Rad u biološkoj laboratoriji-praktikum

SADRŽAJ

1. RAD U BIOLOŠKOJ LABORATORIJI 3

1.1. OPŠTA PRAVILA RADA U LABORATORIJI 31.2. LABORATORIJSKA OPREMA 31.3. LABORATORIJSKO SUĐE 41.4. PRANJE LABORATORIJSKOG SUĐA 5 1.5. PRANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA 5

2. MIKROSKOP I TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA 5

2.1. DIJELOVI MIKROSKOPA 5

2.1.1. Mehanički dijelovi 52.1.2. Optički dijelovi 6

2.2. REZOLUCIJA MIKROSKOPA 82.3. ČUVANJE MIKROSKOPA 92.4. TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA 92.5. MIKROSKOPSKA MJERENA 10

3. PRIPREMA PRIVREMENIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA 11

3.1. METODE I TEHNIKE 113.2. SKVOŠ PREPARAT 11

3.2.1. Opšti princip pripremanja skvoš preparata 12

3.3. PRIPREMA PREPARATA SA MATERIJALOM IZ USTA 143.4. PREPARAT VISEĆA KAP 15

4. PRIPREMA TRAJNIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA 15

4.1. UBIJANJE I FIKSIRANJE 15

4.1.1. Fiksativi koji se najčešće upotrebljavaju 16

1

4.1.2. Fizička fiksacija 18

4.2. ISPIRANJE MATERIJALA 184.3. DEHIDRATACIJA I KONZERVANCIJA MATERIJALA 194.4. METODE PRAVLJENJA PRESJEKA 204.5. INKLUZIJA U KANADA BALZAM 214.6. OBILJEŽAVANJE PREPARATA 21

5. BOJENJE PREPARATA 21

5.1. BOJE I RASTVORI BOJA 225.2. HEMIJSKA OSNOVA BOJENJA 225.3. METODE BOJENJA 23

5.3.1. Hematoksilinska metoda, Delafildov hematoksilin 235.3.2. Dvojno bojenje preparata 275.3.3. Ostale metode 28

5.4. REAGENSI ZA PROSVJETLJAVANJE I NAČIN UPOTREBE 30

6. PARAFINSKA METODA PRAVLJENJA MIKROSKOPSKIH PREPARATA 31

6.1. INKLUZIJA MATERIJALA U PARAFIN 326.2. KALUPLJENJE 336.3. PRIPREMANJE PARAFINSKIH BLOKOVA 346.4. PRIPREMANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA 34

6.5. PRAVLJENJE PRESJEKA MIKROTOMOM 35

6.6. UPOTREBA MIKROTOMA 36 6.7. TEŠKOĆE PRI SJEČENJU MIKROTOMOM 37 6.8. LIJEPLJENJE PRESJEKA NA PREDMETNO STAKLO 38

6.8.1. Pripremanje i upotreba Majerovog ljepila 38

2

6.9. RAZVLAČENJE PARAFINSKIH PRESJEKA 396.10. DEPARAFINISANJE 40

7. TEHNIKA SMRZAVANJA TKIVA 418. SPECIFIČNE METODE PRIPREME CITOLOŠKIH PREPARATA 41

8.1. FRAKCIONISANJE I CENTRIFUGIRANJE ĆELIJE 41

8.2.MACERACIJA 42

8.3. GLICERIN - ŽELATINSKI PREPARAT 43

9. PRAKTIČNA UPOTREBA ELEKTROFOREZE 43

9.1. ANALIZA IZOLOVANE DNK 43

9.2.ANALIZA IZOLOVANE RNK 45

9.3.ANALIZA IZOLOVANIH PROTEINA 46

3

1. RAD U BIOLOŠKOJ LABORATORIJI

Prilikom rada u biološkoj laboratoriji često se koriste različite hemikalije od kojih su neke dosta agresivne i nagrizaju materijale sa kojima dođu u kontakt, izazivaju burne reakcije, ili su njihova isparenja štetna po zdravlje jer nagrizaju sluzokožu usta, grla i nosa, mogu izazvati oštećenje očiju itd. Neke hemikalije, kao što su npr. formalin, ksilol i druge imaju kancerogeno i teratogeno dejstvo, pa pri rukovanju sa njima treba biti posebno oprezan. Zbog svega ovoga se pri radu u biološkoj laboratoriji mora pridržavati određenih pravila.

1.1. OPŠTA PRAVILA RADA U LABORATORIJI

1. Nošenje radnog mantila smanjuje rizik kontaminacije odijela i raznošenje materijala izvan laboratorije. Time ujedno sprečavamo prljanje i uništavanje odijela.

2. Pranje ruku se vrši u toku rada prema potrebi, a na kraju rada je obavezno. 3. Ne preporučuje se rad sa ogrebotinama, a naročito ne sa otvorenim ranama na

rukama. 4. U toku rada ne treba dodirivati oči, nos i usta. 5. Pri radu u laboratoriji nije dozvoljeno uzimati hranu, piti ni pušiti. 6. Dugačka kosa treba biti svezana u rep da se ne bi spalila radom kraj plamenika ili

špiritusne lampe. 7. Radno mjesto se dezinfikuje odgovarajućim sredstvom kao što je 70% etanol ili 5%

asepsol prije početka i na kraju rada. 8. Nije poželjno pipetirati hemikalije ustima. Preporučuje se upotreba propipete. 9. Sa opasnim hemikalijama se radi u digestoru. Ako laboratorija ne posjeduje digestor,

onda se obavezno radi kraj otvorenog prozora. 10. Upotrebljene pipete, epruvete i drugo suđe treba odložiti u posebne posude sa

dezinfekcionim sredstvom. 11. Po završetku rada treba pospremiti i očistiti laboratoriju. 12. Oprema i hemikalije se ne smiju iznositi iz laboratorije.

1.2. LABORATORIJSKA OPREMA

Da bi se omogućio normalan eksperimentalni rad svaka biološka laboratorija treba posjedovati sledeću opštu opremu:

1. Tehnička i analitička vaga 2. Vodeno kupatilo – uređaj u kom se održava destilovana voda na tačno određenoj

temperaturi. Omogućuje izvođenje raličitih biohemijskih, hemijskih i bioloških reakcija.

3. Sušnica (minimum do 200°C) – uređaj za sterilizaciju različitog, uglavnom staklenog posuđa (petrijevke, pipete, čaše, menzure, erlenmajerice itd.).

4. Termostat (minimum do 44°C) – Za gajenje različitih kultura (za klijanje sjemena biljaka, gajenje mikroorganizama itd.) neophodno je obezbijediti određenu temperaturu što se postiže u termostatima. Oni su najčešće metalni sa dvostrukim

4

zidovima koji su obloženi nekim materijalom koji je slab provodnik toplote, npr. vatom. Između zidova se nalazi voda ili vazduh, a zagrijavanje se vrši grijačima.

5. Centrifuga (minimum do 5000 obrtaja u minuti) 6. Frižider –za čuvanje različitih hemikalija i materijala. 7. Mućkalica – uređaj za miješanje rastvora.8. Mikrotom – za sječenje tkiva prilikom pravljenja preparata.9. Termometri (0-100°C)10. Eksikator – za isušivanje u uslovima vakuuma.11. Vakuum pumpa – za filtraciju i obezbjeđivanje vakuuma u eksikatoru. 12. Vruća ploča – uređaj koji omogućuje zagrijavanje na tačno određenu temperaturu.13. Magnetna mješalica 14. Spektrofotometar 15. pH-metar – uređaj za određivanje koncentracije vodonikovih jona u rastvoru.16. Oksimetar – uređaj za određivanje koncentracije kiseonika u rastvoru. 17. Bunzenov plamenik - nastavak koji se instalira na plinsku bocu i služi za sterilizaciju

plamenom. 18. Špiritusna lampa - takođe se koristi za sterilizaciju plamenom, u slučaju da

laboratorija nema Bunzenov plamenik. 19. Set za bojenje – niz povezanih posuda u kojima se vrši bojenje preparata. 20. Destilator – uređaj za proizvodnju destilovane vode.21. Stalak za epruvete22. Stalak za mikroskopske preparate23. Propipeta – gumeni nastavak koji se postavi na pipetu. Služi za uvlačenje tečnosti u

pipetu u onim slučajevima kada se ne preporučuje uvlačenje ustima, npr. ako su u pitanju opasne hemikalije sa štetnim isparenjima

Naravno, pored ove, zavisno od specifičnosti rada u laboratoriji, potreban je i niz drugih aparata. Ovde su pobrojani samo neki koji imaju najširu upotrebu.

1.3. LABORATORIJSKO SUĐE

U biološkim laboratorijama se upotrebljava različito stakleno suđe izrađeno od specijalnog stakla koje podnosi zagrijavanje na visoku temperaturu.

Epruvete su izrađene od staklenih cijevi sa zaobljenim dnom i ravnim ivicama. Postoji nekoliko vrsta epruveta, ali se najčešće koriste epruvete dužine 160-200 mm i prečnika 16-20 mm.

Petrijeve kutije se prave od stakla ili plastike. Imaju oblik spljoštenog valjka i sastoje se iz dva dijela, poklopca koji ima nešto veći prečnik, i dna sa nešto manjim prečnikom, tako da naliježu jedan u drugi. Najčešće se koriste petrijevke prečnika 60 do 100 mm.

Pipete su dugačke, kalibrisane staklene cijevi koje su na donjem kraju izvučene u kapilarno suženje. Služe za odmjeravanje tečnosti. Najčešće se upotrebljavaju pipete od 1, 5 i 10 ml. Često se upotrebljavaju i tzv. Pasterove pipete koje nisu graduisane.

Erlenmajerove boce su stakleni sudovi u obliku kupe sa kraćim ili dužim grlićem različitog prečnika. Njihova zapremina se kreće od 10 do 5000 ml. Koriste se za pripremu ičuvanje različitih rastvora.

Menzure su cilindrični stakleni sudovi sa ravnim dnom, a koriste se za odmjeravanje tečnosti. Graduisane su, a zapremina im se kreće od 10 do 2000 ml.

Čaše su cilindrični stakleni sudovi čije ravno dno služi kao postolje. Kraće su i šire od menzura.

5

1.4. PRANJE LABORATORIJSKOH SUĐA

Pravilno pranje laboratorijskog posuđa predstavlja jedan od preduslova za uspješno izvođenje eksperimenata. Sudovi se peru toplom vodom sa deterdžentom, temeljno se ispiraju u mlazu tekuće vode i potapaju se u hromsumpornu kiselinu u trajanju od 24 sata. Nakon toga se sudovi ispiraju u tekućoj vodi, ostavljaju u destilovanoj vodi 2-3h, a zatim se još jednom ispiraju u destilovanoj vodi.

1.5. PRANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA

Za pripremu mikroskopskih preparata neophodna su čista predmetna i pokrovna stakalca. Stakalca koja su ranije korištena treba držati 2 sata u rastvoru pripremljenom od 100 dijelova sumporne kiseline, 50 dijelova kalijum dihromata i 1000 dijelova vode. Nakon toga ispiraju se vodom, kuhaju 20 minuta u 1% rastvoru NaOH i ispiraju destilovanom vodom. Zatim se potope u razblaženu hlorovodoničnu kiselinu i ponovo se ispiraju destilovanom vodom. Ovako pripremljena stakalca se čuvaju u 96% etilalkoholu.

Čak se i nova stakalca trebaju pripremiti prije prve upotrebe. Ona se kuhaju 10 minuta u 1% rastvoru NaOH, ispiraju se u destilovanoj vodi, potapaju u rablaženu hlorovodoničnu kiselinu i ponovo ispiraju u destilovanoj vodi. Njihova čistoća se može provjeriti tako što se na suho stakalce stavi kapljica vode. Ako je stakalce čisto kapljica će se razliti, dok se na prljavom stakalcu formiraju kapljice.

2. MIKROSKOP I TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA

Mikroskop je optički instrument koji daje uvećan lik malih objekata i njihovih detalja. Danas se koristi više vrsta mikroskopa: svjetlosni, mikroskop sa tamnim poljem, faznokontrastni, fluorescentni, ultraljubičasti i elektronski. Budući da se u nastavi najviše koristi svjetlosni mikroskop, ovde će biti detaljnije opisan.

2.1. DIJELOVI MIKROSKOPA

Postoje različiti tipovi svjetlosnog mikroskopa, ali svi imaju nekoliko osnovnih dijelova koji se mogu podijeliti na mehaničke i optičke dijelove.

2.1.1. Mehanički dijelovi

U mehaničke dijelove mikroskopa spadaju: postolje, ručica, stočić sa mehanizmom za pomijeranje, tubus, kolijevka mikroskopa, zavrtanj kondenzora, makrometarski i mikrometarski zavrtanj.

Stativ mikroskopa je napravljen od metala i u svom donjem dijelu je proširen, obično u obliku potkovice, upostolje (Slika 1a) na kome stoji mikroskop. Postolje je od teškog metala, tako da mikroskopu obezbjeđuje stabilan položaj. Kod novijih mikroskopa u njega je ugrađen sistem za osvjetljenje. Postolje je preko nagibnog zgloba (Slika 1c) povezano sa gornjim dijelom stativa koji se zove ručica. Ručica (Slika b1) služi za prihvatanje, nošenje i

6

premiještanje mikroskopa i kao nosač drugih dijelova. Preko nagibnog zgloba mikroskop se iz vertikalnog dovodi u kosi položaj, koji je često povoljniji za rad.

Iznad nagibnog zgloba za stativ je pričvršćen stočić mikroskopa (Slika 1e). Na sredini stočića se nalazi otvor preko koga se postavlja preparat. Kroz otvor stočića prolaze svjetlosni zraci kojima se objekat koji posmatramo prosvjetljava. Stočić može biti pokretan ili nepokretan. Ukoliko je pokretan pokreće se pomoću dva zavrtnja koji se nalaze na ivici stočića, sa njegove lijeve i desne strane. Stočić se može pokretati u svim pravcima i na taj način je omogućeno posmatraču da u vidnom polju mikroskopa, finim pomijeranjima, pronađe odgovarajući dio preparata. Pokretan stočić je naročito koristan pri radu sa većim uvećanjima koja zahtijevaju neznatna pomijeranja preparata. Tako mala pomijeranja gotovo je nemoguće izvesti slobodnom rukom. Na nepokretnom stočiću preparat se pokreće rukom sve dotle dok se lik objekta ne pojavi u vidnom polju mikroskopa. Na stočiću se nalaze dva metalna držača za preparat, koji su od velike koristi, čak i neophodni, ako se u toku rada mikroskop izvodi iz vertikalnog položaja.

Tubus (Slika 1d) je metalna cijev koja na gornjem kraju nosi okular, a na donjem, kod savremenih mikroskopa, pokretan revolver u kome se nalaze ležišta za objektive različitog uvećanja (Slika 1f). Okretanjem revolvera dovodimo objektiv željenog uvećanja u optičku osu mikroskopa. Objektiv je doveden u optičku osu mikroskopa onda kada metalno perce, pričvršćeno na stativu, upadne u zarez na revolveru koji se nalazi iza tog objektiva. Tubus može da bude postavljen vertikalno ili koso. Ukoliko je postavljen koso između objektiva i okulara nalazi se prizma koja prelama svjetlosne zrake i usmjerava ih u koso postavljen tubus. Tubus je sa stativom pokretno spojen preko kolijevke mikroskopa. Kolijevka mikroskopa je sistem zupčanika koji se pokreće pomoću makrometarskog i mikrometarskog zavrtnja.

Makrometarski zavrtanj (Slika 1i) služi za gruba pomijeranja tubusa na fokusno rastojanje pri kome je lik jasno vidljiv i upotrebljava se pri radu sa manjim uvećanjima. Pomoću mikrometarskog zavrtnja tubus se dovodi tačno u fokus. Mikrometarski zavrtanj (Slika 1j) se upotrebljava pri radu sa većim uvećanjima. Zavrtanj kondenzora služi za podizanje i spuštanje kondenzora, čime se reguliše osvjetljenost preparata.

2.1.2. Optički dijelovi

U optičke dijelove mikroskopa spadaju okulari, objektivi i sistem za osvjetljavanje. Pomoću optičkih dijelova vrši se osvjetljavanje i uvećavanje lika objekta koji posmatramo.

Sistem za osvjetljavanje se nalazi ispod stočića mikroskopa i sastoji se iz ogledala i kondenzora. Ogledalo zauzima niži položaj i smješteno je na pokretnoj osovini tako pričvršćeno u polukružni ram da se može pokretati u svim pravcima (Slika 1k). Pokretljivost ogledala je veoma važna osobina, jer se zahvaljujući tome svjetlosni zraci, koji dopiru iz različitih svjetlosnih izvora, mogu korisnije upotrijebiti u cilju osvjetljavanja preparata. Ogledalo je okruglo, na jednoj strani ravno, a na suprotnoj udubljeno. Pri korišćenju svjetlosti sa udaljenih svjetlosnih izvora (dnevna svjetlost) upotrebljava se ravna strana ogledala, a u slučaju da je svjetlosni izvor blizu (vještačka svjetlost) upotrebljava se udubljena strana ogledala.

Kondenzor se nalazi između mikroskopskog stočića i ogledala (Slika 1l). Sagrađen je iz više sočiva koja se nalaze u zajedničkom prstenu. Kondenzor funkcioniše kao sabirno sočivo. Pomoću njega se objekat osvjetljava širim svjetlosnim snopom nego što bi to bio inače slučaj kada bi svjetlost dolazila samo sa ogledala, što je od posebnog značaja kada se radi sa velikim uvećanjima. Drugim riječima, objekat će biti prosvijetljen intenzivnijom svjetlošću nego što bi bio u istim uslovima ako bi svjetlost dolazila samo sa ogledala.

7

Kondenzor se može spuštati i podizati pomoću zavrtnja (Slika 1m). Podizanjem kondenzora svjetlost se pojačava, a spuštanjem se smanjuje. Neki mikroskopi imaju kondenzor tako montiran da se, osim u vertikalnom, može pomijerati i u horizontalnom pravcu.

U donjem dijelu kondenzora smještena je iris-dijafragma (Slika 1n). Pomoću nje se podešava količina svjetlosti kojom se osvjetljava objekat koji posmatramo. Iris-dijafragma je sagrađena od većeg broja polukružnih, čeličnih Ijuspica koje se, pomoću jedne poluge, skupljaju ili šire i na taj način stvaraju uži ili širi otvor za prolaz svjetlosti.

Objektivi (Slika 1g) su manje ili više složeni sistemi centriranih sočiva koja se nalaze u kratkom cilindru (SI. 2). Na svom gornjem dijelu cilindar ima navoje pomoću kojih se uvrće u ležište na revolveru. Na objektivu je urezana brojka koja označava koliko puta dati objektiv uvećava lik posmatranog objekta. Sočiva u objektivu su plankonveksna (ravnoispupčena). Ravnom stranom su okrenuta objektu, a ispupčenom prema oku. Od kvaliteta objektiva uglavnom zavisi i kvalitet lika objekta koji posmatramo.

Objektiv daje stvaran, uvećan i obrnut lik. Svaki objektiv karakteriše njegova moć razdvajanja, fokusno rastojanje i uvećanje. Slabiji objektivi imaju veće fokusno rastojanje: 50 do 60 mm, a jači 1 do 3 mm. Moć razdvajanja objektiva je njegova sposobnost da daje slike dve međusobno bliske tačke razdvojeno.

U odnosu na način upotrebe objektivi mogu biti suvi i imerzioni. Suvi objektivi su oni između čijih se frontalnih sočiva i preparata nalazi vazduh. (SIika 3 lijevo). To su objektivi manjih uvećanja: 3,2x; 10x; 40x.

