PROTEINI TELESNIH TEČNOSTI

Humani organizam sadrži od 30000 – 50000 strukturnih gena koji kodiraju sintezu

proteina. U jednoj ćeliji se smatra da ima oko 3000-5000 proteina. Na današnjem stupnju

razvoja biohemisjkih metoda i tehnika moguće je analizirati više od 300 individualnih

proteina. Proteini se mogu određivati u krvi, urinu, cerebrospinalnoj tečnosti, amnionskoj

tečnosti, salivi, fecesu, pleuralnoj i perikardijalnoj tečnosti.

Većina proteina plazme sa izuzetkom imunoglobulina i proteinskih hormona se sintetišu u

jetri. Proteini plazme cirkulišu u krvi i između krvi i ekstracelularnih prostora u tkivima, tako

da većina ekstracelularnih tečnosti normalno sadrži male količine proteina plazme. Različite

bolesti menjaju sadržaj plazma proteina u telesnim tečnostima na karakterističan način. U

Tabeli 1 su navedeni glavni individualni proteini plazme, njihove referentne vrednosti za

odrasle osobe i način promene njihove koncentracije u akutnim stanjima. Iz tabele se vidi da

su neki od navedenih proteina svrstani u pozitivne ili negativne reaktante akutne faze, što

znači da se njiva koncentracija značajno povećava (kod pozitivnih reaktanata) ili značajno

snižava (kod negativnih) u toku akutne inflamacije u stanjima kao što su hirurške intervencije,

infarkt miokarda, infekcije i tumori. Ovi proteini imaju značajnu ulogu u kompleksnom

procesu odbrane organizma u inflamaciji.

Određivanje proteina

Metode za određivanje koncentracije proteina u telesnim tečnostima se mogu grubo podeliti

na sledeći način:

1. Kvantitativno određivanje ukupnih proteina i albumina

2. Separacija različitih proteina elektroforetskim tehnikama, što omogućava

semikvatitativno određivanje glavnih klasa proteina koje se nalaze u većim

koncentracijama u telesnim tečnostima.

3. Specifične kvantitativne metode za određivanje individualnih proteina

imunohemijskim metodama korišćenjem specifičnih antiseruma i merenjem Ag-At

kompleksa nefelometrijskim i turbidimetrijskim metodama, radijalnom

imunodifuzijom (RID) ili elektroimunodifuzijom. Ako je protein od interesa prisutan u

jako niskoj koncentraciji onda se primenjuje radioimuno određivanje (uz upotrebu

radioaktivnih supstanci) ili enzimskim imuno testom (EIA).

4. Detekcija i identifikacija abnormalnih proteina pomoću RID, imunoelektroforezom

(IEF) ili imunofiksacijom (IFE).

1

Tabela 1. Osnovne osobine najznačajnijih individualnih proteina plazm

Protein Referentna vrednost

(g/L)

Reaktant akutne faze*

Funkcija/klinički značaj

Prealbumin (PA) 0.2-0.4 - RAF indikator nutricionog statusa

Albumin 35-50 - RAF Snižen kod različitih bolesti: glavni transportni

protein1-region elektroforeze - 1 proteini

1-Antitripsin (AAT) 0.78-2 + RAF urođeni nedostatak može uzrokovati emfizem ili

cirozu jetre-kiseli glikoprotein (AAG,

orosomukoid)0.5-1.5 + RAF nerazjašnjena funkcija

1- lipoprotein (apo A) 1.7-3.25 Transport i metabolizam lipida, glavni protein HDL

čestica1-fetoprotein (AFP) 0.03 mg/L Glavni fetalni protein;

tumor marker kod odraslihe2-region elektroforeze- 2 proteini

2-makroglobulin (AMG) 1.25-4.10 Povišen u nefrotskom sindromu

Ceruloplazmin(CER)

0.2-0.5 +RAF Snižen u Vilsonovoj bolesti, sadrži bakar

1-region elektroforeze - 1-proteiniTransferin (TRF-siderofilin) 2-3.5 -RAF Transportuje gvožđe, povećan

u hipohromnoj anemijiHemopeksin (Hx, Hpx) 0.5-1.15 Vezuje hem-lipoprotein (Apo B) 0.6-1.55 Transport i metabolizam

lipida, glavni protein LDL čestica

C4 0.1-0.4 +RAF Komponenta komplementa2-region elektroforeze - 2-proteini

Fibrinogen 0.2-0.4 +RAF Prekursor fibrinskog ugruškaC3 0.7-1.5 Komponenta komplementa

