [1].
In het bloed van patiënten kan sNS1 teruggevonden worden, waarbij de concentratie correleert met de
viremie. Dit suggereert een mogelijke relatie tussen de concentratie sNS1 en de ernst van het
ziektebeeld [4].
2.2.3.2 Niet-structureel proteïne 2 (NS2)
De coderende regio van NS2 bevat twee proteïnen, namelijk NS2a (~22 kD) en NS2b (~14 kD). NS2a
is een hydrofoob proteïne met verscheidene mogelijke transmembraan domeinen en medieert
proteolytische verwerking van de C-terminus van NS1[1]. NS2b fungeert als cofactor voor de activatie
van het NS3-protease (NS3pro) via binding aan het protease enerzijds en cellulaire membranen
anderzijds [3, 4]. NS2b dient als chaperonne dat het NS3pro stabiliseert en assisteert bij het vouwen
tot de actieve conformatie [26].
Literatuurstudie 9
2.2.3.3 Niet-structureel proteïne 3 (NS3)
NS3 is een hydrofiel multifunctioneel proteïne (~70 kD). Allereerst is het N-terminaal serine protease
domein essentieel voor de verwerking van het polyproteïne tot de afzonderlijke functionele proteïnen
[1, 4]. Verder is de RNA 5’-trifosfatase (RTPase) functie vereist voor de verwijdering van een
fosfaatgroep in het nieuwgevormde RNA, waardoor de 5’ 7mG capping mogelijk is. Als laatste zijn het
RNA helicase en RNA-stimulerend nucleoside trifosfatase (NTPase) domein in de C-terminale regio
vereist voor virale RNA-synthese [1, 3, 4]. Tijdens replicatie ontwindt het helicase het dubbelstrengs
RNA. Dit is een energie-afhankelijk proces waarbij het NTPase de nodige energie levert uit de
hydrolyse van ATP [3].
2.2.3.4 Niet-structureel proteïne 4 (NS4)
Na proteolytische splitsing vormen zich nog twee kleine hydrofobe, functionele proteïnen, NS4a (~16
kD) en NS4b (~27 kD) [1, 4]. Het integraal membraan-proteïne NS4a draagt bij tot het vormen van het
viraal replicatie-complex. NS4b wordt geco-lokaliseerd met het NS3-proteïne en dubbel strengig RNA
(dsRNA) in ER-membraan structuren waar de RNA replicatie plaatsvindt. De identiteit en functie van
de posttranslationele modificatie van het NS4b-proteïne moeten nog bepaald worden [25].
2.2.3.5 Niet-structureel proteïne 5 (NS5)
Het NS5 (~103 kD) proteïne is een RNA-afhankelijk RNA-polymerase (RaRp), maar bezit eveneens
een methyltransferase (Mtase) activiteit. Het Mtase is S-adenosylmethionine (SAM)-afhankelijk en
verantwoordelijk voor de methylatie van de cap. Het RaRp is essentieel voor de synthese van een
intermediaire RNA-streng en voor de verdere synthese van het (+)ssRNA [1, 3, 4].
2.3 Virale replicatie
2.3.1 Adsorptie, penetratie en ontmanteling
De virale replicatie (Figuur 6) begint wanneer het DENV een cel infecteert. Het cellulair tropisme
omvat voornamelijk monocyten, macrofagen en dendritische cellen (DCs). Doorgaans verloopt de
opname van DENV via receptor-gemedieerde endocytose (RGE) [1, 4]. Onder de verscheidene
kandidaatreceptoren voor RGE is DC-SIGN de voornaamste. Andere reeds beschreven receptoren
zijn o.a. heparaansulfaat, hsp70, hsp90, CD14, GRP78/BiP, 37-kD/67-kD hoge-affiniteit
lamininereceptor en vermoedelijk nog andere niet-geïdentificeerde receptoren [4, 23].
De opname van het virus begint met adsorptie, door de binding aan een veel voorkomende lage-
affiniteitsreceptor, waarschijnlijk o.a. heparaan sulfaat. Vervolgens zou het virion een binding aangaan
met een minder voorkomende, hoge-affiniteitsreceptor dat de internalisatie medieert [3, 4]. DC-SIGN
is een lectine dat eerder de adsorptie van DENV bevordert dan de internalisatie [27, 28]. Tijdens RGE,
dat onder zure condities in het endosoom plaatsvindt, ondergaat het E-proteïne dimeer een
irreversibele conformatieverandering tot een trimeer [4, 23, 29]. Deze clusteren op het virale
oppervlak, waarna de blootgestelde fusiepeptiden op de tip van de trimeren de membraanfusie
Literatuurstudie 10
initiëren. Na de fusie wordt het NC vrijgesteld in het cytoplasma en verdere dissociatie van het NC
leidt tot het vrijkomen van het vRNA [3, 23].
2.3.2 Translatie en RNA replicatie
Translatie en replicatie gebeuren in associatie met intracellulaire membraanstructuren. Tijdens de
replicatie wordt de negatieve RNA-streng als templaat gebruikt voor de productie van een overmaat
aan positieve RNA-strengen. Het nieuw gevormde (+)ssRNA dient vervolgens zowel als vRNA, als
mRNA [4]. De niet-structurele proteïnen associëren om het viraal replicatie-complex te vormen.
Vervolgens bindt het complex geconserveerde structuren in het vRNA, waardoor de synthese
geïnitieerd wordt. De synthese wordt gereguleerd door de binding van het replicatie-complex aan
specifieke sequenties in het 3’ UTR [30].
De efficiëntie van de vroege translatie is afhankelijk van het DENV-serotype en de geïnfecteerde
cel. Na het rekruteren van de translatie-machinerie en wanneer de kleine ribosomale subeenheid het
eerste startcodon (AUG) heeft bereikt, kan de initiële translatie starten. Het gevormde polyproteïne
wordt co- en posttranslationeel gekliefd door virale en cellulaire proteases in de drie structurele en
zeven niet-structurele proteïnen (cfr. supra) [4, 27, 31].
2.3.3 Virus assemblage, maturatie en vrijstelling
Het membraan-geassocieerde C-proteïne is de cruciale factor voor de stimulatie van de virion
assemblage. Meerdere kopijen van het C-proteïne en één kopij van het vRNA vormen samen het NC
[3]. Tijdens de vorming van het NC wordt de virale enveloppe verkregen door passage van het NC
door het ER-membraan, dat integraal E- en prM-proteïnen bevat. Dit verklaart waarom de lipide
Figuur 6 | De replicatiecyclus van het DENV . Via receptor-gemedieerde endocytose worden DENV-partikels
geïnternaliseerd. Na het vrijstellen van het RNA uit het nucleocapside in het cytoplasma wordt het polyproteïne
gesynthetiseerd. Associatie van de niet-structurele proteïnen tot een replicatie-complex laat de vorming van dsRNA toe, dat
vereist is voor de verdere replicatie van het vRNA. Maturatie in het trans-Golgi-netwerk laat fusie met de gastheercel toe. Het
proces van ‘antibody-dependent enhancement’ bevordert de internalisatie van het DENV door aanwezigheid van Fc-
receptoren op de doelwitcel [66].
Literatuurstudie 11
samenstelling van de enveloppe eerder gelijkt op intracytoplasmatische membranen dan het
plasmamembraan [1].
Passage door het Golgi-netwerk resulteert vervolgens in virusmaturatie. De blootstelling aan een
lage pH veroorzaakt een irreversibele conformatieverandering, waardoor de furine klievingsplaats in
het prM proteïne wordt blootgesteld [29]. De omvorming van het prM- tot M-proteïne na klieving
resulteert weer in de conformatieverandering van het E-proteïne, waardoor de 60 prM-E trimeren op
het virusoppervlak gereorganiseerd worden tot 90 E homodimeren, de definitieve conformatie [23].
De vrijstelling van virus-partikels, zowel infectieuze en niet-infectieuze (subvirale), gebeurt via
exocytose. De kleinere subvirale partikels worden eveneens geproduceerd in het ER, maar bevatten
enkel het lipide membraan en de glycoproteïnen; het NC en vRNA ontbreekt [23]. Het aantal
infectieuze partikels is sterk afhankelijk van het virus [29].
2.4 Klinische presentatie
DENV-infecties verlopen doorgaans asymptomatisch. Daarnaast kan het virus, na een incubatie-
periode van 3 tot 15 dagen (gewoonlijk 5 tot 8 dagen), twee ziektebeelden veroorzaken, dengue
koorts en dengue hemorragische koorts. De patiënt ervaart een acute koortsachtige ziekte die typisch
3 tot 7 dagen duurt [1, 32, 33]. DK is een ziekte van (oudere) kinderen en volwassenen die gepaard
gaat met plotseling hoge koorts, frontale hoofdpijn, retro-orbitale pijn, myalgie, arthralgie (vandaar de
naam ‘break bone fever’), ‘nausea’, transiënte huiduitslag, braken en verlies van eetlust. Patiënten
kunnen ook aan anorexia lijden, een veranderde smaakperceptie hebben en milde keelpijn ervaren.
Doorgaans verdwijnen deze symptomen zonder complicaties 10 dagen na het opkomen van het
ziektebeeld [1, 5, 32].
In ongeveer 3% van de DENV-gevallen manifesteert DHK/DSS zich zoals beschreven volgens de
WHO-criteria (Figuur 7) [34, 35]. DHK/DSS wordt geclassificeerd in vier graden (van milde graad I tot
de meest ernstige graad IV) op basis van klinische presentatie en laboratorium bevindingen [34, 36].
Symptomen van DK zijn hierin terug te vinden, alsook vasculaire permeabiliteitsdefecten. Deze
defecten resulteren in plasmalekkage, hemostatische abnormaliteiten zoals thrombocytopenie (<
100,000 cellen/mm3), stijging van de bloeddruk, een verhoogd hematocriet (≥ 20%) en hemorragische
diathese [33, 37]. Verandering in de vasculaire permeabiliteit kan leiden tot circulair falen met als
gevolg hypovolemische shock, DSS [38]. Veel DHK-patiënten hebben slechts geringe hemorragische
manifestaties, waarbij petechiae vaak het enige klinische teken is. Deze petechiae kan worden
Figuur 7 | Criteria volgens de WHO
voor de classificatie van DHK -
patiënten. Tekenen en symptomen die
voldoen aan de graad van ziekte (I tot
IV). Graad III en IV zijn geassocieerd
met DSS [1].
Literatuurstudie 12
opgewekt via de tourniquettest [33].
Naast DK en DHK/DSS zijn er nog atypische manifestaties van dengue die steeds meer
voorkomen, maar toch weinig gerapporteerd worden. Vasculaire permeabiliteit en stollingsstoornissen
kunnen een variëteit aan systemische stoornissen veroorzaken, zoals encefalopathie, hepatitis,
hartritmestoornissen, acuut renaal falen, ARDS, lymfadenopathie en splenomegalie [39].
2.5 Pathogenese
Ondanks de vele studies, is de pathogenese van DHK nog steeds niet geheel opgehelderd. Zowel
virale, gastheer als immuun-factoren blijken de graad van ernst van het ziektebeeld te beïnvloeden
[40]. Individuele factoren die het risico verhogen zijn leeftijd, ras, voedingstatus en onderliggende
chronische ziektes, zoals astma [33]. Onder de voorgestelde hypothesen voor de verklaring van de
pathogenese is de ‘antibody-dependent enhancement’ (ADE) theorie de voornaamste (cfr. infra) [37].
In primaire DENV-infecties zijn immature Langerhans cellen de initiële plaats van virale replicatie.
Adsorptie van DENV stimuleert de DC-maturatie en -activatie [37]. DCs zijn de eerste lijn van defensie
van het immuunsysteem, evenals de naturel killer (NK) cellen die de activatie van geïnfecteerde DCs
bevordert door de secretie van IFN-γ en dus een rol heeft in de bescherming en virale klaring [34, 36].
Vervolgens migreren de DCs naar T-cel rijke regio’s zoals de lymfoïde organen [37]. T-cel activatie
stimuleert een geheugenrespons en de activatie van macrofagen (via IFN-γ), het complement-systeem
en bloedplaatjes. Dit alles resulteert in een verandering in vrijstelling van de pro-inflammatoire
cytokines IFN-γ, IL-1, IL-8 en TNF-α, alsook de anti-inflammatoire cytokines IL-6 en IL-10 [4, 30, 41,
42]. Het bevorderen van de vasculaire permeabiliteit in DHK is deels te verklaren door de verhoogde
productie aan TNF-α [33]. Hiermee is evident dat cytokines een sleutelrol spelen in DHK pathogenese
[43].
Een primaire DENV-infectie voorziet de gastheer van een levenslange immuniteit voor dat
serotype, maar slechts een gedeeltelijke en transiënte (<12 weken p.i.) immuniteit voor de drie andere
DENV serotypes [4, 27, 31, 37]. DHK/DSS kan geïnduceerd worden tijdens een primaire of
secundaire DENV-infectie [36]. DHK tijdens een eerste primaire infectie in de eerste levensjaren is te
wijten aan de aanwezigheid van antilichamen (AL) afkomstig van een geïnfecteerde moeder [10, 33].
Doorgaans is DHK geassocieerd met een secundaire infectie van een heterogeen serotype; daarbij
treedt een belangrijk immuunpathogeen proces op, ADE [34]. ADE ontstaat doordat kruisreagerende,
maar niet neutraliserende AL complexen vormen met het DENV die binden aan Fc-receptor-
bevattende cellen (Figuur 6) [44]. Bijgevolg wordt de infectie bevorderd door een toename van het
aantal geïnfecteerde cellen en niet door een toename van de virusproductie binnen de cel [36].
Secundaire infecties activeren preferentieel kruisreagerende geheugen T-cellen die specifiek gericht
zijn tegen de pirmaire infectie (eerder dan tegen de huidige infectie). Met dit fenomeen wordt
verwezen naar ‘original antigenic sin’ en wordt de eliminatie van het virus vertraagd [33]. Terwijl
intracellulaire defensiemechanismen, vrije radicalen en antivirale cytokines worden gereduceerd,
neemt de productie van immuunsuppresieve cytokines toe. Gezamenlijk manifesteert zich dit in een
hogere mate van viremie en een verergering van het ziektebeeld [41].
Literatuurstudie 13
2.6 Behandeling
Ondanks de toename van de gezondheids- en economische impact van dengue, is er nog geen
specifieke behandeling voor deze infecties [34]. Patiënten worden symptomatisch behandeld en
afhankelijk van hun conditie (aantal bloedplaatjes, leverfunctie, elektrolyten en bloedgassen) kunnen
ondersteunende maatregelen genomen worden [14]. De patiënt wordt aangeraden te rusten en veel te
drinken om dehydratatie te vermijden. In geval van DHK stabiliseren corticosteroïden de capillaire
permeabiliteit en voorkomen ze plasma lekkage [45]. Niet-steroïde anti-inflammatoire
geneesmiddelen, zoals ibuprofen en aspirine, moeten ten sterkste vermeden worden omwille van hun
antistollingseigenschappen. Bij zwaar gehospitaliseerde individuen kan controle over de vitale
orgaanfuncties, vloeistofbalans en hematologische parameters doorslaggevend zijn [11].
2.7 Preventie
2.7.1 Vector controle
Er bestaan geen universele richtlijnen voor de bestrijding van arbovirussen, aangezien fluctuaties in
de immuniteit, de contacteigenschappen tussen de mens en mug, vector-ecologie en klimaatpatronen
de transmissiedynamiek sterk doet variëren [46]. Eerder werd voor het GKV een succesvol vector
controleprogramma opgesteld door de PAHO voor de eradicatie van Ae. aegypti. Zo’n succesvol
programma vereist geïnformeerde, adequaat gefinancierde en een goed georganiseerde leiding.
Tevens is de deelname van de gemeenschap essentieel. Personen die het insect rondom hun huis
bestrijden, o.a. door pesticiden, zijn nog steeds kwetsbaar door de omgeving waar geen interventies
worden genomen [47]. Er is consensus over het feit dat een significante reductie in de vectorpopulatie
een effect heeft op het voorkomen van de ziekte en dat de enige parameter om na te gaan of een
programma werkt, de afname in incidentie is [46]. Controle-methodes i.v.m. het milieu omvatten het
beheer van watervoorzieningen, vermijden van broedplaatsen voor de mug, afvalbeheer en het
veranderen van de leefomgeving van de larven. Muggensteken kunnen vermeden worden door
persoonlijke bescherming zoals kleren, afweermiddelen met diëthyltoluamide (DEET) en larviciden. In
geval van een epidemie kunnen insecticiden worden toegepast [14]. Evenzeer kunnen ‘larvicidal
ovitraps’ dienen als hulpmiddelen voor vector controle. Dit zijn zwarte met water gevulde cilindrische
containers waar besmette muggen hun eieren in leggen die de later-gevormde volwassen muggen
gevangen houden onder een netwerk van draden en verdrinken [48].
DengueNet (http://www.who.int/denguenet) is een op internet gebaseerd systeem voor de globale
toezicht op DK en DHK welke door het WHO in het leven is geroepen. Het is een netwerk van
gestandaardiseerde data om incidentie en trends van dengue te detecteren en te controleren,
waardoor nationale data meer vergelijkbaar worden. Daarnaast verleent DengueNet nog een
onbeperkte toegang tot nuttige informatie voor werknemers van de volksgezondheid om zich beter
voor te bereiden op de eerste aanwijzingen van DENV-epidemieën. Het DengueNet bevordert de
beoordeling van de gezondheids- en economische lasten evenals, de doelmatigheid van nieuwe en
reeds bestaande controle-interventies [49, 50].
Literatuurstudie 14
2.7.2 Vaccin
Uit het verleden is gebleken dat vector controle onvoldoende effectief is of slechts succesvol op korte
termijn. Bijgevolg is de ontwikkeling van een vaccin cruciaal voor een langdurige controle [42]. In
tegenstelling tot het GKV en het JEV, bestaat er vandaag de dag nog altijd geen DENV-vaccin. Toch
zijn er wel enkele kandidaten in fase van ontwikkeling [51]. Onder de mogelijke vaccinstrategieën
behoren levend-geattenueerd (chimeer) virus, geïnactiveerd virus, DNA-plasmide en subeenheid
vaccin [14, 52]. De moeizame pogingen om een DENV-vaccin te ontwikkelen, is toe te schrijven aan
het gebrek aan een adequaat diermodel voor dengue. Tevens zou een ideaal vaccin een individu
moeten beschermen tegen alle vier de DENV-serotypes omwille van het risico op ADE in DENV-
endemische gebieden. Ook moet het makkelijk te gebruiken zijn, veilig voor kinderen tussen 9-12
maanden, goedkoop en een langdurig beschermende immuniteit opwekken (>10 jaar) [12].