Imerzioni objektivi su oni čije se frontalno sočivo mora potopiti u kap tečnosti (voda ili kedrovo ulje) koja se nalazi na preparatu iznad objekta koji posmatramo (SIika 3 desno). Imerzioni objektivi su većih uvećanja (90x, 100x).

Slika 3. Šema presjeka suvog objektiva i preparata (lijevo) i imerzionog(desno). A - frontalno sočivo objektiva B - pokrovno stakalce C - predmetno stakalce

Kvalitet mikroskopske slike zavisi, između ostalog, i od količine svjetlosnih zraka koji ulaze u objektiv. Upotrebom imerzionih objektiva, u odnosu na suve, pri ostalim jednakim uslovima, postiže se ulazak većeg broja svjetlosnih zraka u objektiv. Naime, svjetlosni zraci pri upotrebi suvih objektiva prolaze kroz sistem: stakla (predmetna ploča) - vazduh - stakla (frontalno sočivo objektiva). Usljed različitog indeksa prelamanja pojedinih sredina (stakla: 1,53; vazduh: 1:0) dolazi do znatnog rasipanja svjetlosnih zraka pa manja količina svjetlosti ulazi u objektiv (Slika 3 lijevo)

Pri upotrebi imerzionog objektiva svjetlosni zraci prolaze kroz sistem: staklo (predmetna ploča) - tečnost (kedrovo ulje) - staklo (frontalno sočivo imerzionog objektiva). Pošto je indeks prelamanja stakla 1,53 a kedrovog ulja 1,51, svjetlosni zraci prolaze kroz sredine približno istih indeksa prelamanja, te je rasipanje znatno umanjeno. Zbog toga u

8

objektiv ulazi mnogo više korisnih svjetlosnih zraka (Slika 3 desno) nego što je to slučaj kod suvih objektiva, a time se u znatnoj mjeri poboljšava i kvalitet mikroskopske slike. Treba napomenuti da su imerzioni objektivi specijalno građeni pa se zato samo oni mogu utapati u kap tečnosti na preparatu. Osim uljanih imerzionih objektiva postoje i takvi koji se utapaju u kapljicu vode.

Nešto jednostavnije od objektiva sagrađeni su okulari. Njih možemo uporediti sa lupom. Okulari se nalaze na gornjem dijelu tubusa (Slika 1h) i na svakom je upisan broj (7x, 10x, 15x) koji označava njegovu moć uvećanja. Mikroskopi koji imaju jedan okular se nazivaju monokularni, a oni koji imaju dva okulara binokularni. Postoje i mikroskopi sa dvostrukim okularima koji su namješteni u horizontalnoj cijevi tako da dvije osobe mogu istovremeno posmatrati preparat.

2.2. REZOLUCIJA MIKROSKOPA

Rezolucija ili moć razdvajanja mikroskopa može da se formuliše na sledeći način: to je veličina najmanjeg dijametra čestice koju jasno vidimo ili najmanje rastojanje između dve linije koje možemo odvojeno vidjeti u mikroskopu. Moć razdvajanja zavisi od numeričke aperture objektiva, talasne dužine svjetlosti i ugla pod kojim svjetlost pada. Ukoliko je numerička apertura veća, talasna dužina svjetlosti manja i osvjetljenje koso, moć razdvajanja je bolja.

Numerička apertura je mjera za moć razdvajanja objektiva i označena je na samom objektivu. Njene vrijednosti se kreću od 0,11 do 1,3. Razdvojna moć objektiva se izračunava tako što se talasna dužina svjetlosti pri kojoj posmatramo podijeli sa vrijednošću numeričke aperture. Npr. ako je talasna dužina svjetlosti 560 nm, a numerička apertura 1, razdvojna moć je 560 nm. To znači da taj objektiv razdvaja i čini vidljivim dva objekta koja su na međusobnoj udaljenosti od 560 nm. Jedna od osnovnih karakteristika mikroskopa je njegovo opšte uvećanje. Opšte uvećanje mikroskopa (Um) određuje se kao proizvod uvećanja objektiva (Uob) i uvećanja okulara (Uok), a izražava se formulom:

U m= U o b x U o k

Ako objektiv uvećava lik posmatranog objekta 90x, a okular 15x, tada će opšte uvećanje mikroskopa iznositi 1350x. Upotrebom okulara većeg uvećanja (20x) neće se dobiti bolji kvalitet slike posmatranog objekta, jer smo prešli granicu tzv. korisnog uvećanja mikroskopa. Izračunato je da korisno uvećanje mikroskopa nije veće od 1300 do 1450 puta. Postavlja se pitanje kako izabrati okular maksimalnog uvećanja u okviru korisnog uvećanja mikroskopa. Pretpostavimo da radimo sa objektivom 40x čiji je aperturni ugao 0,65. Korisno uvećanje je 1000 x 0,65 = 650x. Kada korisno uvećanje podijelimo uvećanjem objektiva koji koristimo (40x) dobićemo maksimalno korisno uvećanje okulara, u datom primjeru 16x. Korišćenje jačih okulara negativno bi uticalo na kvalitet lika, jer se javlja difrakcija svetlosti.

2.3. ČUVANJE MIKROSKOPA

Pri radu sa mikroskopom posebnu pažnju treba obratiti na prenošenje mikroskopa. Mikroskop se isključivo prenosi ili pomijera na taj način što se jednom rukom drži za ručicu, a drugom za postolje.

9

Kao što je već ranije napomenuto od kvaliteta optičkih dijelova mikroskopa zavisi i kvalitet lika objekta koji dobijamo, pa prema tome okulare i objektive treba posebno čuvati i njegovati. Njihova sočiva treba da su uvijek čista. Na početku i na kraju rada, a po potrebi i u toku rada, sočiva treba očistiti mekom, i za tu svrhu specijalno napravljenom četkicom ili mekom krpom koja ne ostavlja tragove. Ukoliko se prašina nalazi sa unutrašnje strane sočiva ono se odvrne i na isti način očisti, no ovu radnju bolje je prepustiti specijalizovanim radionicama. Sočiva se nikad ne dodiruju prstima, niti se sa njih prašina otklanja duvanjem.

Pri mikroskopiranju se često na metalnim dijelovima mikroskopa kondenzuje vodena para (usljed disanja) koju treba ukloniti brisanjem.

Po završenom mikroskopiranju makrometarskim zavrtnjem podići tubus mikroskopa i ukloniti preparat, pokretanjem revolvera u optičku osu dovesti najmanji objektiv, a sve mehaničke i optičke dijelove obrisati i mikroskop vratiti u kutiju.

Mikroskop treba čuvati i kada se ne upotrebljava i to naročito od prašine, toplote, neposrednog djelovanja sunčeve svjetlosti, vlage i isparenja raznih hemikalija.

2.4. TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA

Opšte napomene. Pri mikroskopiranju se mogu koristiti dnevna difuzna ili vještačka svjetlost. Iako je dnevna svjetlost veoma prijatna za rad, pri dužoj upotrebi mikroskopa prednost ima vještačka svjetlost.

Visina stola i stolice treba da bude takva da posmatrač može duže vremena udobno i bez naprezanja da radi.

Pred početak rada mikroskop se izvadi iz kutije, postavi na radno mjesto i mekom krpom pažljivo očisti od prašine.

Poslije završenog mikroskopiranja preparat se skida sa stočića, u osu se postavlja najmanji objektiv, mikroskop se obriše i pažljivo, držeći ga jednom rukom za ručicu a drugom za postolje, stavlja u kutiju.

Uzimanje i prenošenje mikroskopa vrši se isključivo držanjem za ručicu i postolje istovremeno.

Mikroskop se postavlja tako da ogledalo bude uvijek okrenuto svjetlosnom izvoru, a ručica mikroskopa posmatraču.

Dovođenje objektiva u optičku osu mikroskopa. - Kada mikroskop stavimo na radno mjesto dovodimo objektiv najmanjeg uvećanja u optičku osu mikroskopa.Objektiv se dovodi u optičku osu mikroskopa okretanjem pokretnog dijela revolvera. Na revolveru se, prema svakom objektivu, nalazi ispupčenje sa zarezom. Kada, okrećući revolver, u zarez na njemu upadne perce koje se nalazi na fiksiranom dijelu revolvera ispod tubusa, čuje se karakterističan zvuk, što je znak da se dati objektiv nalazi u optičkoj osi mikroskopa.

Traženje vidnog polja mikroskopa. Kada smo objektiv najmanjeg uvećanja postavili u optičku osu mikroskopa pristupamo traženju vidnog polja. Mikroskopira se uvijek lijevim okom, a desno je otvoreno. Ovo je naročito važno pri crtanju preparata. Ma koliko teškoća takav način rada u početku bude izazivao, vremenom se uvježba. Prema tome, jedno od pravila pri mikroskopiranju je da su oba oka otvorena. Takođe, treba istaći da se mikroskopira bez naočara, osim ako je posmatrač jako kratkovid.

Traženje vidnog polja vrši se na sledeći način: gledajući kroz okular okrećemo ogledalo prema svjetlosnom izvoru sve dotle dok ne ugledamo ravnomjerno kružno vidno polje mikroskopa. Pronalaskom vidnog polja mikroskop je pripremljen za rad pa se vrši fokusiranje.

Fokusiranje. Na stočić mikroskopa staviti preparat i pristupiti traženju jasnog lika objekta koji želimo da proučavamo. Preparat se stavlja na stočić tako da se objekat našeg

10

ispitivanja nalazi preko otvora stočića i, od prilike, ispod sočiva objektiva. Gledajući kroz okular pažljivo pomijeramo preparat sve dok se u vidnom polju ne pojavi sijenka. Tada preparat više ne pomijeramo već pomoćumakrometarskog zavrtnjapažljivo podižemo tubus sve dotle dok ne ugledamo jasan lik objekta koji posmatramo. Pri ovome tzv. malom uvećanju (ono se kreće od 8x do 10x) pregledamo preparat, uočimo njegove osnovne karakteristike, nacrtamo šemu i izaberemo najpogodnije mjesto za detaljnije proučavanje građe pri većem uvećanju. Zatim, ne pomijerajući preparat, okretanjem revolvera dovodimo u optičku osu mikroskopa objektiv većeg uvećanja (40x, 45x). Pomoću mikrometarskog zavrtnja izoštrimo lik objekta koji posmatramo. Jedno od osnovnih pravila fokusiranja je da se tubus pri radu sa malim uvećanjem prvo spusti na 0,5 cm od preparata, što se posmatra sa strane, a zatim gledajući kroz okular, tubus se podiže sve dok se ne pojavi lik objekta u vidnom polju mikroskopa. Fokusira se uvijek odozdo na gore.Pokretanje tubusa pri upotrebi objektiva manjih uvećanja vrši se uvijek makrametarskim zavrtnjem, a pri radu sa objektivima većih uvećanja isključivo se koristi mikrometarski zavrtanj za fokusiranje.

Pri upotrebi imerzionih objektiva postupak je sledeći:

1. pomoću objektiva manjeg uvećanja pronaći lik objekta 2. podići tubus toliko da donja ivica objektiva bude udaljena oko 2 cm od

preparata 3. na preparat staviti kap imerzionog ulja (kedrovo ulje) 4. okretanjem revolvera dovesti u optičku osu mikroskopa imerzioni objektiv 5. gledajući sa strane, polako i veoma pažliivo spuštati tubus sve dok se sočivo 6. imerzionog objektiva ne utopi u kedrovo ulje 7. spuštati objektiv sve dok ne dođe u neposrednu blizinu preparata, a zatim

fokusirati gledajući kroz okular 8. poslije rada imerzioni objektiv odmah očistiti od ulja mekom lanenom krpom

koju prethodno treba Iako natopiti ksilolom, ili još bolje, medicinskim benzinom budući da ksilol nagriza sočiva objektiva. Za čišćenje se nikada ne upotrebljava alkohol! Poslije čišćenja još jednom obrisati objektiv mekom i suvom krpom i ostaviti ga na mjesto.

2.5. MIKROSKOPSKA MJERENJA

Veličina ćelije, određene ćelijske komponente ili čitavog organizma (ako je riječ o organizmima mikroskopskih razmjera) se može odrediti pomoću okular-mikrometra koji se postavlja na svjetlosni mikroskop.

Okular-mikrometar (Slika 4) je obično okruglo staklo koje se može umetnuti u okular mikroskopa. Na njemu se nalazi skala koja je najčešće dužine 5,0 mm i izdijeljena je na 50 podioka. Vrijednost jednog podioka na okular-mikrometru se određuje pomoću objektiv- mikrometra.

Objektiv-mikrometar (Slika 5) ima izgled predmetnog stakalca na kom je ugrađena skala dužine 1,0 mm, a podijeljena je na 100 dijelova. Prema tome, rastojanje između dva podioka iznosi 0,01 mm ili 10,0 mikrometara.

Vrijednost podioka na okularnom mikrometru se određuje tako što se okularni mikrometar postavi u okular, a objektivni na stočić mikroskopa. Podešavanje objektivnog mikrometra se vrši tako što se prva lijeva crta na njemu (označena sa 0) poklopi sa prvom lijevom crtom na okular-mikrometru (takođe označena sa 0). Zatim se skale prate udesno dok se ne pronađe mjesto gdje se poklapa podiok objektiv sa podiokom okular-mikrometra.

11

Izbroji se broj podioka i pošto se zna da vrijednost jednog podioka na objektiv-mikrometru iznosi 0,01 mm, izračuna se vrijednost jednog podioka na okular-mikrometru. Na primjer, ako se poklopi četvrti podiok na objektiv-mikrometru i šesnaesti podiok na okular-mikrometru, vrijednost jednog podioka okular mikrometra iznosi: 0,01x4/16 = 0,0025 mm ili 2,5 mikrometara. Kada se dobije vrijednost jednog podioka na okular mikrometru na stočić mikroskopa se stavi preparat i izmjeri veličina posmatranog objekta.

Vrijednost podioka se određuje za svaku kombinaciju objektiva i okulara.

3. PRIPREMA PRIVREMENIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA

Često se u biološkim laboratorijama pripremaju privremeni mikroskopski preparati koji se koriste kratak vremenski period, nakon čega dolazi do njihovog isušivanja i deformacije posmatranog materijala.

3.1. METODE I TEHNIKE

Pod pojmom mikroskopske tehnike podrazumijeva se opis postupaka koji je primijenjen, kako pri neposrednom posmatranju živog materijala, tako i metode pripremanja privremenih i trajnih preparata.

Obradu materijala i pravljenje mikroskopskih preparata moguće je podijeliti u nekoliko radnih faza: ubijanje i fiksiranje, ispiranje, siječenje (slobodnom rukom ili mikrotomom), bojenje, inkluzija u materiju u kojoj može da se sačuva duže vremena. Sve one zajedno čine jedinstven postupak čiji je krajnji cilj dobijanje privremenog ili trajnog mikroskopskog preparata.

Prije nego što se pristupi pravljenju preparata neophodno je izvršiti prethodna orijentaciona posmatranja na živom materijalu u cilju provjeravanja podobnosti materijala u vezi sa postavljenim zadatkom, određivanja najpogodnijeg fiksativa i ustanovljavanja karaktera tkiva od kojih je organ sagrađen, jer od svega toga zavisi primjena odgovarajućih mikrotehničkih postupaka. Osim toga, proučavanja na živom materijalu sama po sebi su veoma značajna, često i nezamjenjiva (na primjer: kretanja citoplazme), i zato, kad god je to moguće, treba vršiti paralelno proučavanje na živom i fiksiranom materijalu. Ove dve metode se uzajamno dopunjuju, a nikako jedna drugu ne isključuju.

3.2. SKVOŠ PREPARAT

U savremenoj mikroskopskoj tehnici, posebno pri proučavanju procesa ćelijske diobe, određivanju broja hromozoma i analizi kariotipova, primjenjuje se tehnika pravljenja skvoš preparata (engleski: squash - gnječiti, spljeskati). Skvoš preparati su po svome karakteru najčešće privremeni, ali i oni se mogu posebnim postupkom prevesti u trajne. Osnovna karakteristika skvos preparata je da se materijal poslije fiksiranja, ispiranja i bojenja macerira i na mikroskopu posmatra i analizira ustvari macerirano tkivo.

S obzirom na široku primjenu ove metode postoji niz specifičnih postupaka u svim navedenim fazama rada.

3.2.1. Opšti princip pripremanja skvoš preparata

12

Skvoš preparati se prave od mladih biljnih organa čije se ćelije nalaze u fazi intenzivne deobe (vrhovi korjena, mladi prašnici, mladi koleoptili i mladi listovi). Materijal se često prije fiksiranja mora još i specijalno obraditi, posebno ako se javljaju teškoće pri brojanju hromozoma. Najčešći reaktivi koji se u tu svrhu upotrebljavaju su hloralhidrat, kolhicin, paradihlorbenzol, 8-hidroksihinolin i u poslednje vrijeme enzimi (citaza). Pri radu sa ovim reaktivima nužno je zaštititi ruke gumenim rukavicama.

Hloralhidrat sa koristi u vidu 0,3 do 1 % vodenog rastvora. U ovom reaktivu materijal se drži 1 sat, a zatim se isto toliko dugo ispira u vodovodnoj vodi i još 2 do 4 sata ostavlja u vlažnoj komori, pa tek onda fiksira. Hloralhidrat se koristi u cilju postizanja skraćivanja hromozoma.

Prije fiksiranja materijal, na kome želimo da ispitujemo broj, raspored i građu hromozoma, obrađuje se 0,01 - 0,05% rastvorom kolhicina u trajanju od 2 sata.

Zasićen rastvor paradihlorbenzola se takođe koristi kao sredstvo u prethodnoj obradi vrhova korjenčića. Zasićen rastvor dobija se rastvaranjem 5 do 10 grama kristala paradihlorbenzola u 500 ml destilovane vode. Ovaj rastvor se u zatvorenoj posudi ostavlja u termostatu 10 do 12 sati na temperaturi od 60°C. U ovako pripremljenom rastvoru materijal sa drži 2 do 3 sata prije fiksiranja i to na temperaturi izmedu 12 i 16°C.

8-hidroksihinolin se upotrebljava kao 0,002 M rastvor pri temperaturi od 10 do 14°C. Materijal u njemu provodi 3 sata i poslije ispiranja u vodovodnoj vodi se fiksira.

Za skvoš preparate materijal se najčešće fiksira u glacijalnoj sirćetnoj kiselini i apsolutnom alkoholu u odnosu 3:1 ili u fiksativu Karnoa. Vrijeme koje materijal provodi u fiksativu određeno je izborom fiksativa i karakteristikama samog materijala. Tako na primjer u fiksativu Karnoa materijal ostaje 2 do 12 sati. U zavisnosti od prirode materijala, u navedenim granicama, određuje se vrijeme fiksiranja. Materijal na kome želimo da brojimo hromozome fiksira se na nižim temperaturama koje se kreću izmedu +2 i +3°C.

Poslije fiksiranja objekti se ispiraju u 70% alkoholu. U ovom alkoholu materijal može ili da se konzervira iIi se iz njega odmah dalje sprovodi.

Objekti se poslije ispiranja maceriraju. Maceriranje se obavlja na više načina: prokuhavanjem u boji, 45% glacijalnom kiselinom, 40-45% propionskom kiselinom, u 1 n sonoj kiselini. Sledeća faza u pravljenju skvoš preparata je bojenje. Za bojenje se koristi više boja: acetokarmin, acetorsein, acetolakmoid i metilensko plavo.

Pripremanje boja.

Acetokarmin. 1 do 2 gr karmina rastvoriti u 45 ml glacijalne sirćetne kiseline i 55 ml destilovane vode. Rastvor boje uparavati 30 do 60 minuta. Kada se ohladi tamno crveni rastvor karmina se profiltrira i ostavlja u dobro zatvorenoj posudi sve do upotrebe.

