REZISTENCIJA BAKTERIJA MLE^NE KISELINE NA ......tencije" (Levy i Salyers, 2002) postavljen je jo{ daleke 1998. godine u cilju pro-movisanja studija o selekciji i diseminaciji nepatogenih

$Page 1: REZISTENCIJA BAKTERIJA MLE^NE KISELINE NA ......tencije" (Levy i Salyers, 2002) postavljen je jo{ daleke 1998. godine u cilju pro-movisanja studija o selekciji i diseminaciji nepatogenih$
UDK 637.146.1:615.015.8

REZISTENCIJA BAKTERIJA MLE^NE KISELINE NAANTIMIKROBNE LEKOVE*

ANTIBIOTIC RESISTANCE OF LACTIC ACID BACTERIA

Sneàna Bulaji}, Zora Mija~evi}, Radoslava Savi}-Radovanovi}**

Saznanja o rezistenciji na antimikrobne lekove bakterija mle~nekiseline su jo{ uvek ograni~ena, verovatno zbog velikog broja rodova ivrsta koje postoje kod ove grupe, kao i zbog razlika u njihovom spektrurezistencije. Evropska agencija za bezbednost hrane EFSA smatrarezistentnost na antimikrobne lekove, posebno prenosive rezistencije,va`nim kriterijumom kod dono{enja odluke o kvalifikovanoj procenibezbednosti -QPS statusu odredjenog soja. Ne postoje prihva}eni stan-dardi za fenotipsku ili genotipsku evaluaciju rezistencije na antimik-robne lekove kod izolata hrane. Tako|e, izbor medija je problemati~an,kao i specifikacija minimalne inhibitorne koncentracije MIC vrednostikao posledica velikih varijacija u vrsti i mogu}e rezultiraju}e varijacije uMIC vrednostima izme|u vrsta i roda. Teku}a istraìvanja u ovoj oblastipokazala su da bi se na kraju mogao dobiti niz razli~itih MIC vrednostispecifi~nih za vrstu ili rod koje bi mogle jo{ vi{e da prodube sada{njukompleksnost. Jo{ jedan problem koji postoji u vezi sa odre|ivanjimabezbednosti starter sojeva jeste da, kada se jednom identifikuju fenotiprezistencije i asocirana determinanta rezistencije, postaje te{ko da sepokaè da ta determinanta nije prenosiva, posebno ukoliko se genrezistencije ne nalazi na plazmidu i ukoliko nema standardnih protok-ola za prikazivanje genetskog transfera. Usled postojanja takvih prob-lema, sistem o kvalifikovanoj proceni bezbednosti QPS treba da ostaviprostora za interpretaciju rezultata, posebno kada se oni odnose na me-todologiju odre|ivanja fenotipa rezistencije, odredjivanje MIC vred-nosti ze odre|eni rod, vrstu, ili soj, na nemogu}nost ustanovljavanjagenetske baze fenotipa rezistencije, kao i prenosivost gena rezisten-cije.

Klju~ne reci: bakterije mle~ne kiseline, rezistencija, antimikrobni lekovi

329

PREGLEDNI RAD – REVIEW PAPER

* Rad saop{ten na simpozijumu "Bezbednost namirnica animalnog porekla", Fakultet veteri-naske medicine Univerziteta u Beogradu, Beograd 16 i 17. oktobar 2008. godine

** Dr sci. med. vet. Sneàna Bulaji}, docent; dr sci. med. vet. Zora Mija~evi}, redovni profesor,mr sci. med. vet. Radoslava Savi} Radovanovi}, asistent, Fakultet veterinarske medicine,Beograd

Bakterije mle~ne kiseline (BMK) pripadaju taksonomski heterogenojgrupi nesporogenih gram pozitivnih mikroorganizama ~ija je osnovna biolo{kakarakteristika fermentisanje {e}era i posledi~no produkcija mle~ne kiseline. Zah-valjuju}i sposobnosti da rastu u anaerobnoj sredini, a da su aerotolerantni, ~la-novi zajednice BMK zauzimaju veliki broj prirodnih ni{a (Carr i sar., 2002). Tipi~nipredstavnici su vrste iz rodova Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Entero-coccus i Pediococcus (Carr i sar., 2002). Bakterije mle~ne kiseline u~estvuju uproizvodnji i konzervisanju fermentisanih proizvoda, bilo kao prirodno prisutnikontaminenti, i tada u~estvuju u procesima spontane fermentacije, ili kao na-merno dodati starteri u kontrolisanim procesima.

Njihova acidogena sposobnost, pored ostalih tehnolo{ki va`nih ka-rakteristika, koja se ogleda u sniàvanju pH vrednosti matriksa namirnice, vodi kaostvarivanju poèljnih organolepti~kih i reolo{kih svojstava. Kisela sredina jenepovoljna za rast patogenih vrsta bakterija, a istovremeno obezbe|uje postojanikvalitet i higijensku ispravnost kona~nog proizvoda. Metaboli~ka aktivnost bak-terija mle~ne kiseline ogleda se u stvaranju mle~ne kiseline koja ujedno deluje ikao selektivni faktor i tako ostvaruje dominaciju istih mikroorganizama. Zahva-ljuju}i njihovoj dugogodi{njoj bezbednoj primeni u proizvodnji fermentisanih pro-izvoda, BMK imaju "Generally Regarded As Safe" (GRAS) status, priznat od straneAmeri~ke agencije za hranu i lekove. Bakterije mle~ne kiseline predstavljaju i deoprirodne populacije gastrointestinalnog i genitourinarnog sistema vertebrata ismatra se, da u toj sredini, ispoljavaju povoljan efekat na zdravlje doma}ina. Ukontekstu toga, zaìvela je i njihova primena kao probiotika, pri ~emu se probiotikdefini{e kao nepatogeni mikroorganizam, koji u slu~aju da se unese u odre|e-nom broju pozitivno uti~e na fiziolo{ko i zdravstveno stanje doma}ina pored os-novnog nutritivnog delovanja.

