INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

Univerza v LjubljaniFakulteta za matematiko in fiziko

RENTGENSKO SIPANJE NA PROTEINIH

Peter Ferjancic

13. marec 2014

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

KAJ SI BOMO POGLEDALI?INTRODUCTION

UVODZgodovinaOsnovna idejaPrednosti in slabosti

PROTEINSKI KRISTALIProteinski kristaliPriprave na kristalizacijoKristalizacijaMetode rasti kristalovParametri, ki vplivajo na rastAli smo dobili pravo stvar?Kristali

DIFRAKCIJAMonokromatski izvir svetlobevon Lauejev pogojMeritevPogoj za ojacitev v reciprocni mrežiŠtevilo ojacitevDodatne težaveReševeanje faznega problemaResolucija

ZakljucekPonovitevViriPoobedek

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

ZGODOVINA

I 1895 - Röntgen odkrije X-žarke, prva NN 1901I 1912 - oce W. Henry Bragg in sin W. Lawrence Bragg

dolocita prvo kristalno strukturo - NaCl - NN 1915(Lawrence star 25 let)

I 1934 - J.D. Bernal & D. Crowfoot prva slikata proteinI 1953 - Franklin, Crick, Watson, Wilkins razkrijejo strukturo

DNAI 1954+ - razkrite strukture hemoglobina, mioglobina, in

vedno vec ostalegaI 1971 - ustanovitev proteinske baze podatkov (PDB),

struktura inzulinaI 2000+ - strukture celicnih enot (ribosomi, ionske crpalke,

etc.)

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

OSNOVNA IDEJA

I locljivost mikroskopa ≈ λ/2I razdalja med atomi ≈ 1ÅI potrebujemo žarke X (λ = 100 . . . 0.1Å)I Braggov zakon - ravnine atomov so na pravi razdalji za

interferenco - nλ = 2d sin θI Bravaisova mreža - preko treh primitivnih vektorjev nam

poda pozicijo vseh osnovnih celic v kristalu.I reciprocna mreža - fourierova transformiranka Bravejeve

mreže, to kar dejansko izmerimo iz vzorca sipanjaI Z monokromatskim izvirom svetlobe pregledamo odboje

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

PREDNOSTI IN SLABOSTI

I prednostiI izredno natancna merilna tehnikaI tipa znotraj molekuleI za razliko od NMR nima masnega limita

I slabostiI potrebujemo lep, homogen kristalI nevarnost artefaktov, nepravilnosti itn.I struktura je statisticno povprecjeI H atomi praviloma premajhni, da bi bili vidni

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

OSNOVE PROTEINSKIH KRISTALOV

I potrebni za svetel in pravilen uklonski vzorecI le redki proteini naravno kristalizirajo, ponavadi jih je

potrebno vzgojitiI kristalizacija proteinov ponavadi v prenasicenih

raztopinahI proteini so muhasti in ni splošnih pravil za njihovo

kristalizacijo - empiricne izkušnje

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

PRIPRAVE NA KRISTALIZACIJO

I izolacija proteinaI cišcenje proteinaI nukleacija→ kristal

I kristal zahteva prehod cez energijsko bariero

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

KRISTALIZACIJA

I vecina proteinov topna v normalnih fizioloških pogojihI vecanje koncentracije - manjša topnost (salting out)I nižanje koncentracije - manjša topnost (salting in)I kristalizacija proteinov je zahtevna, saj so proteini zelo

velike, težke molekule nepravilnih oblikI dostikrat morajo tvoriti medsebojne vezi skozi vec plasti

topila (posledica: nestabilnost, mehkost proteinskihkristalov)

I proteini se lahko tudi oborijo - zahtevani ravno pravipogoji

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

FAZNI DIAGRAM

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

METODE RASTI KRISTALOV

I delanje v mikrobatch-ihI razlicne metode

I difuzija hlapov (viseca/sedeca kapljica, sendvic)I mikrodializaI kapilare

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

GOJENJE V KAPILARAH IN VISECIH KAPLJICAH

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

PARAMETRI, KI VPLIVAJO NA RAST KRISTALOV

I fizikalno-kemijski parametriI temperaturaI pHI ionske vezi in cistost kemikalijI difuzija in konvekcijaI volumen in geometrija sistemaI prah, umazanija in druge necistoceI viskoznost in razlika gostot med kristali in raztopinoI pritisk, elektricno in magnetno poljeI vibracije in zvok

I biološki parametriI biološki izvor proteinovI bakterijska kontaminacijaI relativna redkost vecine bioloških makromolekul

I biofizikalni in biokemicni parametriI obcutljivost neke konformacije (oblike) glede na temperaturo, pH, jakost

vezi . . .I vezavnost ligandov (molekul ki se vežejo na proteine)I vpliv dodatkov za uravnavanje zgornjih lasntosti na proteinI starost vzorcev

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

ALI SMO DOBILI PRAVO STVAR?