Acetorsein. 1 gr orseina rastvoriti u 45 ml vrele sirćetne kiseline i ostaviti da se ohladi. Kada se rastvor ohladi dodati 55 ml destilovane vode, dobro izmiješati, profiltrirati i boja je spremna za upotrebu.

13

Acetolakmoid. 2 gr lakmoida rastvoriti u 100 ml 45% sirćetne kiseline i uparavati do suve.supstance (oko 2 sata). Kada se završi uparavanje, ponovo dodati sirćetnu kiselinu do nivoa zapremine na početku uparavanja. Prije upotrebe boja se filtrira.

Metilensko plavo. 100 do 500 mg metilenskog plavog rastvoriti u 100 ml destilovane vode. Poslije filtriranja boja se može koristiti.

Iz boje se materijal prenosi na predmetno stakalce u kap 45% sirćetne kiseline iIi u hloralhidrat (5 gr hloralhidrata rastvoriti u 2 ml destilovane vode), prekriva se pokrovnim stakalcem i pritišće. Pritiskanje se vrši preko filter papira, najbolje običnom gumicom za brisanje. Pritisak treba da bude takve jačine da se pod njegovim dejstvom tkiva razdvoje na pojedinačne ćelije, a da se pri tome ne razbije stakalce. Na ovaj način napravljen je privremeni skvoš preparat.

U cilju jasnijeg sagledavanja pravljenja skvoš preparata navešćemo jednu od većeg broja šema koje se koriste u mikroskopskoj tehnici:

fiksiranje: glacijalna sirćetna kiselina - apsolutni alkohol (3:1) u trajanju od 2 sata

ispiranje: u 70% alkoholu (sve dok se osjeća miris sirćetne kiseline) u vodi maceracija: u 1n sonoj kiselini na 60°C nekoliko sekundi ili minuta, ili samo

prokuhavanje u boji bojenje: bojenje u acetokarminu, acetorseinu i acetolakmoidu traje 3 do 5

minuta. Pri bojenju se materijal zagrijava. Kada se maceriranje vrši u boji onda ona treba više puta da proključa, a to se postiže primicanjem i odmicanjem epruvete plamenu špiritusne lampe.

Skvoš preparat: materijal se prenosi na predmetno staklo u kap 45% sirćetne kiseline iIi hloralhidrata, pokriva se pokrovnim staklom, pritišće i spreman je za mikroskopsku analizu.

Od privremenih, moguće je posebnim postupkom dobiti trajan skvoš preparat. Jedan od načina za pravljenje takvih preparata predložili su Konžeri i FerčajId, a sastoji se u sledećem: privremeni skvoš preparat postavlja se na površinu parčeta suvog leda 1 do 1,5 minuta. Zatim se nekim instrumentom udalji pokrovno stakalce, a na predmetnom ostaje zalijepljen materijal. Ovako pripremljen preparat dalje se sprovodi kroz 96% alkohol, apsolutni alkohol, apsolutni alkohol-ksilol u odnosu 1: 1, ksilol i na kraju se preko materijala stavlja kanada balzam i pokriva se čistim pokrovnim stakalcem. U svakom od navedenih agenasa preparati ostaju 2 do 5 minuta.

3.3. PRIPREMA PREPARATA SA MATERIJALOM IZ USTA

Budući da su u ustima stalno prisutne rastvorene hranjive materije i sitni komadići hrane, kao i stabilni uslovi vlažnosti i temperature, usna šupljina predstavlja veoma povoljno stanište za rast različitih vrsta mikrooorganizama. Tu se mogu naći brojne bakterije iz rodova Streptococcus, Micrococcus, Staphylococcus, protozoe kao što je Entamoeba gingivalis, gljivice Candida, Aspergilus, Penicillium, Saccharomyces itd.

Za pripremu preparata sa mikroorganizmima iz usta materijal se može uzeti struganjem plaka sa površine zuba, sa površine desni, sa sluzokože obraza itd. Budući da se na svakom od ovih mikrostaništa razlikuju uslovi života, i mikroorganizmi koji ih nastanjuju će biti

14

različiti. Takođe, blagim struganjem čačkalicom sluzokože obraza može se dobiti materijal za posmatranje ćelija sluznice obraza.

MATERIJAL

- predmetno stakalce, - Bunzenov plamenik ili špiritusna lampa, - vata, - 70% alkohol, - sterilna čačkalica, - bakteriološka eza, - marker, - štipaljka (nije obavezna)

POSTUPAK

1. Sterilisati radnu površinu 70% alkoholom, uzeti čisto stakalce i označiti ga markerom. 2. Flambirati ezu na plamenu do usijanja, sačekati da se ohladi i prenijeti petljom eze

dvije kapljice vode na sredinu predmetnog stakalca. 3. Uzeti sterilnu čačkalicu i njom zahvatiti malu količinu materijala koji se nalazi

između zuba. 4. Zahvaćeni materijal prenijeti u kap vode na stakalcu, dispergovati ga i napraviti

razmaz. 5. Iskorištenu čačkalicu baciti u kantu za smeće. 6. Ostaviti preparat da se osuši, a zatim ga fiksirati na plameniku. 7. Da bi se mikroorganizmi iz usta mogli lakše uočiti poželjno ih je obojiti šafraninom ili

kristal violet bojom. Potrebno je preliti razmaz jednom od ovih boja i sačekati 30 sekundi da djeluje.

8. Zatim se boja izlije i ispere destilovanom vodom. 9. Preparat osušiti na vazduhu ili ga prisloniti na filter papir. Nikako se ne smije brisati

filter papirom! 10. Ovako pripremljen preparat se posmatra pod imerzionim objektivom.

Imerzioni objektiv ima veću moć uvećanja od klasičnog objektiva. Na preparat se stavi kapljica kedrovog ulja u koju se zatim uranja objektiv. Izoštravanje slike se vrši mikrovijkom da se ne bi slomilo stakalce. Radi lakšeg uočavanja mikroorganizama potrebno je da osvjetljenje preparata bude maksimalno i kondenzor mikroskopa spušten. Ako je preparat dobro pripremljen na njemu se mogu uočiti mikroorganizmi različitih oblika.

3.4. PREPARAT VISEĆA KAP

Za proučavanje živih ćelija fitoplanktona, zooplanktona i drugih mikro-organizama, tj. njihovog razmnožavanja, pokretljivosti, sporulacije itd, kao i za izolaciju mikrooorganizama, koristi se preparat ″viseća kap″. Za pripremu ovakvih preparata potrebna su specijalna predmetna stakalca koja imaju udubljenje u sredini.

POSTUPAK

1. Oko udubljenja predmetnog stakalca namazati tanak sloj vazelina (Slika 6a). 2. Na centar pokrovnog stakalca nanijeti suspenziju mikroorganizama. Ako se

mikroorganizmi nanose iz tečne kulture onda se samo sterilnom ezom uzme kap kulture i postavi na stakalce (Slika 6b). Ako se mikroorganizmi uzimaju sa čvrste

15

podloge onda se na pokrovno stakalce prvo stavi kap fiziološkog rastvora, a zatim se sterilnom ezom zahvati malo kulture i razmuti u nanesenoj kapljici. Budući da se neobojeni mikroorganizmi obično veoma slabo vide pod svjetlosnim mikroskopom, često je neopho-dno na pokrovno stakalce dodati i kap metilenskog plavog. Boja mora biti razblažena 10 000 puta da ne bi ubila mikroorganizme. Metilensko plavo se priprema tako što se rastvori 0,3 g boje u 30,0 ml 96% etanola i doda se 100 ml destilovane vode. Ovako pripremljenu boju treba razblažiti 10 000 puta miješanjem 0,01 ml boje i 100 ml destilovane vode. Kap razblaženog metilensko plavog se izmiješa sa suspenzijom mikroorganizama na pokrovnom stakalcu.

3. Predmetno stakalce okrenuti i pritisnuti na pokrovno stakalce tako da kap sa kulturom mikroorganizama ostane u centru udubljenja (Slika 6c).

4. Zatim predmetno stakalce pažljivo okrenuti tako da kap sa kulturom ostane visiti na pokrovnom stakalcu iznad udubljenja predmetnog stakalca.

5. Pritisnuti ivice pokrovnog stakalca da se dobro zalijepe za vazelin (Slika 6d). 6. Ovako pripremljen preparat posmatrati pod velikim uvećanjem mikroskopa ili u

imerziji. Posmatra se ivica kapljice u zatamnjenom vidnom polju.

4. PRIPREMA TRAJNIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA

Jednom pripremljen privremeni preparat se može koristiti samo kratak vremenski period, budući da veoma brzo dolazi do njegovog isušivanja i deformisanja posmatranog materijala. Da bi preparat bio upotrebljiv duži vremenski period, pa i nekoliko godina, potrebno je primijeniti nimalo jednostavan niz postupaka za pripremu trajnih preparata.

4.1. UBIJANJE I FIKSIRANJE

Prva i veoma važna faza u obradi materijala jeste ubijanje i fiksiranje. Ubijanje i fiksiranje materijaia obično se vrši istim agensima. Cilj fiksiranja je ne samo da se ubije objekat, već da se brzim i ravnomjernim prodiranjem, i to u što kraćem vremenu, prekinu životni procesi, a da se pri tome gotovo ništa, ili što je moguće manje izmijeni objekat, tako da ovaj i kasnije pokazuje u najtananijim detaljima istu građu koju je imao dok je bio živ.

Jedan od osnovnih preduslova uspješnog fiksiranja je stanje samog materijala i zato ga uvijek treba fiksirati dok je još svjež. Najbolje je da se ova faza pripremanja preparata vrši odmah nakon što je uzet materijal (npr. ako je riječ o biljnom materijalu na samom mjestu gdje biljka raste). Uspjeh fiksiranja zavisi još i od brzine prodiranja fiksativa, a ona opet zavisi od prirode i veličine materijala koji se fiksira. Sitniji objekti fiksiraju se cijeli, a krupniji (u slučaju biljnog materijala korijen, stablo, list itd.) se sijeku na manje dijelove veličine od 0,5 do 3,0 cm. Pri siječenju krupnijih biljnih organa na manje dijelove vodi se računa o orijentaciji. Tako na primjer cilindrični organi se sijeku poprečno, a list normalno na centralni nerv.

Fiksiranje se vrši u odgovarajućim staklenim sudovima kao što su: epruvete, teglice, mjerni sudovi i slično. Pošto se sastav fiksativa tokom vremena mijenja potrebno je pri fiksiranju koristiti znatno veću količinu fiksativa u odnosu na zapreminu objekta koji preparujemo. Jednom upotrebljen fiksativ više se ne upotrebljava. Ako materijal duže vremena stoji u nekom fiksativu, fiksativ treba povremeno zamijeniti svježim.

Materijal u koji fiksativ prodire pravilno, a to znači brzo i ravnomjerno, ubrzo pada na dno. Da bi sa donje strane objekta fiksativ i dalje ravnomjerno prodirao, na dno suda u kome se vrši fiksiranje stavlja se vata ili filter papir. Može se desiti da iako su sve pripremne radnje

16

dobro sprovedene neki objekti ne potonu, već ostaju na površini. Jedan od uzroka ove pojave može da bude sama priroda materijala, odnosno da je bogat intercelularima koji su puni vazduha. Ukoliko ustanovimo da materijal ne tone zato što je ispunjen vazduhom, treba na posudu u kojoj se vrši fiksiranje pripojiti vakuum pumpu koja će svojim radom odstraniti nepoželjan vazduh i omogućiti prodiranje fiksativa u sve dijelove materijala.

U sud sa fiksativom, pored materijala koji se obrađuje, stavlja se cedulja (etiketa) veličine 1-1,5 x 3 cm na kojoj su ispisani neophodni podaci o objektu: ime vrste, datum i mjesto uzimanja materijala, naziv organa koji se preparuje itd. Za etiketiranje se upotrebljava čvršći bijeli papir, a na njemu se podaci ispisuju isključivo običnom grafitnom olovkom.

4.1.1. Fiksativi koji se najčešće upotrebljavaju

95% etil alkohol

95% etil alkohol upotrebljava se kao fiksativ samo za materijal koji će se u daljem postupku sijeći rukom pomoću žileta. Ovaj fiksativ se ne preporučuje za materijal koji će biti podvrgnut finijim analizama, jer izaziva kontrakciju citaplazme. Da bi se izbjegla kontrakcija citoplazme, a iskoristila dobra svojstva alkohola, upotrebljavaju se fiksativi koji u sebi sadrže glacijalnu sirćetnu kiselinu.

Fiksativ Karnoa (Carnoy)

Priprema se po sledećoj recepturi:

Apsolutni alkohol ... ... ... 6 mlHloroform ... ... ... 3 ml

Glacijalna sirćetna kiselina ... ... ... 1 ml

Ovaj fiksativ brzo prodire. Materijal se u njemu fiksira 6 do 12 sati, a može i kraće. Vrijeme fiksiranja zavisi od veličine i prirode materijala. Tako na primjer za vrhove korjena crnog luka dovoljno je fiksiranje od 10 do 15 minuta. Poslije fiksiranja materijal se ispira u apsolutnom alkoholu sve dok se osjeća miris sirćetne kiseline. Ukoliko se u daljem postupku ne primjenjuje parafinska metoda, materijal se može čuvati (konzervira se) u 80% etil alkaholu. Fiksativ Karnoa nalazi široku primjenu u citološkim i embriološkim istraživanjima.

Farmerov fiksativ


Apsolutni alkahol ... ... ... ... 6 mlGlacijalna sirćetna kiselina ... ... ... ... 1 ml

Farmerov fiksativ se upotrebljava na isti način i u iste svrhe kao i fiksativ Karnoa.

Alkohol-formalin


50% etil alkahol ... ... ... ... 100 ml

17

35 ili 40% prodajni formalin ... ... ... ... 5 ml

Alkohol-formalin je veoma pogodan za fiksiranje materijala na terenu, jer istovremeno vrši i konzervaciju, tako da u njemu objekti mogu da ostanu do konačne obrade. Kao fiksativ koristi se pri anatomskim istraživanjima, a može da se upotrebi i za fiksiranje nježnijeg materijala.

Formalin


35 ili 40% prodajni formalin ... ... ... ... 2-4-6 mlvoda ... ... ... ...98-96-94 ml

2-4% formalin je dobar fiksativ za alge i gljive. Materijal se u fiksativu drži do obrade. Prije obrade materijal se ispira vodom, jer pare formalina, koje se iz neispranog materijala odvajaju, nadražuju oči i sluzne pokožice.

Fiksativ Navašina

a) Jači rastvor:

1 % hromna kiselina .. ... ... ... 10 ml40% (prodajni) formalin... ... ... ... 4 ml

Glacijalna sirćetna kiselina ... ... ... ...1 ml

b) Slabiji rastvor:

1 % hromna kiselina ... ... ... ...15 mlDestilovana voda ... ... ... ... ...17 ml

40% (prodajni) formalin ... ... ... ...2 mlGlacijalna sirćetna kiselina ... ... ...1 ml

1 % rastvor hromne kiseline može se napraviti u većoj količini, a kompletan fiksativ neposredno prije upotrebe. Materijal se fiksira 24 sata, zatim se pažljivo i dugo ispira tekućom vodom (čak i do 24 sata). Zatim se vrši dehidratacija kroz seriju alkohola sve veće koncentracije. U 80% alkoholu materijal može da se konzervira ili se postupak nastavlja dalje parafinskom metodom, koja će detaljno biti opisana u daljem tekstu. Ovaj fiksativ pogodan jeza finija anatomska i embriološka istraživanja.

Fiksativ Buena (Buin)

40% prodajni formalin ... ... ... ... ... ... 25 mlPikrinska kiselina (zasićen rastvor u 70% etil alkoholu) 75 ml

Glacijalna sirćetna kiselina ... ... ... ... ... ... 5 ml

Fiksiranje traje 24 sata. Ispiranje se vrši u 70% alkoholu sve dotle dok iz materijala izlazi žuta boja. Dehidrataciju obaviti kroz seriju alkohola sve veće koncentracije. U 80% alkoholu materijal se može konzervirati, ili se dalje sprovodi po principima parafinske metode. Upotrebljava se u iste svrhe kao i fiksativ Navašina.

18

Fiksativ FAA (formalin-acetoacid-etil alkohol)

Priprema se na sledeći način: 70% etil alkohol 90 ml

40% (prodajni) formalin 5 mlGlacijalna sirćetna kiselina 5 ml

U ovom fiksativu materijal ostaje 24 sata, a zatim se ispira u 70% alkoholu 1 sat. Dehidratacija i konzerviranje vrše se na isti način kao i poslije upotrebe Navašinovog i Buenovog fiksativa. Vrlo je pogodan fiksativ za citološka istraživanja.

4.1.2. Fizička fiksacija

Ako se pripremaju preparati sa mikroorganizmima mnogo je jednostavnije izvršiti fiksaciju fizičkim, umjesto hemijskim putem. Fizički se preparati fiksiraju toplotom tako što se suvi razmaz brzo prenese iznad plamena 5 do 6 puta, vodeći računa da materijal na predmetnom stakalcu bude okrenut na gore. Treba napomenuti da se na ovaj način usmrćuju samo vegetativni oblici mikroorganizama, dok sporegeni opstaju, pa treba biti posebno pažljiv pri rukovanju sa patogenim materijalom.

4.2. ISPIRANJE MATERIJALA

U fiksativu materijal ostaje kraće ili duže vrijeme. Vrijeme fiksiranja je uvijek naznačeno u metodici i različito je za pojedine fiksative. Da bi dalji mikrotehnički postupci mogli pravilno da se odvijaju neophodno je poslije fiksiranja materijal dobro isprati. U čemu će se ispiranje obaviti zavisi od sastava fiksativa. Ako u njegov sastav ulazi alkohol onda se ispiranje vrši alkoholom one koncentacije koja je upotrebljena i pri pravljenju fiksativa. Na primjer: ako je fiksiranje vršeno u fiksativu Karnoa, u čiji sastav ulazi apsolutni etil alkohol, onda se ispiranje vrši apsolutnim alkoholom, dok će materijal fiksiran u Buenovom fiksativu biti ispiran 70% alkoholom. Ako je za fiksiranje korišćen vodeni rastvor neke materije, ispiranje se obavlja tekućom vodom i to najmanje u vremenu od jednog do tri sata, a često i duže.

Najjednostavniji, ali ne i najbolji, način ispiranja je česta promjena vode ili alkohola u staklenim posudama u kojima se materijal fiksira. Mnogo je bolje pronaći mogućnost stalnog proticanja vode preko fiksiranog materijala. Jedan od dobrih, ali komplikovanijih načina ispiranja je upotreba aparata koji predstavlja bateriju cjevčica koje se uvode u posude u kojima se nalazi materijal koji se ispira. Cjevčice se uvode u posude kroz gazu, kojom su ove zatvorene, i dovode do dna. Puštanjem vode preko priključka na slavini u više posuda istovremeno, ravnomjerno i stalno protiče voda onoliko vremena koliko je predviđeno da ispiranje traje (od 1 do 24 sata).

Materijal se može ispirati i na drugi način. Fiksirani objekti se zajedno sa etiketama prebace u vrećice od gaze. Naravno da se pri ovom postupku podrazumijeva da se materijali iz različitih posuda ne miješaju već da svaki ima svoju vrećicu. Svaku vrećicu pri vrhu dobro vezati koncem, tako da iz njih ništa ne može ispasti. Ovako pripremljene vrećice stavljaju se u jedan širi sud u koji se, kroz lijevak, pušta vodovodna voda. Materijal u vrećicama ispira se onoliko vremena koliko je za ovu fazu rada metodikom predviđeno.