U dana{nje vreme mnogi istraìva~i isti~u hipotezu da komenzalnebakterije, pre svega bakterije mle~ne kiseline, mogu predstavljati rezervoar genarezistencije na antimikrobne lekove (Perreten i sar., 1997; Levy i Salyers, 2002).Upravo iz ovog razloga, populacija komenzala je veoma zna~ajna u spoznavanjumehanizama perzistencije i {irenja gena rezistencije u svetu mikroorganizama(Levy i Miller, 1989). Takvi mikroorganizmi koji se ozna~avaju kao "rezervoari"mogu se na}i u razli~itim namirnicama, pre svega fermentisanim proizvodima odmleka i mesa koji su u velikom broju optere}eni nepatogenim bakterijama kao re-zultat njihovog prirodnog pocesa proizvodnje.

Prema ovoj teoriji, lanac hrane se moè smatrati jednim od glavnihputeva transmisije rezistentnih bakterija izme|u populacije ljudi i ìvotinja (Witte,1997). Pre svega, fermentisani proizvodi od mleka i mesa, koji nisu termi~ki treti-rani, predstavljaju sredstvo prenosa rezistentnih bakterija i time postoji direktnapovezanost izme|u mikroorganizama koji se nalaze u organizmu ìvotinja i gas-trointestinalnog sistema ljudi. Projekt pod imenom "Rezervoari antibiotske rezis-

330

Vet. glasnik 62 (5-6) 329 - 340 (2008) Sneàna Bulaji} i sar.: Rezistencija bakterijamle~ne kiseline na antimikrobne lekove

Uvod / Introduction

tencije" (Levy i Salyers, 2002) postavljen je jo{ daleke 1998. godine u cilju pro-movisanja studija o selekciji i diseminaciji nepatogenih bakterija rezistentnih naantibiotike kod ljudi, tokom procesa proizvodnje hrane, kao i u neposrednomokruènju. Iako mnoge bakterije mle~ne kiseline, uklju~ene u procese fermenta-cije namirnica imaju "Generally Regarded As Safe (GRAS)" status, potencijalanrizik po zdravlje ljudi usled transfera gena rezistencije od tzv. rezervoar sojevabakterija mle~ne kiseline na bakterije koje predstavljaju stalno prisutnu populacijumikroorganizama u gastrointestinalnom sistemu ljudi, jo{ nije u potpunosti defini-san.

Fenomen rezistencije na antimikrobne lekove, prirodna i ste~ena rezistencijaPhenomenon of resistance to antibiotics, natural and acquired resistance

Detaljni izve{taji o enormnoj primeni antimikrobnih lekova u humanoj iveterinarskoj medicini (WHO, 1997), poljoprivredi i akvakulturi na veoma dobarna~in dokumentuju razvoj rezistencije bakterija na antimikrobne lekove (Levy,1997). Evolucija rezistencije na antimikrobne lekove u zajednicama mikroorgani-zama je poja~ana horizontalnim transferom gena rezistencije i to preko granicamogu}nosti vrsta i rodova mikroorganizama, putem konjugativnih plazmida,transpozona, posedovanjem integrona i insercionih elemenata, kao i liti~nih bak-teriofaga i profaga (Davies, 1994). Tokom 50 i vi{e godina globalne upotrebe anti-mikrobnih sredstava, uspostavilo se nekoliko mehanizama rezistencije, uklju~u-

ju}i inaktivaciju antimikrobnih lekova enzimima (enzimska inaktivacija) (npr. �-la-ktamaze, aminoglikozid acetil-, nukleotidil-fosforil-transferaze), ograni~eni unosantimikrobnih lekova (npr. penicilin vezuju}i proteini), aktivni iznos antimikrobnihlekova ili pak modifikacija ciljnog mesta delovanja antimikrobnih lekova (metila-cija 23S rRNA, mutacija aminokiselinske sekvence topoizomeraze) i/ili osigura-vanje alternativnog metaboli~kog puta ("premo{}avanje"), po{to je originalni putmetabolizma naru{en (Levy, 1997). Kod pojedinih patogenih i potencijalno pato-genih bakterija, kao {to su stafilokoke i enterokoke, razvoj visoko rezistentnihklonova bakterija je pokrenuo krizu rezistencije na antimikrobne lekove (Neu,1992). U slu~aju vankomicin rezistentnih enterokoka, jo{ uvek ne postoji mo-gu}nost uspe{ne terapije antimikrobnim lekovima (Jett i sar., 1994).

