Priprema uzorka farmaceutskih oblika za kvantitativnu · PDF filestabilnosti pripremljenog uzorka, da pripremljeni uzorak bude kompatibilan sa metodom koja se primenjuje ... Faktori

04/11/2013

1

Priprema uzoraka farmaceutskih oblika za kvantitativnu analizu

2

� Priprema uzorka je postupak kojim se uzorak prevodi u oblik pogodan za analizu primenom odgovarajuće instrumentalne metode.

� Izvodi se kada uzorak ne može direktno da se analizira ili kada se direktnom analizom dobijaju loši rezultati.

� Loši rezultati javljaju se kao posledica interferencija ili male osetljivosti metode.

� Pripremom uzorka:

�� eliminacija interferencije ili

�� koncentrovanje uzorka - direktan uticaj na osetljivost.

04/11/2013

2

3

4

1. poreklo i priroda uzorka1. poreklo i priroda uzorka2. svrha analize rezultati

prikupljanje uzorka

priprema uzorka

metoda za analizu

obrada rezultata

hromatografske metodespektroskopske metode

metode termalne analizeelektrohemijske metode

tok analize

tok informacija

analiza

04/11/2013

3

5

Vrste uzorakaVrste uzoraka

� Čvrsti uzorci:

�� farmaceutske supstance

�� čvrsti farmaceutski oblici

�� pakovni materijal

� Polučvrsti farmaceutski oblici

� Tečni farmaceutski oblici

� Medicinski gasovi

� Biološki materijal

6

PodsetnikPodsetnik

� Farmaceutski oblici predstavljaju smeše aktivnih farmaceutskih supstanci i ekscipijenasa.

� Ekscipijensi neophodni za uspešnu formulaciju, postizanje odgovarajuće stabilnosti i načina delovanja farmaceutskog oblika. Mogu biti prirodnog porekla (npr. skrob, šećeri, celuloza, želatin, laktoza, smole, magnezijum stearat) ili sintetskog porekla (npr. polivinilpirolidon, polisorbati, polietilenglikoli). Pokazuju različitu rastvorljivost u različitim rastvaračima, a to može značajno uticati na izbor metode za pripremu uzorka, kao i na sam postupak pripreme uzorka.

� Uzorci biološkog materijala sadrže ispitivane supstance u veoma niskoj koncentraciji, a matriks je veoma kompleksan. Ispitivane supstance vezane za proteine plazme ili uspostavljanjem kovalentnih veza prevedene u konjugate.

04/11/2013

4

7

� uzorkovanje u laboratoriji, tzv. laboratorijski uzorak,

� usitnjavanje ukoliko je potrebno,

� odmeravanje,

� primena odgovarajuće metode za pripremu uzoraka (npr. ekstrakcija, razblaživanje).

Priprema uzoraka obuhvata:Priprema uzoraka obuhvata:

8

� koncentraciju analita u opsegu metode (merljiva postavljenom metodom),

� čistoću uzorka odgovarajuću za postavljenu analitičku metodu,

� uzorak kompatibilan sa postavljenom analitičkom metodom,

� prinos (eng. Recovery) reproduktivan od uzorka do uzorka,

� analit stabilan do kraja cele analize.

Ciljevi pripreme uzorka su dobiti:Ciljevi pripreme uzorka su dobiti:

04/11/2013

5

9

�� opsegu koji ima metoda koja će se primenjivati za kvantitativnu analizu,

�� selektivnosti,

�� prinosu koji se mora dostići pripremom uzorka,

�� stabilnosti pripremljenog uzorka,

�� da pripremljeni uzorak bude kompatibilan sa metodom koja se primenjuje za analizu.

Metoda za pripremu uzorka bira se prema:Metoda za pripremu uzorka bira se prema:

10

�� Opseg

� Metoda za kvantitativnu analizu postavlja se pre odabira metode za pripremu uzorka.

� Koncentracija analita u pripremljenom uzorku mora biti unutar opsega metode.

� Prilagođava se odgovarajućim razblaživanjem uzorka.

npr. evaporacija uzorka pripremljenog u organskom rastvaraču, a zatim rekonstituisanje manjom zapreminom.

�� Selektivnost

� Metoda kojom se uzorak priprema mora biti selektivna.

� Komponente matriksa moraju biti potpuno uklonjene.

� Ukoliko neke komponente matriksa zaostanu ne smeju interferirati.

04/11/2013

6

11

� Predstavlja količinu analita koja će prilikom pripreme uzorka biti "izvučena" iz ispitivanog uzorka.