Levend-geattenueerde vaccins kunnen bekomen worden door het afzwakken van het virus via
seriële passage in celcultuur [52]. Theoretisch zou het afgezwakt DENV zowel een humorale
(neutraliserende AL) als een cellulaire (Th1/CTL) immuniteit moeten opwekken [53, 54]. Naast het
probleem van onvoldoende/over-attenutatie, is ook het samenstellen van een monovalent tot
tetravalent vaccin een obstakel [52]. De aanwezigheid van een ongebalanceerde immuunrespons bij
een tetravalent vaccin is te wijten aan het optreden van interferentie tussen de verschillende
serotypes. De immuunrespons van bepaalde serotype domineert in dat geval boven de andere, wat
een potentieel risico op ADE met zich meebrengt [42, 53]. Een eerst mogelijke levend tetravalent
vaccin werd vervaardigd door Walter Reed Army Institute of Research and Glaxo-SmithKline en is het
eerste vaccin dat een 100% immunologische respons opwekt voor alle DENV serorypes [26]. Deze
bevindt zich echter nog in klinische fase II in Thailand. Een ander vaccin, ontwikkeld door Acambis,
werd bekomen door de genetische manipulatie van DENV-genen. Het plaatsen van de DENV
structurele genen in een kloon van het gele koorts 17D vaccin levert een chimeer (ChimeriVax-
DENV), levend-geattenueerd vaccin op. Enkel inductie van AL voor DENV kunnen worden
waargenomen en niet voor GKV. In collaboratie met Sanofi Pasteur, werden chimeren gecreëerd voor
de vier DENV-serotypes en gecombineerd tot een tetravalent vaccin die zich momenteel in klinische
fase I bevindt [52, 55].
De ‘National Institutes of Health’ (NIH) hanteerde een andere strategie gebaseerd op ‘reverse
genetics’, waarbij een verminderde immuunrespons bekomen werd door het creëren van deleties in
het 3’ UTR van het DENV-4 genoom [53]. Resultaten van een fase I klinische studie gaven een
redelijke veiligheid en immunogeniciteit weer. Op dezelfde manier creëerde CDC (inviragen) een
tetravalent vaccin (in preklische fase) met als basis een DENV-2 mutant waarbij prM- en E-genen
vervangen werden door die van DENV-1,-3 en -4 [52].
Een andere benadering, aangewend door Hawaii Biotech leidde tot een tetravalent ‘subunit’
vaccin. Het mengel bevat de vier serotypes van het E-proteïne, samen met het NS1-proteïne van
DENV-2 als immunogeen [52]. Andere preklinische ontwikkelingen zijn DNA-vaccins en adenovirale
vectoren voor het tot expressie brengen van één of meerdere DENV-genen [53].
Het internationaal vaccin instituut in Korea richtte in 2003 het pediatrische dengue vaccin initiatief
(PDVI) op dat gefinancierd wordt door de Bill and Melinda Gates Foundation [56]. Het maakt deel uit
Literatuurstudie 15
van één van de vele lopende vaccin ontwikkelingsprogramma’s en richten zich vooral op het
versnellen van de ontwikkeling en introductie van dengue vaccins. Hun doel is een betaalbaar vaccin
dat toegankelijk is voor arme kinderen in endemische landen [51].
2.8 Therapeutische benadering
2.8.1 Ontwikkeling van antivirale middelen
De weg die een molecule aflegt tot een erkend geneesmiddel, is lang en complex. Het
ontwikkelingsproces start bij het basisonderzoek. Het proces impliceert ‘high throughput screening’
(HTS), dat grote bibliotheken van chemische moleculen test voor een gewenst effect. Een alternatief
op HTS is ‘rational-drug design’, dat effectieve moleculen construeert op basis van structurele
informatie [57]. Op die manier kunnen specifieke moleculen worden geïdentificeerd die de functie van
een viraal eiwit of de virale replicatie verstoren in levende cellen. Deze moleculen noemen we ‘hits’.
Geselecteerde hits worden geoptimaliseerd tot ‘lead’ moleculen door varianten, met grotere potentie
en betere farmacologische eigenschappen, te creëren. Na in vivo validatie zal uiteindelijk één of
meerdere kandidaatmoleculen met de gewenste eigenschappen verder in klinische studies getest
worden [58].
Belangrijke aspecten in de evaluatie van nieuwe moleculen zijn het werkingsmechanisme en de
selectiviteit. De selectiviteit stelt het verschil in dosis voor waar een antiviraal effect (EC50) en een
cytotoxisch effect (CC50) optreedt. Het begrijpen van beide aspecten gebeurt het best via de studie
van resistentie-ontwikkeling. Het waarnemen van resistentie tegen een antiviraal middel impliceert dat
het selectief is. Bijgevolg interfereert het molecule eerder met een direct virus-specifiek proces dan
met een gastheercel proces. Naast de verworven resistentie, vereist het virus een behoud van
pathogeniciteit om nog een ziektebeeld te kunnen uitlokken. Door de gevormde mutaties in kaart te
brengen, kan het doelwit en het verdere mechanisme geïdentificeerd worden. Om resistentie tegen te
gaan, biedt combinatietherapie een mogelijke oplossing. Dit brengt echter nadelen met zich mee zoals
de bijkomende toxiciteit en de verminderde compliantie [58].
Voor flavivirussen zou een antiviraal middel bij voorkeur een breed-spectrum activiteit moeten
bezitten. Dit vergroot de toepasbaarheid van het molecule wanneer ze verscheidene RNA-virussen
(bijvoorbeeld alle DENV serotypes en gerelateerde flavivirussen) kan onderdrukken. Bijgevolg zal de
farmaceutische industrie meer geneigd zijn om het antiviraal middel te ontwikkelen [50].
2.8.2 Specifieke antivirale therapie
Om de obstakels van vaccinontwikkeling te omzeilen, zouden specifieke therapeutica een oplossing
kunnen bieden. Voor de ontwikkeling van een DENV inhibitor, komen meerdere essentiële stadia
tijdens de virale cyclus in aanmerking, zoals de binding en opname van het virus in de cel, de
maturatieprocessen, de vRNA synthese en bepaalde gastheercel-proteïnen [3, 57]. Moleculen die
interfereren met de initiële virus-gastheercel interactie, zorgen voor een eerste remming van virale
replicatie [59]. Bepaalde gesulfateerde proteoglycanen blijken receptormoleculen te zijn voor DENV.
Vandaar dat bepaalde sterk gesulfateerde polysacchariden uit zeewier, zoals fucoidans en
Literatuurstudie 16
galactomannanen, het DENV inhiberen [60]. De cap-synthese van vRNA vereist cytoplasmatische
virale enzymen, zoals het Mtase (N-terminaal domein van het NS5-proteïne) en het RNA-trifosfatase
(C-terminaal domein van het NS3-proteïne). Zodoende kan de remming van zulke enzymen
beschouwd worden als een potentieel antiviraal mechanisme. [50]. De zoektocht naar specifieke
inhibitoren vereist bijgevolg een grondige kennis van de biochemische en structurele eigenschappen
van de essentiële virale proteïnen [25].
2.8.2.1 NS3 protease-helicase
Protease. Structurele studies suggereren dat het multifunctioneel NS3-proteïne is opgebouwd uit een
NS3pro, dat ruimtelijk georiënteerd bovenop het subdomein I en II van het NS3-helicase ligt (Figuur 8)
[61]. Het protease is essentieel voor de maturatie van het dengue polyproteïne en bevat de
katalytische aminozuren His-51, Asp-75 en Ser-135 (triade). Peptiden worden gekliefd in een
consensusplaats, waarbij een dibasisch (Arg/Lys)-Arg motief op posities P2 en P1 worden
waargenomen en een klein aminozuur (Gly, Ala, ser) op positie P1’ [25, 61]. Een recombinante vorm
van het NS3pro, gefuseerd door een glycine linker (Gly4-Ser-Gly4) aan 40 AZ van de cofactor NS2b
(CF40GlyNS3pro), werd tot expressie gebracht in Escherichia coli [62]. Alvorens een protease-
inhibitor te creëren, is men genoodzaakt de specificiteit van het protease-substraat te bepalen.
Afhankelijk van deze substraten worden dan kleine moleculen ontworpen en getest op hun
inhiberende activiteit [26]. De proteasen van DENV-1 tot -4 delen een zeer gelijkaardige
substraatspecificiteit. Dit impliceert dat het mogelijk zou zijn slechts één molecule te ontwikkelen tegen
het protease van elk serotype. Dit zou eveneens gelden voor verwante flavivirussen zoals het GKV en
het WNV [63-65]. Zo blijkt er een klasse van inhibitoren (pyrazoline klasse) geïdentificeerd te zijn, die
de NS2b-bindingsplaats in het WNV NS3pro blokkeert. Dit belemmert vervolgens de interactie tussen
NS2b en NS3pro [66, 67]. De interactie tussen beide proteïnen lijkt vereist te zijn voor een degelijke
vouwing van het WNV NS3pro en de correcte interactie met het substraat. Het blokkeren van de
proteïne-interactie biedt een mogelijkheid aan voor het ontwikkelen van nieuwe selectieve inhibitoren
[26, 66].
Helicase. In de C-terminale regio van het NS3-proteïne bevindt zich het helicase, bestaande uit drie
subdomeinen (Figuur 8). Structurele gelijkenissen zijn terug te vinden in andere flavivirussen [61]. De
ontwinding, uitgevoerd door het helicase, zou op drie manieren verhinderd kunnen worden: door te
interfereren met de ATP-binding, het voorkomen van de RNA-binding of het blokkeren van de helicase
translocatie [25]. Bij eerder uitgevoerde plaats-specifieke mutagenese studies ondervond men echter
resterende helicase activiteit die ATP-onafhankelijk blijkt te zijn. Deze observatie ontmoedigt het
ontwikkelen van competitieve inhibitoren voor de ATP-bindingsplaats in het helicase [66]. Anderzijds
kan het NS3pro ook als doel dienen om de helicase activiteit te remmen. In aanwezigheid van het
protease wordt de enzymatische activiteit van het helicase met een factor 30 vergroot en daarbij ook
de affiniteit voor ATP verhoogd [57, 61, 66].
N-alkyl derivaten van 1H-benzotrialzool en 1H-benzimidazool blijken een sterke activiteit uit te
oefenen tegen het helicase van verscheidene flavivirussen (DENV, GKV, JEV en het hepatitis C virus
Literatuurstudie 17
(HCV)) [68]. Verder inhiberen een aantal 5’-O-(4-fluorosulfonylbenzoyl (FSB))-esters van nucleosiden
(adenosine, guanosine, inosine), alsook FSB-esters van ribavirine (RBV), de NTPase/helicase
activiteit van Flaviviridae (o.a. het DENV). De geobserveerde cytotoxiciteit van deze esters is te wijten
aan het blokkeren van de NTP bindingsplaats van cellulaire enzymen [69].
2.8.2.2 NS5 methyltransferase-polymerase
Methyltranferase. Mutationele studies wijzen op de essentiële rol van het Mtase in de virale replicatie.
Het functioneel domein van het Mtase methyleert de N-7 positie van de 5’-guanosine cap, evenals de
ribose op de 2’-OH positie van het eerst afgeschreven nucleotide (m7GpppAm) [25, 61]. Beide
methylaties gebruiken SAM als methyl-donor [70]. De zoektocht naar Mtase-inhibitoren is gestart,
maar vereist nog veel onderzoek [25]. De cap-methylatie kan voorkomen worden door guanosine-
analogen die in competitie treden om de Mtase-bindingplaats. Benarroch et al. toonde in vitro aan dat
RBV trifosfaat de DENV-Mtase activiteit inhibeert. Dit zou een deel van de antivirale activiteit van RBV
in flavivirussen verklaren (cfr. infra) [71].
Figuur 8 | De kristalstructuur van de niet -structurele proteïnen NS3 en NS5. NS3 is links weergegeven. Het protease
domein (residues 1-168) is N-terminaal gelegen in het molecule. De katalytische aminozuren zijn weergegeven in het blauw
(His-51), het paars (Asp-75) en het geel (Ser-135). Rood stelt de cofactor NS2b voor. De Gly-Ser linker tussen het protease en
het helicase is in het blauw afgebeeld. Twee-derde van het proteïne vormt het C-terminale helicase domein (residues 180-618).
De zeven verschillende motieven, verantwoordelijk voor de activiteit, hebben elk een aparte kleur gekregen op de figuur. NS5 is
rechts weergegeven. Het methyltranferase is afgebeeld in verscheidene kleuren, waarbij de cap-structuur van het vRNA in het
zwart is gekleurd en het bijproduct van SAM in het rood. Het polymerase bevat een vinger domein (residu’s 273-315; 416-496;
543-600) afgebeeld in het blauw, het palm domein (residu’s 497-542; 601-705) in het groen en het duim domein (residu’s 706-
900) in het rood. De NLS-sequentie is weergegeven in het geel en het bruin (residu’s 320-368; 369-405) [61].
Literatuurstudie 18
RNA-afhankelijk RNA-polymerase. De kristalstructuur veronderstelt dat het DENV RaRp gelijkaardig is
met andere RaRp-moleculen. De samenstelling volgens een rechterhand conformatie bestaat uit een
palm, vingers en een duim subdomein (Figuur 8) [61]. De actieve plaats is gelegen in het palm
subdomein, waar een asparaginezuur residu betrokken is in de katalytische activiteit. Het vinger
subdomein is uiterst stabiel en verantwoordelijk voor conformatieveranderingen. De interactie tussen
het palm en duim subdomein speelt een rol in de binding van NTP’s [72]. Het nucleus lokalisatie
signaal (NLS) is verantwoordelijk voor de lokalisatie van het NS5-proteïne in de nucleus. De reden
voor deze nucleaire lokalisatie wordt ten heden intensief onderzocht [57, 61]. Aangezien het RaRp
afwezig is in humane cellen, sterk geconserveerd is onder en essentieel is voor de flavivirussen, is het
NS5-proteïne één van de meest belovende doelwitten voor antivirale therapie. De inhibitie van het
NS5-proteïne en bijgevolg de RNA replicatie, kan zowel door middel van nucleoside als niet-
nucleoside analogen (NA/NNA). NA worden gefosforyleerd tot 5’trifosfaten om vervolgens in het vRNA
geïncorporeerd te worden. NNA zijn allosterische inhibitoren, waarbij de kans op resistentie-
ontwikkeling groter is dan NA [25]. Allosterische inhibitoren blijken effectief te zijn in de onderdrukking
van het HIV reverse transcritpase en de polymerase activiteit van het hepatitis B virus [73]. Proteïne-
proteïne interacties en proteïne-RNA interacties van het polymerase zijn minder bestudeerd als
antivirale strategie [72].
2.8.2.3 Gastheercel proteïnen
Virus-gastheercel interacties zijn belangrijk voor de virale levenscyclus, echter ook voor de
pathogenese. Een aantal cellulaire proteïnen die binden aan het vRNA zijn reeds bekend o.a. EF-1α
(elongatie factor) en PTB (polypyrimidine tract binding protein), welke DENV-4 RNA binden. Hun
bijdrage aan de virale replicatie blijft echter nog onbekend [25]. Inhibitoren van gastheercel proteïnen
kunnen zowel de interactie van het proteïne met het translatiecomplex verstoren, als het metabolisme
van de gastheercel [50]. Voorbeeld zijn RBV en 6-azauridine (zie paragraaf 2.8.3).
2.8.2.4 Morfolino oligomeren en andere antisense oligonucleotiden
Morfolino oligomeren zijn antisense synthetische moleculen die gebruikt worden om de genexpressie
te beïnvloeden. De klasse fosforodiamidaat morfolino oligomeren (PMO) bevat een natuurlijke base
op een morfolino-ring (i.p.v. op de deoxyribose-ring zoals in DNA) gekoppeld via een
fosforodiamidaatgroep (i.p.v een fosfodiester) (Figuur 9).[74]In tegenstelling tot ‘small interfering RNA’
(siRNA) degraderen ze het doelwit RNA niet, maar werken ze als een sterische blokker. Kinney et al.
identificeerden twee locaties in het DENV-2 genoom die resulteerden in reductie van virale replicatie
na het toedienen van een peptide-gebonden P4-PMO molecule. Deze zijn gelegen in de 5’ proximale
nucleotiden (5’ UTR) en de 3’ cyclisatie sequentie (3’ UTR) [75]. Fosforothioaat antisense
oligonucleotiden zijn nucleïnezuurfragmenten die hybridizeren met de complementaire sequenties van
RNA. Het zijn antisense oligonucleotiden waarbij het zuurstofatoom in de PO-dubbele binding van
DNA vervangen werd door een zwavelatoom. Deze substitutie maakt ze resistent aan cellulaire
nucleasen en bewerkstelligen zo een succesvolle inhibitie van DENV-replicatie [76]. Naast het
Literatuurstudie 19
selectief binden aan RNA, brengt het echter ook neveneffecten met zich mee door mogelijke interactie
met DNA en proteïnen [59].
2.8.3 Breed-spectrum moleculen
2.8.3.1. Ribavirine
Ribavirine (RBV, 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide, Figuur 10) is een breed-spectrum
inhibitor van de virale RNA replicatie. RBV wordt beschouwd als een guanosine-analoog die
interfereert met de replicatie van een aantal flavivirussen in vitro, waarvan de potentie kan variëren
naar gelang het virus [50]. Slechts in enkele diermodellen blijkt RBV een beschermend effect uit te
oefenen [77]. Voor de verklaring van de antivirale activiteit bestaan er verscheidene moleculaire
mechanismen. Het meest prominente mechanisme voor flavivirussen grijpt in op de synthese
‘pathway’ van GMP wegens de inhibitie van het inosine 5’-monofosfaat (IMP) dehydrogenase [50, 78].
Dit resulteert in een tekort in de GTP-voorraad, welke nodig is voor de synthese van nieuw vRNA [58].
Anderzijds zou RBV de virale cap-vorming tegengaan door een negatief effect uit te oefenen op de
NS5 Mtase activiteit van het DENV [31, 71]. Verder wordt er een inhibitie van het RaRp door RBV
trifosfaat waargenomen, althans in vitro voor het influenza virus en het HCV. Finaal werkt RBV op de
activiteit van het viraal NTPase/helicase. De inhibitie van de helicase activiteit wordt gesuggereerd
voor reovirussen [50].
