Prof. Theodor Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt/Main Gentechnik und Arzneimittel 2. GEHE Forum

Prof. Theodor DingermannInstitut für Pharmazeutische BiologieJohann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt/Main

Gentechnik und Arzneimittel

2. GEHE Forum Pharmaceuticum

GEN-ial?Welche Chancen und Risiken birgtdie Entschlüsselung des menschlichen Genoms? 16.6.2001

Theodor Dingermann


Informationsinhalt und Interaktions-mechanismen zwischen Nukleinsäuren sind

UNIVERSELL

MenschMaus

Fisch

PflanzeProtozoon

Bakterium

Phage

ACGT


Die Kontrolle des Abrufens der genetischen Information ist

SPEZIFISCH

MenschMaus

Fisch

PflanzeProtozoon

Bakterium

Phage


"genetic engineering"

TransgenerOrganismus

Ziel-organis-

mus

Quell-organis-

mus

Kontrollregionen Informationseinheit

Herstellung eines rekombinanten Proteins

Extraktion undReinigung


DefinitionDNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte werden durch genetische Modifikation hergestellt, bei der die kodierende DNA für das benötigte Produkt gewöhnlich mit Hilfe eines Plasmids oder viralen Vektors in einen geeigneten Mikroorganismus oder eine geeignete Zellinie eingeführt wird, in denen diese DNA exprimiert und in Protein translatiert wird. Das gewünschte Produkt wird dann durch Extraktion und Reinigung gewonnen.

DNA-rekombinationstechnisch hergestellte ProdukteProducta ab ADN recombinante


Escherichia coliSaccharomyces cerevisiaeCHO-ZellenBHK-Zellen

MäusezelllinienMyelomzellenmurin-humane Hybridomzellen

Verwendete Produktionszellen


E. coli oder Hefe

CHO-Zellen oder BHK-Zellen

komplex,glykosyliert

einfach,nicht glykosyliert

Proteine


Hormone

Enzyme

Gerinnungsmodulatoren

Zytokine

Impfstoff(e)

Antikörper

Gentechnisch hergestellte Arzneimittel


Humaninsuline / Hypoglykämika

Berlinsulin® Humaninsulin E. coli

Huminsulin® Humaninsulin E. coli

Insuman® Humaninsulin E. coli

Insulin Actrapid® Humaninsulin S. cerevisiae

NovoRapid® Insulin aspart S. cerevisiae

Lantus® Insulin glargine E. coli

Humalog 100 Insulin lispro E. coli

GlucaGen® Glucagon S. cerevisiae

Hormone


HumaninsulinG CC YV NI T LQ SE I C S Q L Y C NEH2N COOH

10 20A-Kette

H PAF TN R KQ L G S H L V E L Y L V G E G F F Y TC CV COOH

10 20 30

B-Kette

H2N

Insulin lisproG CCV NI TQ SE I S QYLC L Y C NEH2N COOH

10 20

PAF TN R KQ G S V E V G E G F F TH L H L L Y L YC CV COOH

10 20 30

H2N

Insulin aspartG CCV NI TQ SE I S QYLC L Y C NEH2N COOH

10 20

KAF TN R DQ G S V E V G E G F F TH L H L L Y L YC CV COOH

10 20 30

H2N

Insulin glargineG CCV NI TQ SE I S QYLC L Y CEH2N COOH

10 20

KAF TN R PQ G S V E V G E G F F TH L H L L Y L YC CV COOH

10 20 30

H2N

G

R R

Insulin-Analoga


Hypophysenhormone

• Wachstumshormon

Genotropin® Somatropin E. coli

Humatrope® Somatropin E. coli

Norditropin® Somatropin E. coli

Zomacton® Somatropin E. coli

Saizen® Somatropin Mäusezelllinie C 127

Hormone


Hypophysenhormone

Gonal-F® r-Follitropin CHO-Zellen alpha, r-hFSH

Puregon® r-Follitropin CHO-K1-Zellen beta, recFSH

Luveris® Lutropin alfa, r-LH CHO-Zellen

Ovidrelle® r-Choriogonadotropin alfa CHO-Zellen

Hormone


Antianämika

Erypo® Epoetin alfa CHO-Zellen

Recormon® / Epoetin beta CHO-ZellenNeoRecormon®

Aranesp® / Nespo® Darbepoetin beta CHO-Zellen

Sonstige

Forcaltonin® Calcitonin E. coli

Thyrogen® Thyrotropin alfa CHO-Zellen

Hormone


Wirkstoff zur Behandlung der cystischen Fibrose

Pulmocyme® Dornase alfa, CHO-Zellen DNase

Wirkstoff zur Behandlung des Fabry-Syndroms

Fabrazyme® Agalsidase beta CHO-Zellen

Replagal® Agalsidase alfa Humanzelllinie

Wirkstoff zur Behandlung der Typ I Gaucher-Krankheit

Cerezyme® Imiglucerase CHO-Zellen

Enzyme


Cerezyme® (Imiglucerase)