19

4.3. DEHIDRATACIJA I KONZERVANCIJA MATERIJALA

Apsolutni alkohol i 96% alkohol, kao i fiksativi u čiji sastav oni ulaze istovremeno i dehidriraju i konzerviraju materijal. Međutim, ako je fiksiranje obavljeno u nekom od fiksativa u čiji sastav ulaze alkoholi niže koncentracije, onda se poslije ispiranja dehidratacija vrši postepeno alkoholima jače koncentracije, a konzervacija se obavlja u 80% alkoholu. Ako konzerviran materijal po svojoj prirodi ne sadrži veće količine vode u sebi (dijelovi drvenastih biljaka, vegetativni organi kserofita i slično) konzervans se mijenja jedanput u dve do tri godine. Ali ako se konzerviraju objekti čija su tkiva bogata vodom potrebna je češća promjena konzervansa, posebno na početku ovog procesa.

Tvrd materijal, kao što je na primjer drvo, obično se čuva u nekom od sledećih konzervansa:

jedan dio 95% etil alkohol i jedan dio vode tri dijela 95% etil alkohola, dva dijela vode i jedan dio glicerina jedan dio 95% etil alkohola i jedan dio glicerina

Kada se materijal fiksira u nekom od vodenih fiksativa, ispiranje se vrši, kao što je već ranije rečeno, vodom, a do alkohola u kome će se čuvati (80%) dovodi se postepeno kroz seriju alkohola sve veće koncentracije (proces dehidratacije). U principu, nježniji objekti se poslije ispiranja u vodi uvode u 10% alkohol i dalje se provode kroz sledeću seriju alkohola: 20% - 30% - 40% - 50% - 65% - 75% - 85% - 95%. Tvrđi materijal se uvodi u 20% alkohol, a dalje proces dehidratacije teče kroz sledeće alkohole: 40% - 65% - 85% - 95%. Ukoliko se ne poštuje princip postepenog dehidriranja doći će, usljed brzog izvlačenja vode, do promjena na materijalu, koje se obično manifestuju smežuravanjem ćelijskih zidova, ali i na druge načine.

Pojedini autori određuju različito vrijeme stajanja u rastvorima alkohola, međutim, zadovoljavajući rezultati postižu se držanjem materijala 20 do 30 minuta u svakom od ova 3-4 rastvora alkohola. U alkoholima veće koncentracije materijal ostaje od jednog do dvanaest sati. Vrijeme dehidratacije zavisi od prirode i veličine objekta koji se tretira, tako da, u okviru datih granica, za svaki objekat treba odrediti najpogodnije vrijeme.

Promjena alkohola vrši se na više načina. Najčešće se alkohol, u kome je materijal već stajao određeno vrijeme, pažljivo odlije i odmah se umjesto njega sipa alkohol potrebne koncentracije. Za vrijeme sprovođenja kroz alkohole posude su dobro zatvorene i otvaraju se samo radi zamjene alkohola.

Pravljenje alkohola određene koncentracije (procenta).

U procesu dehidratacije neophodno je materijal postepeno sprovoditi kroz seriju etil alkohola sve veće koncentracije (20-40-65-75- 85-95%). Od 95% ili 96% alkohola dobićemo svaki drugi alkohol niže koncentracije primjenjujući sledeću tabelu:

Etil alkohol % 96 96 96 96 96 96 96 96 96% Alkohol u ml 10 15 20 30 40 50 60 70 80

Voda u ml 86 81 76 66 56 46 36 26 16

Tabela 1. Pravljenje alkohola određene koncentracije

20

Na tablici su označene formule za alkohole različite koncentracije od 10 do 80%. Procenat alkohola za svaki pojedini slučaj označen je srednjim brojem u svakoj koloni. Na primjer: ako želimo da od 96% napravimo 40% alkohol postupićemo na sledeći način 96-40= 56, a to znači da treba uzeti 56 ml destilovane vode i 40 ml 96% alkohola. Tako dobijeni rastvor sadrzi 96 ml 40% alkohola. Drugim riječima, svaku željenu koncentraciju alkohola dobićemo ako u menzuru sipamo onoliko mililitara 96% alkohola koliki procenat želimo da napravimo i do 96 mililitara dolijemo destilovanu vodu. Na primjer: želimo da napravimo 23% alkohol. U menzuru treba sipati 23 ml 96% alkohola i izvršiti dopunu destilovanom vodom do 96-tog podioka (dodati 73 ml vode).

4.4. METODE PRAVLJENJA PRESJEKA

U okviru anatomskog praktikuma rijedak je materijal koji se može posmatrati pod mikroskopom bez prethodnog sječenja. Materijal se siječe slobodnom rukom pomocu žileta ili brijača i specijalnim aparatom mikrotomom. Za sječenje na mikrotomu objekti se prethodno moraju pripremiti relativno složenim postupkom. Međutim, sječenje mikrotomom neophodno je primjeniti pri citološkim, embriološkim, pa i mnogim histološkim istraživanjima ili pak kada je objekat toliko sitan i nježan da ga drugačije nije moguće isjeći. Dvije najčešće metode pravljenja presjeka za preparate jesu parafinska metoda i metoda sa smrznutim tkivom, koje će opširno biti opisane u poglavljima 6 i 7.

4.5. INKLUZIJA U KANADA BALZAM

Da bi se preparat mogao očuvati duži period vrši se njegova inkluzija u kanada balzam. Inkluziranje u kanada balzam vrši se na taj način što se na predmetno staklo, izvađeno iz ksilola, preko preparata, nanese kap kanada balzama i presjek pažljivo prekrije pokrovnim stakalcem. Presjeci koji nisu Iijepljeni prenose se iz sahatnog stakla u kap kanada balzama koja je prethodno nanijeta na čisto predmetno stakalce. Presjeci stavljeni u kanada balzam i prekriveni pokrovnim stakalcem ostavljaju se, zaštićeni od prašine, najmanje 24 sata u horizontalnom položaju. Za to vrijeme, zahvaljujući isparavanju ksilola u kome je kanada balzam rastvoren, pločica prijanja uz pokrovno stakalce. Ovim je preparat gotov i može se staviti u kutiju za preparate. Ipak treba napomenuti da preparati još nisu definitivno osušeni, pa zato treba sa njima još izvijesno vrijeme postupati pažljivo da se pločica ne pomjeri.

4.6. OBILJEŽAVANJE PREPARATA

Svako predmetno stakalce mora da bude obilježeno tj. numerisano. Numeracija se vrši specijalnim olovkama ili markerima čiji se trag na staklu ne briše u vodi, alkoholu i ksilolu. Ovakve olovke se mogu nabaviti u trgovinama koje prodaju laboratorijski materijal. U slučaju da do takvih olovaka ne može da se dođe pripremamo tuš koji ima sve potrebne osobine (ne briše se). U tom cilju treba izmiješati jednake dijelove tuša, bjelanceta i glicerina i tome dodati kristalić timola ili fenola. Pri upotrebi ovako napravljenog tuša, poslije

21

numerisanja (obilježavanja), predmetno stakalce treba lako zagrijati, ali samo na mjestu gdje je ispisana oznaka. Ovako obilježena predmetna stakalca neće izgubiti numeraciju pri daljoj obradi preparata. Istovremeno sa obilježavanjem preparata vodi se i evidencija u posebnoj svesci. Evidencija treba da bude što potpunija kako bi se analiza gotovih preparata mogla lakše i preciznije izvršiti.

Kada čitav postupak pravljenja preparata bude završen (deparafinisanje, bojenje, inkluzija u kanada balzam) na predmetna stakalca lijepi se etiketa na kojoj su zabilježeni svi potrebni podaci koji se odnose na preparat.

5. BOJENJE PREPARATA

Pri proučavanju anatomske građe, bilo na privremenom ili trajnim preparatima, u najvećem broju slučajeva, vrši se bojenje. Za svaki objekat, u zavisnosti od njegove strukture i cilja rada, odabira se odgovarajući fiksativ i boja. Pri pravljenju anatomskih preparata najčešće se primjenjuje diferencijalno bojenje, odnosno bojenje sa više boja.

Prema načinu rada bojenje može biti progresivno ili regresivno. Pri progresivnom bojenju presjeci se stavljaju u slab rastvor boje, tako da se vremenam obojenost preparata povećava. Na ovaj način se na primjer boji hematoksilinom. Češće se primjenjuje regresivan način bojenja, pri čemu se preparati prvo preboje, a zatim se u tzv. procesu diferenciranja uklanja višak boje sve dotle dok se ne dobije željena nijansa. Diferenciranje je, prema tome, uklanjanje viška boje putem ispiranja. Diferenciranje se vrši u rastvaraču u kome je i boja, kojom se preparat boji, rastvorena, a intenzitet obojenosti preparata se stalno kontroliše mikroskopom.

Boje se najčešće upotrebljavaju kao zasićeni vodeni ili alkoholni rastvori (najčešće odgovaraju 1-2% rastvoru boje), mada se neke vrlo lijepo rastvaraju u karanfilićevom ulju (na primjer oranž, svijetlo zeleno i druge).

5.1. BOJE I RASTVORI BOJA

Prema porijeklu boje za bojenje preparata mogu biti prirodne i vještačke. Prirodne boje su ekstrakti dobijeni iz biljaka, životinja ili minerala, npr. karmin, šafranin, lakmus, orcein i druge. Vještačke boje se dobijaju sintetskim putem iz katrana kamenog uglja. Budući da je u početku razvoja industrije katranskih boja anilin služio kao ishodišni materijal, sintetske boje se još nazivaju i anilinskim bojama. Boje se kupuju u trgovinama i nalaze se u čvrstom stanju, najčešće u obliku kristala ili u prahu. Rastvor se može pripremiti prema tzv. direktnom načinu, kada se boja rastvara direktno u destilovanoj vodi, ili indirektnom načinu, kada se prvo pripremi zasićeni alkoholni rastvor boje. To je matični rastvor od kog se poslije pravi razblaženi rastvor boje u destilovanoj vodi. Vodeni rastvori su manje postojani pa je preporučljivo pripremiti matični rastvor koji može duže stajati, a od njega se lako priprema pravi rastvor za bojenje. Matični rastvor se pravi u 96% alkoholu tako što se u određenu količinu alkohola postepeno dodaje boja dok se ne pojavi talog koji se dalje ne rastvara. Rastvor se ostavi 2-3 dana u termostatu na 30°C, a zatim se prema potrebi pravi rastvor za bojenje.

Na 100 ml destilovane vode dodaje se matičnog rastvora:

• Fuksin 10 ml • Gencian violet 15-20 ml

22

• Metilensko plavo 20-30 ml

5.2. HEMIJSKA OSNOVA BOJENJA

Boje za bojenje preparata su ciklična jedinjenja koja u osnovi sadrže benzolov prsten (Slika 19) za koji su vezane hromoforna i auskohromna grupa. Hromoforna grupa je odgovorna za obojenost, a auksohromna grupa omogućuje vezanje jedinjenja sa molekulima ćelije (npr pikrinska kiselina ima žutu boju jer sadrži hromofornu nitro grupu – NO2, dok je za njeno vezivanje sa ćelijskim molekulima odgovorna auksohromna hidroksilna grupa OH-).

Boje se u zavisnosti od njihovog ponašanja pri elektrolitičkoj disocijaciji dijele na kisele i bazne. Kisele boje imaju afinitet za bazne ćelijske komponente jer sadrže karboksilnu ili hidroksilnu grupu koje pri disocijacijaciji imaju negativan naboj. Ove boje imaju veći afinitet prema citoplazmi pa se još nazivaju i citoplazmatske boje i uglavnom je boje u crveno ili ružičasto. Za razliku od njih, bazne boje sadrže amino grupu, koja pri disocijaciji ima pozitivan naboj, pa boje kisele ćelijske komponente, kao što je jedro, u plavo. Najčešće korištene kisele boje su eozin, kiseli fuksin, pikrinska kiselina i eritrozin, a od baznih boja se najčešće koriste metilensko plavo, kristal violet, bazni fuksin, gencian violet itd.

5.3. METODE BOJENJA

S obzirom na postojanje velikog broja boja koje se primjenjuju prilikom pravljenja preparata, opisaćemo pravljenje i upotrebu samo onih boja koje se najčešće upotrebljavaju.

5.3.1. Hematoksilinska metoda

Hematoksilin je boja biljnog porijekla, a dobija se iz drveta tropske biljke Haematoxylon campechianum. Za bojenje se koristi produkt oksidacije hematoksilina hematein. S obzirom da postoji više načina za pripremanje ove boje, opisaćemo pripremu Delafildovog i Hajdenhajnovog hematoksilina.

Delafildov hematoksilin

- Napraviti zasićen rastvor amonijum alauna u vodi (amonijum alaun = aluminijum amonijum sulfat = alumen ammonium; formula: AINH4(SO4)2 + 12 H2O). - 1 gr hematoksilina rastvoriti u 6 ml apsolutnog alkohola. U 100 ml zasićenog rastvora amonijum alauna u vodi dodati kap po kap hematoksilina rastvorenog u alkoholu. Ovako pripremljena boja stoji na svjetlosti 7 dana u boci koja je zatvorena vatom. Poslije 7 dana rastvor se profiltrira i dodaje mu se 25 ml hemijski čistog glicerina i 25 ml metil alkohola. Kroz 4 sata (rastvor treba da potamni) ponovo se vrši filtriranje. Profiltrovana boja se sipa u bocu koju potom treba dobro zapušiti i izložiti djelovanju svjetlosti ne manje od 2 mjeseca. Tek tada je boja spremna za upotrebu.

Mnogi praktičari preporučuju da se ovako napravljena boja prije upotrebe razblaži (na 100 ml destilovane vode dodati 30 ml pripremljene boje). Ovako razblaženim rastvorom boje

23

preparati se nešto duže boje, ali je moguće izvesti preciznije bojenje. Delafildov hematoksilin je vrlo postojana boja. Prema podacima koje navodi Černberlen (Chamberlain, C., 1921) bila je upotrebljena i dala karakterističnu reakciju boja stara 20 godina.

Dužina bojenja (vrijeme bojenja) ovom bojom različito je za pojedine preparate, a varira od 3 do 30 minuta. Ako je materijal poslije fiksiranja dobro ispran sa bojenjem ne smije biti problema. Naročito dobro treba isprati materijal ako je fiksativ sadržao neku kiselinu.

Iz boje preparati se prenose u tekuću vodu i dobro se isperu. Za parafinske presjeke ispiranje traje 5 do 10 minuta, a za deblje preparate (sječene rukom) 20 do 30 minuta. Pri ispiranju voda se mijenja sve dok se u njoj pojavljuju i najmanji znakovi tragova boje. Iz vode se preparati prebacuju u alkohole sve jače koncentracije (vidi: dehidratacija) i na kraju se preko ksilola inkluziraju u kanada balzam.

Pri prebacivanju iz vode u alkohol na preparatima se može obrazovati talog. Talog se odstranjuje provođenjem preparata kroz zakiseljeni alkohol koji se priprema tako što se na 100 ml 70% alkohola doda 1 do 2 kapi sone kiseline (HCl). Iz ovog alkohola preparati se prenose u čist 70% alkohol u kome treba da promijene boju - od crvenkaste da postanu purpurni. Pošto se prenošenjem iz zakiseljenog alkohola u čist uvijek prenesu i male količine kiseline preporučuje se iIi višekratno ispiranje u čistom 70% alkoholu ili se u 70% alkohol doda kap amonijaka koji neutrališe dejstvo kiseline. Jedna od češće upotrebljavanih šema za bojenje Delafildovim hematoksilinom je sledeća:

• Bojenje (iz vode, 35% ili 50% alkohola) ....... ... ... ... ... ... ...3 do 30 min.• Ispiranje u tekućoj vodi:

- za parafinske presjeke......... ...5 do 10min.- za presjeke žiletom ..... ... ... ... ..20 do 30 min.

• Dehidratacija: 35% alkohol.......5 minuta• 50% alkohol...............................5 minuta• 70% zakiseljeni alkohol (u ovom alkoholu vrši se diferenciranje koje se prati pod mikroskopom). • 70% alkohol (nezakiseljen) preparate isprati više puta• 85% alkohol .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .5 minuta• 95% alkohol .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .5 minuta• 100% alkohol ..... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .5 minuta• 100% alkohol i ksilol u odnosu 1:1....... ... ... ... ... .5 minuta• ksilol .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .5 minuta• inkluzija u kanada balzam

- Ako je poslije ispiranja u vodi preparat blijedo obojen treba ga ponovo vratiti u boju.

- Ako u zakiseljenom alkoholu boja brzo blijedi (za 4 do 5 sekundi) treba smanjiti količinu kiseline.

- Čim se boja u 70% alkoholu počne mijenjati od crvenkaste u purpurnu, dalji tok rada kontrolisati pod mikroskopom. Ako se konstatuje da je preparat slabo obojen treba ga ponovo vratiti u boju, a ako je prebojen u zakiseljeni alkohol.

Inkluziranje u kanada balzam vrši se na taj način što se na predmetno staklo, izvađeno iz ksilola, preko preparata, nanese kap kanada balzama i presjek pažljivo prekrije pokrovnim stakalcem. Presjeci koji nisu Iijepljeni prenose se iz sahatnog stakla u kap kanada balzama koja je prethodno nanijeta na čisto predmetno stakalce. Presjeci stavljeni u kanada balzam i prekriveni pokrovnim stakalcem ostavljaju se, zaštićeni od prašine, najmanje 24 sata u

24

horizontalnom položaju. Za to vrijeme, zahvaljujući isparavanju ksilola u kome je kanada balzam rastvoren, pločica prijanja uz pokrovno stakalce. Ovim je trajni preparat gotov i može se staviti u kutiju za preparate. Ipak treba napomenuti da preparati još nisu definitivno osušeni, pa zato treba sa njima još izvijesno vrijeme postupati pažljivo da se pločica ne pomjeri.

Hajdenhajnov hematoksilin gvožđa

Ovu boju je 1892. godine u tehniku pravljenja preparata uveo Hajdenhajn (Haidenhain) i do danas je ostala jedna od osnovnih boja pri pravljenju preparata. Za bojenje po ovoj metodi pripremaju se dva rastvora koji se nikada ne miješaju. A - 2% - 4% vodeni rastvor feriamonium sulfata. B - 0,5% vodeni ili alkoholni rastvor hematoksilina. Rastvor feriamonium sulfata ne boji preparate, već samo služi kao štavilo, tj. priprema preparate da bolje prime boju. Ovaj rastvor se može upotrebiti čim se kristali feriamonium sulfata rastvore, a održava se oko 2 mjeseca. Pripremanje hematoksilina. 1 gr hematoksilina rastvoriti u 10 mililitara 96% etil alkohola i dodati 90 ml destilovane vode. Sud zatvoriti vatom i ostaviti na svjetlosti 2 do 3 nedjelje da boja sazri. Prije upotrebe boja se razblaži destilovanom vodom (1:1), tako da se dobije 0,5% rastvor hematoksilina.

Proces sazrijevanja može da se ubrza zagrijavanjem. U tom slučaju 1 gram hematoksilina stavlja se u 100 ml destilovane vode i zagrijava se sve do rastvaranja kristala boje. Ovaj rastvor više puta mora da se filtrira i kada se ohladi može da se upotrijebi za bojenje.

Da bi se spriječilo razviće mikroorganizama u boju se dodaje kristalić timola. Hajdenhajnov hematoksilin gvožđa može da se upotrijebi više puta za bojenje, ali se pri tome mora paziti da se u njega ne unese feriamonium sulfat. Zagađivanje boje feriamonium sulfatom uočava se lako, jer hematoksilin počinje da tamni.

Boja može da se upotrebljava duže vremena (do 6 nedjelja, ali povremeno mora da se profiltrira i da se izvrši proba da Ii je još uvek upotrebljiva. Proba ispravnosti boje vrši se tako što se u stakleni sud stavi nekoliko kapi hematoksilina čiju upotrebljivost ispitujemo, i prelijemo ih vodovodnom vodom. Ako se voda oboji Ijubičasto hematoksilin je još uvijek upotrebljiv, a ako boja vode bude žuta ili prljavo Ijubičasta treba praviti novu boju.