De aandacht moet eveneens gevestigd worden op het feit dat RBV een mutagene en
immunomodulerende activiteit zou bezitten. Het mutageen effect kan gegenereerd worden door het
incorporeren van RBV tegenover de pyrimidine basen cytidine en uridine in de groeiende RNA keten
van het poliovirus. De accumulatie van mutaties (met een factor 10) in het viraal genoom is het
resultaat van het zogenaamde proces ‘error-catastrofe’ [50]. Bovendien stimuleert RBV de secretie
van cytokinen (IL-2, IFN-γ, and TNF-α) door T-cellen, om op die manier de immuunrespons te
moduleren. Deze cytokines bevorderen de Th-1respons en remmen de Th-2 repons tijdens een
immuunreactie [79].
RBV wordt toegepast bij RSV-infecties en als therapie voor HCV-patiënten in combinatie met IFN-
α [78]. Over het algemeen is RBV geen effectieve molecule voor de behandeling van flavivirus
Figuur 9 | De opbouw van DNA en morfolino -esters. DNA
is opgebouwd uit een base (A,G,T,C) op een deoxyribose-
ring gekoppeld via een fosfodiester-verbinding. Morfolino’s
bevatten een base (A,G,T,C) op een morfolino-ring
gekoppeld via een fosforodiamidaat-groep [75].
Figuur 10 | De structuur van ribavirine. Ribavirine is een
breed-spectrum inhibitor voor virale RNA replicatie [50].
Literatuurstudie 20
infecties. Het bestuderen van de activiteit en toxiciteit van RBV analogen (levoviridine en mizoribine)
en ‘prodrugs’ (viramidine) leidde tot de conclusie dat meer potente en veiligere analogen gecreëerd
moeten worden. EICAR, een 5-ethynyl analoog van RBV, toont in vitro een 10 tot 30 keer verhoogde
antivirale activiteit, maar dit impliceerde helaas een stijging in toxiciteit als gevolg van een meer
uitgesproken inhibitie van het IMP dehydrogenase [50].
2.8.3.2 Interferon
De IFN-respons vertegenwoordigt de vroege gastheercel defensie en draagt bij tot het aangeboren
immuunsysteem [34]. Het is reeds in vitro aangetoond dat zowel IFN-α/β als IFN-γ een beschermend
effect heeft gedurende een DENV-infectie [4]. DENV/diermodellen bekrachtigen dit resultaat, waarbij
IFN-receptor-deficiënte muizen een hogere DENV-titer bezitten [4]. De suppressie van het DENV zou
te wijten zijn aan het blokkeren van de translatie van het initieel vRNA [34]. Vermits het virus
mechanismen heeft ontwikkeld om de IFN signaling ‘pathway’ te omzeilen (via de inhibitie van
transcriptie factor STAT-1 door NS2b, NS4a en NS4b), zal IFN-α enkel over een antiviraal effect
beschikken indien het wordt toegediend voordat de infectie plaatsvindt. [41]. Dit verklaart de
aanwezigheid van hoge DENV-titers in individuen ondanks het circuleren van grote hoeveelheden
IFN-α [34]. Analyse van IFN signaal transductie ‘pathways’ onthulde het bestaan van TRAIL (tumor
necrosis factor [TNF]-related apoptosis-inducing ligand) als een proteïne met potentiële antivirale
activiteit. Deze nieuwe functie van TRAIL werd reeds eerder aangetoond in vivo voor influenza en
encefalomyocarditis virusinfectie. TRAIL promoot specifiek apoptose in cellen na binding aan zijn
‘death’ receptoren. Warke et al. vermoedt naast een apoptose-afhankelijke DENV inhibitie ook een
apoptose-onafhankelijke functie van TRAIL. De DENV studie gaf weer dat het virus in staat is de
expressie van TRAIL te induceren in imuuncellen via de IFN-α signaal transductie pathway. Men stelt
een mogelijk werkingsmechanisme voor, maar verder onderzoek zal dit moeten uitwijzen. De
hypothese bestaat erin dat de antivirale werking het resultaat zou zijn van een verhoogde expressie
van gekende of nieuwe antivirale cellulaire proteïnen, die vervolgens gesecreteerd worden [80].
2.8.3.3 Andere
Het mycofenolzuur (MPA) is, in tegenstelling tot RBV, een competitieve niet-nucleoside inhibitor van
het IMP dehydrogenase en bevordert eveneens depletie van de GTP-voorraad. Het MPA voorkomt de
replicatie van zowel positieve als negatieve strengs RNA-virussen. Klinische applicatie van MPA
bestaat erin de afstoting van getransplanteerde organen tegen te gaan. Het MPA als
immuunsuppressief agens ligt bij concentraties ver boven de DENV-inhiberende concentraties [77].
ZX-2401 (2-amino-8-(β-D-ribofuranosyl) imidazo [1,2-a]-striazine-4-one of 5-aza-7-deazaguanosine),
een nucleoside analoog met een breedspectrum antivirale activiteit, inhibeert in vitro de replicatie van
minstents vijf virussen van de Flaviviridae familie (o.a. het GKV, DENV en WNV). De activiteit tegen
het DENV blijkt sterker te zijn dan RBV, alsook minder toxisch. Verder onderzoek moet aantonen
welke de verschillen en gelijkenissen zijn in het werkingsmechanisme van ZX-2401 en RBV [81].
Literatuurstudie 21
Het triazine nucleoside, 6-azauridine, interfereert met het metabolisme van de cel, in het bijzonder
de vorming van nucleïnezuren. Na een intracellulaire fosforylatie van 6-azauridine tot zijn 5’-
monofosfaat vorm, grijpt het in op het orotidine monofosfaat decarboxylase dat verantwoordelijk is
voor de biosynthese van pyrimidines. Dit molecule zal echter niet enkel de virale replicatie inhiberen,
maar ook een cytostatisch effect uitoefenen. Het nucleoside analoog, pyrazofurine, zou eenzelfde
antivirale activiteit bezitten [50, 82].
In vele signaal transductie ‘pathways’ staat fosforylatie van proteïnen door kinasen centraal. Dit
laat toe biochemische signalen door te geven, zoals celoverleving en het ontwijken van het
immuunsysteem. Ook virale proteïnen, o.a. het DENV NS5-proteïne, worden gefosforyleerd. Hierdoor
veronderstelt men dat kinase-inhibitoren een invloed hebben op DENV-replicatie. In DENV-infecties
blijken kinsases van de Src-familie belangrijk te zijn. Dasatinib is geïdentificeerd als een niet-
selectieve Src-familie kinase-inhibitor die de assemblage van virus partikels verhindert. Voorts wordt
AZD0530 uit diezelfde familie geclassificeerd als een selectieve kinase inhibitor [83].
Verder blijken deoxynojirimycine (een iminosuiker) en castanospermine (een natuurlijk alkaloïde)
een remmend effect te hebben op de DENV-replicatie. Beiden zijn α-glucosidase inhibitoren van het
ER die de vouwing van de prM-, E- en NS1- glycoproteïnen belemmeren door de posttranslationele
modificatie met mannose-rijke suikers te remmen. Niet-correcte vouwing werkt de secretie van de
proteïnen achteraf tegen en resulteert in een reductie van de virale infectiviteit in vitro voor alle DENV-
serotypes. Alsook blijken deoxynojirimycine en castanospermine de overleving van DENV-2
geïnfecteerde muizen te verbeteren. Het GKV en het WNV, daarentegen, zijn meer resistent voor de
effecten van castanospermine [84, 85].
2.9 Diermodellen
Voor het testen van antivirale therapeutica en vaccins is het van belang te beschikken over een
adequaat diermodel die relevantie vertoont met het humane ziektebeeld. Het gebruik van niet-humane
primaten, die gevoelig zijn voor DENV-infecties, omvat Rhesus makaken (Macaca mulatta) en
Cynomolgus apen (Macaca fascicularis). Deze modellen kunnen aangewend worden bij het testen
van potentiële vaccins en antivirale middelen omwille van het genereren van een viremie en
neutraliserende AL [53, 86]. Gezien de hoge kosten, de geringe beschikbaarheid en de ethische
problemen zijn geschikte muismodellen onontbeerlijk [86]. Moeilijkheden omtrent het creëren van
zulke modellen vloeien voort uit de moeizame DENV-replicatie in de muis en de vroege letaliteit als
gevolg van paralyse (het dominante klinische fenotype na een DENV-infectie) [86]. Bestaande
DENV/muismodellen omvatten intracerebrale infectie van muizen, infectie van muizenhersenen
aangepaste stammen, chimere muizen met getransplanteerde humane cellen (o.a. NOD/SCID-muizen
bezitten geen T- of B-cellen, C5, NK-cellen en APC-functies [87]) en immuun-gecompromitteerde
muizen (o.a. A/J muizen bezitten complement C5 deficiëntie) [86]. Inoculatie (i.p.) van AG129-muizen
(deficiënte IFN-α/β en IFN-γ receptoren) met D2S10 (een virulentere DENV-stam) resulteert in muizen
met verhoogde vasculaire permeabiliteit en TNF-α concentraties. Deze muizen vertonen geen vroege
letaliteit als gevolg van paralyse en kunnen gebruikt worden voor meer relevant onderzoek naar
DHK/DSS [88].
Materiaal en Methoden 22
3.1 Materiaal en Methoden
3.1.1 Materiaal
3.1.1.1 Cellen en virus
De experimenten werden uitgevoerd op continue cellijnen van ‘African Green Monkey’ epitheliale
niercellen [Vero-B cellen, ‘American Type Culture Collection’ (ATCC) CCL-81], ‘African Green
Monkey’ niercellen [Vero cellen, ‘European Collection of Cell Cultures (ECACC), 84113001], ‘Baby
Hamster Kidney’ cellen (BHK-21; ATCC CCL10) en C6/36 cellen (muggencellen afkomstig van Ae.
albopictus, ATCC CRL-1660). Virussen gebruikt voor infectie van bovenstaande cellijnen, zijn (i) het
dengue virus serotype 2, Nieuw-guinea C stam (DENV-2 NGC, ter beschikking gesteld door Dr. V.
Deubel) gekweekt in Vero cellen of C6/36 cellen, (ii) het gele koorts virus 17D vaccin stam [Stamaril,
Aventis Pasteur (MSD, Brussel, België)] opgekweekt in Vero cellen, (iii) het Modoc virus (MODV) stam
M544 (ATCC VR415) gekweekt in BHK-21 cellen en (iv) het MOD/GK17D chimeer virus gekweekt in
Vero cellen (Charlier N et al., 2004).
3.1.1.2 Media en oplossingen
� Groeimedium Vero cellen: 10% FCS/MEM
Minimum Essential Medium (MEM)-Rega3 (Invitrogen, Merelbeke, België) werd aangevuld met 10%
geïnactiveerd foetaal kalfserum (FCS; Integro, Zaandam, Nederland), 2 mM L-glutamine (Invitrogen)
en 0,075% natriumbicarbonaat (Invitrogen).
� Assay medium voor Vero cellen: 2% FCS/MEM
MEM-Rega3 werd aangevuld met 2% FCS, 2 mM L-glutamine en 0,075% natriumbicarbonaat.
� Groeimedium BHK-21 cellen: 10% FCS/DMEM
Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM; invitrogen) werd aangevuld met 10% FCS, 2 mM L-
glutamine en 0,075% ml natriumbicarbonaat.
� Assay medium BHK-21 cellen: 2% FCS/DMEM
Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM; invitrogen) werd aangevuld met 2% FCS, 2 mM L-
glutamine en 0,075% ml natriumbicarbonaat.
� Groeimedium C6/36 cellen: 8% FCS/MEM
MEM-Rega3 werd aangevuld met 8% FCS, 2 mM L-glutamine, 0,01 M HEPES buffer (invitrogen), 1x
niet-essentiële aminozuren (Invitrogen) en penicilline (100 U/ml) / streptomycine (100 µg/ml) oplossing
(Invitrogen).
Hoofdstuk 3 Experimenteel werk
Materiaal en Methoden 23
� 2x MEM
100 ml 10x MEM (Invitrogen) werd gemengd met 400 ml steriel H20, 20 ml FCS, 10 ml l-glutamine en
10 ml natriumbicarbonaat.
� 1% Avicel-oplossing
Na afwegen van 1 g Avicel RC/CL (FMC BioPolymer, Brussel, België) werd 100 ml steriel dH2O
toegevoegd en opgemengd tot een homogene vloeistof voor ongeveer twee uur en vervolgens
geautoclaveerd voor 20 minuten op 120°C.
3.1.1.3 Antivirale moleculen
Moleculen CHI104 en CHI105 (de structuren kunnen hier omwille van intellectuele eigendomsrechten
niet worden getoond), werden ter beschikking gesteld door Prof. Dr. Alba Chimirri (Universiteit van
Messina, Italië). RBV werd aangekocht bij ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, Californië) en vormt de
positieve controle in de verschillende assays. De antivirale moleculen werden afgewogen en opgelost
in dimethylsulfoxide (DMSO) tot stockoplossingen van 20 mg/ml en 10 mg/ml voor RBV en CHI104-
CHI105, respectievelijk. De moleculen werden bewaard bij 4°C, CHI104 bij kamertemperatuur omwille
van relatieve instabiliteit.
3.1.2 Methoden
3.1.2.1 Subcultiveren van cellen
Vero cellen werden opgegroeid in 75 cm2 cultuurflessen met filter (Micron Séparation Europe, Braine-
l'Alleud) bevattende 20 ml 10% FCS/MEM geïncubeerd bij 37°C, 5% CO 2 en 99% relatieve
luchtvochtigheid (incubator CB 210, BINDER GmbH, Tuttlingen, Duitsland). Wanneer de cellen als
een confluente monolaag liggen, werden ze doorgezet door het groeimedium te verwijderen en de
cellen te wassen met 5 ml PBS (BioWhittaker, Verviers, België). Na het afzuigen van de PBS werd 3
ml trypsine-EDTA (0.05%, 1x, GIBCO, Invitrogen, Paisley, Verenigd Koninkrijk) toegevoegd, gevolgd
door een aantal minuten incubatie. De losgekomen cellen werden geresuspendeerd in 3 ml 10%
FCS/MEM. Vervolgens werd de celsuspensie 6 minuten gecentrifugeerd bij 1.100 rpm en werd het
supernatans verwijderd. De pellet werd geresuspendeerd in 1ml 10% FCS/MEM, waarna 200 µl (1:5)
werd overgebracht in een nieuwe 75 cm2 cultuurfles met 20 ml 10% FCS/MEM en geïncubeerd bij
37°C en 5% CO 2. Dezelfde procedure werd aangewend voor het subcultiveren van BHK-21 cellen,
uitgevoerd met 10% FCS/DMEM. Wanneer een celsuspensie noodzakelijk was voor verdere
experimenten, werd de pellet geresuspendeerd in 1 ml assay medium. Om het gewenste aantal cellen
per well in de microtiterplaten te verkrijgen, werd de celtelling uitgevoerd met behulp van een Z1
Coulter Particle Counter (Beckman Coulter TM, Analis, Gent, België).
3.1.2.2 Virusstock
DENV-2 NGC werd gekweekt in muggencellen en Vero cellen. Het DENV repliceert beter in C3/36
cellen, maar is niet in staat om plaques te vormen. Hiervoor zijn enkele passages in Vero cellen
vereist. C6/36 cellen werden 1:3 doorgezet in 75 cm2 cultuurflessen (EasY flask, Nunclon™∆) en de
Materiaal en Methoden 24
Figuur 11 | Een diagonale virustitratie. Een diagonale virusverdunning over een 96-well plaat werd bekomen door het virus
horizontaal (1:2) en verticaal (1:5) te verdunnen. De optimale virusverdunning in verdere assay werd bepaald door het
gemiddelde te berekenen van de virusverdunningen in de wells met minstens 75% CPE.
volgende dag geïnfecteerd met 0,5 – 1 ml virus in 15 ml 8% FCS/MEM. Eén cultuurfles werd niet
geïnfecteerd en bewaard als negatieve controle. Na incubatie gedurende 1 à 2 uur bij 28°C in
afwezigheid van CO2, werd het medium afgezogen en vervangen door 15 ml MEM 8 % FCS. De
cultuurflessen werden uit de incubator gehaald en het virus geoogst wanneer een volledig
cytopathogeen effect (CPE) werd waargenomen (meestal rond de 7 dagen p.i.). Met behulp van een
schrapertje werden alle cellen in het medium gecollecteerd en gecentrifugeerd gedurende 10 – 15
minuten bij 2.000 rpm. Het supernatans (vrij van celdebris) werd gealiquoteerd, verder verdeeld over
cryotubes en bewaard bij -80°C. Op identieke wijze werd de infectie van Vero cellen met het DENV-2
NGC en het GKV 17D uitgevoerd in 2% FCS/MEM in cultuurflessen met filter, geïncubeerd bij 37°C,
5% CO2.
3.1.2.3 Virustitratie
Op basis van het CPE laat een diagonale virustitratie toe de virusverdunning te bepalen die optimaal
is voor het gebruik in verdere assays. Hiervoor werd in een 96-well microtiterplaat (Becton Dickinson,
Franklin Lakes, USA voor GKV 17D of tissue culture-treated white view plate, Perkin-Elmer, Boston,
Massachusetts, USA voor DENV-2, NGC) 100 µl/well 2% FCS/MEM aangebracht, met uitzondering
van de wells op de eerste rij (well B2-B10) waar 125 µl 2% FCS/MEM werd aangebracht. In de
allereerste well werd 125 µl virusstock toegevoegd en horizontaal verdund door een 1:2
virusverdunning aan te houden (125 µl werd overgebracht van well B2-B10). Vervolgens werd een
verticale 1:5 verdunning bekomen door 25 µl over te brengen van rij tot rij. Eén kolom werd
vrijgehouden voor de celcontrole. Na toevoegen van nog 100 µl celsuspensie in elke wells (doorgaans
6.000 cellen/well voor het DENV en 20.000 cellen/well voor het GKV) werden de platen geïncubeerd
bij 37°C, 5% CO 2. Het CPE werd microscopisch opgevolgd totdat in elke well (met bepaalde
virusverdunning, zie Figuur 11) CPE waarneembaar was en volledig CPE te detecteren was bij een
welbepaalde dilutie (meestal na 7 dagen). De platen werden vervolgens afgelezen met ATPlite
(ingeval van DENV, zie paragraaf 3.1.2.7) en MTS (ingeval van GKV, zie paragraaf 3.1.2.6). Op basis
van het berekende percentage CPE van de virusverdunningen kon de optimale assay virusverdunning
bepaald worden. Analyse in Microsoft Excel: %CPE = 100 - (Wvirusdilutie – Wkleinste virusdilutie)/( Wgemiddelde CC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 CC
C 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120
D 100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600
E 500 1000 2000 4000 8000 16000 32000 64000 128000
F 2500 5000 10000 20000 40000 80000 160000 320000 640000
G 12500 25000 50000 100000 200000 400000 800000 1600000 3200000
H
Materiaal en Methoden 25
– Wkleinste virusdilutie)*100, met W de waarde bekomen na uitlezen van de platen. De optimale
virusverdunning werd berekend door het gemiddelde van de virusverdunningen te nemen waar
minstens 75% CPE bereikt werd. Deze waarde is de hoogste virusverdunning waar CPE doorkomt,
aanvaardbaar voor verder gebruik in de daarop volgende experimenten.
