38
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku Odjel za biologiju Zavod za kvantitativnu ekologiju Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologija doc. dr. sc. Goran Palijan

Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 0

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku

Odjel za biologiju

Zavod za kvantitativnu ekologiju

Radni materijal

Praktikum iz mikrobiologije:

bakteriologija

doc. dr. sc. Goran Palijan

Page 2: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 1

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Page 3: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 2

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Sadržaj:

______________________________________________________________________

Vježba 1. Bakteriološke podloge........................................................................................... 3

Priprema hranjive podloge

Razlijevanje hranjive podloge

Nasađivanje čvrste hranjive podloge I

Nasađivanje čvrste hranjive podloge II

Sterilizacija hranjive podloge

Vježba 2. Mikroskopski bakterijski preparati..................................................................... 8

Jednostavno pozitivno bojanje

Jednostavno negativno bojanje

Određivanje bakterija po Gram-u metodom s KOH

Vježba 3. Čista kultura........................................................................................................... 12

Morfologija kolonija

Određivanje broja bakterija

Izolacija čiste kulture

Vježba 4. Metaboličke osobine bakterija.............................................................................. 16

Stvaranje sumporovodika

Razgradnja želatine

Fermentacija ugljikohidrata

Hidroliza škroba

Vježba 5. Sanitarna bakteriologija....................................................................................... 21

Nasađivanje Wilson-Blair (WB) podloge

Nasađivanje andrade laktoze peptonske vode (ALPV)

Nasađivanje Endo agara

Vježba 6. Bris i antibiogram.................................................................................................. 25

Određivanje bakteriološke čistoće površina

Izrada antibiograma

Vježba 7. Obrada rezultata.................................................................................................... 28

Ispitivanje metaboličkih osobina bakterija

Sanitarna bakteriologija

Određivanje bakteriološke čistoće površina

Obrada antibiograma

Radni listovi................................................................................................................................... 30

Page 4: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 3

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 1. BAKTERIOLOŠKE PODLOGE

______________________________________________________________________

Bakteriološka podloga je hranjivi medij koji svojim sastavom omogućuje rast bakterija. Njihova

osnovna namjena je uzgoj bakterija u laboratorijskim uvjetima, a radi upoznavanja biokemijskih

osobina, dijagnosticiranja bolesti, izrade antigena, antibiograma i dr.

Tipovi hranjivih podloga:

1. Podjela prema podrijetlu i sastavu:

-prirodne hranjive podloge (točan sastav nije poznat; npr. krv, mlijeko)

-sintetične hranjive podloge (poznatog sastava)

-polusintetične hranjive podloge (kombinacija 1 i 2)

2. Podjela prema konzistenciji:

-tekuće hranjive podloge (bujoni)

-polutekuće (polukrute) hranjive podloge

-čvrste hranjive podloge (agari)

Čvrstoća podloge postiže se dodatkom agara. U čvstim hranjivim podlogama koncentracija

agara je od 1 do 5 %, a u polutekućim od 0.1 do 0.5 %.

3. Podjela prema namjeni:

S obzirom na specifičnu namjenu varira i sastav podloge (npr. podloge opće namjene,

selektivne i diferencijalne hranjive podloge)

Page 5: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 4

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Zadatak 1: PRIPREMA HRANJIVE PODLOGE

Formirajte sa svojim kolegama dvije grupe studenata te neka svaka grupa pripremi 150

ml čvrste hranjive podloge prema deklaraciji proizvođaća.

MATERIJAL:

1. dehidrirana hranjiva podloga (agarna podloga)

2. žlica

3. tehnička vaga

4. plastična čaša za vaganje podloge

5. destilirana voda

6. menzura od 100 ml

7. Erlenmeyerova tikvica od 250 ml

8. Boca za skuhanu podlogu

9. električno kuhalo

10. lonac

POSTUPAK:

1. Uključite električno kuhalo i stavite na njega lonac s otprilike 4 cm vode.

2. Odvažite na tehničkoj vagi praškastu dehidriranu podlogu potrebnu za pripravu 150

ml hranjive podloge.

3. U Erlenmeyerovoj tikvici suspendirajte potrebnu količinu agarne podloge u 150 ml

destilirane vode. Pripazite! Obavite kvantitativno prebacivanje podloge iz čaše za

vaganje u tikvicu.