Opšta šema bojenja Hajdenhajnovim hematokslilinom gvožđa:

1. Preparate staviti u 4% feriamonim sulfat ...... ... ... ... .6 do 12 sati 2. Dobro isprati tekućom vodom...........................10 minuta ili, ako se ispiranje ne vrši

tekućom vodom, vodu mijenjati više puta (4 do 5 puta). 3. Prenijeti preparate u hematoksilin...... ... ... ... ... ... ... 12 do 14 sati 4. Isprati preparate tekućom vodom 5. Diferenciranje u 2% feriamonium sulfatu. Diferencirati svaki preparat pojedinačno u

petri kutiji i kontrolisati pod mikroskopom oduzimanje viška boje. Kada jedra budu jasno vidljiva preparate prenijeti u sud sa protočnom vodom 1/2 sata do 1 sat

6. Dehidratacija se vrši kroz seriju postupno jačih alkohola počevši od 35% zaključno sa apsolutnim. Zatim se preko alkohol-ksilola i čistog ksilola preparati inkluziraju u kanada balzam.

Kao što se vidi opisani način bojenja zahtijeva nešto više vremena. Međutim, ako preparator iz nekih razloga treba brže da radi može se preporučiti sledeći postupak: Preparate koji se nalaze u 4% feriamonim sulfatu staviti 30 do 40 minuta u termostat na temperaturu 45°C do 56°C. Zatim ih isprati kao u prethodno opisanom postupku i uvesti ih u

25

hematoksilin. Bojenje vršiti takođe u termostatu pri istoj temperaturi i isto vrijeme kao i štavljenje. Diferenciranje se obavlja u 2% feriamonium sulfatu, a dehidratacija kao što je opisana u opštoj šemi.

Hematoksilin brzo i lijepo boji celulozne ćelijske zidove, sluzi, citoplazmu i jedra Ijubičasto i javlja se kao jedna od široko primjenjivanih boja u anatomskim, embriološkim i citološkim istraživanjima. Pri dvojnom bojenju daje lijepe kombinacije sa šafraninom (koji boji odrvenjene zidove kod biljnih preparata crveno).

Hematein je osnovna supstanca hematoksilina od koje u stvari i potiče karakteristična boja. Pošto je hemijski sastav hemateina poznat, ona se industrijski proizvodi kao sintetička boja i u potpunosti zamjenjuje hematoksilin, boju koja se dobija ekstrakcijom iz drveta biljke Haematoxylon campechianum.

Hematein se priprema tako što se 0,5 ml hemateina rastvori u 25 ml 90% alkohola, a zatim je potrebno uzeti 25 grama stipse (KAl (SO4)2, x 12 H2O) i rastvoriti je u 500 ml vode. Spojiti rastvor stipse sa pripremljenom bojom i malo zagrijati da se stipsa rastvori. Kada se ovaj rastvor ohladi boja je spremna za upotrebu.

Šafranin je boja koja daje dobre rezultate ako se kao fiksativ upotrebi alkohol ili neki od fiksativa koji sadrži hromnu kiselinu.

Boja se upotrebljava kao 1% vodeni ili, češće, alkoholni rastvor, a priprema se po sledećem receptu:

• Šafranin..............................................1 gr • 95% etil alkohol.................................50 ml • voda.....................................................50 ml

Parafinski preparati poslije deparafinisanja u boju se prenose iz 50% alkohola, a presjeci napravljeni od svježeg materijala prvo se stavljaju u 95% alkohol 1/2 sata, pa se zatim prenose u boju. Presjeci pravljeni slobodnom rukom od materijala fiksiranog u alkoholu direktno se prenose u boju. Ako je materijal bio fiksiran u alkohol-formalinu presjeci se prvo sprovedu kroz 50% alkohol (10 minuta), pa se tek poslije toga boje. Vrijeme bojenja varira od 5 minuta do 24 sata, a zavisi od karakteristika tkiva koje proučavamo. Ako se radi o biljnim preparatima može se reći da materijal u kome je stepen odrvenjenosti (lignifikacije) manje izražen treba bojiti duže.

Diferenciranje se vrši pod mikroskopom u 50% alkoholu. Ako su presjeci prebojeni, a to se zna na osnovu vremena potrebnog za diferenciranje (za 5 do 10 minuta ne dobije se željeni ton boje), treba u 100 ml alkohola, u kome se vrši diferenciranje dodati 1 do 2 kapi sone kiseline (HCl). Poslije upotrebe zakiseljenog alkohola preparate, iIi presjeke, dobro isprati čistim 50% alkoholom tako da se kiselina potpuno odstrani. Dehidratacija se vrši na već opisani način, kroz seriju alkohola sve jačih koncentracija počev od 70% do 100%, a u svakom ostaju po 5 minuta. Prije inkluzije u kanada balzam preparati iIi presjeci prolaze kroz ksilol-alkohol (1: 1) i čist ksilol (po 5 minuta u svakom). Pri dvojnom bojenju šafranin daje lijepe kombinacije sa hematoksilinskim bojama, oranž, svijetlo zelenim, vodenim plavim itd.

Vodeno plavo (Wasserblau). upotrebljava se u vidu 1% vodenog rastvora, ali ljepše nijanse plave boje ova boja daje ako se pripremi na sledeći način: Napraviti zasićen rastvor

26

pikrinske kiseline (C6H3N307) u 50% alkoholu. U ovaj rastvor postepeno se dodaju kristali boje vodeno plavog sve dotle dok se ne dobije željena nijansa plave boje. Boja može da se napravi i tako što se boja rastvori u 50% alkoholu i tek tada treba postepeno dodavati rastvor pikrinske kiseline sve dotle dok se ne dobije žeIjena nijansa plave baje. Ovom bojom se boje vrlo brzo, za 30 sekundi do 1 minuta, celulozni biljni ćelijski zidovi. Diferenciranje i dehidratacija vrše se u 96% alkoholu. Pri dvojnom bojenju daje lijepe kombinacije sa šafraninom i hrizoidinom.

Oranž G se upotrebljava kao 1% vodeni iIi alkoholni rastvor, a može da se pripremi i kao zasićen rastvor u karanfilićskom ulju (1 gr boje na 100 ml karanfilićskog ulja približno odgovara zasićenom rastvoru). Alkoholni rastvor ove boje pravi se u apsolutnom alkoholu. Boji celulozne biljne zidove u žuto.

Preparati iz vode prenose se u vodeni rastvor boje, a iz apsolutnog alkohola u alkoholni rastvor iIi u zasićeni rastvor boje u karanfilićskom ulju. Bojenje sa oranž G je kratko, oko 1 minuta. Diferenciranje se vrši u onom agensu u kome je boja rastvorena. Oranž G je pogodna boja za rad pri dvojnom iIi trojnom bojenju i daje dobre kontraste sa šafraninom.

Hrizoidin boji odrvenjene zidove žuto, a upotrebljava se kao 1-2% vodeni rastvor. Vrijeme bojenja kreće se od 5 do 20 minuta. Daje dobre kontraste sa svijetlo zelenim.

Svijetlo zeleno. Ova boja se rastvara u vodi, alkoholu i karanfilićskom ulju. Vrlo brzo boji celulozne zidove, za 1 minut, i daje lijepe kombinacije sa šafraninom. Najčešće se upotrebljava kao 0,5% ili 1% rastvor u 50% iIi 70% alkoholu. Najljepše nijanse zelene boje dobijaju se kada se rastvori u karanfilićskom ulju.

Preparati se u boju uvode ili iz vode, ili iz 50%, odnosno 70% alkohola. Ako je boja rastvorena u karanfilićskom ulju, preparati ili presjeci se u boju prenose poslije apsolutnog alkohola. Bojenje traje 1 do 30 minuta, a diferenci-ranje se vrši u karanfilićskom ulju. Poslije provođenja kroz ksilol-apsolutni alkohol (1: 1) i čist ksilol inkluziraju se u kanada balzam.

5.3.2. Dvojno bojenje preparata

Preparati se mogu bojiti jednom od odabranih boja kojom se ističe neki detalj u građi proučavanih organa, tkiva ili ćeiija. Međutim, češće se pri izradi anatomskih preparata primjenjuje metoda kombinovanja boja (diferencijalno bojenje), sa željom da se jasnije istaknu razlike u građi. Na primjer, ako želimo da upoznamo građu provodnih snopića izabraćemo dve boje od kojih će jedna bojiti ksilemski a druga floemski dio. Ako se odlučimo za kombinovano bojenje preparata moramo voditi računa da druga boja često utiče na prethodno upotrebljenu boju. Pri ovom načinu rada neophodan je strpljiv i pažljiv postupak pri kome treba svaki detalj kritički ocijeniti, kako bi se uočili svi uzroci koji bi, eventualno, doveli do nezadovoljavajućeg rezultata.

Šafranin i svijetlo zeleno.

Pripremiti šafranin i obojiti preparate kao što je već opisano. Zatim izvršiti dehidrataciju do onog alkohola u kome je rastvarena boja

svijetlo zeleno (70% ili 100% alkohol). Do aspolutnog alkahola preparati se dovode i kada je boja svijetlo zeleno rastvorena u karanfilićskom ulju.

27

Poslije diferenciranja preparati se prosvetljavaju u ksilolu i inkluziraju u kanada balzam.

Svijetlo zeleno boji celulozne zidove zeleno, a šafranin odrvenjene, kutinizirane i oplutnjale crveno.

Primjer jedne opšte šeme rada za parafinske preparate od deparafinisanja do uključivanja u kanada balzam izgledao bi ovako:

1. ksilol 20 min.2. ksilol-apsolutni alkohol 20 min.3. apsolutni alkohol 10 min.4. 95% alkohol 5 min.5. 85% alkohol 5 min.6. 70%- alkohol 5 min.7. 50% alkohol 5. min. safranin8. 50% alkohol (diferenciranje)9. 70% alkohol 5 min.10. 95% alkohol 5 min 11. apsolutni alkohol 5 min. 12. svijetlo zeleno u karanfilićskom ulju 13. karanfilićsko ulje (diferenciranje) 14. ksilol-apsolutni alkohol 5 min. 15. ksilol 5 min. 16. kanada balzam

Na ovaj način mogu da se boje i preparati sječeni slobodnom rukom od svježeg ili fiksiranog materijala, samo je u tom slučaju proces nešto skraćen jer se isključuje prva faza rada (deparafinisanje) i počinjese ili od 95% alkohola ili od 50% alkohola.

Delafildov hematoksilin i šafranin.

Ako se odlučite za ovu kombinaciju boja onda se preparati, poslije deparafinisanja, prvo boje hematoksilinom (vidi Delafildov hematoksilin), a zatim se isperu vodom i prenose u šafranin. Dalji tok procesa teče na već opisan način (dehidratacija, inkluzija u kanada balzam). Svi neodrvenjeni elementi hematoksilinom se boje Ijubičasto, a odrvenjeni šafraninom crveno.

5.3.3. Ostale metode

Azan Ova metoda se tradicionalno koristi za bojenje vezivnog tkiva. Kolagena vlakna, bazalne membrane i mucin se boje plavo, jedra crveno, a mišići i eritrociti narandžasto-crveno.

Trihromne metode bojenja (Masson) Postoji veliki broj trihromnih metoda u kojima se koriste kombinacije tri različite boje radi specifičnog bojenja i razlikovanja vezivnog tkiva od drugih tkiva (mišića). Jedra i druge bazofilne strukture se boje plavo, kolagen zeleno ili plavo (u zavisnosti od varijante bojenja), a citoplazma ćelija, mišići i eritrociti jasno crveno.

28

PAS metoda (perjodna kiselina-Schiff) Za prikazivanje ugljenih hidrata (glikogen, glikoproteini) u tkivu koristise

PAS histohemijska metoda. Bazira se na oksidativnom dejstvu perjodne kiseline, pri čemu se stvaraju aldehidne grupe, za koje se vezuje bezbojni Šifov reagens koji nakon toga postaje ružičaste boje. Ovom metodom se selektivno boje bazalne membrane, glikogen i različiti ćelijski sekreti glikoproteinske prirode.

Bestov karmin Ova metoda se koristi za selektivno bojenje glikogena u tkivu. Posebna pažnja se obraća fiksaciji (hladni alkoholni fiksativi), pošto se glikogen rastvara u vodi i samim tim se u toku rutinske fiksacije ispira iz tkiva.

Alcian plavo. Alcian plavo se upotrebljava za prikazivanje glikozaminglikana i proteoglikana, a često se primjenjuje u kombinaciji sa drugim bojama. U kombinaciji sa tehnikom van Gieson navedene supstance se boje zeleno.

Van Gieson. Ova tehnika spada u grupu metoda kojima se boji vezivno tkivo. Njome se kolagen boji crveno, a mišićno tkivo i eritrociti žuto. I ova metoda se često koristi u kombinaciji sa drugim metodama.

Orcein i rezorcin-fuksin. Ove metode se koriste za selektivno bojenje elastičnih vlakana, a najčešće se koriste u kombinaciji sa drugim metodama.

May-Grΰnwald –Giemsa. Koristi se za bojenje razmaza krvi i koštane srži. Sastoji se iz kombinacije baznih i kiselih boja (eozin, azur, metilen plavo), pa se jedra boje tamno plavo do ljubičasto, citoplazma svijetlo plavo, a eritrociti ružičasto.

Srebro. Postoji veliki broj metoda u kojima se upotrebljavaju različita jedinjenja srebra. Najčešće se koriste za prikazivanje neurona i neuroglijskih ćelija, ali i za bojenje nervnih vlakana i drugih struktura. U zavisnosti od primijenjene metode, vidljivi talog je crne, braon ili zlatne boje. Rastvor srebra se koristi i u kombinaciji sa heksametilen tetraminom (metenamin-srebro) za prikazivanje bazalnih lamina, ali i za bojenje polutankih isječaka.

Osmijum tetroksid. Pored toga što se koristi kao fiksativ u elektronskoj mikroskopiji, osmijum tetroksid se, zahvaljujući osobini da boji lipide, često upotrebljava za bojenje mijelinskog omotača, ili lipidnih kapljica u svjetlosnoj mikroskopiji.

Toluidin i metilen plavo. Ove bazne boje se najčešće koriste za bojenje polutankih epoksi isječaka, ali i za prikazivanje metahromazije (mastociti) na klasičnim parafinskim isječcima. Mogu se koristiti i u kombinaciji sa azurom.

Bojenje preparata napravljenih žiletom ili na mikrotomu bez inkluzije u parafin.

Svaki presjek, bez obzira da Ii je napravljen žiletom, sječen na mikrotomu od svježeg ili fiksiranag materijala, ili je napravljen iz parafinskog kalupa, moguće je obojiti i napraviti privremeni ili trajni preparat.

Presjeci napravljeni slobodnom rukom uz pomoć žileta ili na mikrotomu od svježeg ili fiksiranog materijala sprovode se kroz alkohole i boje iIi na predmetnom stakalcu (ako je u pitanju 1-2 preparata) ili u sahatnim staklima (ako ih je više). Kako proces rada zahtijeva da

29

presjeci prolaze kroz serije alkohola i boju to se nameće pitanje kako ih prenositi iz suda u sud, a da se pri tome ne oštete ili ne osuše. Ovaj dio posla vrši se na više načina, a ovde će biti opisana dva najjednostavnija.

1. Presjeci se finom četkicom prebacuju iz jednog u drugo sahatno staklo. Za ovaj način rada treba pripremiti onoliko sahatnih stakala ili drugih odgovarajućih sudova kroz koliko različitih agenasa materijal prolazi do konačnog uvođenja u kanada balzam ili neku drugu materiju.

2. U toku rada presjeci mogu ostati u jednom sudu (ne prebacuju se), a odlivanjem ili pipetiranjem izvlači se reagens u kome su stajali. Poslije ispiranja (čistom porcijom reagensa u kome su bili) dodaje se nova, svježa porcija odgovarajućeg reagensa.

Jedna od čestih kombinacija boja koja se pri ovom načinu rada upotrebljava je šafranin - vodeno plavo i zato će na jednom primjeru upravo sa ovim bojama biti opisan način rada. Presjeci napravljeni od fiksiranog materijala odmah se stavljaju u šafranin u kome najčešće ostaju 10-30 minuta, a ponekad i 24 sata. Kada se izvade iz šafranina presjeci se diferenciraju u 50% alkoholu i prenose u boju vodeno plavo. U toj boji ostaju do 10 minuta, a zatim se prenose u 95% alkohol. Ako su presjeci prebojeni diferenciranje vršiti u zakiseljenom alkoholu (u 100 ml 95% alkohola dodati kap-dve sone kiseline) i kada se postigne odgovarajući ton boje presjek, prije daljeg sprovođenja, više puta isprati čistim (nezakiseljenim) 95% alkoholom. Diferenciranje se vrši sve dok se alkohol boji, odnosno dok se ne ukloni višak boje i ne ispolje jasne razlike u obojenosti tkiva. Sva odrvenjena tkiva šafranin će obojiti crveno, a celulozni i drugi neodrvenjeni zidovi biće plavi od boje vodeno plavo.

Dehidratacija presjeka vrši se u apsolutnom alkoholu koji se pri tome više puta mijenja. Dehidratacija mora da bude potpuna, inače će se presjeci pri prenošenju u ksilol, što je dalji korak u ovom poslu, zamutiti. U ksilolu presjeci ostaju 5 do 10 minuta. Iz ksilola se prenose na predmetnu ploču u kanada balzam, prekrivaju se pokrovnim stakalcem i poslije sušenja od nekoliko dana trajni preparat je gotov.

5.4. REAGENSI ZA PROSVJETLJAVANJE I NAČIN UPOTREBE

Pri proučavanju pojedinih struktura nekih biljnih organa često je potrebno primijeniti neku od metoda za prosvjetljavanje. Na ovaj način moguće je posmatrati, ne praveći presjeke, epidermis, stome u epidermisu, dlake, a istovremeno i odrediti dužinu nervature (izračunava se na jedinici površine lista), zatim broj stoma i slično. Najčešće upotrebljavani reagensi za prosvjetljavanje su sledeći:

Hloralhidrat

Hloralhidrat ...... ... ... ... ... ... ... ..5 ml(može i 8 ml)Voda...... ... ... ... ... ... ... ..2 ml

Ovaj reagens se koristi za prosvjetljavanje debelih presjeka. Reagens hloralhidrat se može upotrijebiti hladan, ali i zagrijan do ključanja. Kada se upotrebljava zagrijjan brže prosvjetljava, ali i izaziva bubrenje ćelijskih zidova.

Kalijum hidroksid

30

Kalijum-hidroksid (K0H).......................5 grVoda ili 96% etil alkohol.....................100 ml

Djeluje isto kao i hloralhidrat. Preporučuje se za prosvjetljavanje herbarizovanog materijala.

Žavelova voda

Rastvor A: Hlorni kreč ....... 20 grVoda...... ... ... .. 100 ml

Rastvor B: K2CO3. . . . .. 15 grVoda............ 100 ml

Hlorni kreč se razmuti u vodi i ostavi da odstoji dok pripremamo drugi rastvor (rastvor B). Zatim se oba rastvora izmiješaju i ostave da stoje nekoliko sati. Poslije tog vremena dobijeni rastvor se profiltrira i upotrebljava kao reagens za prosvjetljavanje. Žavelova voda može da se napravi u većoj količini. Čuva se u dobro zatvorenoj tamnoj boci i na zamračenam mjestu.

Materijal koji se prosvjetljava prvo stoji u 96% alkoholu sve dotle dok ne pobijeli, odnosno izgubi zelenu boju. Zatim se prenosi u Žavelovu vodu u kojoj se proces izbjeljivanja dovršava. Žavelova voda je dobar reagens za prosvjetljavanje i naročito je efikasna kada djeluje na svjetlosti. Pod njenim dejstvom se razaraju citoplazma i hloloplasti i zato je pogodna za prosvjetljavanje biljnih objekata u kojima želimo dobro da vidimo ćelijske zidove.