3.1.2.4 Plaque assay
Plaque assays werden uitgevoerd om het virustiter te kunnen determineren. Het bepaalt de
mogelijkheid van een virusstock om één cel te infecteren, daarin te repliceren en naburige cellen te
infecteren. Dit geeft aanleiding tot het vormen van plaques. De maat voor infectieuze viruspartikels
kan uitgedrukt worden in PFU/ml (plaque forming unit/ml). Eén dag voorafgaand aan het experiment
werden 6-well microtiterplaten (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) met Vero cellen (ongeveer
500.000 cellen/well) aangelegd. De dag van het experiment werd het groeimedium afgezogen en 2 ml
van de virusverdunningen (in 2% FCS/MEM) aan de wells toegevoegd. Na 1 à 2 uur incubatie werd
het inoculum verwijderd en het niet-geabsorbeerde virus drie keer weggewassen met 2 ml assay
medium. Een homogene oplossing van 1% avicel-oplossing (goed schudden voor gebruik) werd in
dezelfde hoeveelheid (1:1) in 2x MEM toegevoegd, waarna 3 ml van deze warme Avicel-MEM
oplossing per well werd aangebracht. De 6-well platen werden vervolgens in de incubator geplaatst
gedurende 7 dagen. Dan werd de Avicel-MEM oplossing voorzichtig verwijderd en de cellen met 2 ml
PBS gewassen. De cellen werden gefixeerd met 1,5 ml 70% ethanol gedurende minstens 10 minuten.
Na het drogen van de platen werden de levende cellen gekleurd met 1 ml 1% methyleenblauw.
Ongeveer een 10-15 minuten later werd de kleurstof verwijderd door middel van H2O en de platen
minstens één uur aan de lucht gedroogd. Na het tellen van het aantal gevormde plaques in de
verschillende virusverdunningen kan het virustiter berekend (PFU/ml = aantal plaques*
verdunningsfactor/ aantal ml virusoplossing toegevoegd).
3.1.2.5 Antivirale en cytotoxische assay
De antivirale activiteit van moleculen, als percentage inhibitie van het virus-geïnduceerde CPE, kan
bepaald worden aan de hand van een antivirale assay en de activiteit verder vergeleken worden op
basis van de EC50. Deze waarde stelt de concentratie voor waar 50% activiteit (% inhibitie t.o.v.
viruscontrole) bereikt wordt. Uit een cytotoxische assay kan een CC50 waarde (de concentratie waarbij
50% cytotoxiciteit optreedt) berekend worden om de toxiciteit van antivirale moleculen, uitgeoefend op
de cellen, te omschrijven.
Het protocol van de DENV assays maakte gebruik van één dag vooraf uitgezaaide cellen in een 96-
well microtiterplaat met meer bepaald 6.000 cellen/well. Alle antivirale assays werden afgelezen
m.b.v. de ATPlite-methode (zie paragraaf 3.1.2.7) nadat het CPE visueel werd goedgekeurd. De
luminescentie-gebaseerde assays werden telkens uitgevoerd in witte platen met een doorschijnende
bodem (tissue culture-treated white view plate). Daarentegen werden de DENV cytotoxische assays
geanalyseerd via de MTS-methode (zie paragraaf 3.1.2.6) en hierom uitgevoerd in een
doorschijnende plaat (Becton Dickinson).
Materiaal en Methoden 26
GKV assays, zowel antivirale als cytotoxische, maakten gebruik van één dag vooraf uitgezaaide
cellen, meer bepaald 20.000 cellen/well in een 96-well plaat (Becton Dickinson). Nadat het CPE
microscopisch werd goedgekeurd, werden de platen afgelezen met MTS.
3.1.2.5.1 Manuele assay
In een 96-well plaat met 100 µl virussuspensie in 2% FCS/MEM (optimale virusverdunning uit
virustitratie) werden antivirale moleculen 1:2 horizontaal verdund (concentratie van 0,04 - 10µg/ml of
µM voor CHI104 - CHI105 respectievelijk), rekening houdend met de finale concentratie die moest
bekomen worden. De laatste kolom werd voorbehouden aan celcontroles en viruscontroles (Figuur
12). Vervolgens werd 100 µl assay medium of celsuspensie toegevoegd. De antivirale assay platen
werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO 2 en het CPE microscopisch opgevolgd. Wanneer de
viruscontroles nagenoeg 100% CPE vertoonde werden de assay platen afgelezen met MTS (zie
paragraaf 3.1.2.6) of platen ATPlite (zie paragraaf 3.1.2.7). Vervolgens werden de data verwerkt zodat
de antivirale activiteit van de moleculen berekend werden, uitgedrukt als EC50 waarden. Hiervoor werd
het bekomen signaal omgerekend tot een percentage CPE: %CPE = 100-((W - WVC)/(WCC –
WVC)*100) met W: signaal gemeten van virus geïnfecteerde cellen behandeld met een welbepaalde
concentratie van een antivirale molecule, WVC: signaal gemeten van het gemiddelde van de
viruscontroles en WCC: signaal van het gemiddelde van de celcontroles. Logaritmische interpolatie laat
toe hieruit een EC50 waarde te berekenen (Microsoft Excel). Het percentage cel protectie (inhibitie)
kan berekend worden als 100 - %CPE.
Naast een antivirale assay werd steeds een cytotoxiciteit assay parallel ingezet, deze assay verloopt
identiek, maar de virusoplossing werd vervangen door assaymedium. Daarom wordt de laatste kolom
van de plaat voorbehouden aan een reeks celcontroles. Wanneer de overeenkomstige antivirale
platen volledige CPE vertoonden (meestal 7 dagen voor GKV of 8 dagen voor DENV), werden de
metabool actieve cellen gedetermineerd met MTS (zie paragraaf 3.1.2.6). De bekomen optische
densiteit (OD) werd omgerekend tot een percentage CPE (%CPE = OD/ODCC*100, met OD: OD van
de cellen behandeld met een welbepaalde concentratie van een antivirale molecule, ODCC: OD van
het gemiddelde van de celcontroles). Door middel van een logaritmische interpolatie werd hieruit een
CC50 waarde berekend (Microsoft Excel).
Figuur 12 | Manuele antivirale assay. In een 96-
well plaat, bevattende een welbepaalde
hoeveelheid cellen en virus, werden 9 horizontale
verdunning (1:2) van maximaal 6 moleculen
(cps1-5 met RBV) verricht. De laatste kolom werd
voorbehouden aan de CC (enkel cellen) en de VC
(zowel virus als cellen). Een cytotoxiciteit assay
werd op dezelfde manier opgesteld, met het
verschil dat er geen virus werd toegevoegd,
waardoor de laatste kolom volledig aan CC werd
voorbehouden.
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
µg/ml 10 5 2,5 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04
VC
CC Cps1
Cps4
Cps3
Cps2
RBV
Cps5
Materiaal en Methoden 27
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Cps1
Cps4
Cps3
Cps2
µg/ml 50 10 2 0,4
Cps6
Cps5
VC CC
RBV
Cps11
Cps9
Cps10
Cps8
Cps7
Figuur 13 | Semi-automatische antivirale
assay. In een 96-well plaat, bevattende een
welbepaalde hoeveelheid cellen en virus, werden
4 horizontale verdunning (1:5) van maximaal 12
moleculen (cps1-11 met RBV) verricht. De zesde
kolom werd voorbehouden aan de VC (zowel
virus als cellen) en de laatste kolom bevat de CC
(enkel cellen). Parallel werd op identieke wijze
cytotoxiciteit assays opgesteld, waar geen virus
werd toegevoegd.
3.1.2.5.2 Semi-automatische assay
De evaluatie van een aanzienlijk aantal chemische moleculen, teneinde hun antivirale activiteit en
cytotoxiciteit te bepalen, werd geautomatiseerd door antivirale en cytotoxiciteit assays in te zetten met
behulp van een geïnformatiseerd platform (Freedom EVO®, tecan). Allereerst werd er in elke well van
een 96-well plaat 100 µl 2% FCS/MEM gepipetteerd. Van een 4 mg/ml stockoplossing van de
chemische moleculen werd een 0,5 mg/ml werkoplossing gemaakt (8,57 µl van de stockoplossing
werd in 60 µl 2% FCS/MEM toegevoegd). Hiervan werd 25 µl overgebracht in de eerste well en
vervolgens een 1:5 verdunningen bekomen door 25 µl steeds over te zetten. Vervolgens werd 50 µl
virusoplossing toegevoegd (4x geconcentreerd om de finale virusverdunning te respecteren), gevolgd
door 50 µl celsuspensie of 2% FCS/MEM. Van de maximaal 12 antivirale moleculen op één plaat
werden zo de finale concentraties van 50, 10, 2 en 0,4 µg/ml bekomen. Standaard werden CC en VC
mee inbegrepen, alsook een positieve controle, nl. RBV (Figuur 13). Na een week incubatie bij 37°,
5% CO2 en het bereiken van nagenoeg volledig CPE in de VC, werden de antivirale assays afgelezen
met behulp van MTS of ATPlite (zie paragraaf 3.1.2.6 en 3.1.2.7). De data werden geanalyseerd
gebruik makende van een software programma (Query Editor) tot het bekomen van een EC50 waarde.
Parallel werd op identieke wijze ook cytotoxiciteit assays voor dezelfde moleculen ingezet, enkel werd
de virusoplossing vervangen door 50 µl 2% FCS/MEM. De cytoxiciteit assay werd afgelezen met
behulp van MTS en de resultaten verwerkt tot het bekomen van een CC50 waarde (Query Editor). De
data van beide experimenten werden finaal samen in grafiek gebracht.
3.1.2.6 MTS assay
Het colorimetrisch uitlezen van assay platen met MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-
carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) geeft de cellulaire reductie capaciteit van
het NADH en NADPH weer, geproduceerd door dehydrogenases in de mitochondria. Metabool
actieve cellen zijn in staan om de oplossing van het gele MTS met PMS (phenazine methosulfate) te
reduceren tot het bruine formazan product. Bij verminderde leefbaarheid van de cellen, nl. door
cellulaire toxiciteit/cytostatische activiteit uitgeoefend, daalt de productie van NADH en NADPH en dit
resulteert bijgevolg in een verminderde performantie van de assay. De hoeveelheid bruinkleuring,
aldus de omzetting van MTS, is recht evenredig met het aantal levende cellen in cultuur (Figuur 14).
Materiaal en Methoden 28
Na de platen uit de incubator gehaald te hebben, werd het medium afgezogen en 100 µl 10% MTS
(MTS/PMS; Promega, Leiden, Nederland) stockoplossing in kleurloos medium (1x MEM, Invitrogen)
toegevoegd. Na maximaal 2 uur incubatie bij 37°C, 5 % CO2 werd de absorbantie, uitgedrukt als OD,
spectrofotometrisch bepaald (Safire, Tecan, Mechelen, België) bij een golflengte van 498 nm.
3.1.2.7 ATP detectie assay
ATP is aanwezig in alle metabool actieve cellen, echter de hoeveelheid ATP vermindert sterk als
gevolg van necrose of apoptose. Vandaar dat intracellulair ATP een goede marker blijkt te zijn voor de
leefbaarheid van de cellen. De reactie van ATP in aanwezigheid van een substraatoplossing
(luciferine/luciferase) resulteert in de emissie van licht, waarvan bewezen proportioneel te zijn aan de
aanwezige ATP concentratie.
Reactieschema:
ATP + D-luciferine + O2 oxyluciferine + AMP + PPi + CO2 + licht
ATPliteTM luminescentie ATP detectie assay systeem (ATPlite, PerkinElmer, Massachusetts, USA),
gebaseerd op het vuurvlieg (Photinus pyralis) luciferase, werd aangewend voor het uitlezen van
DENV assays volgens de instructies van de fabrikant. Vermits deze techniek duurder uitkomt in
vergelijking met MTS, reduceerden we de hoeveelheid substraatoplossing tot het toevoegen van 30
µl, zonder de geloofwaardigheid van de resultaten aan te tasten. Kort samengevat, werd 30 µl (i.p.v.
50 µl) cellysis oplossing toegevoegd in 60 µl (i.p.v. 100 µl) suspensie en 5 minuten op de schudder
(700 rpm) geplaatst. Hierdoor werden de cellen gelyseerd en het vrijgekomen ATP gestabiliseerd door
inactivatie van endogene ATPases. Vervolgens werd 30 µl substraatoplossing toegevoegd. Na
nogmaals 5 minuten schudden (700 rmp) werden de platen voor 10 minuten in het donker geplaatst
en de luminescentie vervolgens gekwantificeerd (Safire, Tecan, Mechelen, België).
Luciferase
Mg2+
Figuur 14 | Colorimetrie met MTS/PMS. De reductie van MTS tot zijn formazan product vindt plaats in de mitochondrion van
levende cellen en neemt af in minder metabool actieve cellen. Visueel uit dit zich in de omzetting van een gele kleur, afkomstig
van MTS, naar een bruine kleur, afkomstig van het formazan product (Promega).
MTS Formazan p roduct
LLeevveennddee cceell
MMii ttoocchhoonnddrr iiaalleerreedduucctt iiee
Materiaal en Methoden 29
3.1.2.8 Dengue reporter antivirale assay
Een andere benadering voor het bestuderen van de virale replicatie van het DENV in aanwezigheid
van een molecule, omvat het gebruik van een reporter virus. Het gebruikte dengue reporter virus is
een infectieus ‘full-length’ DENV construct, zoals eerder vermeld in Mondotte et al., 2007 [89]. Hierbij
werd een Renilla luciferase expressie cassette, waarvan de translatie onder controle staat van een
EMCV ‘Internal ribosomal entry site’ (IRES), upstream van het 3’ UTR geïntegreerd (Figuur 15).
Na toevoegen van coelenterazine (het substraat) geeft het gegenereerde bioluminescentie signaal de
Renilla luciferase activiteit weer en reflecteert het dusdanig de hoeveelheid reporter virus aanwezig in
de cellen (Figuur 16). Het Renilla Luciferase assay systeem is een geschikte alternatief aan het
vuurvlieg (Photinus pyralis) luciferase systeem (ATPlite).
Eén dag voorafgaand aan het experiment werden BHK-21 cellen (10.000 cellen/well) uitgezaaid in
een tissue culture-treated white view 96-well plaat. De volgende dag werden de cellen geïnfecteerd
met 2 x 105 PFU/well van het dengue reporter virus in afwezigheid en aanwezigheid van 0,1 – 1 – 10
µg/ml CHI104. Het virusinoculum werd na één uur verwijderd en drie keer gewassen met PBS. Na 8,
24, 48 en 72 uur p.i. werd de luciferase activiteit gemeten (Safire) gebruik makende van het Renilla
Luciferase Assay Systeem (Promega) volgens de instructies van de fabrikant. Het cytotoxisch effect
van deze moleculen werd parallel geëvalueerd in een 96-well microtiterplaat (Becton Dickinson) door
middel van celtelling.
Figuur 16 | Renilla Luciferase Assay Systeem . De bioluminescentie reactie gekatalyseerd door het Renilla luciferase
(Promega).
5’UTR 3’UTR C prM E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5 Ren
Figuur 15 | Dengue reporter virus. Het DENV construct bevat een Renilla luciferase coderende sequentie dat het 3’ UTR
voorafgaat en waarvan de translatie gecontroleerd wordt door het encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site
(EMCV IRES). Opname van het dengue reporter virus in BHK-21 cellen resulteert in een productieve virale replicatie (bewerkte
Figuur uit [89]).
Materiaal en Methoden 30
3.1.2.9 Virus yield assay
Een virus yield assay meet het effect van een antiviraal molecule op de productie van infectieus virus.
De 50.000 cellen/well werden één dag vooraf uitgezaaid in 96-well microtiterplaten (Becton
Dickinson). De monolaag cellen werd vervolgens geïnfecteerd met 100 µl virusoplossing. Na ongeveer
2 uur incubatie bij 37°C, 5% CO 2 werden de cellen drie keer gewassen met 100 µl 2% FCS/MEM om
het niet-geadsorbeerde virus te verwijderen. Vervolgens werd 100 µl 2% FCS/MEM aangebracht en
een verdunningsreeks (1:2) van de geteste antivirale moleculen (CHI104, CHI105) uitgevoerd door
steeds 100 µl over te zetten en een finale concentratiereeks te bereiken van 10 µg/ml tot 0,4 µg/ml.
Uiteindelijk werd een volume van 200 µl te bekomen door 100 µl 2% FCS/MEM aan elke well toe te
voegen. De microtiterplaten werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO 2 voor 4 dagen. De assay werd in
drievoud ingezet zodat uit elke well met een bepaalde molecule concentratie 50 µl supernatans werd
gecollecteerd en vervolgens gepoold. Het celdebris werd verwijderd door gedurende één minuut te
centrifugeren bij 2.400 rpm en het 150 µl supernatans (bevattende de infectieuze viruspartikels) te
bewaren voor RNA extractie (-80°C). Het geïsoleerde RNA werd bekomen met behulp van de
‘NucleoSpin® RNA Virus kit’ (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) volgens de instructies van de
fabrikant. Na 7 dagen p.i. werd nogmaals 300 µl supernatans bewaard bij –80°C, om vervolgens een
plaque assay mee uit te voeren (zie paragraaf 3.1.2.4).
