1

コード No. 285-33801 (200反応用)

コード No. 281-34501（200回用）

コード No. 199-18991（50回用）

遺伝子研究用

SARS-CoV-2 RT-qPCR Detection Kit Ver.2

SARS-CoV-2 Lysis Buffer Ver.2

目次

SARS-CoV-2 RT-qPCR Detection Kit Ver.2 p.1

SARS-CoV-2 Lysis Buffer Ver.2 p.11

SARS-CoV-2 Lysis Buffer（販売中止） p.14

本製品は、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）をTaqManⓇプローブを用いた1-step RT-qPCR法で検

出するキットです。SARS-CoV-2由来 RNAのN遺伝子 2か所（No.1 とNo.2）を標的とした独自のプラ

イマーとプローブを採用することにより、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2） 由来 RNA の高感度検出を実

現しました。

2種類のプライマーとプローブセット（No.1とNo.2）には、インターナルコントロールとしてヒト由来ハウス

キーピング遺伝子である RPL13A を検出するプライマーとプローブセットも含まれています。ヒト RPL13A

を検出することで、検体に RNAが存在することを確認できます。反応は 20μL/well（PCR Master Mix 15

μL、検体由来 RNA5μL）です。

また、高活性型 Hot Start Reverse Transcription DNA Polymerase を用いた 1酵素系 RT-qPCR

法を採用しており、通常は約 130分かかる RT-qPCR が約 50分間で完了します*。

2

別売の SARS-CoV-2 Lysis Buffer（Code No.199-18991）と併用することにより、唾液・鼻咽頭

ぬぐい液検体に含まれる RNA を精製せずに、そのまま RT-qPCR のテンプレート RNA として使用できます

（Direct qPCR）。 SARS-CoV-2 Lysis Buffer（Code No.199-18991）の使用方法は本紙

の 7 ページ目に記載しています。

*RT-qPCR に必要な時間は装置によって異なります。

TaqMan®は Roche Diagnostics K.K. の登録商標です。

【貯法】

－20℃

【ご使用の前に】

キットの各試薬は小分けをして保管し、なるべく凍結融解の回数を減らしてください。

実験施設の取り決めに従い、安全性に留意して実験を行ってください。

実験中は手袋や保護メガネなど保護具を着用してください。

試薬の調製は安全キャビネットもしくはクリーンベンチ内で行ってください。

クリーンな環境で実験を行ってください。また、RNA やヌクレアーゼの混入に注意してください。偽陽性もし

くは偽陰性の原因になります。

<クリーンベンチ清掃例>

実験器具類用 RNase不活化剤（例：RNase Knockout, コード No. 181-03381）をクリーンベ

ンチ内に噴霧し、5 分間以上経過した後にふき取ります。次に 80%エタノールを噴霧し、15 分間以上

経過した後にふき取ります。その後、UV照射を 30分以上行います。

試薬調製は氷上で行ってください。

TEバッファーなど EDTA が含まれるバッファーを使用しないでください。

【別途必要な試薬および器具】

qPCR(Real-Time PCR) 装置

マイクロチューブ遠心機

Nuclease フリー滅菌水（例:コード No. 316-90101, ニッポンジーン）

マイクロピペットおよび Nuclease フリーピペットチップ

Nuclease フリー1.5mL チューブ（DNA/RNA低吸着品が望ましい。例：Micro tube 1.5ml DNA

LowBind, Sarstedt）

qPCR(Real-Time PCR) プレートとプレートシール、もしくは qPCR(Real-Time PCR) チューブとキャ

ップ

3

【キット構成】

試薬名 容量

Hot Start Reverse Transcription DNA Polymerase 50μL

Reaction Buffer and dNTPs 1,600μL

Manganese(II) Acetate 200μL

Primers and Probes No. 1 200μL

Primers and Probes No. 2 200μL

Positive Control RNA, N gene 400μL

Distilled Water 1,600μL

2種類のプライマーとプローブセット（No.1 と No.2）には、インターナルコントロールとしてヒト由来ハウスキーピ

ング遺伝子である RPL13A を検出するプライマーとプローブセットも含まれています。

【プローブの蛍光修飾】

試薬名 SARS-CoV-2

N遺伝子

インターナルコントロール

ヒト RPL13A

Primers and Probes No. 1 FAM HEX

Primers and Probes No. 2 FAM HEX

【Positive Control RNA のコピー数*】

「Positive Control RNA, N gene」は、「Primers and Probe No. 1」と「Primers and Probe No. 2」