Neophodno je praviti razliku izme|u prirodne ("intrinzi~") i ste~ene(prenosive) rezistencije. Rezistencija na dati antimikrobni lek moè biti intrinzi~nau odnosu na bakterijsku vrstu ili rod (prirodna rezistencija), a karakteri{e se spo-sobno{}u jednog mikroorganizma da preìvi u prisustvu odre|enog antimikrob-nog agensa, usled karakteristika uro|ene rezistencije. Prirodna rezistencija se neprenosi horizontalno. Suprotno ovom tipu, ste~ena rezistencija je karakteristikapojedinih sojeva unutar vrste obi~no osetljive na primenjeni antimikrobni lek, amoè se horizontalnim putem prenositi me|u bakterijama. Ste~ena rezistencijana odre|eni antimikrobni agens nastaje bilo iz mutacije u genomu bakterije iliusled sticanja dodatnih gena koji kodiraju mehanizam rezistencije. Ovakve genet-

331


ske promene poja~avaju odbrambenu sposobnost bakterija. Rezistencija se vrloverovatno razvila daleko pre klini~ke primene antimikrobnih lekova. Geni rezisten-cije mogu voditi poreklo od mikroorganizama, prirodnih producenata antimikrob-nih materija, koji su snadbeveni doti~nim genima u cilju samoza{tite (Davies,1997). Drugi potencijalni izvor gena rezistencije mogu predstavljati geni ~iji pro-dukti imaju ulogu u metabolizmu bakterija. Takvi geni su mogli biti izloèni "pamet-nim" mutacijama, koje su izmenile spektar supstrata (po mutaciji supstrat pred-stavlja antimikrobni lek u odnosu na pre|a{nje supstrate biosinteze ili biode-gradacije).

Determinante rezistencije na antimikrobne lekove se prenose verti-kalno ili horizontalno u prirodnim mikrobnim zajednicama. Vertikalna diseminacijase odvija klonalnim {irenjem odre|enog rezistentnog soja. Kod horizontalnogtransfera gena identifikovana su tri mehanizma (Davies, 1994): prirodna transfor-macija sa preuzimanjem i ugradnjom ("inkorporacijom") slobodne DNK iz ekstra-celularnog medijuma; konjugacija -mehanizam DNK transfera zavisan od }e-lijskog kontakta koji kao takav postoji kod ve}ine bakterijskih rodova i trans-dukcija-transfer posredovan bakteriofagima. Veruje se da konjugacija predstavljaglavni na~in transfera gena (Salyers, 1995). Mnogi geni rezistencije na antimik-robne lekove se nalaze na mobilnim elementima kao {to su plazmidi i konjugativnitranspozoni.

Ste~ena rezistencija na antimikrobne lekove, predstavlja karakteris-tiku pre svega onih mikroorganizama, ~ija primarna stani{ta podrazumevaju sre-dine permanentno izloène optere}enju usled kontinuirane primene antimikrob-nih lekova (intestinum ljudi i ìvotinja) (Teuber i sar., 1999). Profili rezistencije naantimikrobne lekove kod bakterija koje predstavljaju komensalne mikroorga-nizme nekog ekosistema, npr. bakterije mle~ne kiseline, indikatori su selektivnogpritiska koji doti~ni mikroorganizmi podnose u uslovima kontaminacije stani{taantimikrobnim sredstvima. Sirovo mleko i meso kontaminiraju se tokom proiz-vodnje fekalnim materijalom, gde se mogu na}i i bakterije mle~ne kiseline rezis-tentne na antimikrobne lekove. Na taj na~in se geni rezistencije prenose u krajnjeproizvode, pre svega sireve proizvedene od sirovog mleka i fermentisane koba-sice. Kako molekularna analiza gena rezistencije lokalizovanih na plazmidima itranspozonima pokazuje identi~ne genetske elemente kod ljudi i ìvotinja, ~ini semogu}im da namirnice animalnog porekla sluè kao sredstvo preno{enja rezis-tentnih bakterija, odnosno determinanti rezistencije na antimikrobne lekove. Na-u~na javnost, poslednjih godina poku{ava odgovoriti na pitanje da li komensalnebakterije iz namirnica mogu preneti gene rezistencije na crevne bakterije ljuditokom prolaza kroz creva.

Rezistencija bakterija mle~ne kiseline na antimikrobne lekove /Antibiotic resistance of lactic acid bacteria

Veliki broj bakterija mle~ne kiseline prisutan u fermentisanim proizvo-dima sasvim sigurno pomaè u ostvarivanju razli~itih mehanizama rezistencija na

332


333


Tab

ela

1.

Min

imaln

ein

hib

ito

rne

ko

nc

en

trac

ijen

ekih

an

tim

ikro

bn

ihle

ko

va(�

g/m

L)

zap

oje

din

eb

akte

rije

mle

~n

ekis

elin

e�

An

tim

ikro

bn

ile

k/

Vrs

te/

Ob

ligatn

oh

o-

mo

ferm

en

tativn

ila

kto

bacili

/H

ete

rofe

rmen

ta-

tivn

ila

kto

bacili

*/

Lac

tob

ac

il-lu

sp

lan

ta-

rum

En

tero

co

c-

cu

ssp

p.

Pe

dio

co

c-

cu

ssp

p.

Le

u-

co

no

sto

csp

p.

Lac

toc

oc

-c

us

sp

p.