2-mikroglobulin (BMG) 1-2 mg/L Za dijagnostiku funkcije bubrega

-region elekroforeze, Imunoglobulin G, IgG 5.25-16.5 Porast antitela u imunim

reakcijamaIgA 0.4-3.9 monoklonsko povećanje u

tumorima B-ćelijaIgM 0.25-3.1

C-reaktivni protein (CRP) <0.8 ++RAF verovatno jedan od proteina imunog sistema

* -RAF- negativan reaktant akutne faze – protein kome se koncentracija snižava u akutnim stanjima;

+RAF- proteini čija se koncentracija u akutnom stanju povećava.

2

IMUNOHEMIJSKE METODE ZA ODREĐIVANJE INDIVIDUALNIH PROTEINA

Najčešće korišćene tehnike za ovaj tip metoda su nefelometrija i turbidimetrija zbog brzine

i jednostavnosti izvođenja. Ove dve tehnike mogu da se izvode merenjem količine stvorenog

Ag-At kompleksa (metoda ravnoteže) ili merenjem brzine stvaranja kompleksa (kinetička

metoda). Kinetičke metode su mnogo brže pa se merenje izvodi tokom 20 sekundi i mnogo su

preciznije pošto slepa proba ovde nije potrebna. Kinetički testovi su nešto manje osetljivi zato

što nisko-afinitetna At nemaju vremena da reaguju.

Prilikom izbora odgovarajuće metode za individualni protein plazme mora se obratiti pažnja

na nekoliko faktora:

OSETLJIVOST METODE. Detekcioni limit od 10 g/mL može se postići kod

nefelometrijskih metoda; turbidimetrijske su nešto manje osetljive, njihov detekcioni limit je

između 20 i 30 g/mL. RID (radijalna imunodifuzija) može da detektuje minimalno

10-20 g/mL, detekcioni limit može da bude još niži ako se upotrebljavaju specijalne „low

level“ ploče (ploče za detektovanje niskih koncentracija). Nefelometrijske, turbidimetrijske i

RID metode imaju zadovoljavajuću osetljivost za detektovanje proteina koji su prisutni u

koncentracijama od oko 20 g/mL ili većim. Najosetljivije su RIA metode i koriste se za

kvantifikaciju koncentracija proteina sa koncentracijama reda veličine ng/mL (na pr. serumski

IgE).

PRECIZNOST. Kod nefelometrijskih metoda nepreciznost u seriji odnosno koeficijent

varijacije (KV) je manji od 5%, pri čemu su ravnotežne metode manje precizne od kinetičkih

zbog toga što zahtevaju slepu probu. RID i EIA metode imaju veće KV iz dana u dan, obično

u opsegu od 5-15%. RIA metode koje obično mere mnogo manje količine proteina imaju KV

u seriji od 5-10%.

VREME POTREBNO ZA IZVOĐENJE. Nefelometrijske metode su brze pri čemu se

kinetičkim izvođenjem rezultat može dobiti za nekoliko minuta a kod ravnotežnih metoda do

1h. RID metode se izvode tokom 24h-48h inkubacije, što nije prihvatljivo za hitne analize. U

zavisnosti od metode vreme potrebno za izvođenje RIA tehnike je obično nekoliko sati.

INSTRUMENTI I OPREMA. Iako su relativno skupi aparati nefelometri i spektrofotometri

koji su neophodni za metode u kojima se meri rasipanje svetlosti pod određenim uglom

(nefelometrija) ili apsorbovana svetlost (turbidimetrija- sa povećanjem zamućenja-turbiditeta

povećava se i količina apsorbovane svetlosti), ovi instrumenti sadrže mikroprocesore koji

3

generišu kalibracione krive i računaju rezultate u uzorcima pacijenata. RID metoda ne zahteva

nikakvu opremu osim pipeta, iako je očitavanje dijametara nastalih precipitacionih prstenova

preciznije ako postoji čitač ploča (čitanje može da se vrši i ručno pomoću lenjira). RIA

metode zahtevaju specijalne brojače radioaktivnih signala.

PRINCIP NEFELOMETRIJSKOG ODREĐIVANJA KONCENTRACIJE PROTEINA

Nefelometrijske metode se zasnivaju na reakciji antiseruma specifičnog za protein koji se

određuje u plazmi. Reakcija se izvodi tako štose antiserum dodaje u reakcionu kivetu u koju

je prethodno dodat uzorak (plazma) pri čemu dolazi do reakcije antigen-antitelo.

