0

PROPOSAL

PENELITIAN DOSEN PEMULA

UNIVERSITAS LAMPUNG

ANALISIS POLIMORFISME GEN DREB2 DAN

RESPON FISIOLOGIS PADI LOKAL LAMPUNG

TERHADAP CEKAMAN KEKERINGAN

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS ILMU PENGETAHUAN DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS LAMPUNG

2021

1

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI ...................................................................................................................... 1

RINGKASAN .................................................................................................................... 2

I. PENDAHULUAN ................................................................................................. 3

1.1. Latar Belakang ........................................................................................................ 3

1.2. Rumusan Masalah ................................................................................................... 5

1.3. Tujuan Penelitian .................................................................................................... 5

1.4. Manfaat Penelitian .................................................................................................. 5

II. TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................ 6

2.1. Tanaman Padi Di Indonesia ...................................................................................... 6

2.2. Kondisi dan Respon Kekeringan Pada Padi .............................................................. 6

2.3. Cekaman Kekeringan Pada Awal Musim Tanam ..................................................... 7

2.4. Polietilen Glikol (PEG) ............................................................................................. 7

2.5. Gen DREB2 ............................................................................................................... 7

2.6. Kadar Prolin dan Klorofil selama cekaman kekeringan ............................................ 8

2.8. Penelitian yang telah dilaksanakan sebelumnya ........................................................ 8

2.9. Road map Penelitian .................................................................................................. 9

III. METODE PENELITIAN ................................................................................... 10

3.1. Bagan Alir Penelitian (Fishbone Diagram) ............................................................ 10

3.2. Material Tanaman..................................................................................................... 10

3.3. Metode Penelitian ................................................................................................. 11

A. Pemberian Cekaman Kekeringan .......................................................................... 11

B. Analisis Respon Fisiologis ................................................................................... 11

C. Analisis Molekuler untuk pengujian polimorfisme gen DREB2 .......................... 13

D. Pembagian Tugas .................................................................................................. 14

IV. BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN ................................................................. 15

4.1. Anggaran Biaya ......................................................................................................... 15

4.2. Jadwal Kegiatan ........................................................................................................ 16

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................... 17

2

RINGKASAN

Pemanasan global yang terjadi saat ini mempengaruhi perubahan iklim dunia yang

berdampak pada penurunan produksi pangan. Peningkatan suhu menyebabkan stress bagi

tanaman dan menjadi faktor pembatas penting bagi produktivitas tanaman. Padi merupakan

tanaman pangan utama bangsa Indonesia. Ketahanan pangan jangka panjang harus menjadi

program penting dalam menjawab tantangan perubahan iklim.

Pencarian varietas baru yang dapat beradaptasi terhadap kenaikan suhu dan tahan

kekeringan dapat diawali dengan menggali potensi plasma nutfah padi lokal. Pengujian

toleransi plasma nutfah padi lokal bermanfaat dalam pegembangan padi tahan cekaman

kekeringan. Pemanfaatan plasma nutfah lokal juga bermanfaat dalam konservasi

sumberdaya genetik yang penting bagi pengembangan varietas baru dikemudian hari.

Berdasarkan hasil studi kami sebelumnya (Chrisnawati, 2020), diketahui bahwa Lampung

memiliki varietas padi lokal Lumbung Sewu Cantik yang banyak dibudidayakan pada

dataran tinggi dengan sedikit air. Akan tetapi, hingga saat ini publikasi mengenai pengujian

ketahanan kekeringan padi lokal tersebut belum tersedia.

Penelitian ini berjudul “Analisis Polimorfisme Gen DREB2 dan Respon Fisiologis Padi

Lokal Lampung Terhadap Cekaman Kekeringan”, merupakan tahap kedua dari penelitian

yang direncanakan mengarah kepada tema akhir Analisis Genetika dan Morfo-fisiologi

Toleransi Terhadap Cekaman Kekeringan pada Padi Lokal Lampung. Pada penelitian

tahap ini, dilakukan pengujian secara molekuler dengan melihat polimorfisme gen DREB2

padi Lumbung Sewu Cantik dengan padi pembanding dan analisis fisiologi untuk melihat

ketahanan kecambah padi lokal Lampung Lumbung Sewu Cantik terhadap cekaman

kekeringan. Hasil penelitian ini direncanakan akan diseminasikan pada seminar The

6th International Conference on Climate Change (ICCC) atau pada jurnal nasional SHINTA.

Analisis molekuler diawali dengan ekstraksi DNA yang telah dilakukan pada penelitian

sebelumnya (Chrisnawati, 2020) menggunakan GENEAID Genomic DNA Mini Kit.

Selanjutnya pada tahap kedua ini dilakukan amplifikasi DNA (PCR) menggunakan

pasangan primer DREB2 (F = 5'-CCT CAT TGG GTC AGG AAG AA-3 'dan R = 5'- GGA

TCT CAG CCA CCC ACT TA-3') dan PROMEGA GoTaq Flexi DNA Polymerase dengan

campuran untuk 25uL reaksi adalah 5 uL buffer 5X, 2 uL MgC12 25 mM, 0.5 uL dNTPs 10

mM, 0.5 uL primer forward 10 mM, 0.5 uL primer reverse 10 mM, 0.14 uL Taq Polymerase,

14.36 uL nuclease-free water, dan 2 uL DNA template, Suhu yang digunakan pada PCR

adalah initial denaturation 95°C- 5 menit, 35 siklus (denatiiration 94°C- 1 menit, annealing

59°C- 2 menit, elongation 72°C- 2 mQwW., final elongation 72°C- 10 menit, dan

dipertahankan pada suhu 14°C). Hasil PCR kemudian divisualisasi mengguanakan agarose

1% dalam TBE dan BIOTIUM Gel Red Nuicleid Acid Gel Stain pada sinar UV.

