Procesividad de la RNA polimerasa

Guillermo Domínguez Huertas

Biología molecular avanzada

Elongación transcripcional

Enzimacompletamente

procesiva.

Recibe diferentesseñales que modulan

un amplio rango develocidad.

La Km ap varíaampliamente

según el moldeDificultad para elaislamiento de

intermediarios.

Existen sitios del moldeconcretos de pausa de

elongación.

La RNA polimerasa está organizada en canales

Timón(rudder)

Fauces (jaws)

Canal de salidadel RNA

Centro catalítico

Canal secundario

Dominio solapa(flap domain)

Canal primariocorriente arriba

Canal primariocorriente abajo

• Modelo más apropiado para estudiosfisico-químicos de la transcripción.

• Enzima monomérica.

• Capaz de llevar a cabo un ciclotranscripción completo en ausencia defactores proteicos adicionales.

• Alta tasa de síntesis de RNA y deespecificidad por el promotor.

• Los análisis estructurales de difracción derayos X revelan una mayor similitud conlas DNA polimerasas.

(Cheetham, 1999)

RNA polimerasa del fago T7

PausaParada transitoria del complejo de elongación.

Produce la pérdida transitoria de capacidad catalítica.

Estado competente Estado de pausa

Retroceso (backtracking)La debilidad del heterodúplex fuerza el retroceso del

complejo de elongación

Pausa

Estado competente

Retroceso

Bloqueo (arrest)

Parada permanente del complejo de elongación transcripcional.Necesita la acción de factores Gre para volver a elongar.

EndonucleasaBloqueo

Gre

NTP PPiGre

Gre

Estado competente Elongación

Las pausas son intermediarios de isomerización del centrocatalítico

NusG

NusAGre

¿Qué sentido biológico tienen las pausas?

(i) Señales reguladoras intrínsecas: sincronizan la RNAP con launión de factores de elongación (a la RNAP y al RNAnaciente).

(ii) Sincroniza la traducción y la transcripción bacterianas. Losoperones rrn se transcriben mucho más rápido.

(iii) Facilita que el RNA adopte una correcta estructurasecundaria.

(iv) Requisito previo del bloqueo y la terminación.

Factores de elongación

Cada factor de elongación actúa sobre la RNAP mediante canales

GreA, GreB, PPi

Mdf

NusA

NusA

NusA

• Conservado entre eubacterias y arqueas.

• Estimula ciertos tipos de pausa (ej: operones his y trp) y la terminaciónintrínseca.

• En asociación con otros factores Nus, y con las proteínas N y Q del fago λ,estimula la antiterminación. La función antiterminadora de NusA juega unpapel clave en la expresión de los operones rrn.

• Terminación: (a) KH y S1 interaccionan con el canal de salida del RNA,facilitando la aparición de una horquilla de terminación. (b) ...o biendirectamente con el dominio “solapa”, induciendo la pausaalostéricamente.

• Antiterminación: basándose en la proximidad del CTD al RNA de salida,el complejo podría secuestrar el brazo 5’ de la horquilla de pausa.

NusA

NTD S1 KH1 KH2

Homologíaestructural con laregión 2 de σ. Unióna la RNAP (hélice αarrollada de β’).

Dominios globulares deinteracción con el RNA deS1/KH

• NusA de E.coli tiene dos dominiosadicionales en el C-terminal, AR1 yAR2, encargados de prevenir launión al RNA fuera de la RNAP.

(estructura de NusA de M.tuberculosis)

Los factores sigma y nusA compiten por el sitio de unión a laRNAP

σ

promotor

RNAP σ

terminadorNusA

nut

nut RNAPNusA

RNAP

GreA y GreB

• Todas las RNAP oligoméricas conservan actividad endonucleasaintrínseca. Los factores GreA y GreB estimulan esta función para salir delestado de bloqueo. En eucariotas, la proteína correspondiente es TFIIS.

• Según algunos autores, participa en la fidelidad transcripcional(proofreading), y facilita la transición del complejo de iniciación al deelongación.

• Los mutantes defectivos tanto de Gre como de TFIIS apenas tienenafectado su crecimiento: es probable una redundancia de factoresimplicados en esta función o que éste actúe sólo bajo ciertas condicionesde estrés.

GreA y GreB

GreA de E. coli

•Familia Gre: ~160 aas, muy conservadaen dos dominios.