Str

ep

toc

oc

-c

us

the

rmo

-p

hilu

s

Am

pic

ilin

/4

44

84

44

4

Van

ko

mic

in/

4IR

IR8

IRIr

44

Gen

tam

icin

/8

86

45

12

44

88

Kan

am

icin

/1

61

66

41

02

44

88

8

Str

ep

tom

icin

/1

61

66

41

02

44

81

61

6

Neo

mic

in**

/1

61

63

21

02

48

88

8

Eri

tro

mic

in/

44

44

44

44

Klin

dam

icin

/4

44

44

44

4

Kvi

nu

pri

stin

+D

alfo

pri

stin

/4

44

44

44

4

Tetr

acik

lin/

88

32

16

44

44

Hlo

ram

fen

iko

l/

44

88

44

88

Tri

meto

pri

m/

88

88

88

ND

nd

Lin

ezo

lid/

44

44

44

44

Tab

ela

jep

reu

zeta

od

FE

ED

AP

Pan

eliz

ve{ta

ja(E

uro

pean

Co

mm

issio

n,

20

02

).S

oje

visa

MIK

vred

no

{}u

ve}o

mo

dn

azn

a~en

ihg

ran

i~n

ihvr

ed

no

sti

sm

atr

aju

se

rezi

ste

ntn

im./

IR–

intr

inzi

~n

ore

ziste

ntn

i;*

uklju

~u

ju}iiL

ac

tob

ac

illu

ssaliv

ari

us;

**

op

isan

ain

terf

ere

ncija

an

tib

iotika

sa

med

ijum

om

ko

jise

ko

risti

pri

od

re|

ivan

ju

osetljiv

osti/r

ezi

ste

ncije

na

an

tim

ikro

bn

ele

ko

ve/

–

antimikrobne lekove putem mutacija. Dodatno, bakterije mle~ne kiseline su snad-bevene mobilnim genetskim elementima, pre svega plazmidima i transpozonima,koji omogu}avaju horizontalan prenos i {irenje gena rezistencije. Po usvajanjusvojstva rezistencije, determinante rezistencije se amplifikuju i mogu se predatidrugom doma}inu. Zbog toga je sasvim opravdan zahtev da se starter i probiotskisojevi bakterija mle~ne kiseline ispituju na sposobnost prenosive rezistencije naantimikrobne lekove, pored potrebe da se kompletno fiziolo{ki i tehnolo{ki oka-rakteri{u. Od vitalnog zna~aja jeste jasno definisanje grani~nih vrednosti na os-novu kojih se vr{i kategorizacija na rezistentne i osetljive sojeve. Posebnu vred-nost ima razlikovanje prirodne (nespecifi~ne, neprenosive) i ste~ene rezistencije,putem postupka koji zahteva pore|enje profila rezistencije na antimikrobne le-kove velikog broja bakterija mle~ne kiseline poreklom iz razli~itih izvora (Teuber isar., 1999). Uz tradicionalne klini~ke grani~ne vrednosti minimalnih inhibitornihkoncentracija (MIK) od pomo}i klini~arima u odabiru efikasnog antimikrobnogleka, predstavljen je i koncept mikrobiolo{kih grani~nih vrednosti, i to na osnovuprou~avanja distribucije minimalnih inhibitornih koncentracija na dati antimik-robni lek u odre|enoj populaciji bakterija (Olsson-Liljequist i sar., 1997). Premadatom konceptu, onaj deo populacije koji pokazuje jasno odstupanje od osetljiveve}ine smatra se rezistentnim delom populacije, odnosno delom populacije saste~enom i potencijalno prenosivom rezistencijom. U tabeli 1. dat je prikaz mini-malnih inhibitornih koncentracija na osnovu kojih se pojedine vrste bakterijamle~ne kiseline kategorizuju kao rezistentne. Definisane MIK vrednosti trebalo bismatrati pragmati~nim odgovorom na postoje}i problem razdvajanja sojeva saste~enom rezistencijom od osetljivih sojeva.

Odre|ivanje profila rezistencije bakterija mle~ne kiseline na antimikrobnelekove / Determining profile of resistance to antibiotics of lactic acid bacteria

Kako za odre|ivanja profila rezistencije na antimikrobne lekove kodBMK postoje brojne metode, ne postoji kona~ni konsenzus o grani~nim vred-nostima za ve}inu antimikrobnih lekova. Pometnja u ovom domenu prvenstvenoproizilazi iz ~injenice da se za definisanja rezistencije koriste razli~ite metode (Etest: Danielsen i Wind, 2003; agar dilucija: Herrero i sar., 1996; disk difuzioni test:Charteris i sar., 1998; i mikrobujonska kultura: Klein i sar., 2000) i tako se dobijenirezultati ne mogu direktno upore|ivati. Pored toga, pojedini testovi se ne smatrajupouzdanim za odre|eni antimikrobni lek. Npr. disk difuzioni test se ne smatrapouzdanim za detekciju rezistencije niskog nivoa na vankomicin kod enterokoka

(MIK od 8 do 32 �g/mL) (Swenson i sar., 1992). Na rezultate ispitivanja rezistencijebakterija na antimikrobne lekove moè da uti~e i sastav podloge (Huys i sar.,2002), kao {to su varijacije u sadràju katjona ili koncentraciji kriti~nih sastojakapoput timina ili folne kiseline, kao i veli~ina inokuluma, temperatura i period inku-bacije. Pored toga, ve}ina vrsta BMK pokazuje relativno slab rast na uobi~ajenimpodlogama za testiranje, kao {to je Mueller-Hinton (Difco) ili Isosensitest (Oxoid),

334


dok MRS medijum moè ~ak i inaktivirati pojedine antimikrobne lekove (npr.imipenem).

