BIOCHIMIEConf. Dr. Adriana Kaycsa INTRODUCERE M. Horowitz:

Viaa posed proprietile de replicare, cataliz i mutabilitate. Biochimia este studiul vieii la nivel molecular Este n legtur strns cu biologia molecular i celular Obiectivele majore ale biochimiei: - izolarea moleculelor din celule- determinarea structurii lor - analiza modului lor de funcionare- apariia vieii - studiind procesele chimice din toate formele de via: microorganisme, plante, insecte, mamifere Biochimia devine: Limbajul comun pentru fiziologie, farmacologie, genetic i microbiologie

Dei lumea vie prezint o enorm diversitate, exist totui o remarcabil similaritate n biochimia acestor forme de via. De exemplu, codificarea i expresia informaiei ereditare, principalele ci metabolice sunt identice la imensa majoritate a lumii vii. Fiinele vii prezint o enorm diversitate, de exemplu n organismul uman gsindu-se peste100 000 de specii moleculare diferite. Structura lor prezint o mare regularitate, bazat pe organizarea ierarhizat a moleculelor componente. Organismele, din punct de vedere anatomic i citologic, sunt constituite:+ organe, alctuite din+ esuturi, iar acestea sunt alctuite la rndul lor din+ celule compuse din+ organite subcelulare. Biochimie Organitele sunt constituite din ansamble supramoleculare care sunt organizate n macromolecule cu masa molecular de la cteva mii n sus: - proteine (21 de aminoacizi)- acizi nucleici (8 nucleotide) - polizaharide (8 tipuri de glucide)- lipide Aceste macromolecule sunt constituite la rndul lor din cteva specii monomerice, fapt ce uureaz enorm sarcina cercettorilor. Principalii compui chimici prezeni n corpul umanElementAbundena (%) ElementAbundena (%) Carbon50Sulf0.8 Oxigen20Sodiu0.8 Hidrogen10Clor0.4 Azot8.5Magneziu0.1 Calciu4Fier0.01 Fosfor2.5Mangan0.001 Potasiu1 Alte elemente sunt necesare n cantiti mici: iodul, cobaltul, molibdenul, seleniul, nichelul, zincul, etc). Chiar dac n unele cazuri nu se cunoate precis rolul lor biologic, aceste elemente sunt necesare unor organisme pentru cretere i dezvoltare normal. Aceste elemente se leag ntre ele prin legturi preponderent covalente formnd diverse structuri moleculare. Dintre diferitele tipuri de molecule din organite i citosol care intr n constituia lumii vii, apa, coninut n proporie de 64% este componentul cel mai abundent.Compoziia chimic a corpului umanSubstanaAbundena (%) Proteine15 Grsimi15 Glucide1 Apa64 Minerale5 PROTEINE Proteinele sunt substane macromoleculare organice cu structur polipeptidic, n care unitile de baz le reprezint cei 21 de aminoacizi proteinogeni. Proteinele au un rol esenial n constituirea i funcionarea lumii vii. Proteinele constituie elementele structurale de baz n celul, esut i organ, ndeplinind o serie de funciuni: proteinele cu funcie catalitic (enzimele) catalizeaz toate reaciile metabolice; exprimarea informaiei genelor necesit activitatea unui mare numr de proteine care coopereaz cu acizii nucleici n procese ca : replicarea ADN, sinteza ARN i a proteinelor; asigur contracia muscular, mobilitatea celular, procese de transport intra i intercelular; asigur imunitatea celular i procesele de transmitere a semnalelor nervoase i hormonale; rol energetic, cca. 20% n energetica organismului provenind din oxidarea aminoacizilor proteinogeni.PROTEINE Chimic, proteinele sunt constituite din aminoacizi, legai ntre ei prin legturi peptidice. Numrul acestora este variabil, ntre 40 - 40.000, ceea ce ar corespunde unor mase moleculare cuprinse ntre 5000 - 4.200.000 Da. Diversitatea proteinelor din natur se bazeaz pe posibilitile, practic nelimitate, de combinare a celor 21 aminoacizi proteinogeni. Astfel din 20 de aminoacizi se pot obine 202 (400) dipeptide diferite sau 203 (8000) tripeptide diferite sau 204 (160.000) tetrapeptide diferite .a.m.d. Aceast