� Metoda za pripremu uzorka bira se tako da se dobije odgovarajući prinos - zavisi od potrebne tačnosti određivanja.

� Ukoliko je ispitivani uzorak farmaceutska supstanca ili farmaceutski oblik Recovery mora biti 100 % - jedino tada se postiže zahtevani nivo preciznosti i tačnosti.

� Kada je ispitivani uzorak biološki materijal, niže Recovery vrednosti su prihvatljive ukoliko je ta vrednost reproduktivna od uzorka do uzorka.

�� Stabilnost pripremljenog uzorka

� Analit u pripremljnom uzorku mora biti stabilan.

� Nekada se radi postizanja stabilnosti analita mora dodatno podešavati npr. pH vrednost.

� Ovo je posebno značajno kod analize degradacionih proizvoda.

�� Prinos (eng. Recovery)

12

�� Kompatibilnost sa metodom za analizu

� Rastvarač se bira tako da:

obezbeđuje maksimalni prinos,

ne utiče na analizu.

� Kod UV spektrofotometrije vrsta rastvarača, pH i jonska jačina mogu bitno da utiču na položaj maksimuma apsoprcije.

� Kod HPLC metode rastvarač može da utiče na oblik pika (deformacija uzlaznog dela pika - tailing, deformacija silaznog dela pika - fronting, cepanje pika).

� Kod GC metode rastvarač može da utiče prvenstveno na preciznost injektovanja - ako rastvarač brzo prelazi u gasovito stanje i zapremina nastalog gasa prevazilazi zapreminu injektora dolazi do gubitka usled curenja.

04/11/2013

7

13

Faktori koji utiču na pripremu uzorkaFaktori koji utiču na pripremu uzorka

�� Fizičko-hemijske interakcije�� Fizičko-hemijske interakcije

�� Rastvorljivost�� Rastvorljivost

�� Ravnoteža faza�� Ravnoteža faza

14

�� Fizičko-hemijske interakcije

� Imaju značajan uticaj na sve metode za pripremu uzorka.

� Dele se na: jonske, dipol-dipol, vodonične veze i hidrofobne interakcije.

� Jonske interakcije značajne kod čvrsto-tečne ekstrakcije zasnovane na izmeni jona i tečno-tečne ekstrakcije zasnovane na građenju jonskih parova.

� Jačina jonskih interakcija zavisi od:

jonske jačine - povećanje dovodi do slabljenja interakcije između suprotnih naelektrisanja,

pH vrednosti - većina farmaceutskih supstanci su slabe kiseline ili slabe baze, pa ih promena pH može prevesti u molekulski oblik.

Faktori koji utiču na pripremu uzorka

04/11/2013

8

15


Fizičko-hemijske interakcije

� Dipol-dipol interakcije i vodonične veze imaju slično ponašanje.

� Dipol-dipol interakcije najviše dolaze do izražaja kod čvrsto-tečne ekstrakcije normalnih faza kada se analit adsorbuje na čvrstu fazu.

� Na njih najveći uticaj ima količina vode i polarnost rastvarača.

� Najjače su u nepolarnim rastvaračima.

� Hidrofobne interakcije značajne kod čvrsto-tečne ekstrakcije reverznih faza i tečno-tečne ekstrakcije.

16

�� Rastvorljivost

� Razmatranje rastvorljivosti najznačajnije kada su ispitivani uzorci farmaceutske supstance i farmaceutski oblici.

� Na rastvorljivost utiču: pH vrednost, jonska jačina i temperatura.


�� Ravnoteža faza

� Značajno razmatrati kod čvrsto-te čne ekstrakcije i te čno-te čne ekstrakcije.

� Na osnovu particionog koeficijenta (Kp).

� Kp zavisi od mnogih faktora naročito kod tečno-tečne ekstrakcije.

[ ][ ]2

1

X

XK p =

Kp - particioni koeficijent

X1 - koncentracija analita u fazi 1

X2 - koncentracija analita u fazi 2

04/11/2013

9

17

Priprema čvrstih uzorakaPriprema čvrstih uzoraka

PodsetnikPodsetnik

Čvrsti farmaceutski oblici:

� tablete (neobložene, filmom obložene, bukalne, sublingvalne),

� kapsule,

� skrobne kapsule (cachets).

