Curso PCR 2011-2012

Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa)

Curso PCR

2011-12

Inmaculada Martín Burriel

minma@unizar.es

Curso PCR 2011-2012

Programa:• Miércoles 18 de enero (10 h) Aula Grados:

– PCR en Tiempo Real (teoría)– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:

• Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie– Protocolo experimental (15 h) Aula Grados

• Diseño de primers y sonda (Primer express).• Validación de primers.• Optimización de la reacción:

– Matriz de primers– Matriz de sonda

• Curva standard.

– Normalización de datos de expresión

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Programa:• Jueves 19 de enero (10h) LAGENBIO:– Práctica: Realización de una PCR en

tiempo real. – Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real :

• Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie

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PCR clásico• La cantidad de producto

no está relacionada con la cantidad de DNA inicial

• Herramienta cualitativa (presencia o ausencia)

• El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial

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Técnicas de cuantificación• Northern Blot

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Early expression of p53 responsive genes (24h)

Bax

CD95/Fas

GAPDH

L C 6 8 10 12 M

PCR Competitivo o PCR “Mimic”

Martín-Burriel et al. (2004)

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Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers

Bcl-2

Tgf-b1

c-myc

L C 6 8 10 12 M

PCR Competitivo o PCR “Mimic”

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Martín-Burriel et al. (2004) Toxicol Pathol

PCR Competitivo o PCR “Mimic”

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Necesidad de PCR en tiempo real

• Necesidad de cuantificar diferencias de expresión de un mRNA

• Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mRNA en algunas prácticas laboratoriales:– Células obtenidas de microdisección por láser– Pequeñas cantidades de tejido– Biopsias embrionarias– Especimenes de gran valor

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PCR en Tiempo Real

Detección de productos PCR en tiempo real

Permite observar la cinéticade la reacción

Nuevos químicos

Nuevas plataformas instrumentales

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Fases de la PCR

• Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto.• Lineal: enlentecimiento, consumo de

componentes, principio de degradación.• Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de

componentes, degradación de productos.

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Fases de la PCR

Lineal

Logarítmica

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Detección en la fase exponencial

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Detección en la fase de meseta

Problemas de cuantificación en la fase de meseta

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PCR en Tiempo Real

• Toma los datos mientras se producen.

• Cuantificación más exacta sin necesidad de métodos laboriosos.

• Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado.

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Flurocromos: SYBR Green

• Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia.

• No es equimolecular.• Necesaria curva de

disociación.

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Curva de disociación

Tª Melting:- Composición de bases del fragmento- Tamaño del fragmento.

-Tm dimeros < Tm fragmento

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Curva de disociación

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Curva de disociación

Muestras problema Controles negativos y sin RT

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Ventajas e inconvenientes

• PCR con SYBR Green:– Más barato– Los mismos reactivos sirven para analizar

cualquier fragmento– La especificidad viene dada únicamente por

los primers– No es equimolecular– Se necesita realizar una curva de disociación

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Sondas TaqMan

• Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa.• Reporter: FAM, VIC.• Quencher: TAMRA.• Importante tªm (~70ºC).• Equimolecular.

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Especificidad

Diseño de sondas entre dos exones

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Equimolaridad

TaqMan SYBR Green

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Sondas MGB

• NFQ: Quencher oscuro, no

emite fluorescencia. Disminuye Baseline. Aumenta sensibilidad.• MGB: Se une al surco

pequeño. Aumenta la Tªm. Aumenta la eficiencia.

R NFQMGB

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Ventajas e inconvenientes

• PCR con Sondas TaqMan:– Más caro– Utilización de sondas específicas para

cada fragmento a analizar– La especificidad viene dada por los

primers y la sonda– Es equimolecular– No necesita curva de disociación

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Aplicaciones de la PCR-TR

• Glosario de términos.

• Cuantificación:– Absoluta– Relativa

• Determinación de mutaciones.

• Ensayos +-

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Aplicaciones de la PCR-TR

• Glosario de términos.

• Cuantificación:– Absoluta– Relativa

• Determinación de mutaciones.