diversitate permite existena de proteine specifice fiecrui organism, organ, esut, celul.AMINOACIZI substane organice cu funciune mixt; conin n molecul att o grupare aminic (-NH2) ct i una carboxil (-COOH) legate de acelai atom de carbon. Aminoacizii mai conin catene saturate, nesaturate, aromatice sau heterociclice. Funcie de originea lor pot fi naturali sau artificiali Se cunosc aproximativ 300 aminoacizi (AA) naturali, 21 AA proteinogeni n constituiA tuturor formelor de via, specificai prin codul genetic. AA prezeni n proteine - 90% din totalul lor (6-8 g/100 ml) AA proteinogeni liberi 10% (0,05 g/100 ml) derivai, care rezult, de fapt, postrannslaional; de ex. hidroxiprolina, hidroxilizina, cistina ce provine din oxidarea a dou cisteine la nivelul gruprii SH, la o legtur S-S-, etc. Alte modificri posttranslaionale la nivelul aminoacizilor pot fi metilri, formilri, acetilri, prenilri, carboxilri, fosforilri. aminoacizi liberi neproteinogeni, cu rol funcionalStructura chimic a aminoacizilor proteinogeni oR CHNH2COOHAminoacizi cu catena lateral R alifatic Glicina (glicocol) Gli (G) Alanina Ala (A) Valina Val (V) Leucina Leu (L) Isoleucina Ile (I) CH2NH2COOHCH3CHNH2COOHCH3CH3CH CH COOHNH2CH3CH3CH CH2CHNH2COOHCHCH3CHNH2COOH CH2CH3Aminoacizi cu catena lateral R coninnd grupri hidroxil (OH) Serina Ser (S) Treonina Thr (T) Tirozina Tir (Y) CH2OHCH COOHNH2CH3CHOHCHNH2COOHC H 2 C H N H 2 C O O HHO Aminoacizi cu catena lateral R coninnd sulf (S) i seleniu (Se) Cistein Cis (C) Metionin Met (M) Selenocistein Se-Cis CH2SHCHNH2COOHCH3S ( CH2)2CHNH2COOHC H2CHSeH NH2COOHAminoacizi cu catena lateral R coninnd grupare acid i amidele lor Acid aspartic Asp (D) Asparagin Asn (N) Acid glutamic Glu (E) Glutamin Gln (Q) HOOC CH2CHNH2COOHH2NOC CH2CHNH2COOHHOOC CH2CH2CH COOHNH2H2NOC CH2CH2CH COOHNH2Aminoacizi cu catena lateral R coninnd grupare bazic Lizina Lis (K) Arginina Arg (R) Histidina His (H) NH2CH2( CH2)3CHNH2COOHNH2C NHNH( CH2)3CH COOHNH2N HN C H 2 C H N H 2 C O O H Aminoacizi cu catena lateral R coninnd inel aromatic Fenilalanin Phe (F) Tirozin Tir (Y) Triptofan Trp (W) C H 2 C H N H 2 C O O H C H 2 C H N H 2 C O O HH O HNCH2CH COOHNH2Iminoacid Prolin Pro (P) NCOOHHAminoacizi neproteinogeni cu rol funcional -alanina - component al coenzimei A, structura unor dipeptide GABA neurotransmitor ac. -amino- levulinic intermediar n sinteza hemului Citrulina intermediar n ureogenez Ornitina intermediar n ureogenez Homocisteina - intermediar n metabolismul unor aminoacizi H2NCH2CH2COOH H2NCH2CH2CH2COOH H2NCH2COCH2CH2COOH H2NCONH(CH2)3CH(NH2)COOH H2N(CH2)3CH(NH2)COOH HS(CH2)2CH(NH2)COOHAminoacizi neproteinogeni cu rol funcional Homoserina - intermediar n metabolismul unor aminoacizi PABA - factor de cretere pt. bac-terii, component al acidului folic DOPA - intermediar n sinteza catecolaminelor T3 - hormon tiroidian T4 tiroxin - hormon tiroidian HO(CH2)2CH(NH2)COOH H2NC6H4COOH HO HO C H 2 C H ( N H 2 )C O O H H O I O I I C H 2 C H N H 2 C O O H H O I O I I C H 2 C H N H 2 C O O H I Proprietile aminoacizilor Proprietile fizice - substane solide,- puncte de topire ridicate (peste 200C) i se descompun nainte de a se topi.- se dizolv, ntr-o msur mai mare sau mai mic, n ap,- sunt greu solubili n solveni nepolari (eter, cloroform, benzen, etc.).- sunt uor solubili n soluii diluate de acizi sau baze. Proprietile optice C H H2NCRHO OC NH2HCROH OL aminoacid D aminoacid n structura proteinelor nu se ntlnesc dect LAA, deoarece proteinele sunt sintetizate cu ajutorul enzimelor, care au stereospecificitate i nu insereaz dect Laminoacizi n lanul proteic.Aminoacizii din seria D apar numai ocazional, la unele microorganisme mai ales, unde ndeplinesc roluri specifice (de ex. n antibiotice polipeptidice)Izoleucina i treonina au un carbon asimetric adiional, atomul CProprietile acido-bazice electrolit amfoter La pH-ul plasmei sanguine (7,4) sau al spaiului intracelular (7,1), gruparea carboxil exist aproape n ntregime sub forma ionului carboxilat (COO-). La aceste valori de pH, majoritar gruparea aminic este n forma protonat (NH3+). -> soluie tampon B AR CHCOOHNH2R CHCOO-NH3+pH > 7-pH < 7+NH3+R CH COOHH+R CHNH2COOHH+R CHNH2COO-pH izoelectric (pI) La o anumit valoare a pH-ului, ionizarea gruprilor NH2 i COOH este egal; la acest pH, aminoacidul este neutru din punct de vedere electric i are solubilitate minim