Analisis fisiologi dilakukan pada fase perkecambahan dengan pemberian cekaman PEG

(Poly Ethylene Glycol) 6000. Karakter yang diamati adalah kadar prolin, kadar air, dan

kadar klorofil. Penelitian dilakukan dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang disusun

secara faktorial dengan 2 faktor, dimana faktor utama adalah varietas padi yang terdiri dari

padi IR 64 (Kontrol Peka), padi Inpago 8 (Kontrol Toleran), dan padi Lumbung Sewu

Cantik. Sedangkan faktor kedua adalah konsentrasi PEG 6000 yang terdiri dari 2 taraf yaitu

kadar larutan PEG 0% dan kadar larutan PEG 20%. Kadar PEG 20% dipilih berdasarkan

penelitian sebelumnya (Chrisnawati, 2020). Setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak

3 kali sehingga didapat 18 satuan percobaan. Data hasil pengamatan dianalisis lanjut

menggunakan analisis ragam pada taraf a uji = 0.05 dan analisis lanjut menggunakan uji

Duncan’s Multiple Range Test (DMRT). Pengolahan data menggunakan program statistik

SPSS 22.

Keyword: Padi Lokal Lampung, gen DREB2, prolin, kadar air, klorofil, tahan kekeringan

3

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Tantangan besar yang dihadapi dunia saat ini dan di masa yang akan datang adalah

perubahan iklim (climate change) yang disebabkan oleh pemanasan global (global

warming). IPCC (Intergovermental Panel on Climate Change) melaporkan bahwa

peningkatan suhu rata-rata yang terjadi akhir-akhir ini berdampak pada penurunan

produksi pangan global. Sejalan dengan hal tersebut, Furuya dan Kayohama (2005)

melaporkan bahwa kenaikan temperatur dapat menyebabkan penurunan produksi padi

dunia. Hal ini tentunya menjadi tantangan besar bagi Indonesia, mengingat padi

menjadi sumber utama makanan pokok masyarakat.

Cekaman kekeringan yang diakibatkan oleh peningkatan suhu merupakan ancaman

besar untuk produksi beras di Indonesia. Hal ini disebabkan karena Padi (Oryza sativa

L.) sangat membutuhkan air selama masa pertumbuhannya. Selain itu, Padi yang

mendominasi luasan lahan sawah di Indonesia merupakan padi sawah tadah hujan

yang sangat tergantung pada ketersediaan air. Ketersediaan air yang kurang akan

berpengaruh pada morfologis, anatomi fisiologi, dan biokimia tanaman hingga

berimbas pada penurunan produksi padi.

Menjawab tantangan akan kekeringan di masa yang akan datang, maka diperlukan

strategi yang tepat yang berdampak pada ketahanan pangan jangka panjang hasil

interaksi antara adaptasi tanaman dan perubahan iklim. Pengembangan padi yang

tahan terhadap cekaman kekeringan adalah salah satu strategi yang dapat dilakukan

untuk menyesuaikan dengan peningkatan suhu global.

Pengembangan padi tahan cekaman kekeringan dapat diawali dengan pengujian

ketahanan plasma nutfah padi lokal. Berdasarkan hasil studi kami sebelumnya

(Chrisnawati, 2020), diketahui bahwa Lampung memiliki tiga varietas padi lokal

yang terdaftar dengan nama Lumbung Sewu Cantik, Sirenik, dan Ampai Merah. Salah

satu dari padi lokal tersebut yaitu varietas padi Lumbung Sewu Cantik merupakan padi

tahan kering yang banyak dibudidayakan pada dataran tinggi dengan sedikit air. Selain

itu, keunggulan dari padi ini adalah budidaya oleh petani lokal yang dilakukan tanpa

pemupukan tetapi mampu menghasilkan ±3,8 ton/ha GKP (Gabah Kering Panen)

4

(Berita PVT, 2018). Akan tetapi, hingga saat ini publikasi ilmiah mengenai pengujian

ketahanan kekeringan padi lokal tersebut belum tersedia. Padahal penggalian potensi

ketahanan plasma nutfah padi lokal sangat bermanfaat dalam konservasi sumber daya

genetik yang dapat digunakan dalam pengembangan varietas baru tahan cekaman

kekeringan.

Pengembangan padi tahan cekaman kekeringan membutuhkan waktu yang lama dan

biaya yang besar karena melalui serangkaian tahapan seleksi. Oleh sebab itu,

diperlukan metode seleksi cepat yang lebih murah dan efisien untuk mendapatkan

informasi awal mengenai genotipe toleran. Penapisan toleransi kekeringan di fase

perkecambahan menggunakan poly ethilen glygol (PEG) menjadi salah satu cara yang

sering digunakan (Widyastuti et al., 2016). PEG bersifat mempertahankan potensial

osmotik sehingga dapat digunakan sebagai pembatas kadar air pada medium

perkecambahan (Widoretno, 2011). Seleksi pada tahap perkecambahan benih dan

pertumbuhan bibit sangat penting karena merupakan salah satu tahapan paling kritis

sehingga kekeringan dapat menjadi pembatas pertumbuhan tanaman (Faisal et al.,

2019). Studi kami sebelumnya (Chrisnawati, 2020) memperlihatkan bahwa PEG

6000 dengan konsentrasi 20% dapat memberikan kondisi kekeringan pada kecambah

padi Lumbung Sewu Cantik.