どちらのポジティブコントロールとしてもご使用いただけます。

試薬名 RNA コピー数

Positive Control RNA, N gene 箱ラベルに記載

*コピー数は、デジタル PCR（Stilla Technologies社 Naica™ System）による絶対定量で測定した。

4

【1 ウェル法と 2 ウェル法について】

1 ウェル法は、1 検体を 1 ウェルで検出する方法です。SARS-CoV-2 RNA のターゲット遺伝子 2 か所

（No.1とNo.2）およびヒトインターナルコントロールを1ウェルですべて検出します。陽性/陰性の判定は可能

ですが、陽性であった場合に No.1 と No.2 のどちらが増幅したのか区別はできません。

2 ウェル法は、1 検体を 2 ウェルで検出する方法です。SARS-CoV-2 RNA のターゲット遺伝子 2 か所

（No.1 と No.2）を別々のウェルで検出します。陽性であった場合に No.1 と No.2 のどちらが増幅したのか

区別できます。

【使用方法 1 ウェル法】

<試薬の準備>

1. キットに含まれる試薬を氷上で融解します。

2. 各試薬をボルテックスミキサーでよく混合した後、遠心機でスピンダウンします。

1. 陽性コントロールの作製

「Positive Control RNA, N gene」をキット付属の「Distilled Water」、あるいは市販品などの Nuclease

フリー滅菌水で希釈*し、任意のコピー数に調製します。作製にはNuclease フリー1.5mLチューブを使用しま

す。

*希釈に TE バッファーなど EDTA が含まれるバッファーを使用しないでください。

2. PCR Master Mixの作製

下表を参考に PCR master mix を必要量作製します。

ROX を使用する場合、PCR Master Mix に ROX を添加し、「Distilled Water」で 1 ウェル分がトータル

15uL となるようにします。

[PCR master mix の調製表]

部材名 １ウェル分, μL 20 ウェル分, μL

Distilled Water 3.75 75

Reaction Buffer and dNTPs 8.00 160

Manganese(II) Acetate 1.00 20

Primers and Probes No. 1 1.00 20

Primers and Probes No. 2 1.00 20

Hot Start Reverse Transcription DNA Polymerase 0.25 5

Total 15.0 300

5

3. qPCRプレートへ PCR Master Mixの添加

PCR Master Mix をプレートの各ウェルへ 15μLずつ添加します。

4. 陰性コントロール、検体、陽性コントロールの添加

PCR Master Mix を添加した各ウェルへ以下を添加します。

(1). 陰性コントロール用ウェルへ陰性コントロール（例:Nuclease フリー滅菌水）を 5μL加えます。

(2). 陽性コントロール用ウェルへ陽性コントロール RNA を 5μL加えます。

(3). 検体用のウェルへ検体由来 RNA を 5μL加えます。

(4). プレートシールでウェルプレートを閉じます。

<96 ウェルプレートのサンプル配置例>

検体 4種類、陽性コントロール 1種類、陰性コントロール 1種類、n=2 の例です。

Posi:陽性コントロール, Nega:陰性コントロール, S1-S4:検体

1 2 3 4 5 6 7 8 9-12

A

B Posi S1 S2 S3 S4

C Posi S1 S2 S3 S4

D Nega

E Nega

F

G

H

5. RT-qPCR反応

qPCR(Real-Time PCR) 装置にプレートをセットし、以下のプログラムを設定します。プログラムを設定後、

反応をスタートさせます。

反応条件

Predenature 90℃, 30 sec. Reverse transcription 60℃, 10 min. Predenature 95℃, 1 min. Denature 95℃, 3 sec.* Annealing & Extension 60℃, 5 sec.*

45 cycles

6

*装置によっては短い時間（3 秒間や 5 秒間）を設定できない場合があります。その場合は、装置の設定可能な最短時間をプログラム

します。

6. 検出

装置のプロトコルに従い、結果を確認します。

7. 結果の解釈

(1)ヒトインターナルコントロール[HEX]

まずヒトインターナルコントロール[HEX]が 40 サイクル以内で検出されたことを確認します。

40 サイクルを超えて検出された場合および未検出の場合は再検査を推奨します。再検査においても同様に

40 サイクルを超えて検出された場合および未検出の場合、検体あるいは検査過程に問題がある可能性があ

ります。SARS-CoV-2 の検査判定はできません。

ヒトインターナルコントロール(HEX)