pIpK pKCOOHNH=++oo322pK pKpICOOH R COOH o+=2pK pKpI3 3NH R NH+ + o+=Nr. crt.AminoacidpKCOOH pKNH3+ pKRpI 1Alanin2,359,696,02 2Arginin2,179,0412,4810,76 3Acid aspartic2,099,823,862,97 4Asparagin2,028,85,41 5Cistein1,7110,788,335,02 6Fenilalanin1,839,135,98 7Glicocol2,349,605,97 8Glutamin2,179,135,65 9Acid glutamic2,199,674,253,22 10Histidin1,829,176,007,58 11Izoleucin2,369,686,02 12Leucin2,369,605,98 13Lizin2,188,9510,539,74 14Metionin2,289,215,75 15Prolin1,9910,606,10 16Serin2,219,155,68 17Tirosin2,209,1110,075,65 18Treonin2,6310,436,53 19Triptofan2,389,385,88 20Valin2,329,625,97 Valorile pKa (la 25C) ipH-ul izoelectric (pI) al aminoacizilor proteinogeni Aminoacizi cu R hidrofob, nepolar: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met Aminoacizi cu R polar, dar fr sarcin electric (la pH fiziologic): Ser, Tre, Tir, Cis, Asn, Gln, Gli. Aminoacizi cu R ncrcat negativ (-) la pH-ul fiziologic: Asp, Glu. Aminoacizi cu R ncrcat pozitiv (+) la pH-ul fiziologic: Liz, Arg, His.Proprietile chimice reacii chimice comune: determinate de prezena gruprii CNH2

- dezaminare,- transaminare,- acilare, alchilare,- formare de baze Schiff cu aldehidele,- amidificare cu gruparea COOH de la alt aminoacid determinate de prezena gruprii Co-COOH- esterificare,- anhidrizare,- decarboxilare - cu formare de amine,- amidificare, de ex. cu grupareaNH2 de la alt aminoacid cu formarea legturii peptidiceelectrolii amfoteriProprieti particulare Cisteina punte disulfidic cistina -SH nucleofil excelent Serina, treonina, tirozina esteri fosforici 2- 2H+ 2HCHCH2COOHSHNH2CH2CHCOOHNH2S S CH2HCOOHNH2C+ ATP+ ADP(+CH2CHCOOHOHNH2( H3PO4)CH2CHCOOHNH2O PO3H2H2O)Liz prin gruparea NH2 suplimentar are rol n realizarea unor activiti enzimatice sau n stabilirea legturii protein - cofactor enzimatic sau formarea de reele n structurile colagenului i elastinelor. Tir i His, prin posibilitile oferite de componentele lor R specifice (de ex. HO-fenolic, respectiv NH-imidazolic, prin fixare respectiv cedare de protoni) au rol n activitatea enzimatic a unor proteine, precum i n constituirea unor molecule funcionale (de ex. hemoglobin). Ala, Val, Leu i Phe n schimb, datorit caracterului hidrofob al componentei lor R specifice sunt aminoacizi care confer proteinei n care sunt prezente, predispoziii privind crearea unor anumite elemente de structur spaial (prin legturi apolare). Aminoacizii nu absorb radiaia luminoas n domeniul vizibil (sunt incolori). Fenilalanina, tirozina, triptofanul i histidina absorb radiaia n domeniul 250 290 nm, fiind responsabili pentru absorbia de radiaie a proteinelor n domeniul respectiv.Reacii de culoare ale aminoacizilor Ninhidrina FluorescaminaFormarea de legturi peptidice OOOOOOCH H2N COOH HHN CH COOHH2N CH NHOCH COOH CR1R2R2R1 H2O+H2OStructura proteinelor Legtura peptidic datorit conjugrii p-t legtura este parial dublR2N CH C OHOoHH2HN CHR1COoR2N CH C OHOoH2HN CHR1C OHOo+Legtura peptidicDipeptid I II IIICC NPOCH+-CC NPOCHCC NPOCH+-ooConsecinele acestui fenomen: legtura CP-N avnd caracter parial de dubl legtur nu mai permite rotaia liber a substituenilor celor doi atomi participani i toi cei ase atomi implicai devin coplanari; adoptarea unui aranjament trans pentru atomii H, O i pentru radicalii R ai celor doi aminoacizi