• Ensayos +-

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• Cuantificación:– Absoluta:

• Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...).

• Se necesita una curva patrón absoluta.

– Relativa:• Resultado sin unidades. Proporciona un

porcentaje de incremento o disminución (expresión génica).

• Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers).

Glosario de términos

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Glosario de términos• Referencia:

– Señal utilizada para normalizar el experimento.• Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX).

• Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción).

• Calibrador:– Muestra que usamos para comparar las demás.

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• Standard (patrón):– Muestra de concentración conocida que

nos permite construir la curva de calibrado.

• Threshold (umbral):– Ct es el ciclo en el cual se detecta un

incremento significativo de Rn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR (Fase exponencial)

Glosario de términos

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Aplicaciones de la PCR-TR

• Glosario de términos.

• Cuantificación:– Absoluta– Relativa

• Determinación de mutaciones.

• Ensayos +-

Métodos de cuantificación

• Curva estándar

• Delta Ct

• Método de Pfaffl

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Curva estándar

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Curva estándar

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Curva Patrón

• y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA].• Relaciona cada concentración con su Ct.• Propia de cada pareja de primers.• La pendiente depende de la eficiencia de los

primers y no debería cambiar entre experimentos:– 100% (a=-3.32).– 75% (a=-4).– Aceptable:-3 ≤ -4.– a> -3 contaminación por fluorescencia.

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• Correlación (R2):– R2=1 (perfecta).– R2≥0.97 (0.99).– Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima.– Mantener el umbral entre experimentos.

• Nº de réplicas:– Al menos 2 réplicas por muestra.– Desviación estándar ≤ 0.38

• Muestra:– Curva absoluta: muestra de [] conocida.– Diluciones 1/5.

Curva Patrón

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1. Cuantificación Absoluta• Validación de la curva patrón:

– La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones.

– Patrones:• DNA plasmídico.• DNA genómico.• Productos PCR.• Grandes oligonucleótidos comerciales.

– Resultado final relativo a una unidad de interés:• Copias/ng de RNA• Copias/g tejido, copias/ml sangre.• Copias/genoma.• Copias/ célula.

ATENCIONDENOMINADOR

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• Posibles curvas de calibrado (Expresión génica):– Productos de RT-PCR u oligonucleótidos:

• Rápido, conocimiento preciso de [DNA].• Inestable, problemas en la reamplificación.

– DNA recombinante:• Muy estable, sin problemas de amplificación, talla

similar a transcritos.• Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la

eficacia de la RT.

– RNA recombinante:• Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir

RNA background).• Muy inestable, clonación complicado, purificación,

problemas de almacenamiento.

1. Cuantificación Absoluta

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1. Cuantificación Absoluta

• Puntos críticos de la curva patrón:– DNA o RNA puro y muy concentrado.– Exactitud en la medida de la concentración

inicial (7 veces).– Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA

original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas (106-1012).

– Estabilidad de las muestras patrón (RNA).

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• Curva patrón:– Sencillez en la preparación.– La cantidad de producto (n veces) se refiere a

la obtenida en el calibrador (1x).– No hay unidades.– Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para

la obtención.

2. Cuantificación Relativa

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2. Cuantificación Relativa

• Puntos críticos de la curva patrón:– Dilución adecuada del RNA o DNA patrón.– La utilización de las mismas muestras en

placas distintas permite comparar resultados.– Se pueden utilizar patrones DNA para análisis

de RNA.– Se necesitan curvas patrón para el gen de

estudio y el control endógeno.

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Cuantificación de la expresión génica

Referencia activa:

Muestra 1 Muestra 2

Gen problema 4 8

Control endógeno 2 16

ratio 2 0.5

Control de la eficiencia de la Retro-transcripción. Control de la eficiencia de la extracción de RNA. Buscar referencias bibliográficas. Utilizar tres endógenos.