4. Kada je voda u loncu prokuhala stavite u nju tikvicu sa suspendiranom podlogom.

Tijekom 10 minuta kuhanja povremeno promješajte sadržaj u tikvici. Pomozite se s

krpom kako vas vodena para ne bi opekla!

5. Nakon kuhanja otopljenu podlogu presipajte u za to predviđenu bocu.

Ovako pripremljenu podlogu je prije upotrebe potrebno sterilizirati prema

uputama proizvođaća.

Page 6: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 5

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Zadatak 2: RAZLIJEVANJE HRANJIVE PODLOGE

Izlijte čvrstu hranjivu podlogu (unaprijed pripremljenu i steriliziranu) u dvije sterilne

petrijevke i epruvetu. Epruvetu s tekućim agarom odložite na rub stalka za epruvete

kako bi se agar skrutnuo u kosom položaju. Tako će te prirediti tzv. kosi agar.

MATERIJAL:

1. sterilna hranjiva podloga (MPA = meat-pepton agar)

2. 2 sterilne petrijevke

3. 1 sterilna epruveta s čepom

4. drveni stalak za epruvete

5. špiritna lampa, šibice

6. vata

7. 70%-tni etanol

8. flomasteri

POSTUPAK:

1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i kada se

osuši upalite špiritnu lampu.

2. Označite petrijevke na vanjskoj strani dna s oznakom grupe i inicijalima. U sterilne

petrijevke ulijte sterilnu hranjivu podlogu. Poklopite. Ostavite da se podloga

skrutne.

3. Na epruveti povucite crtu u visini 2 do 3 cm od dna. Označite epruvetu s oznakom

grupe i inicijalima. Oznaku napišite u gornjem dijelu epruvete nešto ispod čepa.

4. Otpustite čep na boci s agarom.

5. U lijevu ruku uzmite epruvetu, malim prstom desne ruke skinite čep. Lijevom

rukom primite čep boce s hranjivom podlogom, a desnom rukom primite bocu i

nasipajte tekuću podlogu u epruvetu. Začepite bocu s hranjivom podlogom.

Sterilizirajte otvor epruvete i čepa u plamenu špiritne lampe i začepite epruvetu.

Epruvetu naslonite na donju policu drvenog stalka za epruvete kako bi se agar

skrutnuo u skošenom položaju = kosi agar.

Page 7: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 6

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Zadatak 3: NASAĐIVANJE ČVRSTE HRANJIVE PODLOGE 1

Pripremljenu čvrstu hranjivu podlogu u petrijevci nasadite/inokulirajte zrakom. Na taj

način će te provesti tzv. aerokontaminaciju sterilne podloge mikroorganizmima koji

lebde u zraku.

MATERIJAL:

1. Sterilna hranjiva podloga u petrijevci.

POSTUPAK:

1. Petrijevku s hranjivom podlogom nasadite zrakom tako da je ostavite otklopljenu

tijekom 15 minuta. Jedan student neka nasađivanje zrakom obavi tako da otvorenu

petrijevku stavi u struju zraka sušila za ruke u toaletu tijekom tri uzastopna ciklusa

puhanja. Drugi student neka odloži otvorenu petrijevku u suhi sterilizator. Ostali

studenti neka mjesto (prostoriju) na kojem žele obaviti kvalitativno ispitivanje

kakvoće zraka samostalno odaberu na prostoru Odjela za biologiju.

2. Inkubirati tijekom 48 h pri 25 °C.

Zadatak 4: IZRADA DECIMALNIH RAZRIJEĐENJA

U sterilnu epruvetu prebacite 9 ml sterilne fiziološke otopine pomoću dozatora.

Epruvete složite u stalak. U prvu epruvetu dodajte 1 ml dravske vode te je označite s

oznakom 10-1. Epruvetu dobro promučkajte između dva prsta. Zatim iz te epruvete

prebacite 1 ml u narednu epruvetu s 9 ml sterilne fiziološke otopine. Epruvetu označite

s 10-2. Promučkajte epruvetu te ponovite postupak kako bi priredili i decimalno

razrijeđenje 10-3.

Zadatak 5: NASAĐIVANJE ČVRSTE HRANJIVE PODLOGE 2

Pripremljenu čvrstu hranjivu podlogu u petrijevci nasadite uzorkom dravske vode ili

pripremljenim decimalnim razrijeđenjem metodom razmazivanja pomoću savijenog

staklenog štapića.