Oblici sa produženim oslobađanjem:

� tablete sa produženim oslobađanjem,

� kapsule sa produženim oslobađanjem,

� transdermalni terapijski sistemi.

izdvojeni zbog specifičnosti u

pripremi uzorka

18

� Priprema uzorka podrazumeva dodatak rastvarača u kome je analizirana supstanca dobro rastvorna - maksimizacija prinosa.

� U izabranom rastvaraču ekscipijensi treba teško da se rastvaraju ili da budu nerastvorni.

BITNO

� Kada se UV spektrofotometrija primenjuje za kvantitativnu analizu ni jedan od ekscipijenasa NE SME se rastvarati u tom rastvaraču.

� Ukoliko neki od ekscipijenasa interferira, za kvantitativnu analizu mora se primeniti separaciona metoda, npr. HPLC.

04/11/2013

10

19

prikupiti dostupne podatke o API i farmaceutskom obliku

odabrati odgovarajući postupak usitnjavanja farmaceutskog oblika

odabrati odgovarajući rastvarač za rastvaranje/ekstrakciju API

mešanje ili mućkanje

(shaker, vortex, sonication)

odabrati način uklanjanja nerastvorenih materija

(centrifugiranje, filtriranje)

Priprema čvrstih uzoraka

20

Prikupiti dostupne podatke o API i farmaceutskom obliku

API• rastvorljivost (organski rastvarač, voda, pufer, itd)• stabilnost rastvora,• pKa.

Farmaceutski oblik• kompatibilnost API sa ekscipijensima,• rastvorljivost ekscipijenasa,• karakteristike formulacije,• raspadljivost.

� Interakcije API i ekscipijensa mogu biti:

hemijske – utiču na stabilnost API u obliku i rastvoru uzorka,

fizičke – utiču na pripremu uzorka.

� Fizičke interakcije mogu biti:

adsorpcija ili vezivanje API za nerastvorni ekscipijens,

zadržavanje analita u kristalnoj rešetki komponenti matriksa ili gel strukturu polimernog ekscipijensa


04/11/2013

11

21

Primer

� MCC i kroskarmeloza su nerastvorni ekscipijensi.

� Ako je pH rastvarača viši od 4 biće negativno naelektrisani.

� Ako je API pri ovom pH pozitivno naelektrisan dolazi do elektrostatičkog privlačenja suprotnih naelektrisanja.

� Interakcija se eliminiše:

podešavanjem pH rastvarača kako API i ekscipijens ne bi bili suprotno naelektrisani ili

povećanjem jonske jačine rastvarača kako bi prisutni joni konkurisali sa molekulima API i sprečili interakciju sa ekscipijensom.


22

� Neophodno kako bi ekstrakcija API bila lakša i potpuna –naročito kod tableta sa produženim ili odloženim oslobađanjem.

� Najčešće se izvodi mehanički u tarioniku sa pistilom.

odabrati odgovarajući postupak usitnjavanja farmaceutskog oblika


04/11/2013

12

23

� Tvrde kapsule se NIKADA ne usitnjavaju u tarioniku.

� Pažljivo se otvaraju, sadržaj prazni u tarionik, sadržaj se homogenizuje i odmerava odgovarajuća količina ili se mogu direktno prazniti u odgovarajući odmerni sud.

� Ne preporučuje se tvrde kaspule neotvorene stavljati u odmerni sud zato što dodati rastvarač može rastvoriti neke komponente omotača kapsule, a to dovodi do pojave interferencije ili pak značajno otežava filtriranje rastvora.

24

� Meke kapsule se NE usitnjavaju, a NE MOGU se ni otvarati zato što su obično punjene rastvorom ili suspenzijom.

� Priprema ovih uzoraka je veoma komplikovana.

� Najznačajniji je pravilan izbor rastvarača omotača kapsule – eliminisati potenijalne interferencije.

� Ostali koraci u pripremi uzorka zavise od punjenja kapsule i osobina aktivne supstance.

04/11/2013

13

25

odabrati odgovarajući rastvarač za rastvaranje/ekstrakciju API

� Vrsta rastvarača prema rastvorljivosti API, ali i ekscipijenasa – voda, organski rastvarači ili smeša vode i organskih rastvarača.

� pH rastvarača – 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH.

� Jonska jačina rastvarača – primena pufera.

� Aditivi koji smanjuju rastvorljivost ekscipijenasa, surfaktanti koji olakšavaju rastvaranje teško rastvornih API, supstance koje se kompetitivno vezuju za ekscipijens.


26

Kritične tačke u pripremi čvrstih farmaceutskih oblika


Nizak prinos može biti posledica:

�� loše rastvorljivosti analita u odabranom rastvaraču

�� adsorpcije analita od strane elcipijenasa

�� zadržavanje analita u kristalnoj rešetki ili gel strukturi matriksa.