Evaluasi karakter yang berkontribusi terhadap pertumbuhan dan strategi adaptasi padi

terhadap kekeringan menjadi penting dalam pemuliaan padi. Pendekatan morpho-

physiology dan genetika dapat digunakan untuk melakukan seleksi padi lokal yang

tahan kekeringan. Tanaman dapat menginisiasi bermacam-macam perubahan

morfologi dan fisiologi untuk bertahan dalam kondisi cekaman.

Penelitian ini merupakan tahap kedua dari penelitian yang direncanakan yang mengarah

kepada tema akhir Analisis Genetika dan Morfo-fisiologi Toleransi Terhadap

Cekaman Kekeringan pada Padi Lokal Lampung. Pada penelitian tahap kedua ini,

akan dilakukan pengujian secara molekuler dengan melihat polimorfisme gen DREB2

padi Lumbung Sewu Cantik. Gen DREB2 dipilih karena telah terbukti berperan dalam

pembentukan toleransi kekeringan pada padi (Bihani, 2011) dan pada gandum

(Eftekhari, 2017). Pada penelitian ini juga dilakukan analisis fisiologi untuk melihat

ketahanan kecambah padi lokal Lampung Lumbung Sewu Cantik terhadap kekeringan

melalui pengukuran kadar prolin, kadar air, dan klorofil.

5

1.2. Rumusan Masalah

Permasalahan yang dikemukakan adalah: (1) Bagaimanakah polimorfisme gen

DREB2 pada padi lokal Lampung Lumbung Sewu Cantik jika dibandingkan dengan

genotype toleran kekeringan (Inpago 8) dan genotype peka (IR 64)?; (2) Bagaimana

kadar prolin, kadar air, dan kadar klorofil padi lokal Lampung Lumbung Sewu Cantik

di bawah cekaman kekeringan pada fase perkecambahan jika dibandingkan dengan

genotype toleran kekeringan (Inpago 8) dan genotype peka (IR 64)?

1.3. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah: (1) Mengetahui profil gen DREB2 pada padi lokal

Lampung Lumbung Sewu Cantik jika dibandingkan dengan genotype toleran

kekeringan (Inpago 8) dan genotype peka (IR 64); (2) Menganalisis aspek fisiologi

(kadar prolin, air, dan klorofil) ketahanan kekeringan kecambah padi lokal Lampung

Lumbung Sewu Cantik jika dibandingkan dengan genotype toleran kekeringan

(Inpago 8) dan genotype peka (IR 64).

1.4. Manfaat Penelitian

Penelitian ini merupakan tahapan awal dalam menggali potensi ketahanan plasma

nutfah padi lokal Lampung terhadap cekaman kekeringan. Hingga saat ini publikasi

mengenai padi lokal Lampung belum tersedia. Penggalian potensi plasma nutfah padi

lokal bermanfaat dalam penyediaan sumber daya genetik untuk pegembangan

varietas baru dikemudian hari dalam membangun ketahanan pangan jangka panjang

yang beradaptasi dengan tantangan pemanasan global (global warming). Plasma

nutfah lokal juga dipertimbangkan karena adaptasinya yang baik pada lingkungan

lokal. Pengkajian morfo-fisiologi dan genetika penting dilakukan untuk mendapatkan

data yang lengkap dalam menggambarkan karakter fenotip dan genotip yang

beradaptasi pada cekaman.

6

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tanaman Padi Di Indonesia

Padi (Oryza sativa L.) merupakan sumber makanan pokok sebagian besar negara Asia.

Padi dibudidayakan di lokasi ekologis yang bervariasi termasuk sawah dengan irigasi,

sawah tadah hujan, dan tadah hujan dataran tinggi (Kumar, 2012). Di Indonesia,

terdapat varietas padi lokal yang sangat bervariasi karena beradaptasi dengan kondisi

lingkungan yang beragam. Pemuliaan padi di International Rice Research Institute

(IRRI) memanfaatkan padi lokal Indonesia tropical japonica untuk menghasilkan

varietas new plant type (NPT) yang memiliki sedikit anakan, batang yang lebih tebal,

malai yang besar untuk memberikan produksi yang lebih tinggi (Peng et al., 2008).

Badan Litbang Pertanian Indonesia telah melepas 200 lebih NPT padi dengan

karakteristik yang beragam. Walaupun beberapa varietas lokal telah digunakan dalam

pemuliaan tanaman, masih banyak plasma nutfah padi tradisional Indonesia yang

belum dikarakterisasi dan kurang dimanfaatkan seperti halnya padi lokal Lampung.

2.2. Kondisi dan Respon Kekeringan Pada Padi

Air merupakan komponen penting penyusun jaringan tanaman yang aktif melakukan

proses fisiologis dan berfungsi menjaga turgiditas sel. Kondisi kekurangan air pada

jaringan tanaman akan mengakibatkan terganggunya proses metabolisme tanaman

sehingga mengganggu pertumbuhan (Lestari, 2005). Perubahan iklim (climate

changes) berpengaruh terhadap siklus musim. Dugaan pergantian musim kemarau ke

musim hujan atau sebaliknya tidak dapat dilakukan secara tepat. Perubahan iklim juga

berdampak pada potensi lahan karena mengalami cekaman kekeringan. Hal tersebut

berdampak terhadap penurunan hasil atau kegagalan panen (Nugroho, 2013).