Poseban problem pri utvr|ivanju profila rezistencije predstavlja speci-fikacija MIK vrednosti. Ne postoje standardi po tom pitanju, a Institut za klini~ke ilaboratorijske standarde ("Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI", biv{iNCCLS) ne navodi MIK grani~ne vrednosti sa izuzetkom enterokoka. Svakako daproblem predstavlja i velika varijabilnost vrsta i s tim u vezi varijacije u MIK vred-nostima izme|u vrsta i rodova bakterija mle~ne kiseline (Danielsen i Wind, 2003).Iz ovog razloga Nau~ni komitet za ishranu ìvotinja ("Scientific Committee on Ani-mal Nutrition-SCAN") pravi razliku izme|u laktobacila i pediokoka u odnosu naMIK vrednosti za razli~ite antimikrobne lekove (European Commission, 2002).Demonstraciju sloènosti postoje}e problematike, ali i dodatnu konfuziju stvorilaje i odluka FEEDAP (Scientific Panel on Additives and Products or SubstancesUsed in Animal Feed, 2005), po kojoj treba da se izvr{i ispravka postoje}ih MIKvrednosti. Tom prilikom postavljene su i grani~ne vrednosti za razli~ite grupe bak-terija mle~ne kiseline, vrste, ali i sojeve; npr. za homofermentativne i heterofer-mentativne laktobacile, enterokoke, Pediococcus spp., Leuconostoc spp., sojeveL. plantarum, sojeve L. lactis. Pored toga, Danielsen i Wind (Danielsen i Wind,2003) predlaù i do tri razli~ite MIK grani~ne vrednosti i to na osnovu razlike urezistenciji svega 14 ispitivanih vrsta laktobacila. Stoga, ukoliko se za ostale (>60vrsta) Lactobacillus vrste, ali i druge grupe bakterija mle~ne kiseline, za koje dosada nisu ispitane ni postavljene MIK vrednosti, u budu}nosti utvrde zna~ajnerazlike, ovaj sloèni proces evaluacije i utvr|ivanja kriterijuma bi se mogao zavr{itipostavljanjem MIK grani~nih vrednosti, specifi~nih ne samo za dati rod nego i ispi-tivanu vrstu bakterija mle~ne kiseline, a mo`da i pojedine sojeve, {to dodatnouslo`njava problematiku.

Fenotipsko odre|ivanje rezistencije se dopunjuje molekularnim meto-dama gde se sojevi direktno ispituju na prisustvo determinanti rezistencije. Ovemetode uklju~uju amplifikaciju putem PCR tehnike primenom specifi~nih praj-mera za pojedine ili multiple gene rezistencije (Strommenger i sar., 2003), RT PCR(Volkmann i sar., 2004) ili kori{}enje DNK matrice koja sadrì veliku kolekciju genarezistencije (Perreten i sar., 2005). Postoje}e geneti~ke studije na osnovu kojih sepotvr|uje preno{enje poznatih determinanti rezistencije su ograni~ene mnogimeksperimentalnim faktorima, zbog ~ega su i njihovi rezultati razli~iti. Osim toga,nisu dostupni pozitivni kontrolni sojevi za izvo|enje konjugacije i/ili transpozicije,a ne postoji ni standardni protokol demonstracije transfera gena.

Profili rezistencije bakterija mle~ne kiseline na antimikrobne lekove /Profiles of resistance to antibiotics of lactid acid bacteria

Profili rezistencije na antimikrobne lekove kod Lactobacillus, Strepto-coccus, Pediococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium i Propionibacterium vrsta susasvim razli~iti, iako se ne zapaàju jasno odvojeni, po vrstu specifi~ni profili rezis-

335


tencije. S jedne strane, ve}ina vrsta je rezistentna na metronidazol (MIK�256

�g/mL), i trimetoprim (MIK�30 �g/mL) (Charteris i sar., 1998; Katla i sar., 2001). Ovimikroorganizmi imaju ograni~enu sposobnost biosinteze i ne poseduju meta-boli~ki put sinteze folne kiseline, pa se smatraju prirodno rezistentnim na oveagense (Katla i sar., 2001). S druge strane, bakterije mle~ne kiseline i bifidobak-

terije su osetljive na piperacilin i piperacilin plus tazobaktam (MIK�16 �g/mL) (Del-gado i sar., 2005). Lactobacillus, Lactococcus i Leuconostoc vrste pokazuju rezis-

tenciju visokog nivoa na cefoksitin (MIK�30 �g/mL) (Charteris i sar., 1998; Del-gado i sar., 2005). Ve}ina laktobacila, pediokoka i Leuconostoc vrsta je rezis-