Ct値 判定

≦40 陽性

＞40 または未検出 再検査

(2)SARS-CoV-2(FAM)

次に SARS-CoV-2(FAM)の Ct値を確認します。

40サイクル以下で検出された場合は陽性です。また、サイクル数が45以内に検出されなかった場合は陰性で

す。

サイクル数が＞40 かつ≦45 で検出された場合は再検査を推奨します。再検査の結果、一度目と同様にサイ

クル数＞40 かつ≦45 で検出された場合、陽性と判定することを推奨します。

SARS-CoV-2(FAM)

Ct値 判定

≦40 陽性

＞40 かつ≦45 再検査を推奨

未検出 陰性

7

【使用方法 2 ウェル法】

<試薬の準備>

1. キットに含まれる試薬を氷上で融解します。

2. 各試薬をボルテックスミキサーでよく混合した後、遠心機でスピンダウンします。

1. 陽性コントロールの作製

「Positive Control RNA, N gene」をキット付属の「Distilled Water」、あるいは市販品などの Nuclease

フリー滅菌水で希釈*し、任意のコピー数に調製します。作製にはNuclease フリー1.5mLチューブを使用しま

す。

*希釈に TE バッファーなど EDTA が含まれるバッファーを使用しないでください。

2. PCR Master Mixの作製

下表に従い、「Primers and Probe No. 1」と「Primers and Probe No. 2」の PCR master mix をそ

れぞれ必要量作製します。

ROX を使用される場合、PCR Master Mix に ROX を添加し、「Distilled Water」で 1 ウェル分がトータル

15uL となるようにします。

[Primers and Probe No. 1の PCR master mix]

部材名 １ウェル分, μL 20 ウェル分, μL

Distilled Water 4.75 95

Reaction Buffer and dNTPs 8.00 160

Manganese(II) Acetate 1.00 20

Primers and Probes No. 1 1.00 20

Hot Start Reverse Transcription DNA Polymerase 0.25 5

Total 15.0 300

[Primers and Probe No. 2の PCR master mix]

部材名 １ウェル分, μL 20 ウェル分, μL

Distilled Water 4.75 95

Reaction Buffer and dNTPs 8.00 160

Manganese(II) Acetate 1.00 20

Primers and Probes No. 2 1.00 20

Hot Start Reverse Transcription DNA Polymerase 0.25 5

Total 15.0 300

8

3. qPCRプレートへ PCR Master Mixの添加

作製した 2種類の PCR Master Mix それぞれをプレートの各ウェルへ 15μLずつ添加します。

No.1 と No.2 の PCR master mix は、別々のウェルに添加します。

4. 陰性コントロール、検体、陽性コントロールの添加

PCR Master Mix を添加した各ウェルへ以下を添加します。

(1). 陰性コントロール用ウェルへ陰性コントロール（例:Nuclease フリー滅菌水）を 5μL加えます。

(2). 陽性コントロール用ウェルへ陽性コントロール RNA を 5μL加えます。

(3). 検体用のウェルへ検体由来 RNA を 5μL加えます。

(4). プレートシールでウェルプレートを閉じます。

<96 ウェルプレートのサンプル配置例>

検体 4種類、陽性コントロール 1種類、n=2 の例です。

Posi : 陽性コントロール, Nega : 陰性コントロール, S1-S4 : 検体

No.1: PCR Master Mix No.1, No.2 : PCR Master Mix No.2

1 2 3 4 5 6 7 8 9-12

A

B posi(No.1) S1(No.1) S2(No.1) S3(No.1) S4(No.1)

C posi(No.2) S1(No.2) S2(No.2) S3(No.2) S4(No.2)

D nega(No.1) S1(No.1) S2(No.1) S3(No.1) S4(No.1)

E nega(No.2)

S1(No.2) S2(No.2) S3(No.2) S4(No.2)

F

G

H

9

5. RT-qPCR反応

qPCR(Real-Time PCR) 装置にプレートをセットし、以下のプログラムを設定します。反応終了後は 4℃と

なるように設定します。プログラムを設定後、反応をスタートさせます。

反応条件

Predenature 90℃, 30 sec. Reverse transcription 60℃, 10 min. Predenature 95℃, 1 min. Denature 95℃, 3 sec.* Annealing & Extension 60℃, 5 sec.*

*装置によっては短い時間（3 秒間や 5 秒間）を設定できない場合があります。その場合は、装置の設定可能な最短時間をプログラム

してください。

6. 検出

装置のプロトコルに従い、結果を確認します。

7. 結果の解釈

(1)ヒトインターナルコントロール[HEX]