Dalam siklus hidup tanaman, mulai dari perkecambahan sampai panen, tanaman selalu

membutuhkan air. Tidak satupun proses metabolisme tanaman dapat berlangsung

tanpa air. Besarnya kebutuhan air setiap fase pertumbuhan selama siklus hidupnya

tidak sama. Hal ini berhubungan langsung dengan proses fisiologis, morfologis dan

kombinasi kedua faktor di atas dengan faktor-faktor lingkungan. Kebutuhan air pada

tanaman dapat dipenuhi melalui penyerapan oleh akar. Besarnya air yang diserap oleh

akar tanaman sangat bergantung pada kadar air dalam tanah yang ditentukan oleh

7

kemampuan partikel tanah menahan air dan kemampuan akar untuk menyerapnya

(Jumin, 1992).

Kekurangan air akan mengganggu aktivitas fisiologis maupun morfologis, sehingga

mengakibatkan terhentinya pertumbuhan. Defisiensi air yang terus menerus akan

menyebabkan perubahan irreversibel bagi tanaman dipengaruhi oleh beberapa faktor

antara lain jenis tanaman dalam hubungannya dengan tipe dan perkembangannya,

kadar air tanah dan kondisi cuaca (Fitter dan Hay, 1994).

2.3. Cekaman Kekeringan Pada Awal Musim Tanam

Awal pertumbuhan tanaman padi dikenal dengan fase vegetatif, pada fase ini

penggunaan air dalam proses metabolism lebih cenderung digunakan untuk proses

transpirasi dan untuk memproduksi bahan kering. Selanjutnya untuk perkembangan

daun dan perluasan daun serta pembentukan anakan. Pada fase ini tanaman padi

sangat sensitive terhadap kekurangan air, dan ini merupakan proses utama yang akan

dihambat apabila terjadi kekurangan air (Fiscer & Fukai, 2003). Untuk itu penting

dilakukan skrining padi di masa perkecambahan untuk melihat toleransinya terhadap

cekaman lingkungan.

2.4. Polietilen Glikol (PEG)

Polietilen Glikol (PEG) dengan berat molekuler tinggi telah lama digunakan untuk

menstimulasi cekaman kekeringan pada tanaman. PEG digunakan sebagai pengatur

osmotik yang dapat menurunkan potensial air pada larutan nutrient, tanpa diserap oleh

tanaman serta tidak bersifat toksik (Mazumder dan Sharma, 2009).

2.5. Gen DREB2

Gen DREB2 berperan penting dalam regulasi kekeringan. Pada tanaman mutan

Arabidopsis thaliana, overekspresi OsDREB2 secara nyata meningkatkan toleransi

terhadap cekaman kekeringan dan heat shock (Matsukura, 2010). DREBs menjadi

salah satu gen penting yang digunakan dalam perbaikan tanaman toleran kekeringan

melalui rekayasa genetika maupun melalui strategi pemuliaan tanaman (plant

breeding). Hal ini karena gen tersebut merupakan Faktor transkripsi utama yang

mengikat elemen kerja cis dari sebagian besar gen penyebab stres osmotik yang

bertanggung jawab untuk memberikan osmotoleransi pada tanaman dalam kondisi

stress (Hussain, 2011). DREB dipertimbangkan sebagai kandidat gen dan penanda

8

fungsional yang tepat untuk MAS (Marker Assisted Selection) dan alel mining dalam

program pemuliaan tanaman untuk mengembangkan varietas tanaman unggul yang

toleran kekeringan (Lata, 2011).

2.6. Kadar Prolin dan Klorofil selama cekaman kekeringan

Prolin adalah osmoprotektan yang diproduksi tanaman dalam jumlah yang relatif di

bawah cekaman abiotik (Ashraf, 2007) seperti cekaman kekeringan (Sperdouli, 2012).

Prolin berfungsi dalam stabilisasi protein dan membran, osmoprotektan, dan

pembersihan radikal bebas (Aggarwal, 2010; Ben Ahmed,2010). Beberapa penelitian,

menunjukkan bahwa aplikasi prolin eksogen dapat mengurangi efek berbahaya dari

tekanan lingkungan seperti kekeringan (Ashraf, 2007). Kadar prolin yang meningkat

selama cekaman kekeringan mengindikasikan bahwa tanaman tersebut toleran

kekeringan. Selain kadar prolin, kadar klorofil yang tinggi juga dikaitkan dengan

toleransi tanaman terhadap stress lingkungan (Sairam, 1994). Hilangnya klorofil

merupakan konsekuensi negatif dari tekanan tersebut (Sarani, 2014). Pengukuran

kadar klorofil dapat mendeteksi gangguan fotosintesis yang disebabkan oleh tekanan

lingkungan (Jedmowski, 2015). Oleh sebab itu, pengukuran karakter ini penting untuk

melihat bagaimana efek kekeringan terhadap kemampuan fotosintesis tanaman.

2.7. State of The Art

Jurnal yang membahas tentang kajian terhadap padi lokal Lampung belum tersedia.

Melalui penelitian ini, peneliti menggali potensi plasma nutfah padi lokal Lampung

sebagai upaya penyediaan sumberdaya genetik pengembangan varietas baru tahan

kekeringan. Peneliti menggunakan pendekatan fisiologi dan molekuler untuk

melakukan pengujian ketahanan kekeringan pada padi lokal Lampung.