implicai, aranjament care este cel mai stabil din punct de vedere energetic; gruparea NH nu ionizeaz datorit dublei legturi ce o transform n grupare imino =N-H; rotaia liber este permis doar n jurul atomului Co (Co-N, Co-CP), existnd astfel posibilitatea apariiei unor conformaii diferite ale proteinei n structura de ansambluNatura catenelor laterale Orientarea catenelor. n general radicalii nepolari (Val, Leu, Ile, Met, Phe) sunt orientai spre interiorul proteinei, n timp ce radicalii polari ionizabili (Asp, Glu, His, Arg, Lis) sunt ndreptai spre suprafaa proteinei, permind acesteia s formeze legturi cu apa. Formarea de legturi ntre catenele laterale cum ar fi : legturi de hidrogen ntre componentele legturilor peptidice (carbonil i imino) ale celor dou catene punte de sulf ntre dou resturi de cistein legturi ionice ntre formele ionizate ale - COOH i - NH2 legturi esterice ntre gruprile COOH i OH legturi hidrofobe (Van der Waals) ntre catenele de aminoacizi hidrofobe (Val, Leu, Ile, Phe, Trp) Legturi de hidrogen ntre gruprile OH ale aminoacizilor Ser, Tre i TirOrganizarea structural a proteinelorn structura proteinelor se disting dou nivele principale: structura de baz (primar) ce const n secvena catenei polipeptidice a proteinelor constituit pe baza naturii chimice, proporiei i succesiunii aminoacizilor componeni. Conformaia sau organizarea superioar, rezultat al orientrii tridimensionalea catenei polipeptidice Structura primar Reprezint numrul, tipul i ordinea aminoacizilor n secvena proteinei realizat prin legturile peptidice dintre aminoacizii componeni Secvena de aminoacizi dintr-o protein este unic, ea aflndu-se sub un strict control genetic Structura tridimensional i implicit activitatea biologic a unei proteine sunt dependente i controlate de secvena de aminoacizi caracteristic structurii primare. Modificarea acestei secvene prin nlocuirea, adugarea sau eliminarea unuia sau mai multor aminoacizi duce la modificarea conformaiei i implicit a funciei biologice a proteinei respective.Compararea secvenelor este utilizat curent n evaluarea similitudinii proteinelor la nivelul structurii ifuncionrii. Aceste comparaii iau n considerare alinierea secvenelor astfel nct s existe un maxim de resturi de aminoacizi identici. - Dou secvene sunt denumite omoloage dac secvenele lor au un grad nalt de similitudine. Termenul de proteine analoage denumete proteine care au structuri similare dar nu au rapoarte de evoluie ntre ele. Deosebirile pot fi date de substituia unui aminoacid cu un altul. Aceste substituii pot fi: - Conservative atunci cnd un aminoacid este substituit cu altul avnd aceeai polaritate (Val Ile). Aceste substituii apar la aceeai protein dar de la specii diferite. Dac un aminoacid este gsit n aceeai poziie, el se numete reziduu invariabil i se consider c are un rol esenial n structura sau funciile proteinei. - Neconservative atunci cnd un aminoacid este substituit cu altul avnd polaritate diferit. Aceast substituie produce modificri severe n proprietile proteinei rezultate. n cazul substituiilor de aminoacizi au importan deosebit polaritile aminoacizilor, dar i volumul i aria suprafeei aminoacizilor.Nomenclatura peptidelorCH2H2N CO NH CHCH3COOH H2N CHCH3CO NH CH2COOHGlicil - alanin sau Gli - AlaAlanil - glicin sau Ala - GliDatorit posibilitilor de legare a acelorai aminoacizi n secvene diferite, peptidele pot prezenta fenomenul de izomerie de structur.Proprietile peptidelor Legtura peptidic este neionizat la orice pH de interes fiziologic. Formarea de peptide din aminoacizi la pH 7,4 este, prin urmare, acompaniat de pierderea unei sarcini pozitive i a uneia negative per legtur peptidic format. Peptidele sunt, totui, molecule ncrcate electric la pH-ul fiziologic datorit gruprilor lor C- i N-terminale i a altor grupri funcionale prezente n aminoacizii polari. Prin urmare, proprietile electrochimice ale peptidelor sunt similare cu ale aminoacizilor, fiecare peptid avnd un pH izoelectric (pI). Reacia biuretului cu sulfat de cupru n mediu bazic Determinarea constituiei peptidelorStabilirea felului aminoacizilor i proporiile n care acetia intr n constituia peptidelor