Page 8: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 7

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

MATERIJAL:

1. sterilna hranjiva podloga u petrijevci

2. savijeni stakleni štapić, sterilna pipeta od 1 ml

3. drveni stalak za epruvete

4. špiritna lampa, šibice, etanol u čaši od 100 ml

5. uzorak dravske vode

POSTUPAK:

1. Na površinu ranije razlivenog hranjivog agara prebacite 0.1 ml uzorka vode pomoću

pipete. Pipetu iz paketa vaditi tako da se paket primi u ruku, a drugom rukom

izvadite pipetu.

2. Uzmite savijeni stakleni štapić i uronite ga u čašu s etanolom pa ga prinesite

plamenu špiritne lampe i zapalite. Kada etanol izgori pomoću staklenog štapića

razmažite uzorak po cijeloj površini agara

3. Uronite štapić u alkohol i spalite ga.

4. Inkubirati 48 h pri 37 °C.

Zadatak 5: STERILIZACIJA HRANJIVE PODLOGE

Sterilizacija je uništavanje ili uklanjanje vegetativnih stanica i endospora. Može se

obaviti na različite načine: toplinom, zračenjem, filtriranjem, ultrazvukom,

kemikalijama (sterilantima). Više o pojedinim metodama naći će te u predavanjima i

literaturi.

Page 9: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 8

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 2. MIKROSKOPSKI BAKTERIJSKI PREPARATI

______________________________________________________________________

Bojanje bakterijskih stanica se obavlja radi lakšeg proučavanja svijetlosnim mikroskopom.

Dvije skupine boja:

1) bazične - imaju pozitivno nabijene skupine na sebi (najčešće pentavalentni dušik).

Npr. metilensko modrilo, kristal violet, safranin, malahitno zelenilo, bazični fuksin.

2) kisele - imaju negativno nabijene skupine na sebi (hidroksilnu i/ili karboksilnu).

Npr. eozin, roze bengal, kiseli fuksin, nigrozin.

Obojenost neke molekule potječe od područja bogatog dvostrukim vezama. Taj dio molekule se naziva

kromofor. Za stanicu i stanične strukture boja se veže ionskim, kovalentnim i hidrofobnim vezama.

Razlikujemo dva tipa bojanja:

1) jednostavno - utvrđivanje veličine i oblika te rasporeda bakterijskih stanica i bakterijskih

struktura (npr. bičeva)

- upotrebljava se 1 do 2 %-tna otopina samo jedne boje u vodi ili etanolu

2) složeno ili diferencijalno

- za utvrđivanje građe bakterijskih staničnih struktura

- prilikom bojanja se primjenjuje barem dvije boje, a može biti upotrijebljen

mordant (sredstvo za nagrizanje koje intenzivira obojenje)

- npr. bojanje po Gramu, bojanje endospora

- Hans Kristijan Gram 1884. godine otkrio da se bakterijske stanice može

podijeliti u dvije velike skupine (gram pozitivne - G+ i gram negativne - G-) s

obzirom na različitu mogućnost njihovog odbojavanja, a što je posljedica razlika

u strukturi bakterijskih staničnih stijenki.

Page 10: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 9

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Zadatak 1: JEDNOSTAVNO POZITIVNO BOJANJE

Pripremite mikroskopski bakterijski preparat koristeći bakterijski materijal od jedne

odabrane kolonije razvijene na agarnoj podlozi koju ste nasadili aerokontaminacijom.

U jednostavno obojanom, fiksiranom preparatu odredite oblik bakterijskih stanica i

oblik njihovih nakupina.

MATERIJAL:

1. bakterijske kolonije razvijene na krutoj hranjivoj podlozi

2. predmetnica i pokrovnica

3. mikrobiološka ušica

4. špiritna lampa, šibice

5. fiziološka otopina

6. metilensko-modrilo

7. kadica za bojanje, drvene štipaljke

8. filter papir ili staničevina,

9. imerzijsko ulje, 70%-tni etanol

10. mikroskop

POSTUPAK:

1. Predmetnicu očistite od masnoća vatom natopljenom 70%-tnim etanolom i osušite.

2. Na suhu predmetnicu kapnite kap sterilne fiziološke otopine pomoću dozator boce

na sredinu predmetnice pa u nju prenesite malo bakterijske kulture pomoću sterilne

mikrobiološke ušice.

3. Razmutite sadržaj pa ga razvucite po predmetnici u što tanjem sloju. Osušite na

zraku.