I sol ali proteinski kristal?I mehanicne, fizikalne, opticne (birefrakcija, polarizacija,

. . . ), elektromagnetne lastnostiI test z iglo - proteinski kristal je mehak, sol je trdaI zaradi velike (30-80 %) vsebnosti vode se lahko proteinske

kristale pobarvaI IZIT barviloI izgled kristala ne kaže nujno njegove kvalitete

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

KRISTALI

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

MONOKROMATSKI IZVIR SVETLOBE

I klasicna rentgenska cevI rentgenska cev z vrtljivo anodoI sinhrotroniI Braggov zakon - nλ = 2d sin θ

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

VON LAUEJEV POGOJ

I imamo elasticno sipanje - |~k| = |~k′|I ~d - primitivni vektorji kristalne mreže

I 2πm = ~d · (|~k| − |~k′|) = ~d ·∆~kI efektivno isto kot Braggov zakon, ampak predpostavi

samo elasticne trke, ne potrebuje ravnin

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

MERITEV

I kristal naj bo vsaj 0.1 mm velik v vsako smerI za dano valovno dolžino se izmeri itenziteto sipanja na

vseh tockah prostorskega kotaI postopek se ponovi za vse mogoce rotacije kristala

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

POGOJ ZA OJACITEV V RECIPROCNI MREŽI

I Ewaldova sfera, r = 1/λI (~O− ~H) mora biti vektor reciprocne mrežeI povedano drugace, na shemi morata oba vektorja kazati na

delec

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

ŠTEVILO OJACITEV

I ker kristal rotiramo povseh možnih kotihpridejo v poštev vse tockeznotraj dvakratnegaradija Ewaldove sfere

I število ojacitev je torej karštevilo tock reciprocnemreže v tem limitnemvolumnu.

I 4π3

( 2λ

)3 · 1/Vrec =4π3

( 2λ

)3 · Vcelice

Ewaldova sfera:

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

PRIMER

I a = 150Å, b = 100Å, c = 40ÅI λ = 1.54Å, N = 33.51 · 600000/3.6523 = 5.5 · 106 ojacitevI λ = 0.80Å, N = 33.51 · 600000/0.512 = 39.3 · 106 ojacitevI k sreci niso vsi neodvisni in tudi ne rabimo meriti

popolnoma vseh

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

DODATNE TEŽAVE

I naš izmerjeni vzorec je sorazmeren Fourierovitransformiranki mreže

I ker merimo intenziteto izgubimo podatek o fazi in nemoremo rekonstruirati tocne mreže kar tako -Crystallographic phase problem

I k sreci obstajajo triki, ki zaobidejo ta problemI Pattersonov zemljevid - vse faze 0, kvadriranje

strukturnega faktorjaI MR - Molecular replacementI MIR - Multiple Isomorphous ReplacementI MAD - Multi-wavelength Anomalous DiffractionI SAD - Single-wavelength Anomalous Dispersion

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

REŠEVEANJE FAZNEGA PROBLEMA

I MR- Molecular replacementI ce poznamo podoben protein, lahko ugibamo faze novega

proteinaI prvi del: rotacija - najprej fitanje rotacij na že znan protein,

išce se najvišjo korelacijoI drugi del: translacija - protein se premika po prostoru in

išce najboljše ujemanje z izmerki - brute-force metodaI MIR - Multiple izomorphous replacement

I v kristal se doda težke ioneI doloceni deli proteinov se lahko nanje vežejo in tako

delujejo kot referencaI primer: -SH elementiI dodajanje kovin naj ne bi pokvarilo originalne oblike

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

PRIMER MIR

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

REŠEVEANJE FAZNEGA PROBLEMA

I MAD- Multiwavelength anomalous diffractionI kristal izmerimo pri vec valovnih dolžinah, vkljucno z

elektronskimi resonancami težjih atomovI ker so elektroni vezani so v praksi dušeni oscilatorjiI sipanje okoli absorbcijskega vrha je premaknjeno tako v

fazi kot v amplitudi glede na druge frekvenceI ta tehnika deluje posebej dobro kjer se lahko dele proteina

nadomesti s selenom (metionin)I SAD - Single wavelength anomalous diffraction

I osnovna ideja podobna kot pri MAD - išce se anomalijeI ena sama meritev pri eni frekvenciI prednost - manj casa na sinhrotronski liniji in manj

poškodb proteina

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

RESOLUCIJA

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

PONOVITEV

I zgodovina, ponovitev trdne snovi, prednosti in slabostisipanja

I zahtevnost kristaliziranja proteinovI pocasno spreminjanje koncentracije raztopine nam

povzroci izlocanje kristalov, prehod bariere proste energijeI difuzija, mikrodializa, kapilare . . .I odvisnost od mnogo spremenljivk, ni splošnih pravil,

I vsak kristal nam da ogromno število ojacitevI zaradi izgube faze je težko rekonstruirati osnovno

strukturo, ampak obstajajo triki - MR, MIR, MAD, SAD

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

VIRI

I Macromolecular Crystallography, Jeroen R. Mesters,University of Lübeck

I X-ray Crystallography, Prof. Leonardo Scapozza, School ofPharmaceutical Sciences, University of Geneva, Universityof Lausanne

I Wikipedia, X-ray crystallographyI Wikipedia, Protein crystallizationI Crystallography made Crystal Clear, 3ed ed., Gale Rhodes,

University of Southern Maine, Elsevier, 2006

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

Hvala za vašo pozornost!Vprašanja?

INTRODUCTION UVOD PROTEINSKI KRISTALI DIFRAKCIJA Zakljucek

TOPLJENJE IN MARS