2.8. Penelitian yang telah dilaksanakan sebelumnya

Penelitian ini diawali dengan penelitian tahap awal dengan Judul “Ekstraksi DNA dan

Skrining awal toleransi cekaman kekeringan pada padi lokal Lampung”. Studi diawali

dengan melakukan survey tentang padi lokal Lampung. Berdasarkan survey ini

ditemukan bahwa Lampung memiliki tiga varietas padi lokal yang terdaftar dengan

nama Lumbung Sewu Cantik, Sirenik, dan Ampai Merah. Padi yang menjadi fokus

studi saat ini adalah Lumbung Sewu Cantik yang biasa ditanam masyarakat pada

dataran tinggi dengan kebuthan air yang sedikit. Selanjutnya, dilakukan ekstraksi

DNA padi Lumbung Sewu Cantik sebagai langkah awal dalam melakukan pengujian

9

molekuler yang akan dilakukan pada penelitian tahap kedua ini. Pada penelitian

sebelumnya juga telah dilakukan seleksi konsentrasi PEG 6000 yang akan digunakan

pada penelitian tahap kedua ini. Berdasarkan pengujian karakter morfologi kecambah

padi Lumbung Sewu Cantik pada PEG 6000 10% dan 20%, diketahui bahwa PEG

6000 dengan konsentrasi 20% mampu memberikan kondisi kekeringan pada padi

Lumbung Sewu Cantik untuk pengujian skala laboratorium.

2.9. Road map Penelitian

Penelitian ini merupakan tahap kedua (berwarna kuning pada tabel peta jalan

penelitian) dengan tujuan akhir mengetahui aspek genetika dan morfo-fisiologi Padi

Lokal Lampung Lumbung Sewu Cantik dibawah cekaman kekeringan.

Tahapan

Goal

Tahap I (Th. 2020) Tahap II (Th. 2021) Tahap III (Th. 2022)

Tem

a

Ekstraksi DNA dan

Skrining awal toleransi

cekaman kekeringan pada

padi lokal Lampung

Respon fisiologis padi lokal

Lampung dibawah cekaman

kekeringan dan analisis

polimorfisme Gen DREB2 pada

padi lokal Lampung

Analisis karakter anatomi

padi lokal Lampung di

bawah cekaman

kekeringan dan analisis

Sekuense Gen DREB2

Gen

etik

a d

an

Mo

rfo

-fis

iolo

gi

To

lera

nsi

Ter

had

ap

Cek

am

an

Kek

erin

ga

n

pa

da

Pad

i L

ok

al

La

mp

un

g

Keg

iata

n

Survei padi lokal Lampung Pengujian

cekaman

kekeringan

pada fase

perkecambahan

pada skala

laboratorium

untuk analisis

fisiologi

Pengujian

polimorfisme

Gen DREB2

untuk melihat

toleransi

cekaman

kekeringan

secara

molekuler

Pengamatan

anatomi

dibawah

cekaman

kekeringan

Analisis

sekuense

gen

DREB2 Skrining awal

toleransi

kekeringan

tahap

perkecambahan

dengan PEG

6000 (0%, 10%,

20%)

Isolasi

DNA

Ou

tpu

t

Persentase PEG

dan karakter

morfologi untuk

seleksi secara

cepat toleransi

cekaman

kekeringan

Ekstrak

DNA

dengan

purifitas

yang

baik

Respon

fisiologis yaitu

kadar air,

prolin, dan

klorofil.

Profil

fragmen pita

DNA gen

DREB2

Gambaran

anatomi

penampang

akar, batang,

dan stomata

daun

Sekuense

gen

DREB2

Rencana Selanjutnya

Potensi ketahanan plasma nutfah padi lokal Lampung terhadap stres biotik dan abiotic

Penelitian Pemula Penelitian Pemula Penelitian Dasar

10

III. METODE PENELITIAN

3.1. Bagan Alir Penelitian (Fishbone Diagram)

Gambar. Fishbone penelitian

3.2. Material Tanaman

Material tanaman yang digunakan adalah padi lokal Lampung Lumbung Sewu Cantik

yang diperoleh dari daerah lereng bukit Kecamatan Pardasuka Kabupaten Pringsewu

Lampung, Inpago 8 sebagai kontrol tahan kekeringan yang diperoleh dari Balai Besar

Penelitian Tanaman Padi (BB Padi), dan IR 64 sebagai kontrol peka.

Respon fisiologis padi lokal Lampung dibawah

cekaman kekeringan dan analisis polimorfisme gen

DREB2 pada padi lokal Lampung

Lab

Bo

tani

FM

IPA

UN

ILA

Lab

Bo

tani

LIP

I

Cib

inong

Keg

iata

n

Ind

ikato

r Cap

aian

Output

11

3.3. Metode Penelitian

A. Pemberian Cekaman Kekeringan

Sterilisasi Benih

Benih dari masing-masing varietas dipilih yang mempunyai ukuran seragam, lalu di

oven selama 72 jam pada suhu 43oC. Kemudian dimasukkan ke dalam desikator

selama ± 30 menit.

Seleksi Benih

Benih direndam dalam beaker glass berisi aquades selama 24 jam. Benih yang

tenggelam diambil sedangkan benih yang mengapung dibuang. Benih yang telah

diseleksi kemudian dikecambahkan.

Perkecambahan Benih

Perkecambahan benih menggunakan metode Uji Kertas Digulung Didirikan dalam

Plastik (UKDdp). Kertas buram yang sudah dibasahi aquades diletakan di atas plastik

PE, kemudian sebanyak 50 benih disusun secara zigzag di atas kertas buram tersebut.

Benih ditutup kembali dengan kertas buram basah dan digulung. Inkubasi selama 48

jam dalam germinator.