3.1.2.10 ‘Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction’ (RT-qPCR)
Real-time PCR (polymerase-kettingreactie) is een techniek die toelaat het RNA te kwantificeren in een
staal. De methode maakt gebruik van een Taq polymerase (bevat naast een polymerase activiteit ook
een 5’-3’ exonuclease activiteit) en een TaqMan probe (fluorofoor gelabelde oligonucleotide probe
welke een fluorescent signaal uitzendt na klieving). De TaqMan probe bindt een specifieke
doelwitsequentie in het DENV genoom tussen de twee gekozen primers (Tabel 1) en wordt gekliefd
tijdens de elongatiefase door het Taq polymerase. De gekliefde TaqMan probe (quencher wordt
ontkoppeld van het reporter molecule) resulteert in de emissie van fluorescent signaal dat direct
gerelateerd kan worden met een verhoogde amplificatie van de specifieke doelwitsequentie. De
kwantificatie is mogelijk doordat de Ct-waarden (het aantal cycli nodig waar het fluorescent signaal
een gekozen drempelwaarde overschrijdt) bepaald worden tijdens de exponentiële fase van de PCR.
Eén-staps RT-qPCR werd uitgevoerd in een totaalvolume van 25 µl bevattende 6,25 µl One-step
Reverse Transcriptase qPCR MasterMix (Eurogentec, Seraing, België), 13,94 DNase/RNase-vrij
water (ACROS Organics, Geel, België), 0,375 µl ‘forward’ primer (900 nM finale concentratie), 0,375 µl
‘reverse’ primer (900 nM finale concentratie), 1 µl TaqMan probe (200 nM finale concentratie), 0,0625
µl ‘Reverse’ Transriptase en 3 µl RNA staal (staal met ongekende hoeveelheid RNA, standaard of
negatieve test controle). De reactie werd verricht door ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied
Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA) met volgend “thermocycling” profiel: 30 min bij 48°C, 10
min bij 95°C, 45 cycli van 15 sec bij 95°C en 1 min bij 60°C.
Materiaal en Methoden 31
3.1.2.11 DENV replicon assay
Het DENV replicon systeem bestaat uit een artificieel geconstrueerde celcultuur, waarbij een
subgenomisch replicon (een autonoom replicerend vRNA) stabiel getransfecteerd werd in BHK-21
cellen. In het replicon werden de structurele genen van het DENV verwijderd, zodat het vormen van
infectieuze viruspartikels uitgesloten is.
BHK-21 cellen werden getransfecteerd met een subgenomisch dengue replicon [afgeleid van
dengue replicon construct (Jones et al., 2005)], waarin een antibiotica selectie cassette (coderend
voor een antibiotica resistentie gen: puromycine N-acetyltransferase, PAC) samen met een vuurvlieg
(Photinus pyralis) luciferase expressie cassette. De positie van het LUC-gen wordt niet vrijgegeven
vanwege intellectuele eigendomsrechten. Deze cellen, BHK-Rep-Pac-LUC cellen, werden
gecultiveerd in 10% FCS/DMEM in aanwezigheid van 3,3 µg/ml puromycine (Sigma-Aldrich, Bornem,
België). Het antibiotica puromycine is een positieve selectie merker, vermits enkel cellen die het PAC
bevatten, bijgevolg het replicon, overleven.
De BHK-Rep-Pac-LUC cellen werden één dag voorafgaand aan het experiment uitgezaaid (10.000
cellen/well) in een tissue culture-treated white view 96-well plaat. De volgende dag werd het medium
vervangen door 100 µl 10% FCS/DMEM met 0.1, 0.5, 1, 5, 10 en 20 µg/ml CHI104. Na 72 uur p.i.
werd de luciferase activiteit gemeten (Safire) gebruik makende van Luciferase Assay Systeem
volgens de instructies van de fabrikant (Promega). De hieruit bekomen resultaten werden vergeleken
met de onbehandelde replicon cellen (RC). Het cytotoxisch effect van deze moleculen werd parallel
geëvalueerd in een 96-well microtiterplaat (Becton Dickinson) door middel van celtelling.
Virus Primer/Probe Sequentie (5' → 3') Positie t.h.v.
NS3
Forward TCGGAGCCGGAGTTTACAAA 4628 – 4647
Reverse TCTTAACGTCCGCCCATGAT 4722 – 4741 DENV-2
NGC
Probe FAM-ATTCCACACAATGTGGCAT-MGB 4656 – 4674
Forward TGGCATATTCCAGTCAACCTTCT 4645 – 4667
Reverse GAAGCCCAAGATGGAATCAACT 4767 – 4788
GKV 17D en
MOD/GK17D
Chimeer virus Probe FAM-TTCCACAATGTGGCATG-MGB 4712 – 4739
Forward TTGGAGAAAGCAAGTTGGAATA 4587 – 4607
Reverse CTCACTCGCAGAGCACTTCCT 4657 – 4677 MODV
M544
Probe FAM-CCTCAAGGAAGGAGTGTT-MGB 4615 – 4632
De nucleotide sequentie en de positie van de primers en probes in het genoom werden afgeleid van de nucleotide
sequentie van het NS3 proteïne in het DENV-2 Nieuw-guinea C stam (GenBank accession: M29095), GKV 17D
(GenBank accession no. X03700), MODV M544 (GenBank accession no. NC003635) en MOD/GK17D chimeer virus
(Charlier et al., 2007). Aan het 5’ uiteinde van de probe is 6-carboxyfluorescein (FAM) de reporter molecule, aan het 3’
uiteinde is ‘minor groove binder’ (MGB) de quencher.
Tabel 1| Primers en probes gebruikt voor RT -qPCR.
Materiaal en Methoden 32
3.1.2.12 ‘Time-of-addition’ assay
3.1.2.12.1 GKV
Een antiviraal molecule kan inwerken op iedere fase van de virale replicatiecyclus. Om te achterhalen
op welk ogenblik het antiviraal molecule de replicatiecyclus van het virus verstoort, kan een ‘time-of-
addition’ (TOA) assay uitgevoerd worden. De TOA omvat het toevoegen van het antiviraal molecule
op verschillende tijdstippen, waarna (24 hr p.i.) het vRNA gekwantificeerd werd, zowel intracellulair als
extracellulair door middel van RNA isolatie gevolgd door een RT-qPCR (Figuur 17). Het percentage
inhibitie werd berekend t.o.v. de VC.
Eén dag voor infectie werden 5 x 105 Vero-B cellen uitgezaaid in een 12-well plaat (Becton
Dickinson, Franklin Lakes, USA). De cellen werden één uur geïnfecteerd met het GKV aan een MOI =
5. Vervolgens werd het virus 3 à 4 keer weggewassen met 2% FCS/MEM, waarna voor zeer korte tijd
(< 2 min) citraat buffer [20 mM citraatzuur, 10mM KCl en 135 mM NaCl, (pH = 3)] werd toegevoegd
zodat al het niet opgenomen virus gedissocieerd werd. Na nogmaals 3 à 4 keer wassen met 2%
FCS/MEM werd 1ml assay medium toegevoegd. Op tijdstip 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 en 18 hr p.i.
werd het antiviraal molecule CHI104 toegevoegd aan het medium aan een concentratie van 10 mg/ml
(zeker actief aan die concentratie en niet toxisch). Na 24 hr p.i. werd 150 µl virusinoculum en 1,5 x
105 gecollecteerd. Uit elk virusinoculum werd het viraal RNA geïsoleerd met ‘NucleoSpin® RNA Virus
kit’ (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant en het vRNA
gekwantificeerd door RT-qPCR (zie paragraaf 3.1.2.10). Daarnaast werden de gecollecteerde cellen
kort afgedraaid bij 13000 rpm (centrifuge Thermo Electron Corporation), waarna 350 µl RTL lysis
buffer werd toegevoegd om het vRNA te isoleren met ‘RNeasy Mini Kit’ (Qiagen) en te kwantificeren
met RT-qPCR (zie paragraaf 3.1.2.12).
150 µl virusinoculum (voor extracellulaire vRNA meting)
1,5 x 105 cellen (voor intracellulaire vRNA meting)
Figuur 17 | GKV time -of-addition assay. De cellen werden één uur onderheven aan het GKV 17D en op verschillende
tijdstippen (T) werd 10 mg/ml van CHI104 toegevoegd aan het medium. Na 24u p.i. werden het supernatans en de cellen
gecollecteerd. Uit alle stalen werd vRNA geïsoleerd en gekwantificeerd.
CHI104 T=0
CHI104 T=2
CHI104 T=4
CHI104 T=6
CHI104 T=16
CHI104 T=18
VC
CHI104 T=8
CHI104 T=10
CHI104 T=12
CHI104 T=14
Materiaal en Methoden 33
3.1.2.12.2 DENV
Om te achterhalen of de anti-DENV activiteit van een molecule eerder vroeg of laat tijdens de
replicatiecyclus optreedt, werd een TOA assay uitgevoerd met het dengue reporter virus. De
procedure verloopt eenvoudiger dan de TOA assay van GKV. Eén dag voor de infectie werden 2 x 105
BHK-21 cellen uitgezaaid in een 96-well plaat (white view plate). De cellen werden één uur
geïnfecteerd met het dengue reporter virus aan een MOI = 1 (overeenkomstig met 2 x 105 PFU/well).
Vervolgens werd het virus 4 keer weggewassen en 100 µl 2% FCS/DMEM toegevoegd. Op tijdstippen
0, 2, 4, 6, 8, 10 en 12 werd 5 µg/ml of 10 µg/ml CHI104 toegevoegd, uitgezonderd in de VC (zie Figuur
18). Na 24 hr p.i. werd de luminescentie over heel de plaat bepaald (Safire).
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
VC
VC
CHI 104
5 µg/ml
10 µg/ml
5 µg/ml
10 µg/ml
T = 0 2 4 6 8 10 12
T = 0 2 4 6 8 10 12
Figuur 18 | ‘Time -of-addition’ met dengue
reporter virus. Na één uur infectie met het
reporter virus op BHK-21 cellen, werd 5 µg/ml of
10 µg/ml CHI104 op verschillende tijdstippen (T)
toegevoegd, waarna de luminescentie op 24 hr
p.i. bepaald werd.
Resultaten 34
3.2 Resultaten
Een belangrijke initiële stap voor de ontwikkeling van een antiviraal middel tegen het DENV was het
tot stand brengen van een geoptimaliseerde cel-gebaseerde ‘medium-to-high-throughput screening’
assay. Met een dergelijke assay kunnen een aanzienlijk aantal chemische moleculen geëvalueerd
worden op hun antivirale activiteit, waarbij reproduceerbare kwalitatieve gegevens verkregen worden.
Om die reden zijn we gestart in dit onderzoek met het ontwikkelen en verder optimaliseren van een
adequate DENV assay, zodat in een tweede fase, de antivirale activiteit van chemische moleculen
werd geëvalueerd. Na identificatie van inhibitoren volgt een reeks hertesten/validaties, waarna de
interessantste moleculen vervolgens hertest werden. In een derde fase handelt dit onderzoek over de
bevestiging en het verder analyseren van de antivirale activiteit van twee geselecteerde moleculen die
potentiële activiteit vertoonden tegen het DENV en het GKV uit de screening assay.
3.2.1 Optimalisatie van een DENV assay
Aanvankelijk werd beoogd een geoptimaliseerde DENV screening assay uit te werken en te valideren
teneinde betrouwbare, reproduceerbare en kwalitatieve data te bekomen. Belangrijke
aandachtspunten hierbij zijn het selecteren van een geschikte (i) cellijn, (ii) virus, (iii) het aantal
cellen/well en (iv) de afleesmethode. De betrouwbaarheid van de bekomen resultaten uit een
antivirale assay is mede afhankelijk van de kwaliteit van de uitgevoerde assays. Deze onmisbare
parameter werd uitgedrukt als een score: 100-[(CC/VC)*100] met VC de gemiddelde waarde van de
viruscontole, CC de gemiddelde waarde van de celcontrole. Om uit de antivirale testen
representatieve data te bekomen, zou men een score hoger dan 65 moeten bereiken.
3.2.1.1 Optimale testcondities
Al bij al repliceert het DENV relatief inefficiënt in vitro en genereert het virus ondermaats CPE in de
meeste celculturen. Om die reden is het essentieel een cellijn na te streven waarin het opgekweekte
DENV doeltreffend repliceert. Continue muggencellijnen (o.a. C6/36) zijn zeer ontvankelijk voor DENV
infecties, waardoor ze werden gebruikt om het virus tot een hoge titer op te groeien. Echter, deze
cellen zijn niet bruikbaar voor de cel-gebaseerde antivirale assays om de reden dat ze weinig tot geen
CPE vertonen. Het DENV werd voor drie passages opgekweekt hebben in muggencellen (DENV
C6/36 P3), waarna we andere cellijnen infecteerden met dit virus in de hoop voldoende replicatie en
CPE waar te nemen. De cellijnen waarin de replicatie werd onderzocht omvatten de Vero, Vero-B,
Vero E6, Raji DC-SIGN, Huh, Lunet, HepG2, Hek293, BHK-21, cos-7 en werden elk in een 6-well
plaat uitgezaaid aan 500.000 cellen/well, vervolgens geïnfecteerd met het DENV C6/36 P3 aan een
MOI = 0,1 (overeenkomstig met 5 x 104 PFU/ml). Na 4 dagen p.i. werd het vRNA uit het supernatans
gekwantificeerd d.m.v. RNA isolatie gevolgd door een RT-qPCR (Tabel 2). Uit deze Real-time PCR
bleek dat de virale replicatie van het DENV het efficiëntste plaats vond in de Vero cellen, gevolgd door
de Vero-B cellen. Hun lage Ct-waarde wijst op een minder aantal cycli nodig zodat het fluorescent
signaal een gekozen drempelwaarde bereikt, beduidend op een hogere virustiter in het staal.
Resultaten 35
Afgezien van de replicatie is tevens het induceren van het
CPE in de cellijnen van belang. Het verschil in CPE vorming
tussen Vero en Vero-B cellen werd duidelijk na een
diagonale virustitratie van het DENV C6/36 P3 virus op
beide cellijnen (Bijlage I). De Vero cellen vertoonden na 8
dagen p.i. een voortreffelijke CPE vorming over de volledige
96-well plaat. Parallel werd het experiment op Vero-B cellen
ingezet, welke teleurstellende resultaten opleverde in
termen van CPE vorming. We konden op dit ogenblik
concluderen dat het gebruik van Vero cellen ons de
efficiëntste replicatie én CPE vorming verschaft, wanneer ze
geïnfecteerd werden met een virus dat voor een laag aantal
passages in muggencellen werd opgekweekt (DENV C6/36 P3).
De bepaling van het optimaal aantal cellen voor de DENV assays kwam voort uit eerder bekomen
informatie. Hieruit werd besloten 6.000 cellen/well te gebruiken omwille van het analyseren van de
platen m.b.v. de ATPlite-methode (paragraaf 3.1.2.7). De lineariteit tussen de ATP concentratie en het
luminescentie signaal wordt enkel behouden binnen bepaalde limieten. Bijgevolg vereist het protocol
van de assay een weinig aantal cellen, zodat de lineariteit behouden blijft. Nochtans stelt 6.000
cellen/well een relatief weinig aantal cellen voor, waardoor de assay vrij streng wordt. Dit impliceert
dat het cytostatisch effect van een antiviraal middel meer zal doorwegen en kan ook de potentiële
antivirale activiteit lichtjes onderschat worden.
Om de geoptimaliseerde DENV assay (DENV C6/36 P3, 6.000 Vero cellen/well, afgelezen met de
ATPlite-methode) te valideren, werd een antivirale assay met RBV getest (Figuur 19A). Finaal werd
tevens de plaque vorming van het DENV op Vero cellen adequaat bevonden na het uitvoeren van een
plaque assay (Figuur 19B) zoals beschreven in paragraaf 3.1.2.4.
Tabel 2 | RT-qPCR van het DENV C6/36 P3
in verscheidene cellijnen.
Cellijnen Ct-waarde
Vero 27,74
Vero-B 29,53
Vero E6 30,28
Raji DCS 30,3
Huh 32,21
Lunet 34,27
HepG2 38,32
Hek293 38,58
BHK-21 38,83
Cos-7 38,86
A B
Figuur 19 | Optimalisatie van DENV assa ys. (A) Validatie van de optimale condities voor een DENV screening assay blijkt uit
de antivirale assay met RBV als positieve controle (CC50 > 50, EC50 =24,6 ± 3,8). (B) Voortreffelijke plaques worden gevormd
met het DENV (virusverdunning 10, 50, 250, 1250, 6250 en 31250 voudig).
10x 50x 250x
1250x 6250x 31250x
Resultaten 36
3.2.1.2 MTS- versus ATPlite-methode
De kwaliteit van de bekomen resultaten hangt eveneens af van de afleesmethode die gehanteerd
wordt, welke snel, efficiënt en betrouwbaar zou moeten zijn. Om het percentage CPE, bijgevolg de
leefbaarheid van de cellen in aanwezigheid van virus, correct te kunnen scoren is een adequate
techniek vereist. De MTS-methode, afhankelijk van de metabole activiteit van cellen, wordt hiervoor
regelmatig gebruikt. Visueel wordt waargenomen dat het MTS (geel gekleurd) minder gereduceerd
wordt tot het formazan product (bruin gekleurd) naarmate de cellen meer zijn aangetast door het virus
(hoger % CPE aanwezig). Indien we deze colorimetrische methode hanteerden voor de bepaling van
het % CPE in de DENV antivirale assays, bleek de MTS-analyse meermaals twijfelachtige data te
verstrekken in vergelijking met het visueel gescoorde DENV-geïnduceerde CPE. De onderliggende
reden voor deze onenigheid ontleent zich aan de aanwezigheid van celdebris (als gevolg van CPE) en
door een resterend aantal levende cellen vanwege onvolledige CPE vorming. Dit produceert een hoog
achtergrond signaal (ruis). Omwille van de ruis zal bij een MTS geanalyseerde DENV assays de OD
waarde in de VC wells relatief hoog liggen. Deze zal nu dichter aanleunen bij de waarde van de CC,
bijgevolg daalt de kwaliteit van de assay en worden de data onzekerder. Met andere woorden is de
verhouding tussen het signaal en de ruis (S/R ratio) sterk verlaagd, waardoor het venster waarin men
het antiviraal effect wil meten desgelijks wordt verkleind (Figuur 20A). De accuraatheid van de
berekende EC50 en CC50 waarde zal op een systeem dat veel ruis meet, ondermaats zijn.