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Análisis de expresión CON curva patrón

Gen Referencia: GAPDH Gen Estudio: SPP1

T0T7

27.36

-0.2

0.627 Cantidad relativa

27.68

-0.3

0.49

-0.42

0.38 Cantidad relativa

-1.92

0.0121

16.62

21.58

0.49/0.0121

0.627/0.38= 24.54

Qgen trat/Q norm trat

Q gen Ctrl/Q norm Ctrl=Fold Change

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Cuantificación RelativaLa eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados.

Método de Pfaffl (2001)

Curso PCR 2011-2012http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/dnaveff.jpg

Eficiencia: pendiente de la curva patrón

• eficiencia =10-1/pendiente

• Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2

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Método de Pfaffl (2001)

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• Método de comparación de Ct= 2-Ct

Ct= Ct , muestra-Ct, calibrador

Ct , muestra: Valor de Ct para una muestra normalizado con el del control endógeno.

Ct , calibrador: Valor de Ct para el calibrador normalizado con el del control endógeno.

=2-CtExpresión gen/ Expresión basal del gen

Expresión endógeno/ Expresión basal endóg

Análisis de expresión SIN curva patrón

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• Método de comparación de Ct

• Se basa en la eficiencia de los primers• Se refiere a la muestra con mayor cantidad de

gen de estudio (o menor Ct)• Q = e(menor Ct- Ct muestra)

• e =10-1/pendiente

• Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2

Análisis de expresión SIN curva patrón

Ejemplo

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2. Cuantificación Relativa

• PCR Múltiple:– Amplificación del gen de interés y el

endógeno en el mismo tubo.– Reporter: 6-FAM y JOE.– Evitar competición en la reacción:

• Limitar la concentración de primers del gen más abundante.

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Cuantificación Relativa

• Elección del método:– Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos

distintos y usar curva patrón: • Rápida optimización y validación.

– Utilización del método 2-Ct : • Se necesitan eficiencias de amplificación similares.• No necesita curva patrón. • Elimina los errores de dilución de la curva patrón.• Preferible el método de Pfeffl una vez calculada la eficiencia

– PCR Múltiple: • Más puesta a punto.• Mayor rapidez de análisis.

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Aplicaciones de la PCR-TR

• Glosario de términos.

• Cuantificación:– Absoluta– Relativa

• Determinación de mutaciones.

• Ensayos +-

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Polimorfismo de SNPs

• Sondas alelo-específicas.

• Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor discriminación.

• Utilización de oligos alelo-específicos y SYBR Green.

• Las curvas de disociación discriminan alelos.

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CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG GC TCC AAC

CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC

Sonda 1

Metodología

Reverse

Forward

ryr-1:

Protocolo:Componentes de la reacción Volumen /

Reacción(l)

Final concentración

TaqMan® Universal PCRMaster Mix, No AmpErase® UNG (2X)

12,5 1X

40X Assay Mix (Mescla de cebadores y sondas)

0,625 1X

DNA 2 1-20 ng

H2O 9,875 ---

Total 25

Pre-lectura:60ºC 1min

Post-lectura:60ºC 1min

PCR:95ºC 10min92ºC 15sec60ºC 1min

(x50)

Sonda 2 FAMVIC

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Resultados

CC

CT

TTNTC

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Aplicaciones de la PCR-TR

• Glosario de términos.

• Cuantificación:– Absoluta– Relativa

• Determinación de mutaciones.

• Ensayos +/-

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Ensayos +/-

• Se marca el ensayo con sonda TaqMan o SYBRGreen.

• Adición de un control interno positivo (control de amplificación).

Eliminar Falsos Negativos

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Programa:• Viernes 14 de enero (9:30 h) Aula Máster:

– PCR en Tiempo Real (teoría)– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:

• Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie

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Programa:• Miércoles 20 de enero Aula Máster :

– Práctica: Realización de una PCR en tiempo real.

– Protocolo experimental:• Diseño de primers y sonda (Primer express).• Validación de primers.• Optimización de la reacción:

– Matriz de primers– Matriz de sonda

• Curva standard.

– Normalización de datos de expresión– Ejemplo: estabilidad de HKG en scrapie.