GlcNAc MannoseN GlcNAc

Galactose Sialin-säureGlcNAcMannose

Mannose GlcNAc GalactoseSialin-säure

Neuraminidase


GalactoseGlcNAcMannose

Mannose GlcNAc Galactose

Sialin-säure

ß-Galactosidase


GlcNAcMannose

Mannose GlcNAc

Galactose

ß-N-Acetyl-glucosaminidase


Mannose

Mannose

GlcNAc


Antikoagulantien

Refludan® Lepirudin S. cerevisiae

Revasc® Desirudin S. cerevisiae

Fibrinolytika

Actilyse® Alteplase, tPA CHO-Zellen

Rapilysin® / Reteplase E. coliEcokinase®

Tenecteplase® / Tenecteplase CHO-ZellenMetalyse® TNK-tPA



Gewebeplasminogenaktivator (tPA)

FINGER EGF

KRINGEL-1

KRINGEL-2

SERINPROTEASE

1NH2

527COOH

Labile Stelle


KRINGEL-2

SERINPROTEASE

1NH2

355COOH

Labile Stelle

Rapilysin® (Reteplase)


Tenecteplase (TNK-tPA)

FINGER EGF

KRINGEL-1

KRINGEL-2

SERINPROTEASE

1NH2

527COOH

Labile Stelle

Thr Asn

Asn Gln

Lys-His-Arg-Arg

Ala-Ala-Ala-Ala


Blutgerinnungsfaktoren

• Faktor VIII

Kogenate® Blutgerinnungs- BHK-Zellenfaktor VIII

Helixate® Blutgerinnungs- BHK-Zellenfaktor VIII

Rekombinate® Blutgerinnungs- CHO-Zellenfaktor VIII

Bioclate® Blutgerinnungs- CHO-Zellenfaktor VIII

ReFacto® Moroctocog alfa CHO-Zellen



Faktor VIII

A1 A2 B A3 C1 C2H2N COOH

Primärtranskript (2332 Aminosäuren)

mögliche Glykosylierungsstellen

Proteolyse

schwere Kette

leichte Kette

Ca2+

A1 A2 B COOH

A3 C1 C2 COOH

H2N

H2N

Sek

reti

on

Proteolyse durch Thrombin

Akt

ivie

run

g

50 kDa 43 kDa

73 kDa

B

Ca2+

Proteolyse durch Thrombin,aktivierten Faktor X,aktiviertes Protein C

Inak

tivi

eru

ng

45 kDa 43 kDa

62 kDa

Ca2+

maximale Gerinnungsaktivität


Moroctocog alfa

A1 A2 A3 C1 C2H2N COOH

Primärtranskript (1438 Aminosäuren)

mögliche Glykosylierungsstellen

Proteolyse

schwere Kette

leichte Kette

Ca2+

A1 A2 COOH

A3 C1 C2 COOH

H2N

H2N

Sek

reti

on

Proteolyse durch Thrombin

Akt

ivie

run

g

50 kDa 43 kDa

73 kDa

Ca2+

Proteolyse durch Thrombin,aktivierten Faktor X,aktiviertes Protein C

Inak

tivi

eru

ng

45 kDa 43 kDa

62 kDa

Ca2+

maximale Gerinnungsaktivität


Blutgerinnungsfaktoren

• Faktor VII

Novoseven® Blutgerinnungs- BHK-Zellenfaktor VII, rFVIIa

• Faktor IX

BeneFIX® Blutgerinnungs- CHO-Zellenfaktor IX



Proleukin® Aldesleukin, IL2 E. coli

Roferon®-A Interferon alfa-2a E. coliIntron A® Interferon alfa-2b E. coliPegIntron A® Peginterferon alfa-2b E. coliInferax® Interferon E. coli

alfacon-1

Avonex® Interferon beta-1a CHO-ZellenRebif® Interferon beta-1a CHO-ZellenBetaferon® Interferon beta-1b E. coli

Imukin® Interferon E. coligamma-1b

Beromun® Tasonermin E. coli (TNF-1a)

Zytokine


Interferon-Beta vs. Betaferon®.