Deze complicatie (lage S/R verhouding) voor het DENV kan doorslaggevend zijn op de
betrouwbaarheid van onze data en spoorde ons daarom aan te zoeken naar een alternatieve
afleesmethode, nl. het luminescentie ATP detectie assay systeem (ATPlite-methode). Om na te gaan
of deze tweede methode kwalitatief de MTS-methode overtreft, werden twee diagonaal titraties in
dezelfde condities ingezet (6.000 Vero cellen/well geïnfecteerd met het DENV C6/36 P3) en het CPE
geanalyseerd met zowel de MTS als het ATP-gebaseerde systeem. De berekende kwaliteit van beide
titraties leverde een score op van 43 na MTS-analyse, in tegenstelling tot een score van 93,
gegenereerd met de ATP-analyse. Bij de laatst genoemde methode is de gemeten storende ruis
Figuur 20 | MTS- versus ATPlite -methode. (A) De MTS-methode genereert een kleine signaal/ruis verhouding (grote ruis),
waardoor het antivirale effect van een molecule moet gescoord worden in een klein venster. (B) De ATPlite-methode geeft na
analyse van het luminescentie signaal een grote signaal/ruis verhouding, bijgevolg kan het antiviraal effect gemeten worden in
een groot venster, waardoor meer kwalitatieve en betrouwbare resultaten gegenereerd kunnen worden.
[ ] 0
Kleine signaal/ruis verhouding
Ruis
Signaal
1 A
[ ] 10
Grote signaal/ruis verhouding
Ruis
Signaal
108 B
Resultaten 37
kleiner, waardoor de S/R verhouding groter is [89]. Bijgevolg zal een merkwaardige verbetering van
kwaliteit onze data minder betwistbaar en meer betrouwbaar maken (Figuur 20B).
Daarbij biedt de ATPlite-methode nog bijkomende voordelen. Deze omvatten (i) het eenvoudig
gebruik, (ii) 10 minuten na het toevoegen van de substraatoplossing kan de luminescentie gemeten
worden, in tegenstelling tot de MTS-methode met een relatief lange incubatie tijd van 1,5 à 2 uur, (iii)
het geproduceerde signaal bevat een halfwaardetijd groter dan 5 uur (dit laat de ononderbroken
verwerking van veelvuldige platen toe), en (iv) de hoge sensitiviteit van het systeem.
Door afwezigheid van de CPE gegenereerde ruis in DENV cytotoxiciteit assays blijven we deze
assays aflezen met MTS. Dit is nog steeds een goedkopere methode en zolang betrouwbare data
bekomen worden blijft dit de primaire optie.
3.2.2 Hit identificatie
Eens de optimale condities vastgelegd en gevalideerd waren, kon een aanzienlijk aantal moleculen
geëvalueerd worden op een snelle en efficiënte manier dankzij de aanwezigheid van een
geautomatiseerd en geïnformatiseerd platform in het laboratorium. Gepreselecteerde moleculen
werden geleverd door het “Center for Drug Design & Discovery” (CD3, KULeuven) en collaborerende
medicinale scheikundigen. Zowel de DENV als de GKV semi-automatische antivirale assays verliepen
zoals beschreven in paragraaf 3.2.1.7. Daarnaast werden eveneens moleculen handmatig gescreend
volgens het protocol van paragraaf 3.2.1.5 en 3.2.1.6. De resulterende EC50 en CC50 waarde, alsook
hun selectiviteitindex (SI50=CC50/EC50) werden samen in tabel gebracht. Daarnaast werden het
antiviraal en cytotoxisch verloop van de moleculen in grafiek gebracht onder de vorm van een dosis-
respons formaat. Moleculen werden vervolgens als hit geïdentificeerd (‘hit’ identificatie) wanneer het
CPE geïnhibeerd werd boven een vooraf bepaalde drempelwaarde. De identificatie berust op het
volgende criterium: moleculen die het virus geïnduceerde CPE in celcultuur nagenoeg volledig
inhiberen, meerbepaald > 70 % CPE inhibitie en waarvan de leefbaarheid van de cellen niet is
aangetast (minimale toxiciteit). De activiteit van de meest interessante hits werden voorts hertest in de
hoop hun potentiële antivirale activiteit te reproduceren ofwel de hits met vals-positieve activiteit uit de
primaire screen te elimineren (‘hit’ verificatie).
3.2.2.1 Evaluatie DENV antivirale activiteit
In een poging om een reeks moleculen te identificeren die actief zijn tegen het DENV, bereikten we de
evaluatie van de antivirale activiteit van circa 1.400 moleculen, aan de hand van zowel semi-
automatische als handmatige antivirale assay. Visueel toont Figuur 13 aan hoe de indeling op de
semi-automatische assay platen plaats vond en Figuur 12 deze van de handmatige antivirale platen.
Na verwerking van de resultaten bleken een 58-tal moleculen interessant op basis van het reeds
vermelde criterium (> 70% DENV activiteit, zonder toxiciteit). We kozen hiervan de 34 meest
interessante moleculen om hun potentiële DENV activiteit te hertesten. Dit onderzoek handelt verder
over twee aantrekkelijke moleculen, nl. CHI104 en CHI105 [ter beschikking gesteld door Prof. Dr. Alba
Chimirri (Universiteit van Mesa, Italië)] uit deze groep van moleculen en werden evenzeer hertest. De
Resultaten 38
inhibitorische activiteit van CHI104 en CHI105 (analogen) uit drie onafhankelijke antivirale assays zijn
weergegeven in Figuur 21 en Tabel 3.
Op Vero cellen vertoont CHI104 en CHI105 significante activiteit tegen het DENV-2 NGC. Voor
deze analogen berekenden we een gelijkaardige EC50 waarde onder de 1 µg/ml of µM en lijken ze
ietwat meer toxisch te worden naarmate de concentratie stijgt. De berekende selectiviteitindex
weerspiegelt de verhouding tussen de CC50 en de EC50. Een grote SI waarde betekent een groot
therapeutisch venster waarbij de EC50 en de CC50 liefst zo ver mogelijk uit elkaar liggen. Hoe groter de
SI waarde, hoe selectiever het molecule werkt en wordt daarmee ook therapeutisch interessanter.
CHI104 en CHI105 kunnen respectievelijk het CPE tot 62% en 60% inhiberen bij een concentratie van
1,3 mg/ml of µM (maximale % aan celbescherming). De percentages liggen enigszins lager dan ons
vooropgesteld selectiecriterium. Echter, we moeten voor ogen houden dat de antivirale activiteit met
een zeer strikte assay (6.000 cellen/well) bepaald werd. Bij andere experimenten voor het valideren
van de activiteit zal het % inhibitie alleszins hoger liggen, alsook de toxiciteit bij de hogere
concentraties minder sterk doorkomen.
Virus Molecule EC50 CC50 SI50 Conc.
eenheid
CHI104 0,94 ± 0,34 > 10 > 11 µg/ml
CHI105 0,78 ± 0,47 > 10 > 13 µM DENV-2
NGC
RBV 14,8 > 100 > 7 µg/ml
CHI104 3,45 ± 1,91 > 10 > 3 µg/ml
CHI105 0,47 ± 0,21 > 10 > 21 µM GKV 17D
RBV 12,28 ± 3,74 > 100 > 8 µg/ml
Tabel 3 | Inhibitorische activiteit van geselecteerde molecul en.
Figuur 21 | Dosis respons curve van CHI104 en CHI105 tegen het DENV-2 NGC. Vero cellen werden geïnfecteerd met het
DENV en behandelt met CHI104 of CHI105 in drie onafhankelijke assays. Na 8 dagen p.i. werd het % cel bescherming (rood)
en het % cel metabolisme (groen) gemeten, welke voor beide moleculen een gelijkaardig profiel oplevert. De drempel van
50% activiteit of cytotoxiciteit t.o.v. de controle is afgebeeld in geel.
Resultaten 39
3.2.2.2 Evaluatie GKV antivirale activiteit
Vanwege de potentiële antivirale activiteit van CHI104 en CHI105 tegen het DENV, werd eveneens de
activiteit onderzocht tegen het verwante gele koorts virus. Niet enkel CHI104 en CHI105, maar ook de
andere geïdentificeerde hits uit de primaire DENV screening werden geëvalueerd op hun activiteit
tegen het GKV. De antivirale assays verliepen op eenzelfde wijze als de DENV antivirale assays,
enkel werden deze op 20.000 cellen/well uitgevoerd en geanalyseerd met MTS, nadat het CPE
visueel werd goedgekeurd (normaliter na 7 dagen p.i.).
Hier rapporteren we de inhibitorische activiteit van CHI104 en CHI105 (Figuur 22 en Tabel 3).
CHI104 (in een concentratiereeks van 10 µg/ml – 0,04 µg/ml op Vero-B cellen) vertoont enige activiteit
tegen het GKV 17D; CHI105 bezit een krachtigere anti-GKV activiteit en kan nagenoeg het CPE
volledig inhiberen (97% bij 2,5 µM). CHI104 inhibeert het CPE met slechts 65% bij 5 µg/ml. De
moleculen vertonen een sterkere inhibitie t.o.v. het DENV en mindere toxiciteit aan hogere
concentratie, dit zou deels verklaard kunnen worden door het hoger aantal cellen dat in deze antivirale
assay werd toegepast.
3.2.3 Hit validatie
De voorgaande assays zijn gebaseerd op het detecteren van een luminescentie signaal of
absorbantie, gerelateerd met het virus geïnduceerde CPE. Verdere technieken zullen uitmaken of de
bovenstaand geobserveerde antivirale activiteit kan worden gevalideerd. Dit onderzochten we m.b.v.
een dengue reporter virus, DENV replicon assay, evenals een virus yield assay met het DENV en het
GKV, alsook met het MOD/GK chimeer virus en het MODV.
Figuur 22 | Dosis respons curve van CHI104 en CHI105 tegen het GKV/17D. De antivirale en cytotoxische activiteit van
CHI104 en CHI105 op Vero-B cellen uit twee onafhankelijke assays (in een concentratiereeks van 10 – 0,04 µg/ml of µM).
Antivirale activiteit: % cel bescherming (rood), cytotoxiciteit: % cel metabolisme (groen), 50% activiteit of cytotoxiciteit t.o.v. de
controle (geel).
Resultaten 40
DENV
3.2.3.1 Dengue reporter virus
Om op een alternatieve wijze de antivirale activiteit van de potentiële inhibitoren te bestuderen werd
een reporter systeem aangewend. Na infectie van BHK-21 cellen (10.000 cellen/well vooraf
uitgezaaid) met het volledig infectieus dengue genoom, bevattende het reporter gen, werd de
luminescentie gemeten op de tijdstippen 8, 24 en 48 p.i. De luminescentie representeert de virale
replicatie van het dengue reporter virus in aanwezigheid van drie verschillende concentraties CHI104
(0,1 – 1 – 10 µg/ml) en in afwezigheid van CHI104 (VC) (Figuur 23). Na 24 hr p.i. vertoont CHI104 een
duidelijke dosis-afhankelijke inhibitie van het luminescentie signaal t.o.v. de VC (lagere replicatie van
het luciferase gen bevattende virus). In mindere mate gaat de inhibitie door tot 48 hr p.i.. Voor CHI104
aan een concentratie van 10 µg/ml, kan na 24 hr p.i. een EC50 waarde berekend worden van 1,99
µg/ml met 88% inhibitie t.o.v. de VC. Eveneens werd na 48 hr p.i. een EC50 waarde van 2,99 µg/ml
berekend met een 93% inhibitie bij 10 µg/ml CHI104. We kunnen uitsluiten dat de waargenomen
antivirale activiteit te wijten is aan mogelijke toxische activiteiten van het molecule uitgeoefend op de
BHK-21 cellen. De toxiciteit bepaalden we door de celgroei te analyseren aan de hand van celtelling;
aan een concentratie van 10 µg/ml CHI104 werd geen remming in celgroei gedetecteerd.
Figuur 23 | CHI104 antivirale activiteit met het dengue reporte r virus. BHK-21 cellen werden geïnfecteerd met het dengue
reporter virus. Op 8, 24 en 48 hr p.i. werd het luminescentie signaal gemeten, welke de replicatie van het luciferase gen
coderende DENV weerspiegelt. Een dosisafhankelijke inhibitie van de replicatie was te detecteren na 24 en 48 hr p.i. voor de
CHI104 concentraties 0,1 – 1 – 10 mg/ml. Deze laatste concentratie inhibeerde 93 % van de virale replicatie t.o.v. de VC na
48 hr p.i. Aan een concentratie van 10 µg/ml (en lager) heeft CHI104 op de proliferatie van BHK-21 cellen geen remmend
effect.
Resultaten 41
3.2.3.2 DENV virus yield assay
Een gevoeligere, maar arbeidsintensievere techniek bestaat erin het vrijgestelde, nieuw aangemaakte
virus te kwantificeren als maat voor de antivirale activiteit van een potentiële inhibitor. De potentie van
zowel CHI104 als CHI105 om in vitro de productie van virale partikels te remmen, wordt weergegeven
in Figuur 24 en Tabel 4. Na het uitvoeren van een virus yield assay volgens het protocol beschreven
in paragraaf 3.1.2.9 en kwantificatie met RT-qPCR, werd een welgevormde dosis-respons curve
verkregen; de bekomen EC50 waarde liggen lager dan in de overeenkomstige antivirale CPE assays.
Dit zou kunnen door de hogere gevoeligheid van de gebruikte techniek en het groter aantal gebruikte
cellen (50.000 cellen/well). Beide moleculen bieden vrijwel volledige inhibitie tegen virus-geïnduceerd
CPE aan concentraties van 5 en 10 µg/ml (CHI104) of 5 - 10 µM (CHI105). Door de afwezigheid van
cytotoxiciteit is de antivirale activiteit volledig toe te schrijven aan een selectieve inhibitie van virale
replicatie en niet aan pleiotrope effecten op de cel.
3.2.3.3 DENV replicon assay
Tijdens de virale infectie laat de replicatie van het replicon toe het effect van CHI104 op de functionele
NS-proteïnen te bestuderen. Het luminescentie signaal werd 72 hr, na het toevoegen van 0.1, 0.5, 1,
5, 10 en 20 µg/ml CHI104 aan de BHK-Rep-Pac-LUC cellen, gemeten en vervolgens gecorrigeerd
voor cytostatische effecten (de replicon bevattende cellen blijken relatief gevoelig aan cytostatische
effecten). Figuur 25 toont de werkelijke inhibitie (als percentage van de replicon controle) die CHI104
uitoefent op de replicatie van het DENV replicon. Aan 20 µg/ml kan CHI104 gemiddeld 90% van de
replicon replicatie remmen. Een dosis afhankelijke inhibitie werd waargenomen met een EC50 van 1,2
µg/ml voor CHI104 in het replicon systeem.
Figuur 24 | DENV virus yield met CHI104 en CHI105. In vitro werd het totaal aantal vRNA gedetermineerd in het
supernatans van DENV geïnfecteerde Vero cellen (50.000 cellen/well) waarbij CHI104 en CHI105 is toegevoegd. De
hoeveelheid vRNA werd omgerekend naar een % celbescherming (rood). De antivirale activiteit wordt niet beïnvloed door
mogelijke toxiciteit van de moleculen (groen).
Resultaten 42
3.2.3.4 ‘Time-of-addition’ met dengue reporter virus
Om een inzicht te krijgen over wanneer CHI104 zal interfereren met de virale replicatie van het DENV,
werd een ‘time-of-addition’ experiment ingezet. Dit laat ons toe na te gaan of de inhibitorische activiteit
van het molecule vroeg, laat of in het midden van de replicatiecyclus gebeurt. Twee concentraties van
CHI104 (5 en 10 µg/ml) werden op zes verschillende tijdstippen (0, 2, 4, 6, 8, 10 en 12 hr p.i.)
toegevoegd aan het medium van cellen die werden geïnfecteerd met het reporter virus. De
doeltreffendheid van de virale replicatie in BHK-21 cellen werd bepaald op 24 hr p.i. o.b.v. een
luminescentie meting. Een percentage inhibitie t.o.v. de VC werd berekend voor beide concentraties
op de verschillende tijdstippen (Figuur 26). CHI104 remt de replicatie van het dengue reporter virus
Figuur 25 | Activiteit van CHI104 in de DENV replicon assay . Een dosis afhankelijke inhibitie van de replicon replicatie in
BHK-21 cellen, gemeten o.b.v. luminescentie. Bij een concentratie van 20 µg/ml van CHI104 t.o.v. de replicon controle wordt
een inhibitie van gemiddeld 90% waargenomen. Het signaal werd gecorrigeerd voor cytostatische effecten.
Figuur 25 | Het effect van CHI104 op de replicatie cyclus in een ‘time -of-addition’ studie. De BHK-21 cellen geïnfecteerd
met het dengue reporter virus, werden behandeld met 5 µg/ml of 10 µg/ml CHI104, toegevoegd op tijdstippen 0, 2, 4, 6, 8 10
en 12 hr p.i.. Na 24 hr p.i. werd de luciferase activiteit bepaald en het percentage inhibitie berekend t.o.v. de onbehandelde
controle.
Resultaten 43
met 95% en 97% aan een concentratie van respectievelijk 5 µg/ml en 10 µg/ml. Zelfs wanneer CHI104
werd toegediend tot 6 hr p.i. kan het de replicatie met meer dan 85% inhiberen. Toevoegen van het
molecule aan de geïnfecteerde celculturen op latere tijdstippen, resulteert in een gedeeltelijk tot
volledig verlies van de inhibitorische activiteit op de virale replicatie.
GKV
3.2.3.5 GKV virus yield assay
In een volgende stap werd eenzelfde virus yield experiment opgesteld voor het GKV als voor het
DENV. Uit Figuur 27 en Tabel 4 blijkt duidelijk dat beide moleculen de productie van viruspartikels
(gekwantificeerd d.m.v. RT-qPCR) efficiënt remmen. Een vrijwel volledige inhibitie (≥ 99% t.o.v. de
VC) werd waargenomen aan de hoogste concentratie. De resultaten werden niet beïnvloed door de
toxiciteit van CHI104 en CHI105 aangezien die niet aanwezig is aan ≤10 µg/ml of µM.