Iz Žalelove vode materijal se brzo prenosi u tekuću vodu i u njoj se nekoliko minuta ispira. Ovako pripremljen materijal posmatra se u vodi ili glicerinu. Ako želimo da materijal sačuvamo duže vremena postepeno se dovodi do 70% alkohola i u njemu se konzervira.

Glicerin

Glicerin. . . . . . . . . 1 dioVoda .. ................. 1 dio

Upotrebljava se kao medijum u kome se posmatraju presjeci. Može da se upotrijebi i čist glicerin.

Prosvjetljavanje krupnijih objekata se vrši u vatrostalnom sudu. Stavljaju se u stakleni sud (epruveta) j pažljivo se kuvaju u 50% alkoholu sve dok se iz njih izdvajaju mjehurići vazduha. Zatim se u epruvetu stavlja 0,25 gr KCl03. Kada se ova so rastvori dodati još nekoliko kapi sone kiseline (HCl). Sve se zajedno promućka i ostavi na dnevnoj svjetlosti. Čak se preporučuje da se izloži djelovanju direktne sunčeve svjetlosti. Vrijeme ekspozicije se kreće, u zavisnosti od prirode materijala, od 1 minuta do 2 dana.

6. PARAFINSKA METODA PRAVLJENJA MIKROSKOPSKIHPREPARATA

31

Već je ranije napomenuto da se na preparatima sječenim slobodnom rukom ne mogu vršiti mnoge analize, posebno analize finijih struktura ćelijske građe. Pri citološkim, embriološkim pa i anatomskim proučavanjima često je istraživač prinuđen da presjeke pravi posebnim aparatom mikrotomom. Isto tako, pri analizama građe sitnih objekata, ili kada je potrebno, u cilju rješavanja postavljenog problema, dobiti seriju preparata u nizu jedan za drugim, takođe se primjenjuje sječenje mirkotonom.

Objekti koji se sijeku mikrotonom moraju se prethodno, posebnim načinom, pripremiti. Postupak pripremanja objekata za sječenje mikrotonom je dosta složen i, generalno rečeno, sastoji se u tome da se u fiksirane i dehidrirane objekte uvede određena materija, u kojoj će poslije biti i zaliveni. U ovu svrhu najčešće se upotrebljava parafin, a rjeđe celoidin. Po parafinu u koji se inkluziraju objekti ova metoda je dobila ime parafinska metoda.

Čvrsti objekti mogu se i direktno, bez inkluziranja u parafin, sjeći mikrotomom. O tom postupku biće riječi kasnije.

6.1. INKLUZIJA MATERIJALA U PARAFIN

Da bi materijal koji se preparuje mogao biti uveden u parafin potrebno ga je prethodno fiksirati, isprati i vrlo pažljivo, provodeći ga kroz seriju alkohola, dehidrirati. Za uvođenje u parafin dehidratacija materijala mora da ide i dalje od one koja je opisana u poglavlju "Dehidratacija i konzervacija materijala". Naime, materijal treba da ostane u 96% alkoholu ne manje od 1 do 2 sata, a zatim se prebacuje u apsolutni alkohol. U apsolutnom alkoholu I materijal stojine manje od jednog sata, a zatim se prebacuje u novi apsolutni alkohol (AAI II - apsolutni alkohol II). Sitni objekti i u AAI II ostaju 1 sat, a krupniji mogu i da prenoće.

Da bi se omogućilo natapanje materijala parafinom potrebno je agens kojim se vršila dehidratacija (AAI) zamijeniti agensom koji ne sadrži vodu, a u kome se parafin rastvara. Takvih tečnosti ima više: kedrovo ulje, terpentin, benzol, toluol, hloroform, ali se najčešće upotrebljava ksilol (Xy). Iz apsolutnog alkohola materijal se postepeno prevodi u neki od navedenih agenasa, a pri tom procesu istovremeno dolazi i do prosvjetljavanja materijala. Prosvjetljavanje je značajan proces, jer pokazuje da je alkohol zamjenjen agensom u kome se parafin rastvara i da se može početi sa inkluzijom (uvođenjem) parafina.

Za prosvjetljavanje i zamjenu alkohola koriste se manje količine agensa, toliko koliko je potrebno da se prekrije materijal koji se sprovodi. Postupak koji se pri tome primjenjuje najčešće je sledeći:

1 dio ksilola i 3 dijela apsolutnog alkohola ... ... ... 1 sat 1 dio ksilola i1 dio apsolutnog alkohola ... ... ... ... 1 sat 3 dijela ksilola i

1dio apsolutnog alkohola ... ... ... ... ... ... 1 satčist ksilol I ... ... ... ... 1 sat odnosno do prosvjetljavanja meterijala, a može i da prenoći

čist ksilol ll... ... ... ... ... 1 sat

Vrijeme držanja materijala u svakom od ovih rastvora zavisi od prirode i veličine objekta, ali nije manje od navedenog vremena.

U sudove sa materijalom, koji je doveden do čistog ksilola, ubaciti malo nastruganog parafina. Preporučljivo je da se usitnjen (isjeckan ili nastrugan) parafin stavi u vrećice od gaze, a one potope u ksilol tako da ne dodiruju materijal. Na taj način sprečavaju se mehaničke povrede materijala do kojih bi moglo da dođe od direktno ubačenih komadića parafina. Posude sa materijalom prvo se stavljaju u vodeno kupatilo, da se parafin brže

32

rastvori, a zatim se otvore i prenose u termostat. Temperatura u termostatu treba da bude za 2 do 3°C viša od tačke topljenja parafina. Ako je parafin potpuno rastvoren u ksilolu, ili kada do toga dođe, u sudove sa materijalom treba doliti jos čistog, otopljenog parafina. U ksilol-parafinu materijal stoji u termostatu 24 sata. Poslije ovog vremena ksilol-parafin se zamjenjuje čistim rastopljenim parafinom. U zato posebno izdvojenu i obilježenu posudu treba odliti ksilol-parafin, a umjesto njega u sudove sa materijalom naliti čist otopljen parafin čija se tačka topljenja kreće od 52 do 57°C. U ovom parafinu materijal ostaje u otvorenim sudovima 72 sata, a nakon tog vremena izlijevaju se kalupi. U zavisnosti od tvrdoće materijala upotrebljava se parafin različite tačke topljivosti. U najvećem broju slučajeva za anatomske analize zadovoljavajuće rezultate daće rad sa parafinom čija se tačka topljenja kreće od 48 do 52°C. Tvrđi objekti se inkluziraju u čvršći parafin tj. u parafin čija je tačka topljenja 52 do 57°C.

S obzirom da je poznavanje tačke topljenja važan podatak, opisaćemo jednostavan način njenog određivanja. U stakleni kapilar naliti rastopljen parafin. Kada se parafin stegne kapilar pričvrstiti za termometar i zajedno ih staviti u sud sa hladnom vodom. Voda se postepeno zagrijava, a istovremeno se posmatra pri kojoj će se temperaturi parafin u kapilarnoj cjevčici rastopiti. Očitana temperatura je tačka topljenja parafina. Ako se parafin pri sječenju na mikrotomu kruni i lomi treba mu dodati 5 do 10 procenata voska.

6.2. KALUPLJENJE

Materijal koji je uveden u parafin i koji je predviđeno vrijeme stajao u termostatu kalupi se u porcelanskim posudama (posude za žarenje), petri kutijama, sahatnim staklima ili drugim odgovarajućim posudama. Pri kalupljenju je važno da se upotrebi posuda u kojoj će se parafin brzo stezati. Ako se uzima neka vrsta staklenih sudova, prije izlivanja parafina sa materijalom u njih treba ih dobro oprati sapunicom i toplom vodom, a zatim ih namazati glicerinom. Kalupljenje se vrši pored termostata, a prije nego što se pristupi ovom poslu treba pripremiti, osim posuda za izlijevanje parafinskih kalupa, još špiritusnu lampu, dve anatomske igle, pincetu i posudu sa hladnom vodom. Pošto se posude sa materijalom u rastopljenom parafinu nalaze u termostatu, sve što je potrebno za izlijevanje kalupa treba rasporediti na radnoj površini ispred termostata, tako da se u najkraćem vremenlu može izliti dobar kalup. Određena brzina pri radu potrebna je zato što se parafin brzo steže na sobnoj temperaturi.

Pri kalupljenju radi se sledećim redoslijedom: 1. Pripremiti posude za izlijevanje parafinskih kalupa. 2. Upaliti špiritusnu lampu. 3. Izvaditi posudu sa materijalom iz termostata. Iz nje brzo izvući pincetom

etiketu i staviti je uz kraj posude u koju se izlijeva kalup. 4. Ugrijanom iglom pažljivo promiješati rastopljeni parafin, tako da se objekti 5. Podignu sa dna, ali da se pri tome ne stvore mjehurići vazduha u parafinu. 6. Naglo izliti parafin sa materijalom u posudu za kalupljenje. Svi preparovani

objekti treba da se nalaze u posudi za kalupljenje. Ako je neki dio materijala ostao u sudu koji je bio u termostatu ugrijanom iglom ga prijeneti u posudu za kalupljenje u kojoj se parafin još nije stegao.

7. Ugrijanim iglama razmjestiti objekte u parafinu tako da budu ravnomjerno raspoređeni po cijeloj površini posude, da se nalaze na dovoljnom rastojanju jedan od drugog, i orijentisati ih u najpovoljniji položaj za sječenje.

33

Orijentacija objekata je važan dio procesa kalupljenja, jer kada se kalup stegne i kada u njemu možemo samo nazirati objekte koje želimo da siječemo, moramo tačno znati u kom se položaju oni nalaze.

8. Pažljivo prenosimo posudu sa izlivenim parafinom na površinu hladne vode. Posuda sa vodom je ranije pripremljena. Kada je parafin dovoljno očvrsnuo potapamo posudu sa kalupom u vodu. Brzo rashlađivanje parafina potrebno je da bi se kasnije parafin mogao dobro da siječe. Ako se dopusti da se parafin rashlađuje polako, dolazi do njegove kristalizacije, a takav parafin izaziva određene teškoće pri sječenju.

Ako je sve dobro urađeno, kada se parafin potpuno ohladi i očvrsne, kalup bi trebalo da sam ispliva iz posude za kalupljenje, ili bar da se odvoji na lak dodir skalpelom. Ako ga moramo vaditi skalpelom, iglom ili nekim drugim predmetom, onda kalup zahvatimo na nekoliko mjesta sa strane i polako ga odvojimo od suda. Naravno, pri tom poslu ne smije da dođe do pucanja kalupa. Ako se iz bilo kog razloga kalup pokvari, jednostavno ga treba opet vratiti u termostat i ponoviti cijeli postupak kada se parafin rastopi.

Kada se kalupi izvade, posude za kalupljenje se operu toplom vodom i sapunicom, a ako na njima ima djelića parafina, prije pranja ih treba odstraniti vatom natopljenom u ksilolu ill nekom drugom rastvaraču parafina. Posude se zatim dobro obrišu vatom natopljenom u apsolutnom alkoholu i isuše suvom krpom.

U parafinskim kalupima, koji imaju oblik suda u kome su izliveni, vide se ukalupljeni objekti. U parafinu objekti mogu da ostanu neograničeno dugo vrijeme, ili se pak odmah sijeku.

6.3. PRIPREMANJE PARAFINSKIH BLOKOVA

Već je rečeno da parafinski kalup ima oblik suda u kojem je tečan parafin izliven. Za dalju obradu potrebno je iz parafinskog kalupa isjeći parafinske blokove u kojima će se nalaziti materijal koji je kalupljen. Napravljeni blokovi se lijepe za drvene nosače koji se pričvršćuju u određeni dio mikrotoma i pristupa se sječenju preparata.

Ukoliko se materijal odmah ne siječe parafinski blokovi se čuvaju u kesicama na kojima se ispišu svi podaci neophodni za identifikovanje materijala i dalju obradu (vrsta, organ, fiksativ, datum i drugo). Neki autori preporučuju da se parafinski blokovi nekoliko dana (5 do 6) prije sječenja potope iIi u vodu ili u agens koji sadrži 20 ml zasićenog rastvora pikrinske kiseline i 1 ml glacijalne sirćetne kiseline.

Pošto se objekti u parafinskom kalupu vide (makar kao siluete prema svjetlosnom izvoru) treba oko njih isjeći parafin tako da oko objekta ostane 1-2 mm parafina i na taj način će se dobiti parafinski blokovi sa objektima u njima. Parafinski blokovi se sijeku tako da je u njima materijal najpovoljnije orijentisan za sječenje. Naspramne strane blokova moraju biti međusobno paralelne.

Blokovi sa parafinom se lijepe za drvene nosače koji se obično prave od hrastovine, bukovine, brezovine ili nekog drugog čvrstog drveta. Veličina drvenih nosačaje različita, ali bi se kao prikladna mogla preporučiti sledeća 2 x 2 x 2,5 cm. Na manju površinu pripremljenog nosača špatulom se nanosi rastopljen parafin i u njega se, dok je još rastopljen (ili dok sejoš nije stegao) potapa parafinski blok. Blok se lijepi u onom položaju pri komeje materijal orijentisan za sječenje. Pošto se parafin brzo steže blok će biti zalijepljen čim se parafin ohladi. Da bi bili sigurni da je blok dobro pričvršćen na nosaču, treba ga još sa svih strana zaliti rastopljenim parafinom. Poslije ove radnje drveni držač zajedno sa parafinskim

34

blokom potapa se u vodu da parafin brže očvrsne. Ovako pripremljen kalup spreman je za sječenje na mikrotomu.

6.4. PRIPREMANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA

Prije nego što pristupimo pravljenju presjeka potrebno je, bilo da se radi o privremenim iIi trajnim preparatima, da se pripreme predmetna i pokrovna stakalca. Predmetna i pokrovna stakalca moraju biti besprekorno čista. Ako su stakalca nova dovoljno ih je oprati toplom vodom i obrisati lanenom ili nekom drugom krpom koja ne ostavljatragove (dlačice). Pri pranju, brisanju, i uopšte pri uzimanju predmetnih i pokrovnih stakalca mora se voditi računa da se uvijek drže sa strane između palca i kažiprsta. Ako su predmetna i pokrovna stakalca bila ranije upotrebljavana, ili ih pripremamoza trajne preparate, moramo ih oprati toplom vodom i sapunicom. Nakon toga ih ispiramo tekućom vodom i potapamo u sonu kiselinu (HCI). U sonoj kiselini ostaju 24 sata. Umjesto sone kiseline mogu se upotrijebiti i drugi rastvarači. Jedan od njih je sledeći:

- destilovana voda. . . . . . . . . . . 80 cc - Kalijum bihromat. . . . . . . . . . . . . . 10 gr 2-3 dana - tehnička sumporna kiselina . . . . . 10 cc

U ovom rastvaraču predmetna i pokrovna stakla ostaju 2 do 3 dana. Poslije stajanja u rastvaraču treba ih isprati prvo tekućom, a zatim i destilovanom vodom i potopiti u 96% alkohol. U alkoholu ostaju sve do upotrebe. Prije upotrebe predmetna i pokrovna stakalca pincetom se vade iz alkohola i suše, iIi dobro ispranom krpom koja ne ostavlja tragove, iIi na plamenu špiritusne lampe. Umjesto u alkoholu predmetna i pokrovna stakalca se mogu čuvati i u destilovanoj vodi, ali prednost dajemo alkoholu.

6.5. PRAVLJENJE PRESJEKA MIKROTOMOM

Precizan laboratorijski aparat koji služi za dobijanje finih presjeka zove se mikrotom. I ako postoje različiti tipovi mikrotoma najčešće se upotrebljavajuklizećii ro ta c i on i. Osnovna razlika izmedu ova dva tipa mikrotoma je u sledećem. Kod rotacionog mikrotoma nož je nepokretan, a po vertikali se kreće mikrotomski stočić. Kod klizećeg mikrotoma je obrnuto: pri sječenju preparata stočić je nepokretan, a nož se pokreće.

Bilo o kom mikrotomu da je riječ stočić mikrotoma je uvijek povezan sa mikrometarskim zavrtnjem i pri svakom pokretu noža automatski se podiže za određenu željenu visinu. Na taj način dobijaju se presjeci uvijek određene debljine. Debljina presjeka se inače može podešavati, a zavisi od materijala koji se siječe i cilja rada.

Pripremljen drveni nosač sa parafinskim blokom u kome je materijal, pričvršćuje se između dve metalne ploče u stočić klizećeg mikrotoma. Mikrotomski stočić je inače konstruisan tako da pomoću različitih zavrtanja može da mijenja položaj čime se omogućava neophodno dotjerivanje orijentacije objekta koji sa siječe. Kada se objekt orijentiše, a prije nego što se počne sa sječenjem, svi zavrtnji moraju biti stegnuti, a samim tim i stočit postaje potpuno nepokretan. Mikrotomski nož ima svoje ležište na mikrotomu u koje se stavlja i pričvršćuje pomoću dva zavrtnja. Sam nož je, prema tome nepokretno pričvršćen, a kod klizećih mikrotoma, koji su inače češće u upotrebi, nosač noža slobodno klizi po žlijebu na tijelu mikrotoma. Žlijeb mora, kao u ostalom i svi drugi dijelovi mikrotoma, da bude čist i dobro podmazan kako bi se nosač noža po njemu lako i ravnomjerno kretao.

35

Pri pravljenju presjeka od materijala koji je kalupljen u parafinu nož se postavlja tako da njegova oštrica bude paralelna ivici parafinskog bloka. Na mikrotomu nož može da se postavi i koso prema bloku koji se siječe, ali takav polažaj noža se preporučuje ako su objekti kalupljeni u celoidin, ili ako se siječe materijal koji uopšte nije kalupljen (čvršća tkiva koja možemo direktno pričvrstiti u stočić mikrotoma). Na ovaj način se, i bez prethodnog uvođenja u parafin, od svježeg ili fiksiranog materijala mogu dobiti presjeci na mikrotomu. Pri ovakvom pravljenju presjeka ne smije se izgubiti iz vida da presjeci ne smiju da se osuše i zato, ako se radi sa svježim materijalom, i nož i površinu presjeka treba stalno kvasiti vodom, a ako se upotrebljava materijal iz fiksativa vlaži se 70% alkoholom. Dobijeni presjeci se prenose u vodu ili alkohol koji se nalaze u sahatnom staklu. Debljina presjeka koji se na ovaj način dobije obično se kreće između 20 i 25 mikrona, a mogu da budu i deblji.

Mikrotomski noževi su veoma važan dio mikrotoma. Od njihovog kvaliteta i oštrine zavisiće i kvalitet presjeka. Mikrotomski noževi se po obliku razlikuju. Ima noževa koji su sa jedne strane ravni a sa druge ugnuti, iIi mogu biti sa obe strane ugnuti. Ravno-ugnuti upotrebljavaju se za sječenje objekata inkluziranih u parafin, a dvostrano ugnut za sječenje objekata koji se teško sijeku, ili za one koji se sijeku na mikrotomu sa uređajem za smrzavanje (poseban tip mikrotoma).

S obzirom na značaj mikrotomskih noževa pri radu neophodno je da se oni pažljivo čuvaju i održavajiu. Ovo se posebno odnosi na njihovo sječivo koje je vrlo osjetljivo na najmanji udar o neki čvršći predmet. Poslije upotrebe nož se očisti vatom namočenom u ksilol. Na taj način se otklanjaju i poslednji ostaci parafina koji su se, eventualno na njemu zadržali. Zatim se nož obriše suvom krpom i stavlja u kutiju za noževe. Ako se nož duže vremena neće upotrebijavati treba ga konzervirati tankim slojem ulja ili specijalne masti, čime je zaštićen od korozije.