まずヒトインターナルコントロール[HEX]が 40サイクル以内で検出されたことを確認します。40サイクルを超えて

検出された場合および未検出の場合は再検査を推奨します。再検査において、40 サイクルを超えて検出され

た場合および未検出の場合、検体あるいは検査過程に問題がある可能性があります。

ヒトインターナルコントロール(HEX)

Ct値 判定

≦40 陽性

＞40 または未検出 再検査

(2)SARS-CoV-2(FAM)

次に SARS-CoV-2(FAM)の Ct値を確認します。No.1 と No.2 のどちらかのみが陽性になった場合であって

も SARS-CoV-2陽性と判定します。

40 サイクル以下で検出された場合は陽性です。また、45 サイクル以下で検出されなかった場合は陰性です。

サイクル数が＞40 かつ≦45 で検出された場合は再検査を推奨します。再検査の結果、一度目と同様にサイ

クル数＞40 かつ≦45 で検出された場合、陽性と判定することを推奨します。

45 cycles

10

SARS-CoV-2(FAM)

Ct値 判定

≦40 陽性

＞40 かつ≦45 再検査を推奨

未検出 陰性

11

【オプション：検体を直接サンプルとして使用する場合（Direct RT-qPCR）】

唾液あるいは鼻咽頭ぬぐい液を検体とする場合、以下の SARS-CoV-2 Lysis Buffer Ver.2（コード No.