4. Fiksirajte preparat provlačenjem predmetnice kroz plamen špiritne lampe 8 puta

(zagrijavajte s donje strane!). Preparat držite drvenom štipaljkom.

5. Predmetnicu smjestite na stalak nad kadicom za bojanje i kapalicom prelijte razmaz

metilenskim modrilom.

6. Nakon 2 minute isperite boju mlazom vode, a preparat osušite staničevinom (ne

trljati!) i strujom toplog zraka iznad špiritne lampe (držati 20-tak cm iznad

plamena).

Page 11: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 10

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

7. Kapnite na preparat kap imerzionog ulja, a kapljicu prekrijte pokrovnicom te je

lagano pritisnite. Promatrajte pod mikroskopom. Nakon povećanja od 400x na

pokrovnicu kapnite kap imerzionog ulja i promatrajte pod imerzionim objektivom

(1000x).

8. Sliku preparata nacrtati i opisati.

Zadatak 2: JEDNOSTAVNO NEGATIVNO BOJANJE

U jednostavno obojanom, fiksiranom preparatu odredite oblik bakterijskih stanica i

oblik njihovih nakupina. Proučite je li bakterija kapsulirana.

MATERIJAL:

1. bakterijske kolonije razvijene na krutoj hranjivoj podlozi

2. 2 predmetnice i pokrovnica

3. mikrobiološka ušica

4. tuš

5. filter papir ili staničevina

6. imerzijsko ulje,

7. 70%-tni etanol

8. mikroskop

¸ POSTUPAK:

1. Predmetnicu očistite od masnoća vatom natopljenom 70%-tnim etanolom. Osušite

na zraku.

2. Na suhu predmetnicu kapnite kap tuša bliže jednom od krajeva predmetnice pa u

nju prenesite malo bakterijske kulture sterilnom mikrobiološkom ušicom.

3. Razmutite sadržaj pa ga razvucite u što tanjem sloju preko cijele predmetnice. Za to

upotrijebite novu predmetnicu držeći je pod približno 45o.

4. Osušite preparat na zraku. Ne fiksirati ga toplinom!

5. Kapnite na preparat kap imerzionog ulja, a kapljicu prekrijte pokrovnicom te je

lagano pritisnite. Promatrajte pod mikroskopom. Nakon povećanja od 400x na

Page 12: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 11

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

pokrovnicu kapnite kap imerzionog ulja i promatrajte pod imerzionim objektivom

(1000x).

6. Sliku preparata nacrtati i opisati.

Zadatak 3: ODREĐIVANJE BAKTERIJA PO GRAM-U METODOM S KOH

Pomoću razrijeđene otopine kalijevog-hidrooksida odredite strukturalna svojstva

stanične stijenke bakterijskih stanica tj. pripadnost bakterija po Gramu.

MATERIJAL:

1. bakterijske kolonije razvijene na krutoj hranjivoj podlozi

2. predmetnica

3. kapalica

4. 3%-tni kalijev hidrooksid (KOH)

5. mikrobiološka ušica

6. špiritna lampa, šibice

POSTUPAK:

1. Predmetnicu očistite od masnoća vatom natopljenom u 70%-tni etanol.

2. Na suhu predmetnicu kapnite kap 3%-tne otopine KOH na sredinu predmetnice pa u

nju prenesite malo bakterijske kulture pomoću sterilne mikrobiološke ušice.

3. Razmutite sadržaj i nakon 30-tak sekundi lagano podižite mikrobiološku ušicu iz

kapljice do udaljenosti 1-2 cm. Što primjećujete?

4. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.

Page 13: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 12

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 3. ČISTA KULTURA

______________________________________________________________________

Zadatak 1: MORFOLOGIJA KOLONIJA

Kolonija je makroskopska nakupina stanica iste vrste nastala iz jedne ili više istovrsnih

stanica (manje nakupine). Prema tome, kolonija se sastoji od jednog ili nekoliko

klonova.

Pregledajte petrijevke nasađene aerokontaminacijom. Proučite izgled kolonija i njihova

morfološka obilježja. Što primjećujete? Kakva im je morfologija (oblik, boja, površina,

oblik ruba i dr.)? Pomozite si u promatranju ručnim lupama, a po tome proučite detalje

kolonija pomoću binokularnih lupa. Pomoću eze dotaknite kolonije kako bi im ispitali

konzistenciju.