Sječivo noža se mora povremeno naoštriti. Oštrenje noža se vrši ili ručnim oštračem mikrotomskih noževa ili automatskim oštračem, a kontrola kvaliteta sječiva se vrši lupom ili na mikroskopu pri uvećanju od 100 puta. Nož je dobro naoštren i spreman za rad kada na njegovom sječivu nema zubaca.

Za dobijanje dobrog presjeka potrebno je, osim već navedenih postupaka, još i nož pravilno namjestiti na mikrotomu, odnosno podesiti odgovarajući ugao noža prema površini parafinskog bloka. Mnogi autori smatraju da je nož dobro postavljen kada je njegova donja faseta paralelna površini rezanja.

6.6. UPOTREBA MIKROTOMA

Prije nego što se pristupi pravljenju presjeka mikrotom treba pažljivo očistiti od prašine i ostataka parafina. lsto tako, svi pokretni dijelovi na mikrotomu uvijek moraju biti podmazani. Kao mazivo se koristi specijalno ulje za mikrotome, ili ako njega nema dobro je i ulje za šivaće mašine.

Na očišćen i podmazan mikrotom stavlja se nož, podešava se njegov ugao prema objektu (faseta paralelna površini objekta, a upravna na pravac kretanja noža). Za vrijeme rada i poslije završenog posla nož se čisti od ostataka parafina krpom namočenom u neki od rastvarača parafina (ksilol, benzin i dr.) i dobro isuši čistom suvom krpom.

Kada je nož postavljen, u stočić mikrotoma se stavlja drveni nosač parafinskog bloka i čvrsto zavrtnjem pritegne. Pri tome se vodi računa o pravilnoj orijentaciji materijala. Kada je sve na opisan način pripremljeno polako se nož privlači parafinskom bloku, a istovremeno kada se nož nalazi uz sam blok, pomoću zavrtnja se podešava visina bloka prema nožu. Pošto je blok uvijek tako sječen da se iznad objekta nalazi jos 1-2 mm parafina, laganim podizanjem stočića i istovremeno odsijecanjem (mikrotomskim nožem) viška parafina,

36

dolazimo do objekta. Ponovo fiksiramo stočić i na mikrometarskoj skali odredimo debljinu presjeka. Debljina presjeka se određuje jednostavnim postupkom pomijeranja klizećeg dijela na mikrometarskoj skali do željenog mjesta. Mikrometarska skala je podijeljena na podioke označene brojevima od 0 do 30. Postavljanjem klizećeg dijela na jedan od podioka, odnosno brojeva, i pritezanjem na tom mjestu, odredili smo i debljinu presjeka koje ćemo sjeći. Drugim riječima, ako oznaku postavimo i učvrstimo na br. 20 svakim pokretom noža, koji mora da dođe do mikrometarske skale i da je gurne do kraja, stočić se podigne zajedno sa objektom za 20 mikrona, a pri povlačenju noža prema sebi dobija se presjek upravo te debljine. Radnja se ponavlja i tako se dobija željeni broj presjeka određene debljine. Određivanje debljine presjeka zavisiće od samog objekta kao i od cilja istraživanja. Za anatomska ispitivanja biljnog materijala zadovoljavajuće rezultate daju presjeci debljine 15 do 20 mikrona, a za animalni i humani materijal presjeci su znatno tanji, i do 5 mikrona.

Ako su suprotne strane parafinskog bloka u kome je objekat koji siječemo paralelne, pri odgovarajućoj sobnoj temperaturi i nagibu noža, na nožu ostaju presjeci u obliku trake. Presjeci se sa noža skidaju mekom i nakvašenom četkicom i stavljaju na posebno pripremljeno predmetno staklo. Pri stavljanju presjeka na predmetno staklo mora se voditi računa o orijentaciji parafinskih traka ili pojedinačnih presjeka, ako se oni kao takvi prave. To nije teško jer se gornja i donja strana parafinskih presjeka razlikuju. Donja strana je glatka i svijetla, a gornja je mat. Presjeci se uvijek donjom, glatkom stranom stavljaju na predmetno staklo. Ako se postave suprotno, u daljem postupku će se odljepljivati.

6.7. TEŠKOĆE PRI SJEČENJU MIKROTOMOM

Pri pravljenju presjeka često se javljaju mnoge teškoće od kojih ćemo nabrojati najčešće, ukazati na uzroke koji do njih dovode, kao i na način kako da ih otklanimo.

Presjeci se lijepe za nož. Do ovoga obično dolazi ako je u radnoj prostoriji visoka temperatura koja prouzrokuje omekšavanje parafina ili je kalupljenje izvršeno u neodgovarajućem parafinu, odnosno u parafinu niske tačke topljenja. Ova teškoća u radu se otklanja snižavanjem sobne temperature, rashlađivanjem (pomoću kockica leda) parafinskog bloka i noža, a ako je u pitanju parafin, kalupe treba pretopiti, a objekte ponovo ukalupiti u parafin više tačke topljenja (tvrđi parafin).

Presjeci se krune. Do pojave krunjenja presjeka dolazi ili usljed niske sobne temperature ili usljed kalupljenja u neodgovarajuećem (tvrdom) parafinu. Uzrok može da bude i lagano hlađenje pri izlijevanju kalupa.

Rascijepljena traka, uzdužne brazde na presjecima. Pojava ovakvih presjeka znači da nož više nije dobar, da se na njemu nalaze zubci, ili da je prljav. Ako je nož tup treba ga opet naoštriti, ili ga bar pomjeriti za širinu oštećenog (zupčastog) dijela, a ako je prljav treba ga očistiti. Do pojava brazda i raskidanja dovode i drugi uzroci, kao npr. nečist parafin ili priroda samog objekta. Ako je parafin nečist treba ga profiltrirati, a ako se kao uzrok ovoj pojavi ustanovi prisustvo kristala silicijumdioksida, treba izvrštiti desilifikaciju prije uvođenja u parafin.

Iskrivljena traka. Strane bloka nisu paralelne, ivica bloka nije paralelna sa ivicom noža. Žiletom pravilno oblikovati blok. Pri sječenju mikrotom "preskače" i dobijaju se presjeci nejednake debljine. Nož je postavljen pod suviše kosim uglom. Podesiti ugao pod kojim nož stoji u odnosu naparafinski blok. Neki šarafi u zglobovima mikrotomskog stočića ili držača

37

noža nisu dovoljno zategnuti. Treba prekontrolisati sve zavrtnje i pritegnuti one koji su labavi. Mikrotom nije podmazan. Treba ga očistiti i podmazati.

Presjeci zbijeni, naborani i slijepljeni. Uzroci mogu biti različiti: nož suviše tup, soba pretopla, parafin mekan, mali nagib noža, prljav nož. Pored oštrenja noža, podešavanja sobne temperature, hlađenja parafina, podešavanja nagiba noža i njegove čistoće, pri pojavi ovakvih presjeka preporučljivo je prije sječenja potopiti blok sat, dva ili preko noći u vodu ili 10% glicerin u 60% alkoholu.

Ukalupljeni materijal se lomi i ispada iz bloka. Materijal nije dovoljno dehidrovan iIi nije potpuno prosvijetljen, alkohol nije potpuno zamijenjen reagensom za prosvetljavanje, materijal je postao krt u reagensu za prosvjetljavanje, tkivo suviše tvrdo za kalupljenje u parafinu. Ako je uzrok navedenoj pojavi nedovoljno anhidrovan i nepotpuno prosvijetljen materijal, pomoći nema, mora se ponovo početi od fiksiranja. Ako se kao reagens za prosvjetljavanje koristi ksilol i materijal u njemu postane previše krt, tako da se ne može sjeći, umjesto ksilola treba upotrijebiti toluol ili mješavinu toluola i kedrovog ulja. Ako je tkivo suviše tvrdo za kalupljenje u parafinu, umjesto u parafin uvodi se u neku drugu odgovarajuću materiju.

Presjeci se podižu. Veliki nagib noža; tup nož, soba pretopla ili parafin mekan.

Presjeci talasasti. Materijal nije dobro zaliven u parafin. Pretopiti kalupe. Presjeci lete i lijepe se za dijelove mikrotoma zato što se pri sječenju stvara statički elektricitet. Ovo obično nastaje kada je vazduh izuzetno suh. Vlažnost vazduha se u radnoj prostoriji može povećati postavljanjem suda sa vodom.

6.8. LIJEPLJENJE PRESJEKA NA PREDMETNO STAKLO

Za lijepljenje parafinskih prejseka koriste se apsolutno čista predmetna stakalca. Da Ii su predmetna stakalca dobro oprana provjerava se tako što se na čisto predmetno stakalce stavi nekoliko kapi vode. Ako se voda po njemu lako razlijeva staklo je dobro oprano, a ako se skuplja znači da na ploči ima masnoće. Sa nečiste ploče preparati se odljepljuju i zato ovoj fazi rada treba pristupiti ozbiljno. Ma koliko nam se stakalca činila čistim treba provesti kompletan praces pranja da ne bismo doživjeli neprijatno iznenađenje, tj. da se poslije fiksiranja, dehidriranja, kalupljenja i sječenja, preparati, zbog nemarnosti, odlijepe i da se mora čitav proces započinjati od početka. Prema nekim autorima presjeci se mogu lijepiti direktno na čista predmetna stakalca, ali ako nismo sigurni da će se bez upotrebe Majerovog ili nekog drugog ljepila preparati održati, poslije pranja i sušenja na predmetna stakalca treba nanijeti ljepilo.

6.8.1. Pripremanje i upotreba Majerovog ljepila.

Iz svježeg jajeta razdvojiti bjelance od žumanceta. Bjelance sipati u menzuru i na njega dodati istu količinu glicerina. Bjelance i glicerin dobro izmješati, toj smjesi dodati kristalić fenola ili timola (konzervans) i filtrirati. Pošto filtracija teče sporo (nekoliko dana) lijevak treba pokriti. U sud sa filtratom treba ubaciti kristalić fenola ili timola.

Predmetna stakalca na koja se nanosi Majerovo ili neko drugo ljepilo moraju biti apsolutno čista, jer će se u protivnom preparati u daljem postupku odljepljivati. Na čisto i

38

suho predmetno stakalce kapaljkom se nanosi kap Majerovog ljepila. Nanijetu kap ravnomjerno i u tankom sloju rastrljati po površini stakla. Utrljavati sve dotle dok kažiprst ne počne da zapinje o površinu stakla. Predmetno stakalce se pri ovom postupku drži lijevom rukom sa strane između kažiprsta i palca. Na pripremljenu površinu predmetnog stakalca stavi se nekoliko kapi destilovane vode i na njenu površinu postavljaju se parafinski presjeci. Oni se sa mikrotomskog noža prenose vlažnom četkicom ili nekim instrumentom, a pri tome se vodi računa da donja strana presjeka (glatka strana) leži na površini vode. Pri pravljenju serijskih preparata takođe se mora voditi računa o redoslijedu postavljanja.

Broj presjeka koji se stavljaju na jedno predmetno staklo zavisiće od namjene pravljenja preparata, ali isto tako i od veličine pokrovnog stakalca kojim se presjeci kasnije prekrivaju. Ako se upotrebljavaju pokrovna stakalca različitih dimenzija (20x20 mm, 22x22 mm, 32x32 mm) preporučujemo da se konture svake od navedenih dimenzija pločica nacrtaju na neku tvrdu, tamniju podlogu i tako dobije marker za raspoređivanje presjeka. Presjeci se raspoređuju samo unutar kontura markera. Kada se presjeci pravilno rasporede i orijentišu pristupa se razvlačenjui li ispravljanju parafinskih presjeka. Za lijepljenje presjeka koriste se i druge materije i drugačiji postupci, međutim ovaj opisani način je najrasprostranjeniji i najdostupniji, a daje dobre rezultate.

6.9. RAZVLAČENJE PARAFINSKIH PRESJEKA

Poslije sječenja parafinski presjeci se razvlače ili ispravljaju. Postupak ispravljanja parafinskih presjeka obavlja se na više načina.

1. Kada se presjeci poslije sječenja prenesu na predmetno stakalce i rasporede mogu se razvlačiti ili na plamenu špiritusne lampe ilina specijalno konstruisanom stočiću (Slika 7). Pri razvlačenju na plamenu predmetno stakalce se brzim pokretima prenosi preko plamena sve dok se presjeci ne isprave. Pri ovom postupku osoba koja pravi preparat mora biti izuzetno pažljiva da ne pregrije presjeke i da ne dozvoli da se parafin otopi. Znači, presjeci se ispravljaju ispod tačke topljenja parafina. Ako se razvlačenje parafinskih presjeka vrši na specijalnom termo stočiću onda se temperatura grejne ploče reguliše pomoću preklopnog dugmeta tako da uvijek bude nešto niža od temperature na kojoj se upotrebljen parafin topi. Opisani postupci primjenjuju se za ispravljanje kako serijskih tako i pojedinačnih presjeka. Pri razvlačenju mora se stalno voditi računa da voda na predmetnom stakalcu u kojoj se nalaze presjeci ne ispari. Po potrebi pipetom se može voda i naknadno dodavati. Tek kada su presjeci ispravljeni višak vode se odstranjuje filter papirom.

Slika 7. Stočić za razvlačenje parafinskih presjeka

39

2. Mnogi praktičari primjenjuju postupak razvlačenja parafinskih presjeka na toploj vodi. Temperatura vode mora da se održava za nekoliko stepeni niže od tačke topljenja parafina (temperatura se stalno kontroliše termometrom). Presjeci se sa noža prenose na površinu vode. I u ovom slučaju mora da se vodi računa o orijentaciji presjeka. Donja, glatka strana presjeka leži na vodi. Kada se isprave presjeci se prenose na predmetno stakalce tako što se ispod presjeka u vodu koso zamače predmetno stakalce i laganim pokretom izvlači. Pri tome presjek ostaje zalijepljen na staklu. Ovaj način ispravljanja pogodniji je za pojedinačne presjeke, ali je za serijske povoljnije razvlačenje na plamenu ili na termostočiću. Poslije razvlačenja predmetna stakalca prenose se na marker (tamna površina na kojoj su označene konture pokrovnih stakalaca) i vrši se raspoređivanje presjeka na već opisan način. Razvučeni i raspoređeni presjeci treba da se osuše. Sušenje presjeka se obično vrši na sobnoj temperaturi i to na taj način što se predmetna stakalca sa presjecima ostavljaju (zaštićene od prašine) nekoliko dana izložena djelovanju sobne temperature. Zatim se obilježavaju i stavljaju u kutije. Neki preparati zahtijevaju sušenje u termostatu, 1-2 dana, na temperaturi od približno 35-40°C. Prema literaturnim podacima na ovaj način se isključuje mogućnost odljepljivanja presjeka pri daljem radu.

6.10. DEPARAFINISANJE

Bojenju preparata prethodi proces deparafinisanja - oslobađanja presjeka od parafina. Deparafinisanje se vrši u posebnim staklenim posudama – kivetama. Po obliku i veličini kivete mogu biti različite. Predmetna stakalca se stavljaju, jedna po jedna ili u parovima, u odgovarajuće žljebove u kivetama. Ako se deparafinišu, a kasnije i boje u parovima, stakalca se stavljaju "Ieđa u leđa", tj. parafinski presjeci su okrenuti spolja.

Deparafinisanje se vrši ksilolom, a traje, u zavisnosti od debljine presjeka, 5 do 15 minuta. Količina ksilola koja ispunjava jednu kivetu dovoljna je za deparafinisanje do sto predmetnih stakalaca na kojima se nalaze parafinski presjeci. Pri deparafinisanju svi presjeci moraju biti potpuno potopljeni u ksilol, kao uostalom i u sve rastvore kroz koje preparat prolazi.

Iz ksilola predmetna stakla se pincetom prenose u sledeću kivetu u kojoj se uvijek nalazi apsolutni etil alkohol i ksilol u jednakim dijelovima. U ksilol-alkoholu preparati ostaju 5 do 10 minuta. Prenošenje preparata iz jedne kivete u drugu obavlja se brzo kako bi se izbjeglo sušenje presjeka. Postoji još jedan način promjene reagenasa: odlivanje upotrebljenog, pri čemu se preparati pridržavaju pincetom, i brzo nalivanje sledećeg reagensa. Bilo da se primjenjuje jedan ili drugi način,cilj rada je da se vrši sprovođenje preparata kroz seriju alkohola sve niže koncentracije, ako je potrebno sve do vode. U svakom alkoholu preparati ostaju po 5 minuta. Šematski taj proces se može predstaviti na sledeći način:

Xy - Xy+AAI - AAI - 96%At - 90%AI - 80%A I - 70%AI - 50%AI - 30%AI -20%AI - voda.

Pošto se iz ove faze rada prelazi na bojenje, a boje se rastvaraju u alkoholu različite koncentracije (na primjer 50% ili 70% alkoholu) ili u vodi, to će upravo taj rastvarač i uticati u kom trenutku će preparat iz navedene serije alkohola biti prebačen u boju. Drugim riječima, ako se koristi vodeni rastvor boje onda preparate sprovodimo do vode (kroz cijelu seriju) pa

40

ih tek tada bojimo. Ako se pak upotrebljava alkoholni rastvor boje, na primjer boja je rastvarena u 50% alkoholu, onda se preparati, pri sprovođenju kroz seriju alkohola, u boju uvode iz 50% alkohola. Ako je boja rastvorena u apsolutnom alkoholu, onda se preparati odmah iz njega prenose u boju itd.

7. TEHNIKA SMRZAVANJA TKIVA

Da bi se spriječilo oštećenje određenih ćelijskih komponenti koje može nastati primjenom parafinske tehnike i da bismo sačuvali osjetljive molekule u uzorku, tkivo možemo podvrgnuti brzom zamrzavanju, najčešće u tečnom azotu. Smrznuto tkivo tako postaje dovoljno tvrdo da se pomoću mikrotoma u hladnoj komori mogu dobiti tanki isječci (5 do 10 mikrometara), koji se zatim mogu direktno bojiti bez izlaganja organskim rastvaračima ili alkoholu. Ova metoda se primjenjuje kod brojnih histohemijskih i imunohistohemijskih metoda za demonstraciju enzima ili osjetljivih molekula. Međutim, sa morfološke tačke gledišta tkivo je znatno slabije sačuvano. S obzirom da se isječak može posmatrati pod mikroskopom već poslije 5 do 10 minuta od dobijenog uzorka, ova tehnika se široko primjenjuje u toku operativnih zahvata (biopsija “ex tempore”) radi dobijanja brze dijagnoze i nastavka hirurške procedure.

Danas se prave i specijalna rashladna kupatila, koja se povežu sa mikrotomom i omogućavaju sječenje tkiva na niskim temperaturama, ali ne toliko niskim kao pri sječenju tkiva zamrznutog u tečnom azotu. Rashladna kupatila obično omogućavaju snižavanje temperature tkiva na –20 do – 400C, čime tkivo postaje dovoljno tvrdo da bi se moglo sjeći mikrotomom. Ovaj proces je znatno brži od pravljenja parafinskih kalupa, ali su takođe ćelije morfološki slabije očuvane.