Pemberian Larutan PEG 6000

Pemberian larutan PEG 6000 dilakukan dengan metode Uji Kertas Digulung Didirikan

dalam Plastik (UKDdp). Kertas buram dibasahi dengan larutan PEG 6000 sesuai

dengan konsentrasi yang dibutuhkan. Sebanyak 30 kecambah yang memiliki ukuran

plumula dan radikula ± 2 mm yang seragam dipindahkan dari kertas gulung

sebelumnya. Kecambah disusun secara zigzag di atas kertas buram yang telah dibasahi

PEG 6000. Benih ditutup kembali dengan kertas buram basah dan digulung. Setiap

gulungan kertas dilebel notasi perlakuan dan ulangan. Inkubasi di dalam germinator

selama ± 7 hari.

B. Analisis Respon Fisiologis

Uji Kandungan Prolin

Pengukuran akumulasi prolin dilakukan dengan menggunakan metode asam

ninhidrin.

a. Pembuatan Ekstrak Sampel

12

Sebanyak 0,5 g sampel daun segar digerus hingga halus dalam mortar yang diberi

larutan sulfosalisilat 3% sebanyak 10 ml, kemudian disaring dengan kertas filter

Whatman no. 1.

b. Pembuatan Larutan Ninhidrin

Larutan asam ninhidrin dibuat dengan memanaskan 1,25 g ninhidrin dalam 30 ml

asam asetat glasial dan 20 ml asam fosfat hingga larut.

c. Pengukuran Kandungan Prolin

Sebanyak 2 ml filtrat sampel direaksikan dengan 2 ml asam ninhidrin dan 2 ml

asam asetat glasial dalam tabung reaksi pada suhu 100°C selama 1 jam. Reaksi

diakhiri dengan memasukkan tabung reaksi ke dalam beaker glass yang berisi es.

Kemudian campuran diekstraksi dengan 4 ml toluen, lalu digojog dengan vortex

selama 15-20 detik sehingga terbentuk dua lapisan cairan yang terpisah. Toluene

yang berwarna merah yang mengandung prolin terletak di bagian atas. Larutan

bagian atas disedot menggunakan pipet, untuk diukur kadar prolinnya dengan

spektrofotometer, absorbansi dibaca pada panjang gelombang 520 nm.

Kadar prolin dihitung menggunakan rumus :

Kadar Prolin =

𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛

𝑚𝑙 × 𝑚𝑙 𝑡𝑜𝑙𝑢𝑒𝑛 ( 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙)

(115,13𝜇 𝑔𝑟𝑎𝑚

𝑚𝑜𝑙) (5)

Pengukuran Kadar Air Relatif

Kandungan air relatif kecambah padi dihitung dengan rumus :

Kadar Air Relatif = 𝑀1−𝑀2

𝑀1 × 100%

Keterangan :

M1 = Berat segar kecambah

M2 = Berat kering kecambah

Pengukuran Kadar Klorofil Total

Sebanyak 0,1 gram sampel daun padi untuk tiap perlakuan digerus menggunakan

mortar sampai halus. Kemudian ditambahkan 10 ml etanol 96 % v/v. Ekstrak disaring

dengan kertas Whatman No.1 ke dalam flakon lalu ditutup rapat. Larutan ekstrak

sampel diambil sebanyak 1 mL dimasukkan dalam kuvet. Selanjutnya dilakukan

pembacaan serapan dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang (λ) 648 nm

dan 664 nm.

13

Kadar klorofil dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :

Chltotal = 15,24 A648 + 22,24 A664 mg/L(𝑉

𝑊 ×1000)

Chla = 13,36 A664 – 5,19 A648 mg/L (𝑉

𝑊 ×1000)

Chlb = 27,43 A648 – 8,12 A664 mg/L (𝑉

𝑊 ×1000)

Keterangan :

Chltotal = Klorofil total

Chla = Klorofil a

Chlb = Klorofil b

A664 = Absorbansi pada panjang gelombang 664 nm

A648 = Absorbansi pada panjang gelombang 648 nm

V = Volume etanol 96%

W = Berat daun

Analisis data pengujian fisiologi

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang disusun secara

faktorial dan terdiri dari 2 faktor, dimana faktor utama adalah varietas padi (A) yang

terdiri dari padi IR 64 (Kontrol Peka), padi Inpago 8 (Kontrol Toleran), dan padi

Lumbung Sewu Cantuk. Sedangkan faktor kedua adalah konsentrasi PEG 6000 (B)

yang terdiri dari 2 taraf yaitu kadar larutan PEG 0% dan kadar larutan PEG 20%.

Setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 3 kali sehingga didapat 18 satuan

percobaan. Data hasil pengamatan dianalisis lanjut menggunakan analisis ragam pada

taraf a uji = 0.05 dan analisis lanjut menggunakan uji Duncan’s Multiple Range Test

(DMRT). Pengolahan data menggunakan program statistic SPSS 22.

C. Analisis Molekuler untuk pengujian polimorfisme gen DREB2

Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan GENEAID Genomic DNA Mini Kit. Amplifikasi

DNA (PCR) dilakukan menggunakan pasangan primer DREB2 (F = 5'-CCT CAT TGG GTC

AGG AAG AA-3 'dan R = 5'- GGA TCT CAG CCA CCC ACT TA-3') dan PROMEGA

GoTaq Flexi DNA Polymerase dengan campuran untuk 25uL reaksi,: 5 uL buffer 5X, 2 uL

MgC12 25 mM, 0.5 uL dNTPs 10 mM, 0.5 uL primer forward 10 mM, 0.5 uL primer reverse

10 mM, 0.14 uL Taq Polymerase, 14.36 uL nuclease-free water, dan 2 uL DNA template,

Suhu yang digunakan pada PCR adalah initial denaturation 95°C- 5 menit, 35 siklus

14

(denatiiration 94°C- 1 menit, annealing 59°C- 2 menit, elongation 72°C- 2 mQwW., final

elongation 72°C- 10 menit, dan dipertahankan pada suhu 14°C). Hasil PCR kemudian

divisualisasi mengguanakan agarose 1% dalam TBE dan BIOTIUM Gel Red Nuicleid Acid

Gel Stain pada sinar UV.