Zadatak 2: ODREĐIVANJE BROJA BAKTERIJA

Dvije su osnovne grupe metoda za određivanje broja bakterija. To su posredne i neposredne metode.

POSREDNO – bakterijski uzorak se prenese u okoliš (medij) u kojem će uzrokovati vizualni efekt (porast

kolonije na krutoj podlozi ili zamućenje tekuće podloge)

1. Kochova metoda

-brojanje kolonija na agarnoj podlozi u petrijevci

-služi određivanju broja živih stanica

-prebrojava se petrijevke na kojima je broj kolonija od 25 do 300; ovaj raspon se postigne

nasađivanjem više decimalnih razrijeđenja

-prebrojavanje se obavlja uz pomoć povečala

-broj kolonija odgovara broju bakterijskih stanica u uzorku samo ako se svaka kolonija razvila

od jedne bakterijske stanice; zbog toga se broj kolonija označava kao broj jedinica koje tvore

kolonije ili CFU (eng. colony forming units)

Page 14: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 13

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

-broj CFU = broj kolonija / nasađeni volumen * recipročna vrijednost nasađenog decimalnog

razrijeđenja

-nasađivanje uzorka na petrijevku je moguće napraviti na tri naćina:

a) razmazivanjem uzorka po površini skrutnutog agara u petrijevci pomoću staklenog

štapića savinutog pod 90° (eng. spread plate)

b) mješanjem uzorka sa tekućim agarom (eng. pour plate); postoje dvije inačice: u

petrijevku se najprije doda uzorak pa agar; uzorak i agar se pomiješaju u epruveti pa po

tome izliju u petrijevku

c) membranska filtracija – filter na kojem su se zadržale bakterije se prenese na površinu

agara u petrijevci

2. MPN metoda (eng. Most Probable Number)

-služi za određivanje najvjerojatnijeg broja bakterija (koliformnih)

-statistička metoda zasnovana na teoriji vjerojatnosti

3. Turbidimetrijska metoda

-broj bakterija se određuje usporedbom izmjerene optičke gustoće bakterijske suspenzije sa

standardnom krivuljom

NEPOSREDNO – za određivanje ukupnog broja bakterija (živih i mrtvih) direktnim promatranjem

1. Brojanjem u Petroff-Hauserovoj komorici

-brojanje se obavlja u komorici određenog volumena pomoću svjetlosnog mikroskopa, a pri

povećanju od 400x u Th. komorici odnosno 1000x u P-H komorici.

2. Brojanjem nakon jednostavnog bojanja fluorescentnom bojom

-brojanje se obavlja pomoću epifluorescentnog mikroskopa

-bakterijske stanice se imobilizira na membrani uređaja za membransku filtraciju; oboja ih se

fluorescirajućom bojom (npr. DAPI, AO); promatra pod povećanjem 1000 x ili više.

Page 15: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 14

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Odredite ukupni broj bakterija razvijen nakon aerokontaminacije. Rezultate zabilježite

zajedno sa nazivom lokaliteta/prostorije u kojoj ste obavili aerokontaminaciju.

MATERIJAL:

1. hranjiva podloga nasađena aerokontaminacijom

2. brojači

3. lupe

4. alkoholni flomasteri

POSTUPAK:

1. Alkoholnim flomasterom označiti svaku koloniju izraslu na hranjivoj podlozi.

2. Označene kolonije prebrojati.

Zadatak 3: IZOLACIJA ČISTE KULTURE

Presađivanje/precjepljivanje je sterilno prenošenje mikroorganizama s jedne hranjive

podloge na drugu. Služi pripravi i održavanju kultura mikroorganizama na krutim ili

tekućim hranjivim podlogama.

S obzirom da mikroorganizmi u okolišu žive u zajednicama za potrebe laboratorijskog

uzgoja razvijeni su postupci izolacije čistih kultura. Takva kultura se sastoji od samo

jedne vrste stanica. Zbog toga su takve kulture pogodne za istraživanje uzgojnih,

morfoloških i biokemijskih osobina. Čista kultura se dobiva izolacijom pojedinačnih

kolonija iz mješovite kulture razvijene na agaru.

Prenesite na kosi agar bakterijski materijal prikupljen od jasno izolirane kolonije. Na

ovaj način je izolirana čista kultura koja se sastoji od samo jedne bakterijske vrste.