Propuštanjem svetlosti kroz reakcionu kivetu usled stvaranja kompleksa Ag-At povećava se

zamućenje pa dolazi do rasipanja svetlosti. Nefelometar je aparat koji meri intenzitet rasute

svetlosti pod određenim uglom koji u zavisnosti od aparata može biti različit, negde je to 70 a

negde 90 u odnosu na pravac prolaska ulaznog snopa svetlosti. Intenzitet rasute svetlosti je

proporcionalan koncentraciji Ag-At kompleksa u reakcionoj kiveti pa samim tim i

koncentraciji proteina od interesa. Prilikom reakcije Ag i At, brzina formiranja čestica Ag-At

kompleksa se povećava dok ne dostigne maksimalnu brzinu. Brzinu promene rasipanja

svetlosti beleži aparat i bira maksimalnu brzinu postignutu tokom reakcije izdvaja jer se

uzima da je ona proporcionalna koncentraciji Ag odnosno proteina koji određujemo. Da bi se

koncentracija proteina odredila koristimo kalibratore poznatih koncentracija, pri čemu aparat

generiše krivu zavisnosti maksimalnih brzina od koncentracija kalibratora. Koncentracija Ag

iz uzorka pacijenata se onda računa tj. očita sa kalibracione krive (nefelometar daje rezultat

kao koncentraciju tog proteina koji određujemo).

Imunoglobulini (At telesnih tečnosti)

Imunoglobulini su jedinstveni po svojoj heterogenosti, mestu sinteze i činjenici da je njihova

sinteza adaptivni odgovor na stimulaciju određenim antigenom. Imunoglobulini imaju

funkciju prepoznavanja antigena i inicijaciju efektorskih mehanizama koji će uništiti antigen.

Za razliku od većine plazmatskih proteina koji se sintetišu u jetri imunoglobulini se sekretuju

od strane plazma ćelija, koje su krajnji produkti ćelijske linije koja počinje sa matičnim

ćelijama B-limfocita u kostnoj srži. Osnovne klase imunoglobulina su IgM, IgG, IgA, IgD i

IgE.

Metode za određivanje koncentracije pojedinačnih imunoglobulina su imunohemijske; mogu

se koristiti RID ili elektroimuno gel tehnike ali nefelometrijsko ili turbidimetrijsko

4

određivanje su metode izbora obzirom da su danas dostupni vrlo specifični antiserumi

visokog titra.

Komponente komplementa

Proteini komplementa čine grupu od najmanje 20 imunoloških različitih komponenti u krvi i

telesnim tečnostima. Oni mogu da reaguju sekvencijalno sa Ag-At kompleksima , međusobno

i sa ćelijskim membranama u cilju uništavanja virusa i bakterija i u nekim patološkim

procesima mogu da unište ćelije sopstvenog organizma. Najznačajnije komponente

komplementa su označene C1-C9

Metode za određivanje komponenti komplementa

Uzorak

Serum je uzorak izbora, može se koristiti i EDTA plazma. Najvažnije je što pre odvojiti

serum/plazmu od krvnih ćelija i analizirati odmah ili zamrznuti uzorak pošto su ovi proteini

veoma labilni.

Metode

Imunohemijske – nefelometrijske ili RID.

PREALBUMIN I RETINOL-VEZUJUĆI PROTEIN (RBP)

Oba proteina se sintetišu u jetri. Tokom elektroforeze oba proteina idu ispred albumina. Oba

ova proteina su transportni proteini. Prealbumin vezuje tiroksine i trijodtironin. RBP u 1:1

kompleksu sa prealbuminom transportuje vitamin A (retinol). Prealbumin je negativan

reaktant akutne faze i njegova koncentracija se smanjuje u inflamaciji i kod maligniteta. Kod

Hodkinovog limfoma njegova koncentracija raste. RBP se povećava kod hroničnog renalnog

oboljenja, posebno kod pacijenata sa tubularnom proteinurijom.

Metode za određivanje ova dva proteina su nefelometrijske ili RID:

1-ANTITRIPSIN

je pozitivan reaktant akutne faze sa antiproteaznom aktivnošću i njegova deficijencija je

udružena sa oboljenjima pluća i jetre. Funkcija ovog proteina je neutralizacija lizozomalnog

enzima elastaze koji se otpušta prilikom fagocitoze čestica polimorfonuklearnim leukocitima.

