Nofima har oppnådd akkreditering av en ny analysemetode for salmonellabakterier basert på RealTime PCR (Polymerase Chain Reaction). Metoden er den hurtigste i markedet og gir negative analysesvar etter kun ett døgn. PCR-positive prøver bekreftes med konvensjonell metodikk. Metoden er akkreditert for analyse av fôr, fôringredienser, næringsmidler og hygiene prøver fra pro duksjonslinjene i slike virksomheter.

Salmonellaanalyse med RealTime PCR

Mattilsynets krav

Mattilsynet krever at salmonella-analyser som skal kunne brukes i deres tilsynsvirksomhet, skal være akkreditert og utført med metodikk som er “internasjonalt anerkjent” eller “dokumentert å gi tilsvarende resultater som den spesifiserte metodikk”. Virksomheter som kjøper slike analysetjenester skal kunne dokumentere overfor Mattilsynet at metoden som er brukt tilfredsstiller disse krav.

Referansemetoder

I de nordiske land er den konvensjonelle metoden NMKL 71 anerkjent som referansemetode for salmonellaanalyse. NMKL 71 ligger nært opp til den internasjonale referansemetoden ISO 6579. Alternative metoder skal valideres ved sammenligning med en anerkjent referansemetode.

Prinsipp for den kombinerte RealTime PCR/NMKL 71-metoden

RealTime PCR er en prosess for massekopiering og sanntids deteksjon av DNA-segmenter. Ved hjelp av en reagensblanding (primere, prober, enzymer, mm.) kan et kjent “target” DNA-segment kopieres opp i stort antall. Prosessen styres av en temperatursyklus som repeteres 45 ganger og resulterer i opptil 35.000.000.000.000 (245) kopier av target DNA. PCR-maskinen som benyttes ved Fiskeriforskning bruker knapt ett minutt på hver syklus.

Hver PCR-kjøring tar derfor under én time.

Før selve PCR-analysen foretas preanrikning (20 t), subkultivering (3 t) og DNA-ekstraksjon (0,5 t) av prøvene. Total analysetid er derfor ca 24 timer.

Eventuelle PCR-positive prøver videreføres med NMKL 71 som innebærer isolering og biokjemisk/serologisk konfirmering av Salmonella. Tilgjengelige isolater er en forutsetning for all videre verifisering og typebestemmelse som kan kreves av Mattilsynet som underlag for epidemiologiske undersøkelser o.l.

Et viktig trinn i NMKL-71 metoden er isolering av Salmonella kolonier fra selektive diagnostiske agar-medier. Salmonella danner karakteristiske rød-fiolette kolonier på OSCM-mediet (t.h.) og svarte kolonier på XLD-mediet (lengst t.h.).

Akkreditering

Akkreditering av Nofimas PCR-baserte metode for salmonellapåvisning ble gitt av Norsk Akkreditering i oktober 2006.

Akkreditering innebærer en offisiell anerkjennelse av at organisasjonen har kompetanse og evne til å utføre angitte oppgaver i samsvar med gitte kravdokumenter. Organisasjonen tilfredsstiller den internasjonale standarden for prøvings- og kalibreringslaboratorier NS-EN ISO/IEC 17025 og utfører analysene i samsvar med nærmere spesifisert metodikk.

Les mer om Nofimas analysetjenester på http://www.nofima.no

Valideringer

Organisasjon Antall

prøver

Rel. sensi-

tivitet (%)

Rel. spesi-

fisitet (%)

Deteksjons-

grense antall

pr. 25 gram

NorVal 1) 840 100 99 1

AOAC 2) 440 100 100 1 - 10

Fiskeriforskning 3) 60 100 100 1 - 10

1) NorVal Certificate for Roche Diagnostics LightCycler Foodproof Salmonella Detection Kit in combination with ShortPrep Foodproof I Kit (Ref.no.: 2005-30-5408-00052). 2) AOAC Certificate of Performance Tested Status. Roche Diagnostics LightCycler Foodproof Salmonella Detection Kit for Salmonella sp. in combination with ShortPrep Foodproof I Kit (Certificate no. 1203019).3) Validering av alternative metoder for salmonellapåvisning (Fiskeriforskning Rapport K-306).

Laboratoriets rutiner

Salmonellaanalysene startes normalt på samme dag som prøvene mottas. For å oppnå kortest mulig analysetid, gjennomføres en fast vaktordning i helger og på helligdager. Laboratoriets leveringsdyktighet sikres også ved at fem analytikere er godkjent for selvstendig utførelse av analysen. Analysebevis sendes til kunde per e-post samme dag som analysene avsluttes. I tillegg sendes bevisene per post.

LightCycler 1.5 instrumentet (Roche Diagnostics, GmbH, Tyskland) benytter luft i stedet for konvensjonell termoblokk til oppvarming og kjøling. Derved oppnås en svært hurtig og ensartet temperaturdistribusjon i reaksjons-kapillærene. Instrumentet har plass til 32 prøver samtidig.

Skjermbildet viser at ”target” DNA fra Salmonella er påvist i 2 av 26 prøver. Den ene er en positiv “templat” som analyseres parallellt med hver prøveserie for å kontrollere at prosessen fungerer normalt. Ved en annen bølgelengde avleses resultater for internkontrollen som er tilsatt i alle prøvene. Internkontrollens funksjon er bl.a. å avdekke produktinhibering, dvs. hemming av PCR prosessen som kan forårsakes av visse bestanddeler i prøvematerialet som analyseres.

BioLab, Bergen

Kjerreidviken 16 NO-5141 Fyllingsdalen

Postadresse: Nofima Postboks 1425 Oasen NO-5828 Bergen

Tlf. 02140

http://www.nofima.no/forskningsomrade/biolab

Kontaktpersoner:

Analysetjenester: Arne Brodin, leder BioLab Analyse, tel. 55 50 12 11, mobil 41 50 40 11, arne.brodin@nofima.no Halvor Nygaard, seniorforsker, tel. 55 50 12 33, halvor.nygaard@nofima.no

Generell informasjon: Jarle Wang-Andersen, leder BioLab, tel. 55 50 12 46, jarle.wang-andersen@nofima.no

Nofima er et av Europas største næringsrettede forskningsinstitutt som driver forskning og utvikling for akvakulturnæringen, fiskerinæringen og matindustrien.

Instituttet ble etablert 1. januar 2008 og har om lag 380 ansatte. Årlig omsetning er rundt 530 millioner kroner.

Vi leverer internasjonalt anerkjent forsk-ning og løsninger som gir næringslivet konkurransefortrinn langs hele verdi-kjeden.

Nofima AS har hovedkontor i Tromsø, og forskningsvirksomhet i Bergen, Stavanger, Sunndalsøra, Tromsø og på Ås.