tentna na visoke koncentracije vankomicina (MIK�256 �g/mL), dok je ve}ina lak-

tokoka veoma osetljiva na isti antimikrobni lek (MIK�2 �g/mL) (Danielsen i Wind,2003; Delgado i sar., 2005). Rezistencija Lactobacillus, Pediococcus i Leuco-nostoc spp. na vankomicin obja{njava se postojanjem D-Ala-D-Laktata u pepti-doglikanu, umesto D-Ala-D-Ala dipeptida koji predstavlja ciljno mesto delovanjaantimikrobnog leka. Time se rezistencija kod ovih vrsta smatra prirodnom i nemoè se upore|ivati sa ste~enom, plazmidima kodiranom rezistencijom, utvr|e-nom kod enterokoka. Ispitivanjem molekularne osnove rezistencije kod BMK, ana osnovu pore|enja identiteta nukleotidne sekvence sa sekvencom gena orig-inalno opisanih kod filogenetski udaljenih bakterijskih grupa, utvr|eno je da samarezistencija vodi poreklo od drugih mikroorganizama, sa kojih je, na neki na~inprene{ena na bakterije mle~ne kiseline i bifidobakterije.

Bakterije mle~ne kiseline, kao deo interaktivne populacije mikroor-ganizama, podlo`ne su izmeni gena rezistencije kao mehanizmu adaptacije nasredinu optere}enu antimikrobnim lekovima, a u cilju preìvljavanja u takvimsredinama. Izvan svake sumnje jeste to da se distribucija bakterija sa prenosivimdeterminantama rezistencije treba izbe}i (WHO, 1997). Mere uklju~uju kori{}enjeodgovaraju}ih, pa`ljivo selekcionisanih startera, kao i odgovaraju}ih supstrata zaprocese fermentacije, uz neophodnu potvrdu da starter i probiotski sojevi nesadrè gene koji prenose rezistenciju na antimikrobne lekove. Pa`ljiva i op-ravdana upotreba antimikrobnih lekova, kako u veterini, poljoprivrednom sektoru ihumanoj medicini, uz pasterizaciju ili drugi termi~ki tretman sirovih supstrata(mleka ili mesa) predstavljaju neophodne mere u re{avanju problema rezistencijena antimikrobne lekove. Neophodnim se smatra i zabrana kori{}enja antimikrob-nih lekova, promotora rasta u uzgoju ìvotinja, pre svega onih koji se klini~ki pri-menjuju, kako u veterinarskoj, tako i u humanoj medicini: zabranjeni su antimik-robni lekovi koji dovode do ukr{tene rezistencije kod bakterijskih uzro~nika, (ti-lozin, virginiamicin) ili oni koji se koriste samo u humanoj medicini, kao {to je baci-tracin. Uro|ena rezistencija na antimikrobne lekove utvr|ena je na vankomicinkod Leuconostoc vrsta, odre|enih laktobacila ili pak na nalidiksinsku kiselinu.Razliku izme|u prirodne i ste~ene rezistencije je te{ko postaviti budu}i da je ne-

336


Zaklju~ak / Conclusion

mogu}e pratiti ispitivani soj u preantibiotskoj eri. Ukoliko bakterije mle~ne kiselineìve u biotopu koji je optere}en antimikrobnim lekovima (digestivni sistem ljudi iìvotinja, vime krava), ste~ena rezistencija na antimikrobne lekove se utvr|uje kodmnogih vrsta koje naseljavaju takve sredine, uklju~uju}i Enterococcus, Lactococ-cus i Lactobacillus vrste.

Ne postoji barijera izme|u patogenih (streptokoke), potencijalno pa-togenih (enterokoke) i komenzalnih (laktobacili, laktokoke) BMK s obzirom namogu}nost preuzimanja i sticanja determinanti rezistencije na antimikrobne leko-ve. Utvr|eni su identi~ni geni odgovorni za rezistenciju na tetraciklin - tet (M), eri-tromicin - ermAM, hloramfenikol - cat, streptomicin - str, streptogramin - sat, u svetri grupe mikroorganizama. Ovi podaci potvr|uju gledi{te da u sredinama, u ko-jima su kori{}ene enormne koli~ine antimikrobnih lekova, bakterije mle~nekiseline, kao i drugi mikroorganizmi, u~estvuju u sistemima komunikacije, putemkojih i prenose osobine rezistencije preko granica vrsta, pa ~ak i rodova.

Do sada, multirezistencija, na sre}u, nije uobi~ajena kod bakterijamle~ne kiseline. Ipak, u sve ve}em broju se izoluju sojevi koji pokazuju atipi~nenivoe rezistencije na pojedine antimikrobne lekove (posebno tetraciklin i eritromi-cin). Takvi sojevi nose gene rezistencije za koje se veruje, a u mnogim slu~ajevimaje i potvr|eno, da su ste~eni horizontalnim preno{enjem. Stoga je sasvim oprav-dana inicijativa Evropske agencije za bezbednost hrane za neophodnim ispitiva-njem prisustva prenosivih determinanti rezistencije onih sojeva bakterija mle~nekiseline koji se primenjuju kao starter ili probiotski sojevi. Takvi zahtevi su defini-sani usvajanjem sistema kvalifikovane pretpostavke bezbednosti ("Qualified Pre-sumption of Safety" – QPS) (EFSA, 2004).