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Diseño primers

• Tamaño amplicon: 50-150pb

• %GC: 20-80%

• Máximo 2/5 G o C en el extremo 3’

• Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se recomiendan longitudes <18pb)

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Diseño de primers y sonda (Primer express).

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Diseño de primers

• Tm: 58-60ºC– Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está

unida y el 50% despegada– Si se pega más del 50%más posibilidad de

inespecificidades– En tiempo real: Tª=Tm

• Diferencia de Tm entre los dos primers < 2ºC

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Diseño de primers

Primer F: Tm 58ºC Primer R: Tm 60ºC

PCR: 60ºC

[Primer F]

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Matriz de Primers

Primer Forward

Prim

er Reverse

50nM 300nM 900nM

50nM 2X 2X 2X

300nM 2X 2X 2X

900nM 2X 2X 2X

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Matriz de primers< Ct > Sensibilidad> Rn primers no limitantes

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Diseño de sondas

• Tm sonda 10ºC > Tm primers• Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente

antes de la mayor eficiencia de la polimerasa• GC: 20-80%• Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB)• Nunca puede haber G en el extremo 5’

(quencher natural)• <4G continuas• Procurar [C]>[G]

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Matriz de sonda

• Se realiza tras la optimización de los primers (para ello sonda a 250nM)

• Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a 225nM Componentes de la reacción Volumen / Reacción

(l)Final concentración

TaqMan® Universal PCRMaster Mix, No AmpErase® UNG (2X)

12,5 1X

Forward 1 900/300/50 nM

Reverse 1 900/300/50 nM

Sonda 1,25 250 nM

H2O 8,25 ---

DNA 1 50 ng

Total 25

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250 nM

200 nM

150 nM

100 nM

50 nM

Matriz de sonda

< Ct > Sensibilidad> Rn no limitante

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Recta patrón Gen Referencia

Nos muestra la eficiencia de los primers:

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Recta Patrón: Gen de estudio

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Control de la curva patrón

• Seleccionar el umbral (manualmente) para obtener la mayor correlación (>0.99)

• Asegurarnos de que las curvas de melting son adecuadas

• Confirmar que las pendientes de las muestras son iguales en vista logarítmica

• Eliminar muestras de las diluciones que se entrecrucen

• Eliminar muestras que se amplifican a Ct<10• La curva debe tener 5 o + puntos

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Etapas del análisis de expresión

• Extracción de RNA

• Retrotranscripción

• Análisis de la expresión del gen (genes) de referencia

• Análisis de la expresión del gen de estudio

• Normalización

• Análisis de los resultados

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Retrotranscripción

• El paso más delicado por la baja eficiencia de la enzima

• Distintas retrotranscriptasas en función del experimento: – Expresión génica (MLMv o modificaciones)– rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA

difíciles)• Primers:

– Random Hexamers expresión– Poly(dT)– Específico (la eficiencia de la RT dependerá del

primer) virus

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Errores más comunes

1. Mal diseño de primers y sondas:– Utilizar software:

• Obtener la Tm óptima, • Evitar complementariedad entre primers, • Observar estructura secundaria• Atención al tamañio del amplicón

– Elegir primers en la unión de exones– Eficiencia pobre

2. Pobre calidad del RNA:– Los amplicones cortos (70-250bp) toleran cierta

degradación– Para una buena cuantificación, evitar la degradación

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Errores más comunes

3. No utilizar master-mix:– Los errores de pipeteo se amplifican– Minimiza la variación entre muestres y

réplicas– Rox en master-mix.

4. Contaminación:– Utilizar siempre un NTC

5. No utilizar un “–RT” control

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Errores más comunes

6. Usar un control de normalización inadecuado:– Elegir controles estables– ¿Existen referencias bibliográficas en nuestro modelo?

7. No hacer curvas de disociación con SYBR-Green:– Podemos “cuantificar dímeros” o bandas contaminantes

8. No elegir adecuadamente “baseline” y “threshold”• Baseline: 2 ciclos antes que el Ct de la muestra más

abundante• Threshold: en fase exponencia (al menos a 10 desviaciones

estándar del inicio de baseline

9. Utilizar curvas estándar de rango inapropiado