2.3.6 ‘Time-of-addition’ met GKV
Eveneens werd voor het GKV het stadium van de virale replicatiecyclus, dat geïnhibeerd wordt door
CHI104, gedetermineerd. CHI104 werd op tijdstip 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 en 18 hr p.i. toegevoegd
aan het medium aan een concentratie van 10 µg/ml. De virustiter werd 24 hr p.i. intracellulair en
extracellulair gedetermineerd en berekend als een percentage inhibitie van de onbehandelde
celcontrole (Figuur 28). CHI104 is in staat om 95% van de virusproductie te remmen wanneer het
molecule werd toegediend tijdens de infectie. Als CHI104 werd toegevoegd op latere tijdstippen na
infectie, neemt het beschermend effect af.
Figuur 27 | GKV virus yield me t CHI104 en CHI105. Het totaal vRNA gedetermineerd d.m.v. RT-qPCR in het supernatans
van GKV geïnfecteerde Vero-B cellen (50.000 cellen/well) op tijdstip x uur p.i. in met CHI104 en CHI105 behandelde cellen,
werd omgerekend naar een % celbescherming (rood). De antivirale activiteit is niet te wijten aan cytotoxiciteit (groen).
Resultaten 44
Molecule Virus EC50 CC50 SI50
DENV 0,90 > 10 > 11
GKV 0,15 > 10 > 67
MOD/GK chimeer virus
2,35 > 10 > 4
CHI104 µg/ml
MODV 7,10 > 10 > 1
DENV 0,42 > 10 > 24
GKV 0,25 > 10 > 40
MOD/GK chimeer virus
0,76 > 10 > 13
CHI105 µM
MODV 2,66 > 10 > 4
DENV 20,51 > 100 > 5
GKV 10,11 > 100 > 10
MOD/GK chimeer virus
> 100 > 100 > 1
RBV µg/ml
MODV 25 >1 00 > 4
Tabel 4 | Samenvatting van de antivirale activiteit van gesel ecteerde moleculen uit de virus yield assay.
DENV-2 Nieuw-guinea C stam, GKV 17D, MODV M544 en MOD/GK17D chimeer
virus (Charlier et al., 2007)
Figuur 28 | Het effect van CHI104 op de GKV replicatie in een ‘ time -of-addition’ experiment. De geïnfecteerde BHK-21
cellen met het GKV (17D vaccin stam), werden behandeld met 10 µg/ml CHI104, dat werd toegevoegd op 0 tot 18 hr p.i.. Op
tijdstip 24 hr p.i. werd intracellulair en extracellulair het viraal RNA gekwantificeerd en de hoeveelheid uitgedrukt als
percentage van de onbehandelde conditie.
Resultaten 45
3.2.3.7 Virus yield assay met MOD/GK chimeer virus
Om de verdere gevoeligheid van de GKV antivirale activiteit van beide moleculen te valideren, werd
een virus yield met het MOD/GK chimeer virus uitgevoerd. Zoals beschreven in Charlier et al., 2004,
werd hierbij het GKV 17D als ‘backbone’ gebruikt, waarbij de structurele genen, prM en E, werden
vervangen door deze van het neuroinvasief MODV, een muis flavivirus (Figuur 29) [90]. Dit laatste
virus behoort tot de cluster van ‘not-known vector’ (NKV) flavivirussen [90].
De virus yield werd ingezet met het chimeer virus in aanwezigheid van CHI104 en CHI105 op Vero-B
cellen. Eerder werd al aangetoond dat het chimeer virus quasi even efficiënt repliceert in Vero-B
cellen als het parentale GKV 17D [90].
CHI104 is in staat om aan een concentratie van 5 en 10 µg/ml vrijwel volledig de replicatie van het
chimeer virus te inhiberen, nagenoeg hetzelfde produceert zich voor CHI105 (Figuur 30 en Tabel 4).
De EC50 waarden van het chimeer virus (2,35 µg/ml en 0,76 µM voor CHI104 en CHI105,
respectievelijk) zijn gelegen tussen de EC50 waarden van de moleculen tegen het GKV en het MODV
(zie verder). Net zoals in de GKV virus yield assay werd geen toxiciteit van de moleculen
waargenomen in de Vero-B cellen aan de hoogst geteste concentratie.
TTGVMG/DQGCAI LLMTGGTILS/IEV
5’UTR 3’UTR NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5 E prM C
Figuur 29 | Genomische organisatie van het MOD/GK17D chimeer v irus. De constructie van het chimeer virus werd
verwezenlijkt door het vervangen van de GKV 17D prM en de E genen door de overeenkomstige genen van het MODV (groen).
De aminozuur sequentie in de overgangsgebieden (C/prM en E/NS1) zijn weergegeven; de onderlijnde sequenties behoren tot
het MODV. De schuine streep stelt de voorspelde klievingsplaats voor (bewerkte Figuur uit [90]).
Figuur 30 | Virus yield met het MOD/GK 17D chimeer virus. CHI104 en CHI105 werd toegevoegd aan geïnfecteerde Vero-B
cellen (50.000 cellen/well), waarna het vRNA gekwantificeerd werd in het supernatans op x hr p.i.. De kwantiteit vRNA is
uitgedrukt als % t.o.v. de onbehandelde controle (rood). CHI104 en CHI105 oefenen geen cytotoxiciteit uit op de cellen aan
een concentratie van 10 µg/ml (of 10 µM) of lager.
Resultaten 46
3.2.3.8 MODV virus yield assay
Het evalueren van CHI104 en CHI105 op de replicatie van het muis Modoc virus is van betekenis voor
eventuele latere in vivo experimenten. Vero-B cellen (50.000 cellen/well) werden geïnfecteerd met het
MODV (M544) in de aan- of afwezigheid van CHI104 of CHI105. Het vRNA, afkomstig van het
supernatans, werd gekwantificeerd op dag 4 p.i.. De resultaten (Figuur 31 en Tabel 4) tonen aan dat
de beide moleculen aan de hoogste concentratie de MODV replicatie efficiënt remmen.
Figuur 31 | Virus yield met het MOD/GK 17D chimeer virus. Het vRNA werd gekwantificeerd in het supernatans 4 dagen
p.i. (MODV/GKV 17D op Vero-B cellen met/zonder CHI104 en CHI105). De kwantiteit van het vRNA werd omgerekend naar
een % t.o.v. de onbehandelde controle (rood). CHI104 en CHI105 zijn niet cytotoxisch aan een concentratie van 10 µg/ml (of
10 µM) of lager.
Algemeen besluit 47
Dit onderzoek had als objectief een bijdrage te leveren tot de ontwikkeling van krachtige antivirale
moleculen tegen het dengue hemorragische koorts virus. DENV inhibitoren zouden bij voorkeur
eveneens een activiteit moeten vertonen tegen andere flavivirussen, zoals het GKV. Verscheidene
pogingen om dergelijke inhibitoren te ontwikkelen werden reeds gepubliceerd, maar tot op heden
werden geen van de moleculen verder ontwikkeld [52, 62, 63, 65, 91-93]. De efficiëntie van een
antiviraal middel wordt bevorderd wanneer het sneller na een infectie wordt toegediend. Daarom zou
de ontwikkeling van differentieel diagnostische technieken, die op een snelle manier andere ziekten
(van andere virale, bacteriële of parasitaire oorsprong) kunnen uitsluiten, toelaten vroeg na infectie de
geneesmiddelen toe te dienen, waardoor een verbeterde antivirale respons gerealiseerd kan worden
[14, 57, 94]. Aangezien dengue acuut optreedt [54] en een antiviraal middel hierdoor slechts voor
korte duur (1 à 2 weken) zou moeten worden gegeven, zou de kans op resistentieontwikkeling kleiner
zijn, dan bijvoorbeeld HCV, dat een chronische ziekte kan veroorzaken en jarenlange therapie vereist.
De dengue antivirale middelen zouden allereerst de viremie in patiënten moeten reduceren, zodat
een minder ernstig ziekteverloop ontwikkeld wordt [95]. In het geval van dengue zal een verminderd
risico van dengue koorts of dengue hemorragische koorts/dengue shock syndroom optreden in
volwassen, alsook in kinderen. Het potentieel gebruik van dergelijke antivirale middelen omvat:
(i) het profylactisch gebruik tijdens epidemische situaties, voornamelijk belangrijk in
hyperendemische regio’s.
(ii) het gebruik in endemische gebieden bij patiënten met vermoedelijk of laboratorisch
bewezen een dengue infectie.
(iii) het profylactisch gebruik voor mensen die naar of door DENV endemische gebieden reizen.
(iv) het profylactisch gebruik voor personeel van niet-gouvernementele hulporganisaties, zoals
artsen zonder grenzen, of militairen die in endemische regio’s humanitaire acties
verrichten.
In een eerste deel van dit werk hadden we de intentie om een efficiënte antivirale screenings-assay
voor dengue te ontwikkelen. Omdat het DENV relatief inefficiënt in celcultuur repliceert en het
onvoldoende CPE bleek te produceren voor het gebruik in een reproduceerbare assay, kozen we
ervoor om het virus eerst op te kweken in een meer natuurlijke situatie [1]. Om hoge titers van het
virus te krijgen, werd het DENV voor drie passages op muggencellen gekweekt (DENV C6/36 P3). Dit
virus werd vervolgens gebruikt voor de infectie van Vero cellen, waarin CPE werd geïnduceerd. Het
analyseren van het CPE in een cel-gebaseerde assay met de MTS-methode (o.b.v. de metabole
celactiviteit) leverde weinig bruikbare resultaten op vanwege een hoge “ruis”. De signaal/ruis
verhouding konden we vergroten door over te schakelen op een alternatieve aflees methode (ATPlite-
methode) [89]. Gong et al. ontwikkelde en valideerde deze luminescentie-gebaseerde methode voor
Hoofdstuk 4 Algemeen besluit
Algemeen besluit 48
positief strengs-RNA virussen om de ATP levels in levende cellen, beschermd van het virus-
geïnduceerde CPE door aanwezigheid van een antiviraal molecule, te determineren. Deze gevoelige
methode verschafte ons inderdaad, i.t.t. MTS-methode, de nodige betrouwbare, reproduceerbare
resultaten die toelaten de verdere EC50 en CC50 waarden nauwkeuriger te bepalen.
Uit de ‘medium-to-high-throughput screening’ van een selectie van ongeveer 1.400 moleculen voor de
evaluatie van de antivirale activiteit tegen het DENV-2 NGC, identificeerden we twee potentiële
inhibitoren nl. CHI104 en CHI105. HTS cel-gebaseerde assays zijn reeds gebruikt om bibliotheken
van moleculen te evalueren op de inhibitorisch activiteit tegen flavivirussen, zoals het WNV [72].
Bepaalde van de geïdentificeerde moleculen voor het WNV vertoonden ook inhibitie tegen het DENV
en andere flavivirussen, zoals het GKV. Deze cel-gebaseerde methode, i.t.t. de ‘target’-gebaseerde
methode, laat toe het al dan niet gewenste werkingsmechanismen te onderzoeken en tevens
moleculen, die eender welke stap in de virus replicatie blokkeren, te identificeren in levende cellen
[58].
De opzet was om de activiteit van CHI104 en CHI105 te bevestigen en te karakteriseren. De
gemiddelde EC50 van beide moleculen in Vero cellen ligt beneden 1 µg/ml of µM, met een CC50 groter
dan > 10 µg/ml (of µM voor CHI105). Deze activiteit is aanzienlijk beter dan de activiteit van ribavirine.
Het dengue reporter virus (dat eerder ontwikkeld werd voor de studie van de rol van de glycosylatie
van het DENV E-proteïne tijdens virale regulatie) werd aangewend om de inhibitorische effecten van
CHI104 op de virale replicatie verder te bestuderen [89]. Dit luciferase coderende virus liet toe om de
tijds- en dosis-afhankelijke inhibitie van de virale replicatie door CHI104 te bevestigen. Vrijwel
volledige inhibitie werd waargenomen aan een concentratie van 10 µg/ml (na 48 hr p.i.). Dergelijke
krachtige inhibitie werd ook bekomen in de DENV virus yield assay.
Een stabiel subgenomisch replicon bevattende cellijn is een nuttig systeem om de anti-DENV activiteit
van CHI104 additioneel te bevestigen en verder te karakteriseren. Deze subgenomische replicon
constructen bevatten alle genetische elementen die nodig zijn voor de amplificatie ervan in de
gastheercel (BHK-21 cellen). Door het ontbreken van het overgrote deel van de structurele genen kan
het replicon wel repliceren maar niet in een viruspartikeltje verpakt worden. Het experiment toont aan
dat CHI104 in staat is om de replicatie van dit artificieel vRNA zo goed als volledig te remmen. Dit
impliceert een directe inwerking van CHI104 op de DENV NS-genen of een indirecte werking op het
functioneren van het replicatiecomplex. CHI104 zal een meer selectief antivirale molecule zijn, indien
ze inwerkt op de virale proteïnen, dan eerder wanneer ze indirect de gastheercel capaciteiten
beïnvloedt. In geval van een directe werking op virale proteïnen, zal het cytotoxisch effect minder
uitgesproken zijn, maar kan het fenomeen van resistentie wel sneller optreden [58]. Verder laten deze
resultaten toe te concluderen dat het positief antiviraal effect niet te wijten is aan een remmend effect
ter hoogte van de virale adsorptie of fusie fase, alsook de virus assemblage of vrijstelling, aangezien
het inwerkt op de vRNA replicatie zelf.
Algemeen besluit 49
Met een ‘time-of-addition’ (TOA) studie voor CHI104 zijn we erin geslaagd de bovenstaande conclusie
uit het replicon systeem te bevestigen. Het feit dat CHI104 zijn inhibitorisch effect hoogstwaarschijnlijk
niet uitoefent tijdens de adsorptie/fusie fase van de replicatie, werd in de ‘time-of-addition’ (TOA)
studie weerspiegeld als een behoud van het antiviraal effect tijdens de eerste uren na infectie.
Wanneer CHI104 werd toegediend tijdens de eerste 6 uur na infectie, werd de activiteit grotendeels
behouden, toedienen van CHI104 op latere tijdstippen resulteerde in een belangrijk verlies van de
activiteit. CHI104 faalt volledig na toevoegen op 12 uur p.i., de tijdspanne die het DENV nodig heeft
om één replicatiecyclus te voltooien. Eerder rapporteerde men de typische duur van 12 tot 16 uur
vooraleer nieuw virus kan gedetecteerd worden in het extracellulair medium voor het DENV in
celcultuur [31].
Vermoedelijk zal het molecule interfereren met de virale RNA synthese van het DENV (vb. het
NS3pro of RaRp), maar verdere in vitro studies, zoals resistentiekweek en de evaluatie in
enzymatische assay, moeten deze assumpties en het uiteindelijke werkingsmechanisme uitwijzen.
‘Proof-of-principle’ voor de inhibitie van het DENV NS3pro, blijkt uit de ondernomen pogingen in het
verleden [3, 26, 65, 96]. Deze omvatten substraat gebaseerde inhibitoren met natuurlijke dengue
protease herkenningssequentie die het DENV-2 op een competitieve manier in vitro remmen [62, 63,
91, 92].
Uiteraard is het van uiterst belang dat dengue geneesmiddelen actief zijn tegen alle vier de serotypes;
in dit werk toonden we de activiteit aan van CHI104 en CHI105 tegen het DENV-2 NGC. Het
laboratorium beschikt ook over de andere DENV serotypes; deze produceren echter weinig of geen
CPE. Momenteel worden hiervoor de nodige methoden op punt gesteld, o.a. antigeen detectie m.b.v.
flow cytometrie en RT-qPCR.
Doordat flavivirussen een gelijkaardige genomische opbouw en replicatie delen, is er een perspectief
om breed-spectrum inhibitoren te ontwikkelen met een antivirale activiteit tegen verschillende
flavivirussen [25]. CHI104 en CHI105 blijken eveneens een activiteit te vertonen tegen het GKV, zelfs
meer uitgesproken dan de anti-DENV activiteit. De ‘time-of-addition’ assay, net zoals voor het DENV,
laat vermoeden dat de CHI-moleculen direct inwerken op een mechanisme in de replicatiecyclus van
flavivirussen, dat ongeveer 6 uur na infectie gebeurt.
We evalueerden evenzeer het potentieel inhibitorisch effect van CHI104 en CHI105 tegen een virus,
verder gelegen in de fylogenetische boom, nl. het MODV. Dit muizen flavivirus (uit de NKV cluster)
bleek ook gevoelig aan de antivirale activiteiten van CHI104 en CHI105, weliswaar met mindere
potentie (hogere EC50 waarde). De activiteit van deze klasse van moleculen opent echter
perspectieven voor de evaluatie in proefdiermodellen. Om potentiële moleculen, die in vitro een
antivirale activiteit hebben aangetoond tegen verschillende flavivirussen, in vivo te testen, is het
Algemeen besluit 50
aangeraden ze eerst te evalueren in eenvoudig te manipuleren diermodellen, zoals de Modoc
modellen in SCID-muizen en -hamsters [2].
Vervolgens evalueerden we de activiteit van CHI104 en CHI105 op de replicatie van een MOD/GKV
chimeer virus. Dit chimeer virus werd bekomen door de prM en E structurele genen van het genoom
van het GKV 17D vaccin stam te vervangen door de overeenkomstige genen van het MODV.
Opnieuw bevestigen deze experimenten de antivirale werkzaamheid. Het chimere virus werd
geconstrueerd met de bedoeling een GKV te ontwikkelen, dat in tegenstelling tot het parentale vaccin
virus, repliceert in muizen. De activiteit van de CHI-moleculen die we aantoonden tegen dit chimere
virus opent verdere perspectieven voor in vivo evaluatie.
Samengevat: we optimaliseerden een DENV cel-gebaseerde assay, waarmee we twee moleculen (uit
een sterk geselecteerde reeks) identificeerden met een activiteit tegen het DENV-2. Na het verder
valideren van de activiteit tegen dit serotype, bleek uit de TOA studie het inhiberend effect van de
moleculen vroeg in de RNA replicatie plaats te vinden. De activiteit tegen het GKV, het MODV en het
chimeer virus suggereert een breed-spectrum anti-flavivirus activiteit.
Literatuurlijst
[1] Henchal EA, Putnak JR. The dengue viruses. Clinical microbiology reviews 1990;3(4):376-96.
[2] Charlier N, Leyssen P, De Clercq E, Neyts J. Rodent models for the study of therapy against
flavivirus infections. Antiviral research 2004;63(2):67-77.
[3] Qi RF, Zhang L, Chi CW. Biological characteristics of dengue virus and potential targets for
drug design. Acta biochimica et biophysica Sinica 2008;40(2):91-101.