04/11/2013

14

27

�� Loša rastvorljivost se eliminiše primenom smeše rastvarača, primenom veće zapremine rastvarača, podešavanjem pH vrednosti rastvarača, dodatkom aditiva (npr. surfaktanata), dužim rastvaranjem u ultrazvučnom kupatilu.

� Adsorpcija se eliminiše podešavanjem pH vrednosti i jonske jačine rastvarača - moraju se uzeti u obzir vrste veza koje su dovele do adsorpcije.

�� Zadržavanje analita u u kristalnoj rešetki komponenti matriksa karakteristično je za rezidualne rastvarače - u tom slučaju mora se naći rastvarač koji rastvara i analit i matriks.


Praktično izvođenje pripreme uzorka čvrstih farmaceutskih oblika:

� Odgovarajućoj količini ispitivanog uzorka (tabletne mase, sadržaja kapsule, itd) doda se rastvarač.

� Analit se rastvara mešanjem, mućkanjem ili u ultrazvučnom kupatilu.

� Ne dobija se bistar rastvor - potrebno je filtriranje ili centrifugiranje.

04/11/2013

15

29

Priprema polučvrstih uzorakaPriprema polučvrstih uzoraka

� Kod masti i supozitirija API je najčešće dispergovana u lipofilnom matriksu – tipa suspenzija.

� Analit se iz masti i supozitorija najčešće ekstrahuje primenom:

tečno-tečne ekstrakcije ili

direktnim rastvaranjem API u rastvaraču u kome se podloga ne rastvara; primenjuje se ekstrakcija uz zagrevanje. Uzorak se hladi, pa filtrira, a ekstrakcija ponavlja još nekoliko puta.

� U pripremi uzoraka može se, sem zagrevanja, primenjivati i intenzivno mešanje (vortex, shaker ili ultrazvučno kupatilo) –olakšava dispergovanje i ekstrakciju.

�Ako je matriks supozirotija PEG, glicerol ili na bazi surfaktanata priprema uzorka je jednostavnija, jer se podloga rastvara u vodi ili smeši vode i organskog rastvarača.

30

Primer – ekstrakcija dibukaina iz masti

� Odmeriti odgovaraju ću koli činu ispitivanog uzorka - gravimetrijsko uzorkovanje.

� Kod API koje su kiselog ili baznog karaktera rastvo rljivost u vodi (smeši voda-organski rastvara č) pod velikim uticajem pH.

� Dibukain je supstanca baznog karaktera pKa 8,7.

� Iz masti se ekstrahuje 0,1 M HCl uz zagrevanje.

� Nakon hla đenja potrebno je filtriranje i/ili centrifugiranje kako bi se uklonio matriks.

� Ekstrakcija se ponavlja još nekoliko puta.

� HPLC analiza - injektuje se bistar supernatant.

Priprema polučvrstih uzoraka

04/11/2013

16

3131

Primer – ekstrakcija klobetazol propionata iz masti


� Uzorak se dispergije heksanom.

� Ekstrakcija se izvodi metanolom – višekratna.

� Beklometazon dipropionat se koristi kao interni sta ndard.


32

� Primenjuje se ekstrakcija uz zagrevanje. Uzorak se hladi, pa filtrira, a ekstrakcija ponavlja još nekoliko puta.

� Retko je za ekstrakciju iz kremova potrebno primeni ti te čno-te čnu ekstrakciju.

� Kod kremova matriks može biti tipa ulje u vodi (u/v) ili voda u ulju (v/u).

� Uobičajeno je da se za pripremu uzoraka primenjuje direktno rastvaranje API u rastvaraču.

� Rastvarač se bira prema osobinama API, tj. zavisi od toga u kom delupodloge je API rastvorena.

� U pripremi uzoraka može se, sem zagrevanja, primenjivati i intenzivno mešanje (vortex, shaker ili ultrazvučno kupatilo) –olakšava dispergovanje i ekstrakciju.


04/11/2013

17

33

Primer – ekstrakcija mikonazol nitrata iz krema


� Odmerenu koli činu uzorka preneti u odgovaraju ći odmerni sud.

� Dodati smešu metanol-acetonitril-tetrahidrofuran-rastvor trietil amina pH 2,5 (5:4:3:8) i promu ćkati.

� Ekstrakciju nastaviti u ultrazvu čnom kupatilu zagrejanom na 40°C do 45°C.