Interferon-Beta

CEK Y D NGL FK RQ NQ WL RL MLL

A E

T

D

V

I

N

S

I

V

YF FD IT I

E

M

N

VFF N

S N

DK

T

A

KK K GR

S

MF

R

RS

T SE

Q

20 30

A A L EED K IQF KEL QQ PQ 40

506070

100

COOH

110

LQS

W

G

HVE T N YVE NI AL

90

L Q I N H L T L L E E L

LYHCWIEILRYI

R

L T G Y L R N

K Y KK I HRR GA 120LYLHYLE

130140

M

150

160

FGS L QY CNN L FS QSRL

101

H2N

80

Betaferon®

CEK Y D NGL FK RQ NQ WL RL MLL

A E

T

D

V

I

N

S

I

V

YF FD IT I

E

M

N

VFF N

S N

DK

T

A

KK K GR

S

MF

R

RS

T SE

Q

20 30

A A L EED K IQF KEL QQ PQ 40

506070

100

COOH

110

LQS

W

G

HVE T N YVE NI AL

90

L Q I N H L T L L E E L

LYHCWIEILRYI

R

L T G Y L R N

K Y KK I HRR GA 120LYLHYLE

130140

M

150

160

FGS L QY NN L FS QSRL

101

H2N

80

S


Interleukin 2 vs. Proleukin®

Proleukin®

EVF N LQS N E E LKPLLLAK

A NNIL Q IL NYG PN RL L TD M K K

F

H

T

Q

S

L

VF FC

M

L E T M E A D E TAT I E L

N

RWITSI IST TL

20 30

40H E FYC A TQ L L KFMPK KTK

5060

80

70

R V I EI GVRP D L I S N N L L K90 100

HOOC

110

Y

120

130

1

P TT S KS QQ LS HL EL LT K

10

EE

H2N

S

Interleukin 2

EVF N LQS N E E LKPLLLAK

A NNIL Q IL NYG PN RL L TD M K K

F

H

T

Q

S

L

VF FC

M

L E T M E A D E TAT I E L

N

RWITSI IST TL

20 30

40H E FYC A TQ L L KFMPK KTK

5060

80

70

R V I EI GVRP D L I S N N L L K90 100

HOOC

110

Y

C 120

130

1

P TT S KS QQ LS HL EL LT K

10

H2N

EE


Authentizität ist dann besonders wichtig,wenn Präparate zur Substitutions- bzw.Dauertherapie eingesetzt werden

• Insulin• Gerinnungsfaktor VIII• Somatropin• ß-Interferon• -Interferon


Wachstumsfaktoren

Leucomax® Molgramostim, E. colirhuGM-CSF

Neupogen® Filgrastim, E. coli r-metHuG-CSF

Granocyte® Lenograstim, CHO-Zellen G-CSF

Regranex® Becaplermin, S. cerevisiaerhPDGF-BB

Impfstoff

Engerix®-B Hepatitis-B-Antigen S. cerevisiae

Zytokine / Impfstoff


Man kann resümieren,• dass alle rekombinanten Wirkstoffe durch einen extrem hohen

Sicherheitsstandard imponieren.

• Dies gilt nicht nur für die biologische Sicherheit der

rekombinanten Wirkstoffe im Vergleich zu Konzentraten aus

humanen Quellen. Katastrophen wie die Kontamination von

Gerinnungsfaktor-VIII-Präparaten mit HIV, HBV oder HCV bzw.

von Somatropin-Präparaten mit Erregern der Creutzfeldt-

Jakob-Krankheit sind bei rekombinanten Präparaten

ausgeschlossen.

• Dies gilt auch für Kontaminationen und Verunreinigungen aus

den Produktionszellen oder aus dem Medium. Derartige

Verunreinigungen und Kontaminationen sind bestenfalls in

Spuren vorhanden, die sich in der Regel nur theoretisch

errechnen, nicht aber konkret nachweisen lassen.


O

OOH

HO

HN

NH

L-783,281

Zellmembran

Zytoplasma

Insulinrezeptor

Konformationsänderung,Aktivierung der Rezeptorkinase

Insulin-Mimetika

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