1. Carr FJ, Chill D, Maida N. The lactic acid bacteria: a literature survey. Crit. rev. Microbiol.2002; 28: 281-370.

2. Charteris WP, Kelly PM, Morelli L, Collins JK. Antibiotic susceptibility of potentially probi-otic Lactobacillus species. J. Food Prot. 1998; 61: 1636-43.

3. Danielsen M, Wind A. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. Int. J.Food Microbiol. 2003; 82: 1-11.

4. Davies J. Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes. Science1994; 64: 375-82.

5. Davies J. Origins, acqusition and dissemination of antibiotic resistance determinants.In: Chadwick DJ, Goode J (Eds.), Antibiotic Resistance: Origins, Evolution,Selection and Spread, Ciba Foundation Symposium, Vol. 207. Wiley, Chiches-ter, 1997; 15-27.

6. Delgado S, Florez AB, Mayo B. Antibiotic susceptibility of Lactobacillus and Bifidobac-terium species from the human gastrointestinal tract. Curr. Microbiol. 2005;50: 202-7.

7. European Commission. Opinion of the Scientific Committee on animal Nutrition on thecriteria for assessing the safety of microorganisms resistant to antibiotics ofhuman clinical and veterinary importance. European Commission, Health and

337


Literatura / References

Consumer Protection Directorate, Directorate C, Scientific Opinions, Brus-sels, Belgium. 2002.

8. European Food Safety Authority. EFSA Scientific Colloquium Summary Report. QPS:qualified presumption of safety of microorganisms in food and feed. EuropeanFood Safety Authority, Brussels, Belgium, 2004.

9. Herrero M, Mayo B, Gonzales B, Suarez JE. Evaluation of technologically importanttraits in lactic acid bacteria isolated from spontaneous fermentations. J. Appl.Bacteriol. 1996; 81: 565-70.

10. Huys G, D'Haene K, Swings J. Influence of the culture medium on antibiotic susceptibil-ity testing of food-associated lactic acid bacteria with the agar overlay disc dif-fusion method. Lett. Appl. Microbiol. 2002; 34: 402-6.

11. Katla AK, Kruse H, Johnsen G, Herikstad H. Antimicrobial susceptibility of starter culturebacteria used in Norwegian dairy products. Int. J. Food Microbiol. 2001; 67:147-52.

12. Klein G, Hallmann C, Casas IA, Abad J, Louwers J, Reuter G. Exclusion of vanA, vanBand vanC type glycopeptide resistance in strains of Lactobacillus reuteri andLactobacillus rhamnosus used as probiotics by polymerase chain reactionand hybridization methods. J. Appl. Microbiol. 2000; 89: 815-24.

13. Levy SB. Antibiotic resistance an ecological imbalance.In: Chadwick, D.J., Good, J.(Eds.), Antibiotic Resistance. Origins, Evolution, selection and Spread. JohnWiley &Sons, Chichester. 1997; 1-14.

14. Levy SB, Miller RV. Horizontal gene transfer in relation to environmental release of ge-netically engineered microorganisms. Gene Transfer in the Environment.McGraw-Hill Publishing Company, New York, 1989; 405-20.

15. Levy SB, Salyers AA. Reservoirs of antibiotic resistance (ROAR) Network.http://www.healthsci.tufts.edu/apua/Roar/roarhome.htm, 2002.

16. Neu HC. The crisis in antibiotic resistance. Science. 1992; 257: 1064-73.

17. Ollson-Liljequist B, Larsson P, Walder M, Miorner H. Antimicrobial susceptibility testingin Sweden. III. Methodology for susceptibility testing. Scand. J. Infect. Dis.1997; Suppl. 105: 13-23.

18. Perreten V, Schwarz F, Cresta L, Boeglin M, Dasen G, Teuber M. Antibiotic resistancespread in food. Nature 1997; 389: 801-2.

19. Perreten V, Vorlet-Fawer L, Slickers P, Ehricht R, Kuhnert P, Frey J. Microarray-based de-tection of 90 antibiotic resistance genes of Gram-positive bacteria. J. Clin. Mi-crobiol. 2005; 43: 2291-302.

20. Salyers AA. Antibiotic Resistance Transfer in the Mammalian Intestinal Tract: Implica-tions from Human Health, Food Safety and Biotechnology.Springer-Verlag,1995.

21. Scientific Panel on Additives and Products or Substances Used in Animal Feed. Opin-ion of the scientific panel on additives and products or substances used in ani-mal feed on the updating of the criteria used in the assessment of bacteria forresistance to antibiotics of human or veterinary importance. EFSA J. 2005;223: 1-12.

22. Strommenger B, Kettlitz C, Werner G, Witte W. Multiplex PCR assay for simultaneousdetection of nine clinically relevant antibiotic resistance genes in Staphylococ-cus aureus. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 4089-94.

23. Swenson JM, Ferraro MJ, Sahm DF, Charache P, Tenover FC. New vancomycin disk dif-fusion breakpoints for enterococci. The National Committee for Clinical Labo-

338


ratory Standards Working Group on Enterococci. J. Clin. Microbiol. 1992; 30:2525-28.

24. Teuber M, Meile L, Schwarz F. Acquired antibiotic resistance in lactic acid bacteria fromfood. Antonie Van Leeuwenhoek 1999; 76: 115-37.