D. Pembagian Tugas

No Nama Tim Peneliti Kegiatan

1 Mahasiswa didampingi ketua

penelitian

Persiapan alat dan bahan

2 Mahasiswa didampingi ketua

penelitian

Perkecambahan dan pemberian cekaman

kekeringan pada skala laboratorium dengan PEG

6000 20%

3 Mahasiswa didampingi ketua

dan anggota penelitian

Pengukuran kadar klorofil dan kadar air relatif

untuk pengujian fisiologi

4 Mahasiswa didampingi ketua

penelitian dan anggota

penelitian

Analisis data fisiologi

5 Ketua peneliti Mempersiapkan primer gen DREB2 untuk

amplifikasi PCR

6 Ketua peneliti dan anggota

penelitian

Amplifikasi PCR menggunakan primer gen DREB2

pada padi Lumbung Sewu Cantik, IR64 (kontrol

negatif) dan Inpago 8 (control positif)

7 Ketua penelitian dan

Anggota penelitian 1 dan 2

Analis data molekuler

8 Mahasiswa didampingi

anggota penelitian 1 dan 2

Publikasi dan penulisan skripsi mahasiswa

yang terlibat

9 Ketua penelitian dan

Seluruh anggota tim

Penulisan laporan penelitian dan keuangan

15

IV. BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN

4.1. Anggaran Biaya

Bahan dan Alat Penelitian

N Nama bahan Vol Biaya (Rp)

1 Primer gen DREB2 forward reverse 1 Paket 750.000

2 Toluena Teknis 98% 1L 500.000

3 Ninhidrin 10gr 750.000

4 Isopropanol lL 120.000

5 Etanol 500ml 250.000

6 Analisis PCR 3 Sampel 3.600.000

7 Nitrogen Cair 5 ltr 100.000

8 Benih Padi 3 Paket 200.000

9 Bak Tanam 10 Buah 300.000

10 Kapas 2 paket 30.000

11 Media Tanam 1 Paket 50.000

12 PEG 6000 1000g 800.000

13 Cawan Petri Plastik 10 Buah 300.000

14 Kertas Saring 1 Paket 50.000

15 Kertas Gulung 3 Gulung 50.000

Sub Total 7.850.000

Biaya Perjalanan

No. Uraian Kegiatan Volume Biaya (Rp)

1 Biaya perjalanan pengambilan sampel

3 Kegiatan 1.000.000

2 Protokol Kesehatan 1 Paket 150.000

Sub Total 1.150.000

Alat Tulis Kantor

No. Uraian Kegiatan Volume Biaya (Rp)

1 Dokumentasi 1 kegiatan 500.000

1. Alat Tulis 1 Kegiatan 500.000

3 Penggaris Besi 2 Buah 50.000

4 Millimeter Block 2 Buah 100.000

5 Gunting 2 Buah 50.000

6 Tinta Printer 4 Warna 1.000.000

16

7 Pembuatan Label dan Patok 1 Kegiatan 300.000

Sub Total 2.500.000

Laporan/Diseminasi/Publikasi

No. Uraian Kegiatan Volume Biaya (Rp)

1 Laporan akhir dan keuangan 1 kegiatan 500.000

2 Diseminasi dan publikasi 1 kegiatan 3.000.000

Sub Total 3.500.000

Jumlah Total

Bahan dan Alat Penelitian : Rp. 7.850.000

Biaya Perjalanan : Rp. 1.150.000

Alat Tulis Kantor : Rp. 2.500.000

Laporan/Diseminasi/Publikasi : Rp. 3.500.000

Total Rp. 15.000.000

4.2. Jadwal Kegiatan

Jadwal pelaksanaan penelitian disajikan selengkapnya pada tabel berikut:

Kegiatan Bulan ke

1 2 3 4 5 6

Persiapan alat dan bahan

Persiapan benih padi

Perkecambahan dan pemberian cekaman kekeringan

pada skala laboratorium dengan PEG 6000 20%

Pengukuran kadar klorofil dan kadar air relatif untuk pengujian fisiologi

Analisis data fisiologi

Mempersiapkan primer gen DREB2 untuk amplifikasi

PCR

Amplifikasi PCR menggunakan primer gen DREB2

pada padi Lumbung Sewu Cantik, IR64 (kontrol

negatif) dan Inpago 8 (control positif)

Analis data molekuler

Penulisan publikasi

Penulisan laporan penelitian dan keuangan

17

DAFTAR PUSTAKA

Aggarwal M, Sharma S, Kaur N, Pathania D, Bhandhari K, Kaushal N, Kaur R, Singh K,

Srivastava A, Nayyar H. 2010. Exogenous proline application reduces phytotoxic

effects of selenium by minimising oxidative stress and improves growth in bean

(Phaseolus vulgaris L.) seedlings. Biol Trace Elem Res. 140(3):354-67. doi:

10.1007/s12011-010-8699-9.

Ashraf M., Foolad M.R. 2007. Roles of glycine betaine and proline in improving plant

abiotic stress resistance. Environ. Exp. Bot. 59:206–216. doi:

10.1016/j.envexpbot.2005.12.006.

Ben Ahmed C, Ben Rouina B, Sensoy S, Boukhriss M, Ben Abdullah F. 2010. Exogenous

proline effects on photosynthetic performance and antioxidant defense system of

young olive tree. J Agric Food Chem. 58(7):4216-22. doi: 10.1021/jf9041479.