•El dominio N-terminal (Gre-NTD)consistente en un dímero de hélices aarrolladas. Aporta la estimulación de laactividad endonucleasa y la unión alRNA, tal y como indica la distribución decargas superficial.

GreA y GreB

El domino C-terminal (Gre-CTD) globular se une la RNAP por la proximidaddel canal secundario.

GreA y GreB

TFIIS interaccionando con la RNAP II

[Kettenberger H et al. Cell 114, 347-357(2003)]

El canal secundario es el únicodesocupado en el CET,proporcionando un paso directohacia el centro catalítico para losfactores reguladores.

Gre-NTD se introduce en el canalsecundario de la RNAP, colocandodos residuos ácidos invariantes muycerca del centro catalítico.

Ensayos de huella detalladossugieren que Gre afectaalostéricamente a varias regiones,estabilizando la conformaciónretrasada y así facilitando elmecanismo de hidrólisis.

GreA y GreB

Conaway RC et al. Cell. 2003 Aug 8;114(3):272-4.

El modo de acción de TFIIS es completamenteanálogo. Los residuos ácidos invariantes se localizanen el extremo del lazo de zinc del C-terminal.

Mfd(TRCF: factor acoplador de la transcripción y la reparación)

Homología conUvrB Unión al DNA ATPasa TRG

Homología conRecG

Hidroliza ATP y se transloca. Su velocidad de translocación lleva a pensar

que sólo interacciona con RNAP bloqueadas.

La hidrólisis de un ATP produce un cambio conformacional crítico que lleva a

establecer nuevos contactos con el DNA. Si esto se produce unido a la

RNAP, impulsa su avance.

Ante un “obstáculo” importante, Mfd aborta la transcripción.

Modelos de transcripción

Huellas observadas en DNA y RNA de CET parados:ruptura con el modelo monótono de transcripción. La RNAP avanza

comprimiéndose y relajándose como si fuese una “oruga”.

Modelos de transcripción

• El modelo de transcripción “de gusano” (inchworm model; Chamberlin,1995) fue replantado a finales de los años 1990, ya que estaba basadoúnicamente en CET parados. Hoy se sabe que la distancia entre el centrocatalítico y el frente de la RNAP es constante.

• Modelo de “abrazadera deslizante” (sliding clamp model; Reeder & Hawley,1996): es rígida y puede “deslizarse” hacia atrás debido a la debilidad delheterodúplex. El deslizamiento hacia delante y atrás podría esplicar la reduccióndel número de pb digeridas. ¿Replisoma? ¿Flexibilidad?

Técnicas de estudio de la procesividad de la RNApolimerasa

• Ensayos de huella dactilar.

• Difracción de rayos X.

• Ensayos de entrecruzamiento ácido nucleico-proteína.

• Transcripción en fase sólida (paseo de la RNA polimerasa).

• Análisis de moléculas individuales mediante la trampa óptica.

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Pulso de luz UV

Nucleasas

Bromurocianógeno.MAPEAR.

ProteínaÁcido nucleico

Experimento de entrecruzamiento (crosslinking assays)

Técnica del paseo de la RNAP

RNAP

PoliHis

mRNADNA

Sustrato de agarosa con Ni2+

conjugado

Técnica del paseo de la RNAP

Vamos añadiendo grupos de NTP alternando con lavados hasta llegar a laposición deseada...

ATCGAGAGGG10ACACGGCGAA20TAGCCAT27GCC30AAT

AUC GAGAGGGACACGGCGAA20

AUC GAGAGGGACACGGCGAA20UAG

AUC GAGAGGGACACGGCGAA20UAG CCAU27

(ATP, GTP, CTP)

(ATP, GTP, UTP)

(ATP, CTP, UTP)

Técnica del paseo de la RNAPSi la posición deseada está lejos del promotor, lo mejor es añadir una proteína

“obstáculo” (roadblock) y dejar elongar con los cuatro NTP...

...AATCG111TAGTTGACTAGAATGAATTCGCGT135CAEcoQ111

AUC AGAGGGA10CACGGCGAA20TAGCCAT.....

ATCGAGAGGG10A.................ATGAATTCGCGT135CAEcoQ111

(ATP, CTP, GTP, TTP)

(ATP, GTP, TTP)

Trampa óptica: análisis de motores biomolecularesindividuales

F=K·L0/Δx

Los protagonistas...

Evgeny A. Nudler Robert C. Landick

Sergei Borukhov Carlos Bustamante

Bibliografía

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