8. SPECIFIČNE METODE PRIPREME CITOLOŠKIH PREPARATA

Pored standardnih metoda pravljenja privremenih i trajnih preparata, često se u laboratoriji primjenjuje i jedan od sledećih postupaka:

8.1. FRAKCIONISANJE I CENTRIFUGIRANJE ĆELIJE

U nekim slučajevima prilikom pravljenja preparata potrebno je izdvojiti pojedine ćelijske komponente. Jedan od načina na koji se to može postići jeste centrifugiranje pri velikom broju obrtaja. Postoji veliki broj različitih modela centrifuga koji se međusobno razlikuju po broju obrtaja u minuti, a time i po veličini razvijene centrifugalne sile i vrsti pogona. Za najveći broj potreba dobro može poslužiti svaki model električne centrifuge koji može postići brzinu od 3000 do 5000 obrtaja u minuti. Kod rada sa centrifugom mora se voditi računa o sledećem:

• Epruvete sa tečnošću koja se centrifugira moraju biti uravnotežene. • Poklopac centrifuge mora biti zatvoren prije početka rada centrifuge, a otvara se tekkada “glava” centrifuge prestane da se okreće. • Brzina obrtaja se mora postepeno povećavati, a isto tako, po isteku određenog vremena, postepeno smanjivati ukoliko se centrifuga ne isključuje automatski. Nagla promjena brzine pored ostalog dovodi do potresanja taloga, a time i do ponovnog zamućenja. Tečnost iznad taloga se može odliti (dekatnirati) ili odvojiti pipetom, a

41

ostatak tečnosti se uklanja izvrtanjem epruvete na filter papir ukoliko to dozvoljava vrsta taloga.

8.2. MACERACIJA

Maceracija predstavlja prirodno ili vještačko razlaganje međućelijske supstance. Kao rezultat maceracije dolazi do razdvajanja ćelija. Vještačka maceracija se vrši u cilju dobijanja pojedinačnih ćelija određenag tkiva. Na ovaj način moguća su detaljnija ispitivanja oblika i veličine ćelija kao i finija ispitivanja ćelijskog zida.

Postoji više načina za maceriranje tkiva, a koji od njih ćemo primijeniti zavisi od samog tkiva koje se macerira.

1. Nježna tkiva se maceriraju kuvanjem u ključaloj vodi. 2. Maceracija nježinih tkiva vrši se i u različitim koncentracijama KOH (5-

50%). Koncentracija KOH se određuje prema čvrstini materijala koji se macerira. Ukoliko je materijal tvrđi, upotrebljava se jaca koncentracija. Poslije maceracije, a prije posmatranja, materijal se ispira vodom.

3. Najpogadniji metod za maceriranje tkiva zeljastih biljaka je metod Manžea, a sastoji se u sledecem: Dijelovi biljke se stavljaju u zakiseljenu vodu ili zakiseljeni alkohol (na 3-5 dijelova 96% alkohola 1 dio sone kiseline HCI). U ovom rastvoru ostaju 24 sata. U daljoj fazi obrade materijal se prenosi u 10% rastvor amonijaka u kome ostaje 24 sata. Ukoliko želimo da proces ubrzamo, materijal treba kuhati u 10% amonijaku 1 sat. Kada se izvade iz amonijaka dijelovi biljke treba da se, na lak dodir pincetom, raspadnu na ćelije. Ukoliko je maceracija slaba treba povećati koncentraciju amonijaka do 30%, a ponekad se može upotrijebiti i nerazblaženi amonijak. Maceracija po metodu Manžea ima tu prednost što se u toku procesa ne razara sadržaj u ćelijama.

4. Drvo i veoma čvrsti dijelovi biljke, kao što je endokarp kad oraha (ljuska), vrlo dobro se maceriraju Šulceovom smješom. Prilikom ovog načina maceriranja obavezno je da se rad odvija u digestoru ili na otvorenom prostoru jer se izdvajaju pare azotne kiseline koje su otrovne. Dijelovi drveta se stave na dno epruvete i preko njih se naspe bertoletova so (KCIO3), tako da prekrije materijal koji se macerira. Preko soli se pažljivo sipa nekoliko kapi azotne kiseline (HNO3). Pri lakom zagrijavanju, a nekad i bez zagrijavanja, dalazi do burne reakcije pri kojoj se u početku izdvajaju mrke pare azatnog oksida, a zatim bijela para hlora. Kada ključanje prestane i kada dijelovi drveta postanu bijeli, sadržaj epruvete se izlijeva u sud sa vodom i nekaliko puta se ispira. Naravno, pri tome se pazi da sa vodom ne ode i macerirani materijal. Ovako pripremljeni materijal se čuva u alkoholu do upotrebe.

Maceririani materijal se može bojiti eozinom, šafraninom i Delafildovim hematoksilinom, a posmatra se u 2% sirćetnoj kiselini ili u glicerinu. Osim privremenih preparata moguće je napraviti i trajne, samo prethodno materijal treba da prođe kroz seriju alkohola da bi mu se oduzela voda (uobičajen mikrotehnički postupak).

8.3. GLICERIN - ŽELATINSKI PREPARAT

42

Kad god postoji potreba da se brzo naprave trajni preparati od svježeg materijala, bez sprovođenja kroz alkohole, prave se glicerin-želatinski preparati. U glicerin-želatin obično se stavljaju neobojeni preparati, jer u njemu boje brzo izblijede, osim nekih koje su nešto postojanije (na primjer metilensko plavo).

Pripremanje glicerin-želatina. U 6 ml destilovane vode, koja se sipa u vatrostalnu posudu, dodati 1 gram želatina. Želatin u destilovanoj vodi ostaje nekoliko sati i za to vrijeme on bubri. Poslije ovog vremena u posudu se još dolijeva 7 ml hemijski čistog glicerina i ubacuje kristalić antiseptika (timol, fenol). Zatim se posuda prenosi u vodeno kupatilo i zagrijava. Kroz izvijesno vrijeme sadržaj u vatrostalnoj posudi će se otopiti. Za vrijeme otapanja potrebno je više puta staklenim štapićem promiješati sadržaj u posudi. Poslije otapanja i homogenizovanja glicerin - želatin obavezno treba profiltrirati kroz lijevak u kome se nalazi staklena vata. Na ovaj način se odstranjuju nepoželjne primjese kojih uvijek ima u želatinu. Filtriranje se vrši u termostatu, jer se na običnoj temperaturi glicerin-želatin steže. Ovako pripremljeno ljepilo se čuva u frižideru i veoma je postojano.

Pri korišćenju glicerin-želatina potrebno je staklenu posudu, u kojoj se nalazi, postepeno zagrijavati u vodi sve dotle dok se on ne otopi. Staklenim štapićem se kap glicerin-želatina prenosi na predmetno stakalce i u nju se utapaju napravljeni presjeci. Zatim se presjeci prekrivaju pokrovnim stakalcem i kroz izvijesno vrijeme, kada se glicerin- želatin stegne, dobija se trajan preparat.

9. PRAKTIČNA UPOTREBA ELEKTROFOREZE

Pod elektroforezom se podrazumijeva kretanje čestica sa električnim nabojem u električnom polju. Brzina kretanja ovih čestica je proporcionalna jačini električnog polja, a zavisi od električnog naboja, veličine i oblika čestica. Postoje tri tipa elektroforeze:

1. Slobodna elektroforeza koja se vrši u naročitom staklenom sudu – ćeliji u obliku slova “U”, u koju se stavlja serum ili plazma, razblaženi određenim puferskim rastvorom, određenog pH i određene jonske jačine. Elektroforetska ćelija je u kontaktu sa sudom koji je ispunjenistim puferskim rastvorom kao i ćelija, a u njega su zagnjurene elektrode koje su u vezi sa izvorom konstantne struje određenog napona i jačine.

2. Zonska elektroforeza se vrši na čvrstoj podlozi kao što su filter-papir, acetatna celuloza, agar-gel i skrobni gel.

3. Imunoelektroforeza koja služi za dokazivanje molekula bjelančevina na osnovu njihovih antigenih osobina.

Danas se najčešće primjenjuje zonska elektroforeza.

9.1. ANALIZA IZOLOVANE DNK

Analiza kvantiteta i kvaliteta izolovane genomske i plazmidne DNK se vrši agaroznom gel elektroforezom bojenom etidijum bromidom. Agaroza je polisaharid čiju osnovnu jedinicu čini disaharid agrobioza. Nakon rastvaranja, kuvanja i laganog hlađenja, agaroza formira gustu mrežu sa porama koje variraju od 100 do 300 nm, u zavisnosti od koncentracije rastvora agaroze.

U električnom polju, u blago alkalnom puferu, molekuli DNK će se kretati kroz ovaj matriks, od katode ka anodi (DNK molekul je inače negativno nabijen), pri čemu brzina kretanja DNK molekula zavisi od njihove veličine, od veličine pora u agaroznom matriksu, tj.

43

od njegove gustine, zatim od primijenjene električne struje (voltaža) i drugih parametara kao što su temperatura, puferski sistem (jonska jačina) i dr.

Poređenjem brzine kretanja molekula DNK koji ispitujemo sa brzinom kretanja molekula DNK poznate veličine (tzv. DNK markeri), elektroforezom možemo procijeniti veličinu dobijenog DNK fragmenta. DNK molekuli se separišu na osnovu veličine tako što manji mogu da se kreću kroz pore gela brže od onih većih. Generalno, na gušćim gelovima bolje se razdvajaju fragmenti DNK male molekulske težine, dok rjeđi gelovi služe za razdvajanje velikih fragmenta.

Za pripremu agaroznog gela i elektroforetsku analizu koristi se neki od standardnih pufera za elektroforezu, npr. TAE (glacijalna sirćetna kiselina), TBE (borna kiselina), TPE (fosforna kiselina); sadrže Tris kao deterdžent te Na-EDTA za denaturaciju, a razlikuju se u koncentraciji, tj. u jačini. Agarozni gel se priprema na sledeći način:

1. U staklenu bocu ili erlenmajer (zapremine 2-4 puta veće od zapremine gela koji želimo da napravimo) usuti željenu zapreminu pufera već razblaženog do finalne koncentracije (0,5X ili 1X).

2. Dodati odgovarajuću količinu prethodno izmjerenog agaroznog praha i mućkanjem omogućiti disperziju agaroze u puferu.

3. Izmjeriti ukupnu masu suda, pufera i agaroze i prekriti plastičnom folijom da bi se smanjio gubitak tečnosti isparavanjem. Na foliji probušiti iglom nekoliko rupica.

4. Zagrijati u mikrotalasnoj rerni (na najvećoj snazi za nisko-pro- centne gelove, odnosno na srednjoj snazi za gelove koncentracije >2%) ili u ključaloj vodi, dok se u rastvoru agaroze ne pojave mjehurići. Izvaditi erlenmajer i lagano ga promućkati.Pažnja: rastvor agaroze nakon vađenja iz mikrotalasne rerne može prilikom mućkanja dodatno proključati ili se zapjeniti pa treba biti oprezan.

5. Ponovo zagrijati rastvor agaroze, ovog puta do ključanja, i pustiti ga da ključa oko 1 minut, odnosno dok se sva agaroza ne rastvori.

6. Izmjeriti sud sa agarozom ponovo na vagi i doliti vruće destilovane vode dok se ne dobije prvobitno izmjerena masa (iz koraka 3 ovog protokola).

7. Ohladiti rastvor do temperature od 50-60°C. 8. Sastaviti kalup za nalivanje gela i postaviti češalj na odgovarajuće mesto, pazeći

da zubići češlja ne dodiruju dno kalupa. Rastvor agaroze sipati u kalup tako da se dobije gel debljine oko 3 mm i ostaviti na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta da se postepeno ohladi i očvrsne. Formiran gel se može čuvati do 1 dan, najbolje u frižideru, umotan u plastičnu rastegljivu foliju.

9. Gel, zajedno sa plastičnim nosačem, staviti u kadicu za elektroforezu i doliti pufer tako da prekrije gel 3-5 mm. (Koristiti isti pufer i u istoj koncentraciji kao za pripremu gela.) Izvaditi češalj i pre nalivanja uzoraka eventualno, ukoliko je potrebno, ukloniti pasterovom pipetom iz bunarića komadiće otkinutog gela.

Uzorci koje želimo da analiziramo prethodno se pomiješaju sa puferom za nalivanje uzoraka koji služe da povećaju gustinu uzorka čime se omogućuje da DNK iz uzorka padne na dno bunarića. Zatim se uzorak boji čime se olakšava njegovo nalivanje u gel i olakšava se praćenje elektroforeze jer se boje u električnom polju kreću određenom brzinom u smjeru prema anodi.

Najčešće se koriste glicerolski ili saharozni puferi. Na gel se obično nanosi 100-500 nanograma DNK što zavisi od veličine fragmenata DNK u smjesi (da bi se mogli vidjeti veći fragmenti potrebno je staviti više DNK).

44

Uobičajeno se koristi struja konstantnog intenziteta od 5 V/cm (rastojanje između elektroda). Prejaka struja će dovesti do bržeg propadanja puferskog sistema što se ogleda u prekomjernom grijanju pufera, topljenju gela i difuziji traka u gelu. Do difuzije molekula DNK u gelu će doći i ako se primjenjuje struja previše niskog intenziteta. Za vizuelizaciju molekula DNK u gelu, najčešće se koristi etidijum bromid, supstanca koja se «umeće» između lanaca DNK molekula i koja flourescira kada se osvijetli UV svjetlom. Etidijum bromid se može staviti u gel prilikom pripreme, može se staviti u pufer za elektroforezu ili se može dodati nakon elektroforeze rastvoren u destilovanoj vodi (etidijum bromid je kancerogen pa je neophodno nositi gumene rukavice prilikom manipulacije njime).

Trajni zapis rezultata elektroforetske analize u agaroznom gelu može sedobiti fotografisanjem gela izloženog UV svjetlu (fotografisanje se obavlja u mraku).

Nakon bojenja moguće je vizuelno uočiti do 10 ng DNK veličine do 1 kb. Najjasnija traka DNK na gelu se vidi kod oko 100 ng DNK fragmenta.

9.2. ANALIZA IZOLOVANE RNK

Analiza rRNK se vrši denaturišućom agaroznom elektroforezom bojenom etidijum bromidom. Za analizu izolovanih RNK poželjna je denaturišuća agarozna elektroforeza zato što većina RNK formira sekundarnu strukturu na osnovu intramolekulskog sparivanja baza što može spriječiti da se kroz gel kreće pravilno proporcionalno dužini fragmenta.

Priprema gela:

1. zagrijati 1 g agaroze u 72 ml vode dok se ne rastvori i onda ohladiti na 60oC 2. dodati 10 ml MOPS pufera (0,4 M MOPS, pH 7.0; 0,1 M Na acetata; 0,01 M

EDTA u 18 ml 37% formaldehida (12,3 M) 3. izliti gel koristeći «češalj» koji će formirati «bunariće»u koje će se staviti RNK

uzorci 4. gel koji se nalazi u kadici prelije se puferom u visini od nekoliko mm i onda

ukloniti «češalj»

U sam RNK uzorak dodaje se određena količina formaldehida u svrhu denaturacije, tj. narušavanja sekundarne strukture RNK. Slijedi nastavak denaturacije na temperaturi od 65-70oC u trajanju od 5-15 min. Uključiti elektroforezu na 5-6 V/cm. RNK je takođe negativno naelektrisana i u neutralnom pH okruženju (u električnom polju) kretaće se ka katodi.

Za bojenje se koristi etidijum bromid koji se doda u formaldehid. Rezultati eletroforeze vidljivi su pod UV svjetlom. Kretanje RNK molekula u gelu zavisiće od molekulske veličine RNK (veće molekule kreću se sporije), konformacije RNK (sekundarna struktura), jačine struje, baznog sastava RNK, vrste pufera, boje, tipa aparata za elektroforezu itd. Migracija fragmenata i DNK i RNK u agaroznom gelu obrnuto je proporcionalna log10 njihove molekulske težine.

9.3. ANALIZA IZOLOVANIH PROTEINA Elektroforetsko ispitivanje proteinskih frakcija krvnog seruma danas ima široku primjenu. S obzirom da proteini krvnog seruma nisu homogeni već se razlikuju po veličini, obliku i električnom naboju, mogu se ovom metodom odvojiti jedni od drugih. Najčešće se primjenjuje zonska elektroforeza na filter-papiru. Aparat za elektroforezu na papiru se sastoji

45

od izvora konstantne struje (ispravljača) i vlažne komore. Vlažna komora je kada 50x50 cm od pocinkovanog lima ili neke plastične materije, na čijim bočnim stranama se nalazi po jedan otvor za prolaz elektroda. Pokrivena je pokretnom staklenom pločom. U unutrašnjosti vlažne komore nalaze se četiri suda za pufer, dimenzija 47x5 cm. U spoljašnje sudove su uronjene elektrode koje su povezane sa izvorom konstantne struje. Kao izvor struje se koristi ispravljač sa stabilizatorom koji omogućuje izbor željenog napona. Oba puferska suda su međusobno povezana, obično filter-papirom. Za elektroforezu na papiru se upotrebljava specijalni filter papir (Whatman No I, Munktell No 20, Schleicher i Schull No 2043). Za papirnu elektroforezu su potrebni sledeći reagensi:

1. Pufer Veronal-natrijum pH 8,6 jonske jačine 0,1 ( priprema se od 29,428 grama veronal-natrijuma, 19,428 g natrijumacetata, 270 ml 0,1 mol/l HCl, do 3000 ml redestilovane vode.

2. Boja brom-fenol plavo ili amido crno ( 1g boje, 40 ml glacijalne sirćetne kiseline, 20 g sublimata do 2 litre vode)

3. Rastvor 83,3 mmol/l sirćetne kiseline za ispiranje traka 4. Rastvor 0,01 mol/l NaOH za eluiranje traka.

POSTUPAK:

U svaki sud za pufer usuti po 500 ml svježe napravljenog pufera. Na isječenu traku filter papira dimenzija 27x4 cm staviti mikropipetom 0,05 ml seruma, a potom traku pokvasiti puferom izuzev mjesta gdje je stavljen serum. Serum se nanosi 5-6 cm od kraja trake i taj kraj se postavlja prema katodi. Pokvašena traka se pažljivo zategne između dva unutrašnja suda, tako da njeni krajevi leže u puferu. Poslije postavljanja traka elektrode se dovedu u kontakt sa izvorom struje određene voltaže. Pošto su trake postavljene, kada se pokriva staklenom pločom da bi se izbjeglo nepoželjno isparavanje. U cilju održavanja stalne vlažnosti komore, ispod traka se postavi petrijevka sa destilovanom vodom. Ovako postavljene trake stoje 19-20 sati, nakon čega se skidaju i suše na sobnoj temperaturi.

Osušene trake se boje tako što se u sud za bojenje sipa brom fenolplavo i ostave se desetak minuta da boja djeluje. Nakon toga trake se vade i suvišak boje se uklanja odbojavanjem tri puta po 10 min u 83,3 mmol/l sirće kiselini. Tamo gdje na traci nema bjelančevina, pri odbojavanju traka se potpuno obezboji. Trake se zatim ponovo suše na sobnoj temperaturi.

Kada se traka osuši, boja se pojača parom amonijaka pa se traka isiječe na pojedine frakcije. Svaka frakcija se posebno isjecka i stavi u bočicu u koju se nalije po 5 ml 0,01 mol/l NaOH i ostavi 30 minuta. Poslije toga se intenzitet boja čita na fotometru sa zelenim filtrom talasne dužine 540 nm. Iz dobijene ekstinkcije se izračunava relativna vrijednost pojedinih frakcija kao što je dato na primjeru:

Ekstinkcija za albumine ... ... ... ... ... 159Ekstinkicija za α globuline ... ... ... ... ..66Ekstinkicija za β1globul i ne ... ... ... ... 48Ekstinkicija za β2globul i ne ... ... ... ... ..40Ekstinkicija za γ globuline ... ... ... ... ... ..92 Ukupno ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .405

Relativan odnos pojedinih frakcija se izračunava iz proporcije:

46

Ukupna ekstinkcija : 100 = ekstinkcija frakcije : X4 0 5 : 1 00 = 1 59 : X

X = 39,2

Tako se u ovom primjeru za albumine dobije relatina vrijednost 39,2%. Ovako se izračuna i za sve ostale frakcije, a zbir relativnih vrijednosti mora iznositi 100%.

47

Documents

Rad u biološkoj laboratoriji-praktikum