[4] Clyde K, Kyle JL, Harris E. Recent advances in deciphering viral and host determinants of
dengue virus replication and pathogenesis. Journal of virology 2006;80(23):11418-31.
[5] Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clinical microbiology reviews
1998;11(3):480-96.
[6] Holmes EC, Twiddy SS. The origin, emergence and evolutionary genetics of dengue virus.
Infect Genet Evol 2003;3(1):19-28.
[7] Gubler DJ. The changing epidemiology of yellow fever and dengue, 1900 to 2003: full circle?
Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 2004;27(5):319-30.
[8] Monath TP. Dengue: the risk to developed and developing countries. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 1994;91(7):2395-400.
[9] Reiter P. Climate change and mosquito-borne disease. Environmental health perspectives
2001;109 Suppl 1:141-61.
[10] Halstead SB. Dengue. Lancet 2007;370(9599):1644-52.
[11] Centers for Disease Control and Prevention. Vectorborne Infectious Diseases. Dengue Fever.
April 16, 2008.
[12] Mackenzie JS, Gubler DJ, Petersen LR. Emerging flaviviruses: the spread and resurgence of
Japanese encephalitis, West Nile and dengue viruses. Nature medicine 2004;10(12
Suppl):S98-109.
[13] Centers for Disease Control and Prevention. Outbreak Notice Update: Dengue, Tropical and
Subtropical Regions. April 16, 2008.
[14] Gibbons RV, Vaughn DW. Dengue: an escalating problem. BMJ (Clinical research ed
2002;324(7353):1563-6.
[15] World Health Organisation. Regional Office for South-East Asia. Dengue/DHF, Reported
Cases of DF/DHF in Selected Countries in SEA Region (1985 – 2006). Laatste update Juli 6,
2007.
[16] World Health Organization 2008. Impact of Dengue.
http://www.who.int/csr/disease/dengue/impact/en/index.html.
[17] Solomon T, Mallewa M. Dengue and other emerging flaviviruses. The Journal of infection
2001;42(2):104-15.
[18] M.M. Jager AH, A.S. de Boer, W. Takken, E.J. Scholte,J.H.J. Reimerink, M.P.G. Koopmans.
Import van de tijgermug, risico voor volksgezondheid? Infectieziekten 2008;3:108-12.
[19] Gubler DJ. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and
economic problem in the 21st century. Trends in microbiology 2002;10(2):100-3.
[20] Shope R. Global climate change and infectious diseases. Environmental health perspectives
1991;96:171-4.
[21] Gould EA, Solomon T. Pathogenic flaviviruses. Lancet 2008;371(9611):500-9.
[22] World Health Organization. WHO calls for Collaboration on Dengue "Controlling Dengue has
to be everyone's business". Phuket/ New Delhi, september 19, 2007. .
[23] Mukhopadhyay S, Kuhn RJ, Rossmann MG. A structural perspective of the flavivirus life cycle.
Nature reviews 2005;3(1):13-22.
[24] Seligman SJ, Bucher DJ. The importance of being outer: consequences of the distinction
between the outer and inner surfaces of flavivirus glycoprotein E. Trends in microbiology
2003;11(3):108-10.
[25] Sampath A, Padmanabhan R. Molecular targets for flavivirus drug discovery. Antiviral
research 2008.
[26] Melino S, Paci M. Progress for dengue virus diseases. Towards the NS2B-NS3pro inhibition
for a therapeutic-based approach. The FEBS journal 2007;274(12):2986-3002.
[27] David M. Knipe PMH, ed. Fields Virology. Immunopathogenetic Mechanisms, pp.1208-1217,
5th edn. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2007.
[28] Miller JL, deWet BJ, Martinez-Pomares L, Radcliffe CM, Dwek RA, Rudd PM, Gordon S. The
mannose receptor mediates dengue virus infection of macrophages. PLoS pathogens
2008;4(2):e17.
[29] van der Schaar HM, Rust MJ, Waarts BL, van der Ende-Metselaar H, Kuhn RJ, Wilschut J,
Zhuang X, Smit JM. Characterization of the early events in dengue virus cell entry by
biochemical assays and single-virus tracking. Journal of virology 2007;81(21):12019-28.
[30] McBride WJ, Bielefeldt-Ohmann H. Dengue viral infections; pathogenesis and epidemiology.
Microbes and infection / Institut Pasteur 2000;2(9):1041-50.
[31] David M. Knipe PMH, ed. Fields Virology. Flaviviridae: The viruses and their Replication.
Flaviviruses., pp.1103-1112, 5th edn. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2007.
[32] Kurane I, Takasaki T. Dengue fever and dengue haemorrhagic fever: challenges of controlling
an enemy still at large. Reviews in medical virology 2001;11(5):301-11.
[33] Rothman AL. Dengue: defining protective versus pathologic immunity. The Journal of clinical
investigation 2004;113(7):946-51.
[34] Navarro-Sanchez E, Despres P, Cedillo-Barron L. Innate immune responses to dengue virus.
Archives of medical research 2005;36(5):425-35.
[35] Halstead SB, Lan NT, Myint TT, et al. Dengue hemorrhagic fever in infants: research
opportunities ignored. Emerging infectious diseases 2002;8(12):1474-9.
[36] Chaturvedi UC, Nagar R, Shrivastava R. Macrophage and dengue virus: friend or foe? The
Indian journal of medical research 2006;124(1):23-40.
[37] Chaturvedi UC, Shrivastava R, Tripathi RK, Nagar R. Dengue virus-specific suppressor T
cells: current perspectives. FEMS immunology and medical microbiology 2007;50(3):285-99.
[38] Luplertlop N, Misse D. MMP cellular responses to dengue virus infection-induced vascular
leakage. Japanese journal of infectious diseases 2008;61(4):298-301.
[39] Gulati S, Maheshwari A. Atypical manifestations of dengue. Trop Med Int Health
2007;12(9):1087-95.
[40] Boonnak K, Slike BM, Burgess TH, et al. Role of dendritic cells in antibody-dependent
enhancement of dengue virus infection. Journal of virology 2008;82(8):3939-51.
[41] Chareonsirisuthigul T, Kalayanarooj S, Ubol S. Dengue virus (DENV) antibody-dependent
enhancement of infection upregulates the production of anti-inflammatory cytokines, but
suppresses anti-DENV free radical and pro-inflammatory cytokine production, in THP-1 cells.
The Journal of general virology 2007;88(Pt 2):365-75.
[42] Stephenson JR. Understanding dengue pathogenesis: implications for vaccine design. Bulletin
of the World Health Organization 2005;83(4):308-14.
[43] Bozza FA, Cruz OG, Zagne SM, Azeredo EL, Nogueira RM, Assis EF, Bozza PT, Kubelka CF.
Multiplex cytokine profile from dengue patients: MIP-1beta and IFN-gamma as predictive
factors for severity. BMC infectious diseases 2008;8:86.
[44] Goncalvez AP, Engle RE, St Claire M, Purcell RH, Lai CJ. Monoclonal antibody-mediated
enhancement of dengue virus infection in vitro and in vivo and strategies for prevention.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
2007;104(22):9422-7.
[45] Mairuhu AT, Wagenaar J, Brandjes DP, van Gorp EC. Dengue: an arthropod-borne disease of
global importance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2004;23(6):425-33.
[46] Morrison AC, Zielinski-Gutierrez E, Scott TW, Rosenberg R. Defining challenges and
proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti. PLoS medicine
2008;5(3):e68.
[47] Igarashi A. Impact of dengue virus infection and its control. FEMS immunology and medical
microbiology 1997;18(4):291-300.
[48] Ooi EE, Goh KT, Gubler DJ. Dengue prevention and 35 years of vector control in Singapore.
Emerging infectious diseases 2006;12(6):887-93.
[49] World Health Organization. Weekly epidemiological record: DengueNet. 6 September
2002;36(77):300-4.
[50] Leyssen P, De Clercq E, Neyts J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.
Antiviral research 2008;78(1):9-25.
[51] International Vaccine Institute. The Pediatric Dengue Vaccine Initiative Program.
http://www.pdvi.org/. Seoul, 2008.
[52] Nair V, Chi G, Shu Q, Julander J, Smee DF. A heterocyclic molecule with significant activity
against dengue virus. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2009;19(5):1425-7.
[53] Guy B, Almond JW. Towards a dengue vaccine: progress to date and remaining challenges.
Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 2008;31(2-3):239-52.
[54] Whitehead SS, Blaney JE, Durbin AP, Murphy BR. Prospects for a dengue virus vaccine.
Nature reviews 2007;5(7):518-28.
[55] Monath TP. Dengue and yellow fever--challenges for the development and use of vaccines.
The New England journal of medicine 2007;357(22):2222-5.
[56] Edelman R. Dengue vaccines approach the finish line. Clin Infect Dis 2007;45 Suppl 1:S56-
60.
[57] Rawlinson SM, Pryor MJ, Wright PJ, Jans DA. Dengue virus RNA polymerase NS5: a
potential therapeutic target? Current drug targets 2006;7(12):1623-38.
[58] David M. Knipe PMH, ed. Fields Virology. Antiviral agents. Principals and Mechanisms of
Specific Antiviral Drugs, pp.447-476, 5th edn. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2007.
[59] Leyssen P, De Clercq E, Neyts J. Perspectives for the treatment of infections with Flaviviridae.
Clinical microbiology reviews 2000;13(1):67-82.
[60] Hidari KI, Takahashi N, Arihara M, Nagaoka M, Morita K, Suzuki T. Structure and anti-dengue
virus activity of sulfated polysaccharide from a marine alga. Biochemical and biophysical
research communications 2008;376(1):91-5.
[61] Perera R, Kuhn RJ. Structural proteomics of dengue virus. Current opinion in microbiology
2008;11(4):369-77.
[62] Leung D, Schroder K, White H, et al. Activity of recombinant dengue 2 virus NS3 protease in
the presence of a truncated NS2B co-factor, small peptide substrates, and inhibitors. The
Journal of biological chemistry 2001;276(49):45762-71.
[63] Li J, Lim SP, Beer D, et al. Functional profiling of recombinant NS3 proteases from all four
serotypes of dengue virus using tetrapeptide and octapeptide substrate libraries. The Journal
of biological chemistry 2005;280(31):28766-74.
[64] Lohr K, Knox JE, Phong WY, et al. Yellow fever virus NS3 protease: peptide-inhibition studies.
The Journal of general virology 2007;88(Pt 8):2223-7.
[65] Ganesh VK, Muller N, Judge K, Luan CH, Padmanabhan R, Murthy KH. Identification and
characterization of nonsubstrate based inhibitors of the essential dengue and West Nile virus
proteases. Bioorganic & medicinal chemistry 2005;13(1):257-64.
[66] Lescar J, Luo D, Xu T, Sampath A, Lim SP, Canard B, Vasudevan SG. Towards the design of
antiviral inhibitors against flaviviruses: the case for the multifunctional NS3 protein from
Dengue virus as a target. Antiviral research 2008;80(2):94-101.
[67] Noueiry AO, Olivo PD, Slomczynska U, et al. Identification of novel small-molecule inhibitors
of West Nile virus infection. Journal of virology 2007;81(21):11992-2004.
[68] Bretner M, Baier A, Kopanska K, et al. Synthesis and biological activity of 1H-benzotriazole
and 1H-benzimidazole analogues--inhibitors of the NTpase/helicase of HCV and of some
related Flaviviridae. Antiviral chemistry & chemotherapy 2005;16(5):315-26.
[69] Bretner M, Schalinski S, Haag A, et al. Synthesis and evaluation of ATP-binding site directed
potential inhibitors of nucleoside triphosphatases/helicases and polymerases of hepatitis C
and other selected Flaviviridae viruses. Antiviral chemistry & chemotherapy 2004;15(1):35-42.
[70] Zhou Y, Ray D, Zhao Y, et al. Structure and function of flavivirus NS5 methyltransferase.
Journal of virology 2007;81(8):3891-903.
[71] Benarroch D, Egloff MP, Mulard L, Guerreiro C, Romette JL, Canard B. A structural basis for
the inhibition of the NS5 dengue virus mRNA 2'-O-methyltransferase domain by ribavirin 5'-
triphosphate. The Journal of biological chemistry 2004;279(34):35638-43.
[72] Malet H, Masse N, Selisko B, et al. The flavivirus polymerase as a target for drug discovery.
Antiviral research 2008;80(1):23-35.
[73] De Clercq E. Recent highlights in the development of new antiviral drugs. Current opinion in
microbiology 2005;8(5):552-60.
[74] Corey DR, Abrams JM. Morpholino antisense oligonucleotides: tools for investigating
vertebrate development. Genome biology 2001;2(5):REVIEWS1015.
[75] Kinney RM, Huang CY, Rose BC, Kroeker AD, Dreher TW, Iversen PL, Stein DA. Inhibition of
dengue virus serotypes 1 to 4 in vero cell cultures with morpholino oligomers. Journal of
virology 2005;79(8):5116-28.
[76] Raviprakash K, Liu K, Matteucci M, Wagner R, Riffenburgh R, Carl M. Inhibition of dengue
virus by novel, modified antisense oligonucleotides. Journal of virology 1995;69(1):69-74.
[77] Diamond MS, Zachariah M, Harris E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by
preventing replication of viral RNA. Virology 2002;304(2):211-21.
[78] David M. Knipe PMH, ed. Fields Virology. Antiviral drugs and immunoglobulins, pp.1218, 5th
edn. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2007.
[79] Tam RC, Lau JY, Hong Z. Mechanisms of action of ribavirin in antiviral therapies. Antiviral
chemistry & chemotherapy 2001;12(5):261-72.
[80] Warke RV, Martin KJ, Giaya K, Shaw SK, Rothman AL, Bosch I. TRAIL is a novel antiviral
protein against dengue virus. Journal of virology 2008;82(1):555-64.
[81] Ojwang JO, Ali S, Smee DF, Morrey JD, Shimasaki CD, Sidwell RW. Broad-spectrum inhibitor
of viruses in the Flaviviridae family. Antiviral research 2005;68(2):49-55.
[82] Crance JM, Scaramozzino N, Jouan A, Garin D. Interferon, ribavirin, 6-azauridine and
glycyrrhizin: antiviral compounds active against pathogenic flaviviruses. Antiviral research
2003;58(1):73-9.
[83] Chu JJ, Yang PL. c-Src protein kinase inhibitors block assembly and maturation of dengue
virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
2007;104(9):3520-5.
[84] Whitby K, Pierson TC, Geiss B, Lane K, Engle M, Zhou Y, Doms RW, Diamond MS.
Castanospermine, a potent inhibitor of dengue virus infection in vitro and in vivo. Journal of
virology 2005;79(14):8698-706.
[85] Wu SF, Lee CJ, Liao CL, Dwek RA, Zitzmann N, Lin YL. Antiviral effects of an iminosugar
derivative on flavivirus infections. Journal of virology 2002;76(8):3596-604.
[86] Yauch LE, Shresta S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral research
2008;80(2):87-93.
[87] Bente DA, Melkus MW, Garcia JV, Rico-Hesse R. Dengue fever in humanized NOD/SCID
mice. Journal of virology 2005;79(21):13797-9.
[88] Shresta S, Sharar KL, Prigozhin DM, Beatty PR, Harris E. Murine model for dengue virus-
induced lethal disease with increased vascular permeability. Journal of virology
2006;80(20):10208-17.
[89] Mondotte JA, Lozach PY, Amara A, Gamarnik AV. Essential role of dengue virus envelope
protein N glycosylation at asparagine-67 during viral propagation. Journal of virology
2007;81(13):7136-48.
[90] Charlier N, Molenkamp R, Leyssen P, et al. Exchanging the yellow fever virus envelope
proteins with Modoc virus prM and E proteins results in a chimeric virus that is neuroinvasive
in SCID mice. Journal of virology 2004;78(14):7418-26.
[91] Chanprapaph S, Saparpakorn P, Sangma C, Niyomrattanakit P, Hannongbua S,
Angsuthanasombat C, Katzenmeier G. Competitive inhibition of the dengue virus NS3 serine
protease by synthetic peptides representing polyprotein cleavage sites. Biochemical and
biophysical research communications 2005;330(4):1237-46.
[92] Yin Z, Patel SJ, Wang WL, et al. Peptide inhibitors of Dengue virus NS3 protease. Part 1:
Warhead. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2006;16(1):36-9.
[93] Wang QY, Patel SJ, Vangrevelinghe E, et al. A Small Molecule Dengue Virus Entry Inhibitor.
Antimicrobial agents and chemotherapy 2009.
[94] Bray M. Highly pathogenic RNA viral infections: challenges for antiviral research. Antiviral
research 2008;78(1):1-8.
[95] Vaughn DW, Green S, Kalayanarooj S, et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern,
and virus serotype correlate with disease severity. The Journal of infectious diseases
2000;181(1):2-9.
[96] Liu-Young G, Kozal MJ. Hepatitis C protease and polymerase inhibitors in development. AIDS
patient care and STDs 2008;22(6):449-57.
I
Bijlage I
Optimalisatie DENV screening assay: percentage CPE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B 66 63 62 75 94 97 98 94 93 CC
C 64 79 92 100 98 95 88 56 39
D 94 95 95 96 94 72 50 13 6
E 97 98 87 77 43 25 13 30 8
F 64 57 49 42 18 30 0 0 0
G 49 6 5 30 0 0 0 0 0
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B 100 88 56 48 19 19 0 100 100 CC
C 89 47 16 17 0 0 1 100 0
D 28 8 9 8 0 0 3 100 0
E 0 0 0 0 0 0 0 0 18
F 0 0 0 0 10 7 0 0 0
G 0 0 0 0 3 0 9 24 36
H
Vero cellen (6.000 cellen/well) werden geïnfecteerd met het DENV C6/36 P3. Na 8 dagen p.i. werd de titratie
afgelezen met ATPlite en de resultaten verwerkt tot het verkrijgen van een kwaliteit van 93 en een
virusverdunningsfactor van 1:600. Een geschikte overgang in % CPE wordt waargenomen over de volledige 96-well
plaat.
Vero-B cellen (25.000 cellen/well) werden geïnfecteerd met het DENV C6/36 P3. Na 8 dagen p.i. werd de titratie
afgelezen met ATPlite en de resultaten verwerkt tot het verkrijgen van een kwaliteit van 71 maar een
virusverdunningsfactor van 1:10. Enkel in de drie laagste virusverdunningen is voldoende % CPE waarneembaar,
waardoor de virusverdunningsfactor te laag ligt om optimaal bruikbaar te zijn in daaropvolgende assay .