MATERIJAL:

1. bakterijske kolonije razvijene na podlozi nasađenoj pruganjem

2. sterilan, kosi hranjivi agar

Page 16: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 15

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

3. stalak za epruvete

4. mikrobiološka ušica

5. špiritna lampa, šibice

6. 70%-tni etanol

POSTUPAK:

1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i kada se

osuši upalite špiritnu lampu.

2. U desnu ruku uzmite mikrobiološku ušicu i sterilizirajte je u plamenu špiritne

lampe.

3. Lijevom rukom odignite poklopac petrijevke s kolonijama. Mikrobiološkom ušicom

zahvatite malo od jedne jasno izolirane kolonije, vratite poklopac na petrijevku.

4. U jednom potezu opišite cik-cak trag po površini kosog agara. Prije zatvaranja

spalite otvor epruvete i čep. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.

5. Inkubirati tijekom 48 h, pri 25 oC

Page 17: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 16

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 4. METABOLIČKE OSOBINE BAKTERIJA

______________________________________________________________________

Prilikom identifikacije mikroorganizama potrebno je odrediti morfološke (određivanje oblika, veličine,

pokretljivosti, reakcija na bojenje), serološke, molekularno biološke i biokemijske (metaboličke)

osobine. Biokemijske osobine predstavljaju sposobnosti razgradnje pojedinih kemijskih spojeva tj.

sinteze enzima odgovornih za tu razgradnju. Zbog toga se u hranjivu podlogu dodaju odgovarajući

spojevi (npr. ugljikohidrati) ili je već čitava podloga prikladna za ispitivanje biokemijskih osobina (npr.

proteinske podloge). Razgradnjom ovih spojeva će nastati vidljive promjene ili će te promjene tek

postati vidljive nakon dodatka odgovarajućeg indikatora. Npr:

STVARANJE SUMPOROVODIKA

Prilikom razgradnje proteina bakterije metaboliziraju i aminokiseline sa sumporom (metionin i cistein).

Kao posljedica toga stvaraju i oslobađaju plin sumporovodik (H2S). U reakciji s indikatorom, olovnim

acetatom [Pb(OOCCH3)2], razvije se olovni sulfid koji je crne boje.

LIKVEFAKCIJA (OTAPANJE) žELATINE (IZVANSTANICNA PROTEOLITICKA AKTIVNOST)

Umjesto agarne podloge bakterije se nasadi na želatinu. Nakon inkubacije se podloge smjesti u

hladnjak jer je pri sobnoj temperaturi želatina tekuća. Pozitivna reakcija (razgradnja želatine) se

dogodila u onom uzorku u kojem je želatina ostala tekuća i nakon hlađenja.

FERMENTACIJA UGLJIKOHIDRATA

Andrade laktoza peptonska voda (ALPV) je tekuća podloga u kojoj je izvor ugljika za heterotrofni

metabolizam mliječni šećer laktoza. Laktoza je disaharid građen od glukoze i galaktoze. Razgradnjom

laktoze dolazi do zakiseljavanja medija što rezultira promjenom boje ALPV podloge koja iz žute i

bistre tekućine pređe u ružičastu i mutnu. Istovremeno dolazu do oslobađanja ugljik dioksida kojega se

može detektirati pomoću tzv. Durhamovih epruvetica.

ŠKROBNI AGAR ZA DOKAZIVANJE RAZGRADNJE POLIMERNIH UGLJIKOHIDRATA

Škrob je polisaharid velike molekularne mase. Zbog toga mora biti hidroliziran na manje podjedinice

kako bi ih se moglo unjeti u stanicu. Razgradnju polimera obavljaju ekstracelularne amilaze.

Page 18: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 17

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Agarnu podlogu se obogati škrobom. Nakon razvoja kolonija površinu agara se prelije lugolom. U

okolici kolonija sa sposobnošću razgradnje škroba se pojavi prozirna zona dok ostatak podloge poprimi

plavo-ljubičasto obojenje zbog reakcije lugolove otopine sa nerazgrađenim škrobom.

Zadatak 1: STVARANJE SUMPOROVODIKA

Odrediti metaboličku sposobnost stvaranja sumporovodika bakterijskom kulturom

izoliranom metodom pruganja (uzorak dravske vode).