25. Volkmann H, Schwartz T, Bischoff P, Kirchen S, Obst U. Detection of clinically relevantantibiotic-resistance genes in municipal wastewater using real-time PCR(TaqMan). J. Microbiol. Meth. 2004; 56: 277-86.

26. WHO. The Medical Impact of the Use of Antimicrobials in Food Animals. Report of aWHO Meeting, Berlin, Germany, 1997 13-17 October, WHO, Geneva.

ANTIBIOTIC RESISTANCE OF LACTIC ACID BACTERIA

Sneàna Bulaji}, Zora Mija~evi}, Radoslava Savi} Radovanovi}

Knowledge on the antibiotic resistance of lactic acid bacteria is still limited,possibly because of the large numbers of genera and species encountered in this group,as well as variances in their resistance spectra. The EFSA considers antibiotic resistances,especially transferable resistances, an important decision criterion for determining astrain's QPS status. There are no approved standards for the phenotypic or genotypicevaluation of antibiotic resistances in food isolates. Also, the choice of media is problem-atic, as well as the specification of MIC breakpoint values as a result of the large speciesvariation and the possible resulting variation in MIC values between species and genera.The current investigations in this field showed that we might end up with a range of differentspecies- or genus-specific breakpoint values that may further increase the current com-plexity. Another problem associated with safety determinations of starter strains is thatonce a resistance phenotype and an associated resistance determinant have been identi-fied, it becomes difficult to show that this determinant is not transferable, especially if the re-sistance gene is not located on a plasmid and no standard protocols for showing genetictransfer are available. Encountering those problems, the QPS system should allow leewayfor the interpretations of results, especially when these relate to the methodology for resis-tance phenotype determinantions, determinantions of MIC breakpoints for certain genera,species, or strains, the nondeterminability of a genetic basis of a resistance phenotype andthe transferability of resistance genes.

Key words: lactic acid bacteria, antibiotic resistance

ANTIBIOTIÊSKOE SOPROTIVLENIE BAKTERIY MOLO^NOY KISLOTÀ

Sneàna Bulai~, Zora MiÔ~evi~, Radoslava Savi~ Radovanovi~

PoznaniÔ o soprotivlenii na antibiotiki bakteriy molo~noy kislotìvsÒ eçÒ ograni~ennìe, veroÔtno iz-za bolÝ{ego ~isla roda i vidov, suçih u Ìtoy

339


ENGLISH

RUSSKIY

gruppì, slovno i iz-za raznic v ih spektre soprotivleniÔ. Evropeyskioe agenstvodlÔ bezopasnosti korma EABK s~itaet rezistentnostÝ na antibiotiki, otdelÝnoperenoslivogo soprotivleniÔ, va`nìm kriteriem u prinimaniÔ reçeniÔ o kvali-ficirovannoy ocenke bezopasnosti - KOB statusu opredelÒnnogo {tamma. Ne suçe-stvuÓt prinÔtìe standartì dlÔ fenotipi~eskogo i genotipi~eskogo opredeleniÔcennosti soprotivleniÔ na antibiotiki u izolÔtov korma. Takè vìbor mediÔproblemati~nìy, slovno i specifikaciÔ minimalÝnoy ingibitornoy koncentra-cii MIK stoimosti kak sledstvie bolÝ{ih variaciy v vide i vozmo`nìe ÔvlÔÓçi-esÔ rezulÝtatom variacii v MIK stoimostÔh me`du vidami rodami. TekuçieissledovaniÔ v Ìtoy oblasti poazali, ~tobì na konce mog polu~itÝsÔ rÔd raz-li~nìh MIK stoimostey specifi~eskih dlÔ vida ili raoda, kotorìe bì mogli eçÒbólÝ{e uglubitÝ tepere{nÓÓ kompleksnostÝ. EçÒ odna problema, suçaÔ v svÔzi sopredeleniÔmi bezopasnosti starter {tammov, kogda odna`dì identificiruÓtfenotip soprotivleniÔ i associrovannìy determinant soprotivleniÔ, stano-vitsÔ tÔÌèlo pokazatÝ, ~to Ìtot detrminant ne perenosnìy, otdelÝno poskolÝkugen soprotivleniÔ ne nahoditsÔ na plazmide i poslkolÝku ne imeet standartnìhprotokolov dlÔ geneti~eskogo transfera. Vsledstvie suçestvovaniÔ takih prob-lem, sistema o kvalificirovannoy ocenke bezopasnosti KOB nado ostavitÝ pros-transtva dlÔ interpretacii rezulÝtatov, otdelÝno, kogda oni otnosÔtsÔ na me-todologiÓ opredeleniÔ fenotipa soprotivleniÔ, opredeleniÔ MIK stoimostidlÔ opredlÒnnogo roda, vida, ili {tamma, na nevozmo`nostÝ ustanavlivaniÔ ge-neti~eskoy bazì fenotipa soprotivleniÔ, slovno i perenosnostÝ gena soprotiv-leniÔ.

KlÓ~evìe slova: bakterii molo~noy kislotì, antibioti~eskaÔ rezistentnostÝ

340


Documents

REZISTENCIJA BAKTERIJA MLE^NE KISELINE NA ......tencije" (Levy i Salyers, 2002) postavljen je jo{ daleke 1998. godine u cilju pro-movisanja studija o selekciji i diseminaciji nepatogenih