Hidroliza n cataliz acid se realizeaz cu HCl 6N la 110C, n tub nchis vidat, timp ndelungat (pn la 96 ore). n aceste condiii tot Trp, Cis i mare parte din cistin sunt distrui; Ser i Tre se recupereaz incomplet. Hidroliza n cataliz bazic, care distruge Ser, Tre, Arg i Cis i racemizeaz toi aminoacizii este utilizat pentru analiza Trp. Dup hidroliz, aminoacizii pot fi separai i identificai prin metode cromatografice (ex. cromatografie de schimb ionic automat sau HPLC). Urmeaz apoi operaia de determinare a secvenei lanurilor polipeptidice, aceasta ncepnd prin cunoaterea aminoacizilor terminaliDeterminarea aminoacidului N-terminal metoda Edman cu izotiocianat de fenil +NCSNNNH2RHHCHOOOOSNNCHCHHHHN NHC RCCCR'R'+H2OH+NHCHNH2CON NHSROCR'ni t romet anO metoda Sanger cu 2,4dinitrofluorbenzen +NO2F HHN CHRCOOH O2N O2NNO2NHCHRCOOHAminoacidul C-terminal+ cu sulfocianur de amoniu n mediu de acid acetic i anhidrid acetic (se formeaz 1acil2tiohidantoina peptidului care, tratat cu baze, elibereaz aminoacidul C-terminal sub form de 2tiohidantoin;+ cu hidrazin, ceea ce face s cliveze toate legturile peptidice, transformnd toate resturile de aminoacizi n aminoacid-hidrazide, cu excepia aminoacidului C-terminal care, eliberat ca aminoacid liber, se identific cromatografic.Pe cale enzimatic,- aminopeptidaze - carboxipeptidazePeptidele naturale mai importante Glutationul este o tripeptidic atipicGluCisGlioCH2CH2CH2CH2CO NSHH2N CH COOHCH CONHCOOH funcioneaz ca un sistem redox, prezint dou forme: redus (prescurtat GSH) i oxidat (prescurtat GSSG). particip la procese de oxido-reducere n majoritatea esuturilor (cu rol deosebit n hematii) i activator al multor sisteme enzimatice Oxidarea neenzimatic (n cataliza ionilor de cupru i fier). GSH + HSGGSSG + 2H+ + 2e Oxidare cu peroxizii aprui la nivel celular datorit proceselor oxidative normale sau favorizate de un numr de medicamente (glutation peroxidaza). glutation peroxidazaG-SH +R-OOH G-SS-G + R-OH + H2O Reducerea formei oxidate nu se poate face dect n prezena unei enzime glutation reductaza (NADPH - dependent). glutationul redus reprezint forma activ. Posibilitatea aceasta de interconversiune reprezint, de fapt, mecanismul de aciune al glutationului, care, putnd ceda i accepta hidrogen, face parte din categoria transportorilor neenzimatici de hidrogen. Glutationul, pe lng rolul de antioxidant celular mai ndeplinete i alte funcii: de depozit al cisteinei, de conjugare a unor compui n vederea eliminrii lor din organism, etc G-SS-G + NADPH + H+glutation reductaza2GSH + NADP+ Peptide cu rol hormonal hormonii hipofizei posterioare, ocitocina i vasopresina sunt nonapeptide ciclice. hormonii hipotalamici (factorii de eliberare sau de inhibare a eliberrii hormonilor hipofizari) sunt peptide mici, uneori cu structur modificat. Astfel TRH-ul este piroglutamilhistidilprolinamid. Hormonii importani ca insulina, parathormonul, ACTH-ul, calcitonina, au structur peptidic. Angiotensina II, cel mai puternic hormon hipertensiv, este un octapeptid. Endorfinele i encefalinele, substane endogene cu rol funcional i cu efect analgezic puternic Peptidele antibiotice sunt produse de microorganisme. Au o structur peptidic, deseori ciclic i pot conine i Daminoacizi (ex. gramicidina S este un decapeptid, atipic, ciclic; actinomicina D este format din dou pentapeptide; acidul 6aminopenicilanic, substana de baz a penicilinei i precursor pentru multe peniciline sintetice, este un dipeptid atipic).