281-34501）を用いることで、RNA を精製せず RT-qPCR のテンプレート（サンプル）RNA を調製できま

す。

コード No. 281-34501（200回用）

SARS-CoV-2 Lysis Buffer Ver.2

SARS-CoV-2 Lysis Buffer Ver.2 は、唾液および鼻咽頭ぬぐい液に含まれる新型コロナウイルス（ SARS-CoV-2 ）

由来の RNA を抽出する試薬です。本製品は Solution A と Solution B で構成されます。

酵素と界面活性剤で SARS-CoV-2の構造を壊すことで RNAを抽出します。RNAの精製が不要になり、短時間かつ簡

便にリアルタイム RT-PCR用のテンプレート RNA を調製できます。

抽出した RNAは、SARS-CoV-2 RT-qPCR Detection Kit Ver.2（コード No. 285-33801）を用いてリアルタイム

RT-qPCR を行ってください。

【貯法】

-20℃

【有効期限】

ラベルに記載

【ご使用の前に】

実験施設の取り決めに従い、安全性に留意して実験を行ってください。

実験中は手袋や保護メガネなど保護具を着用してください。

操作中はヌクレアーゼの混入に注意してください。

操作は氷上で行ってください。

【別途必要な試薬および器具】

マイクロチューブ遠心機（ピペッティングで混合する場合は不要）

ボルテックスミキサー（ピペッティングで混合する場合は不要）

マイクロピペットおよび Nuclease フリーピペットチップ

Nuclease フリー1.5mL チューブ（DNA/RNA低吸着品が望ましい。例：Micro tube 1.5ml DNA

LowBind, Sarstedt）

12

氷もしくは保冷剤

【キット構成】

試薬名 容量

Solution A 200μL

Solution B 200μL

【使用方法の流れ】

【使用方法】

1. 5μLの検体を Nuclease フリーの 1.5mL マイクロチューブに移します。

2. そこへ Solution A を 1μL添加します。

3. ボルテックスミキサーもしくはピペッティングで混合します*。

4. チューブの蓋を閉めて 5分以上室温で静置します。

5. ヒートブロックにチューブをセットし、95℃で 5分間加熱します。

6. チューブを氷上もしくは保冷剤上に置いて冷却します。

7. チューブへ Solution B を 1μL添加します**。

8. ボルテックスミキサーもしくはピペッティングで混合します*。

検体の前処理は完了です。

9. 事前に調製した PCRマスターミックス 15μLを前処理済み検体のチューブに添加します（液量 22μ

L/チューブ）***。

10. ボルテックスミキサーもしくはピペッティングで混合します*。

11. 全量の 22μL を PCR チューブに移し、RT-PCR を行います。

* ボルテックスミキサーで攪拌した場合、マイクロチューブ遠心機でスピンダウンしてから次の工程に移ります。

13

**Solution Bは PCR マスターミックスにあらかじめ混合しておくこともできます。Solution B が 1 ウェルあたり 1μL となる

量を PCR マスターミックスに添加します。15μL/ウェルの PCR マスターミックスの場合、Solution B を 1μL/ウェル添加する

ので、合計 16μL/ウェルの PCR マスターミックスとなります。

*** 事前に PCRチューブに PCRマスターミックス 15μLを添加しておき、そこへ前処理済み検体 7μLを添加する方法で

も問題ありません。

14

【オプション：検体を直接サンプルとして使用する場合（Direct RT-qPCR）】

唾液あるいは鼻咽頭ぬぐい液を検体とする場合、SARS-CoV-2 Lysis Buffer（コード No. 199-18991）

を用いることで、RNA を精製せず RT-qPCR のテンプレート（サンプル）RNA を調製できます。

コード No. 199-18991（50回用）

SARS-CoV-2 Lysis Buffer

SARS-CoV-2 Lysis Buffer は、唾液および鼻咽頭ぬぐい液に含まれる新型コロナウイルス

（SARS-CoV-2）由来の RNA を抽出する試薬です。SARS-CoV-2 Lysis Buffer は、主に界面活性

剤と還元剤が含まれ、SARS-CoV-2 の構造を壊すことで RNA を抽出します。RNA の精製が不要になり、

短時間かつ簡便にウイルス RNA を抽出できるため、作業者の感染リスクを低減します。

抽出した RNAは、SARS-CoV-2 RT-qPCR Detection Kit ver.2（コード No. 286-32851）のテンプ

レート（サンプル）RNA として使用できます。

【貯法】

-20℃

【有効期限】

ラベルに記載

【ご使用の前に】

実験施設の取り決めに従い、安全性に留意して実験を行ってください。

実験中は手袋や保護メガネなど保護具を着用してください。

操作中はヌクレアーゼの混入に注意してください。

操作は氷上で行ってください。

SARS-CoV-2 Lysis Buffer Ver.2（コード No. 281-34501）の発売に伴い、

本製品は 2020年 11月に販売を中止しました。

15

【使用方法の流れ】

【使用方法】

<試薬と検体の準備>

1. 検体と本品を氷上で融解します。

本品に析出物が見られる場合、40°C程度にチューブを温め、析出物を完全に溶解します。溶解後

は氷上で冷却します。

加温には恒温水槽やヒートブロックを使用します。

2. 検体をボルテックスミキサーで攪拌し、スピンダウンします。氷上で冷却します。

3. 本品を転倒混和やピペッティングで穏やかに攪拌し、スピンダウンします。氷上で冷却します。

本品をボルテックスミキサーで攪拌すると、多量の泡が発生します。多量の泡が発生した場合、軽く

遠心分離し、泡がなくなるまで氷上に静置します。

<RNA の抽出>

1. 45μLの検体をマイクロチューブに移します。マイクロチューブは氷上に置きます。

2. 5uLの SARS-CoV-2 Lysis Buffer をマイクロチューブに添加します。

3. ボルテックスミキサーで混合します。

4. ヒートブロックもしくはリアルタイム PCR装置を使用し、チューブを 90℃で 5分間加熱します。

5. チューブを氷上に戻して冷却します。テンプレート（サンプル）RNA の調製は完了です。

6. リアルタイム PCR 装置プレートを氷上で冷却しながら、テンプレート（サンプル）RNA と PCR マスタ

ーミックスをアプライします。

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<改訂履歴>

2020年 12月 22日 SARS-CoV-2 Lysis Buffer Ver.2 の使用方法の注釈に Solution B を PCR マスターミックス

へ添加する方法を追記。

2020年 11月 4日 SARS-CoV-2 Lysis Buffer Ver.2 を追加。

SARS-CoV-2 RT-qPCR Detection Kit Ver.2 に含まれる Primers and Probe No. 1、

Primers and Probe No. 2 の容量が 100uL から 200uL に増量されたため、キット構成の容

量を変更。

SARS-CoV-2 Lysis Buffer に販売中止を追加。

2020年 10月 8日 SARS-CoV-2 Lysis Buffer の使用方法からスピンダウンを削除。

2020年 9月 28日 1 ウェル法を追加。サイクル数別の結果の解釈を追加。

2020年 8月 20日 3.qPCR プレートへ PCR Master Mix の添加の文章を追記。

2020年 8月 7日 クリーンベンチ清掃例を追記。サンプル配置例を訂正。その他表現を変更。

2020年 7月 30日 初版