� Kada se ispitivani uzorak potpuno disperguje, ohlad iti do sobne temperature, pa dopuniti do oznake.

� Uzorak staviti u frižider.

� Nakon taloženja nerastvorenih komponenata matriksa, uzorak profiltrirati kroz filter 0,45 µm.

� HPLC analiza - injektuje se filtrat.


3434

Primer – ekstrakcija kortikosteroida iz kremova

� Odmeriti odgovarajuću količinu ispitivanog uzorka - gravimetrijsko uzorkovanje.

� Primenjuje se dvostepena ekstrakcija.

� U prvom koraku tečno-tečne ekstrakcije (LLE) uzorak se disperguje etil-acetatom. Zatim se dodaje 0,1 M citratni pufer zasićen natrijum-hloridom. U etil-acetatnom sloju zaostaju kortikosteroidi i lipidni deo matriksa. Sloj citratni pufer zasićen natrijum-hloridom uklanja u vodi rastvorne komponente matriksa.

� Etil-acetatni sloj se upari do suva i redisperguje heptanom.

� Ekstrakcija kortikosteroida izvodi se smešom acetonitril-voda (9 : 1).


04/11/2013

18

35

� Za izradu gelova uglavnom se koriste u vodi rastvorni ekscipijeni.

� Uobičajeno je da se za pripremu uzoraka primenjuje direktno rastvaranje API u polarnim organskim rastvaračima ili smeši vode i polarnog organskog rastvarača.

� Podešavanje pH rastvarača primenjuje se radi povećanja rastvorljivosti API kiselih ili baznih osobina.

� U pripremi uzoraka dovoljno je primeniti samo intenzivno mešanje (vortex,

shaker ili ultrazvučno kupatilo) – olakšava dispergovanje/rastvaranje gela i ekstrakciju.

� Nerastvorene materije uklanjaju se centrifugiranjem ili filtriranjem.


36

Primer – ekstrakcija metronidazola iz gela


� Odmerenu koli činu uzorka preneti u odgovaraju ći odmerni sud.

� Dodati smešu metanol-fosfatni pufer (65:35 V/V).

� Uzorak intenzivno mu čkati 20 min upotrebom shaker-a.

� Uzorak dopunitri rastvara čem do oznake i centrifugirati.

� HPLC analiza - injektuje se bistar supernatant.


04/11/2013

19

37

Priprema tečnih uzorakaPriprema tečnih uzoraka

� Priprema ovih uzoraka je najjednostavnija.

� Odmeravanje uzorka najčešće volumetrijski – pipetom. Ako je uzorak previše viskozan (neki sirupi) uzorkovanje može i gravimetrijski. Kod gravimetrijskog uzorkovanja MORAMO znati gustinu, jer se doza prikazuje kao mg mL-1.

� Vodeni rastvori ili alkoholno-vodeni rastvori mogu direktno da se analiziraju ili nakon razblaživanja rastvaračem, mobilnom fazom, i sl. Podešavanje pH rastvarača može biti neophodno kako bi se sprečila precipitacija.

� Uljane injekcije se: rastvaraju u odgovarajućem organskom rastvaraču ili se primenjuje tečno-tečna ekstrakcija.

� U pripremi uzoraka dovoljno je primeniti samo intenzivno mešanje (vortex,

shaker ili ultrazvučno kupatilo) – olakšava homogenizaciju rastvora.

38

� Suspenzije se pre uzorkovanja MORAJU dobro promućkati. Odmeravanje uzorka naj češće volumetrijski – pipeta se naj češće mora isprati rastvara čem. Ako je uzorak previše viskozan ili se prilikom mu ćkanja stvaraju mehuri ći uzorkovanje se vrši gravimetrijsi. Kod gravimetrijs kog uzorkovanja MORAMO znati gustinu, jer se doza prikazuje kao mg mL -1.

� Ekstrakcija najčešće direktnim rastvaranjem API u odgovaraju ćem rastvara ču.

� U pripremi uzoraka dovoljno je primeniti samo inten zivno mešanje ( vortex, shaker ili ultrazvu čno kupatilo) – olakšava rastvaranje API i ekstrakcij u.

� Nerastvorene materije uklanjaju se filtriranjem.

Priprema tečnih uzoraka

Documents

Priprema uzorka farmaceutskih oblika za kvantitativnu · PDF filestabilnosti pripremljenog uzorka, da pripremljeni uzorak bude kompatibilan sa metodom koja se primenjuje ... Faktori