Berita Resmi PVT. 2018. Pendaftaran varietas Lokal Lumbung Sewu Cantik. Diakses

15/2/2021 Tersedia di http://pvtpp.setjen.pertanian.go.id/cms2017/berita-

resmi/pendaftaran-varietas-lokal/padi-lumbung-sewu-cantik/

Bihani P, Char B, Bhargava S. 2011. Transgenic expression of sorghum DREB2 in rice

improves tolerance and yield under water limitation. The Journal of Agricultural

Science, 149, 95-101.

Chrisnawati L, Ernawiati E, Yulianty. 2020. Ekstraksi DNA dan Skrining Awal Toleransi

Cekaman Kekeringan Pada Padi Lokal Lampung (Penelitian : unpublish)

Chrisnawati L, Ernawiati E, Yulianty. 2020. Penapisan Toleransi Kekeringan Padi Lokal

Lampung Pada Fase Perkecambahan. Jurnal biologi udayana. 25(1): in press

Eftekhari A, Baghizadeh MM, Yaghoobi R, Abdolshahi. 2017. Differences in the drought

stress response of DREB2 and CAT1 genes and evaluation of related physiological

parameters in some bread wheat cultivars, Biotechnology & Biotechnological

Equipment, 31:4, 709-716, DOI: 10.1080/13102818.2017.1316214

Faisal, S., Mujtaba, S.M., Asma et al. 2019. Polyethylene Glycol Mediated Osmotic Stress

Impacts on Growth and Biochemical Aspects of Wheat (Triticum aestivum L.). J.

Crop Sci. Biotechnol.22, 213–223. https://doi.org/10.1007/s12892-018-0166-0

Fischer KS, Lafitte R, Fukai S, Atiin G, Hardy B. 2003. Breeding Rice for Drought Prone

Environment. International Rice research institute. Los Banos. P98.

Fitter AH, Hay RKM. 1994. Fisiologi Lingkungan Tanaman. Penerjemah : Sri Andani dan

E.D. Purbayanti. Gadjah Mada University Press. hal421.

Furuya J,Koyama, O. 2005. Impacts of climatic change on world agricultural product

markets: Estimation of macro yield functions. JARQ, 39(2): 121–134.

Hussain SS, Kayani MA, Amjad M. 2011. Transcription factors as tools to engineer

enhanced drought stress tolerance in plants. Biotechnol Prog. 27(2):297-306. doi:

10.1002/btpr.514.

Jedmowski C, Ashoub A, Momtaz O, Brüggemann W. 2015. Impact of Drought, Heat , and

Their Combination on Chlorophyll Fluorescence and Yield of Wild Barley ( Hordeum

spontaneum ). Journal of Botani. 2015: 1-9

Jumin HB. 1992. Ekologi Tanaman Suatu Pendekatan Fisiologi,Rajawali Press,Yogyakarta

18

Kumar. 2012. Breeding rice for drought tolerance and adaptation to climate

change.International Rice Research Institute, Philipines.

Lata C, Prasad M. 2011. Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants.

J Exp Bot. 62(14):4731-48. doi: 10.1093/jxb/err210.

Lestari, EG. 2005 Hubungan antara Kerapatan Stomata dengan Ketahanan Kekeringan pada

Somaklon Padi Gajahmungkur, Towuti, dan IR 64. Biodiversitas 7: 44-48

Matsukura S, Mizoi J, Yoshida T, Todaka D, Ito Y, Maruyama K, Shinozaki K, Yamaguchi-

Shinozaki K. 2010. Comprehensive analysis of rice DREB2-type genes that encode

transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes. Mol

Genet Genomics. 283(2):185-96. doi: 10.1007/s00438-009-0506-y.

Mazumder, Sharma. 2009. Proline, catalase and root traits as indices of drought resistance

in bold grained rice (Oryza sativa) genotypes. African Jounal of Biotechnology, 8(23),

6521-6528

Nugroho CA. 2013. Pengaruh cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan bibit tanaman.

Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya

Peng S, Khush GS, Virk P, Tang Q, Zou Y. 2008. Progress in ideotype breeding to increase

rice yield potential. Field Crops Research 108, 32–38

Sairam RK. 1994. Effect of moisture stress on physiological activities of two contrasting

wheat genotypes. Indian J. Exp. Biol., 32: 594–597

Sarani M, Namrudi M, Hashemi SM, Mahdi M. 2014. The effect of drought stress on

chlorophyll content, root growth, glucosinolate and proline in crop plants.

International Journal of Farming and Allied Sciences, 3(9), pp.1997–2000.

Sharma AD, Gill PK, Singh P. 2002. DNA isolation from dry and fresh samples of

polysaccharide-rich plants. Plant Mol Biol Rep 20, 415 .

https://doi.org/10.1007/BF02772129

Sperdouli I, Moustakas M. 2012. Interaction of proline, sugars, and anthocyanins during

photosynthetic acclimation of Arabidopsis thaliana to drought stress. J Plant Physiol.

169(6):577-85. doi: 10.1016/j.jplph.2011.12.015.

Widoretno, W. 2011. Skrining untuk toleransi terhadap stres kekeringan pada 36

varietas kedelai pada fase perkecambahan. Berk Penel Hayati 16: 133-142.

(2)

Widyastuti Y, et al. 2016. Identifikasi Toleransi Kekeringan Tetua Padi Hibrida pada Fase

Perkecambahan Menggunakan Polietilen Glikol (PEG) 6000. Indonesian Journal of

Agronomy. 44 (3):235-241, doi:10.24831/jai.v44i3.13784.