Metode za određivanje aktivnosti ovog proteina koji ima funkciju enzima ranije su merile

aktivnost ovog enzima a danas su uglavnom imunohemijske, nefelometrijske metode.

1-KISELI GLIKOPROTEIN

ili orosomukoid je pozitivan reaktant akutne faze i njegova uloga iako nije potpuno

razjašnjena je povezana sa inflamacijom. Klinički značaj određivanja ovog proteina se ogleda

u određivanju njegove koncentracije u toku akutno-fazne reakcije. Do njegovog povećanja

dolazi u reumatoidnom artritisu, sistemskom lupusu, Kronovoj bolesti, malignim

5

neoplazmama, infarktu miokarda. Sniženje koncentracije se može naći u slučajevima

malnutricije, jakom oštećenju jetre i kod nekih gastroenteropatija.

Metode koje se primenjuju za određivanje koncentracije ovog proteina su imunohemisjke,

RID i nefelometrijske.

1-FETOPROTEIN

Protein koji se sintetiše u jetri fetusa i oko 13. nedelje fetalnog razvoja postaje glavni protein

plazme fetusa. Maksimalni nivo dostiže 30. nedelje a zatim njegova koncentracija u plazmi

fetusa počinje da opada pa je na rođenju koncentracija 1% od pomenute vršne koncentracije.

Kod odraslih je koncentracija manja od 2 ng/mL. Nije poznata njegova funkcija a klinički

značaj se ogleda u ginekologiji kada se određivanjem koncentracija AFP u amnionskoj

tečnosti ili serumu majke koristi za prenatalni skrining na defekte nervne cevi fetusa.

Povećanje ovog parametra kod odraslih ukazuje na prisustvo hepatocelularnog karcinoma, pa

se ovaj protein ubraja u tumor markere.

Metode: RIA, EIA, fluorescentna polarizacija.

HAPTOGLOBIN

Ovaj protein vezuje slobodan hemoglobin u plazmi i pozitivan je reaktant akutne faze. Do

povećanja koncnetracije ovog proteina dolazi tokom akutno-faznih reakcija kao što je u

slučaju opekotina ili kod nefrotskog sindroma. Niske koncentracije se mogu naći u

slučajevima povećane intravaskularne hemolize ili bržeg metabolisanja hemoglobina kao što

je to kod hemolitičke anemije, transfuzija ili malarije.

Metode-imunohemijske: nefelometrijske i RID.

2-MAKROGLOBULIN

je protein sa još uvek nerazjašnjenom funkcijom a klinički značaj određivanja ovog proteina

nije veliki.

Metode su imunohemijske: nefelometrijske i RID.

CERULOPLAZMIN

je kasni reaktant akutne faze. To je glavni protein plazme koji sadrži bakar. Glavni klinički

značaj je u dijagnozi Wilsonove bolesti (degeneracija jetre usled taloženja bakra). Povećane

koncentracije ovog proteina se nalaze kod infekcija, maligniteta i trauma. U Wilsonovoj

bolesti su njegove koncentracije snižene.

Metode su imunohemijske: nefelometrijske i RID.

TRANSFERIN

je glavni protein plazme koji transportuje gvožđe. Njegova koncentracija korelira sa ukupnim

kapacitetom seruma da vezuje gvožđe. Ovaj protein je negativan reaktant akutne faze.

6

Klinički značaj određivanja ovog proteina je u diferencijalnoj dijagnozi različitih tipova

anemija i kod praćenja uspešnosti njihovog tretmana.

Metode su: imunohemijske: nefelometrijske i RID.

2-MIKROGLOBULIN

je protein male molekulske mase koji se nalazi na površini svih ćelija sa jedrom. Do

povećanih koncentracija ovih proteina dolazi u bolestima bubrega, inflamaciji, neoplazmama.

Glavni klinički značaj ovog proteina je za testiranje funkcije bubrega naročito kod pacijenata

sa tarnsplantiranim bubregom kod kojih se odbacivanje transplanta ogleda u smanjenju

funkcije tubula.

Metoda: RIA

C-REAKTIVNI PROTEIN (CRP)

je pozitivan reaktant akutne faze koji se smatra jednim od najosetljivijih reaktanata akutne

faze. Koncentracija CRP proteina raste značajno nakon infarkta miokarda, u stresu, traumi,

infekciji, inflamaciji, operacijama ili proliferaciji neoplazmi.

Metode: imunohemijske: nefelometrijske i RID, RIA i EIA.

7

8