MATERIJAL:

1. čista bakterijska kultura na kosom agaru ili jasno izolirane kolonije na petrijevci

2. epruveta s hranjivim bujonom

3. 1 sterilna epruveta

4. stalak za epruvete

5. sterilna pipeta od 1 ml

6. propipeta

7. dozator

8. mikrobiološka ušica

9. špiritna lampa, šibice

10. filter papir impregniran olovnim acetatom

11. pinceta

12. čep od staničevine za montiranje impregniranog filter papira

13. 70%-tni etanol

POSTUPAK:

1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i kada se

osuši upalite špiritnu lampu.

2. Označite epruvetu s hranjivim bujonom s oznakom grupe i inicijalima.

3. Pomoću dozatora prebacite 3 ml sterilne fiziološke otopine u praznu epruvetu.

4. Sterilnom mikrobiološkom ušicom zahvatite dio bakterijskog materijala s kosog

agara ili s jasno izolirane kolonije i suspendirajte ga u epruveti s fiziološkom

Page 19: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 18

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

5. otopinom. Pomoću pipete prebacite 1 ml suspenzije u epruvetu s hranjivim

bujonom.

6. Montirajte traku filter papira impregniranog olovnim acetatom u epruvetu tako da

kraj trake bude 5 mm od površine bujona. Pri tome se koristite sterilnim čepom od

staničevine umotanom u aluminijsku foliju. Epruvetu držite u stalku. Traku filter

papira umetnite u epruvetu i držite pincetom na potrebnoj udaljnosti od površine, a

slobodnom rukom začepite epruvetu.

7. Inkubirati 48 h pri 37 oC.

NAPOMENA: nasađivanje podloga u prvom i drugom zadatku napravite s istom pipetom.

Zadatak 2: FERMENTACIJA UGLJIKOHIDRATA

Odrediti metaboličku sposobnost razgradnje disaharida laktoze bakterijskom kulturom

izoliranom metodom pruganja (uzorak dravske vode).

MATERIJAL:

1. suspenzija bakterija izrađena od čiste kulture

2. epruveta sa ALPV tekućom podlogom (andrade laktoza peptonska voda)

3. stalak za epruvete

4. sterilna pipeta od 1 ml

5. propipeta

6. špiritna lampa, šibice

POSTUPAK:

1. Označite epruvetu s ALPV tekućom podlogom oznakom grupe i inicijalima.

2. Pomoču pipete prebacite 1 ml suspenzije pripremljene u prvom zadatku u epruvetu s

ALPV tekućom podlogom.

3. Inkubirati 48 h pri 37 oC.

Page 20: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 19

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Zadatak 3: RAZGRADNJA ŽELATINE

Odrediti metaboličku sposobnost razgradnje želatine bakterijskom kulturom izoliranom

metodom pruganja (uzorak dravske vode).

MATERIJAL:

1. suspenzija bakterija izrađena od čiste kulture

2. epruveta sa želatinom

3. stalak za epruvete

4. mikrobiološka ušica

5. špiritna lampa, šibice

POSTUPAK:

1. Označite epruvetu sa želatinom oznakom grupe i inicijalima.

2. Sterilnu mikrobiološku ušicu uronite u suspenziju bakterijskih stanica.

3. Nasadite želatinu ubodom cijelim žičanim dijelom mikrobiološke ušice.

4. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.

5. Inkubirati 48 do 72 h pri 37 oC.

6. Nakon inkubacije epruvete sa želatinom staviti u hladnjak. Pregled obaviti nakon

par sati hlađenja želatine u hladnjaku.

Zadatak 4: HIDROLIZA ŠKROBA

Odrediti metaboličku sposobnost razgradnje polimernog ugljikohidrata (škroba)

bakterijskom kulturom izoliranom metodom pruganja (uzorak dravske vode).

MATERIJAL:

1. suspenzija bakterija izrađena od čiste kulture

2. sterilna petrijevka

3. stalak za epruvete

4. sterilni štapić s vatom

5. sterilni škrobni agar

6. špiritna lampa, šibice

Page 21: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 20

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

POSTUPAK:

1. Označite petrijevku na vanjskoj strani dna s oznakom grupe i inicijalima.

2. Izlijte sterilni škrobni agar u sterilnu petrijevku i ostavite da se skrutne.

3. Preostalu suspenziju iz zadatka 1 izlijte iz epruvete u metalni čep, a epruvetu vratite

u stalak.

4. Namočite sterilni štapić s vatom u suspenziju te povucite trag u obliku jedne linije

po površini škrobnog agara.

5. Inkubirati 48 h pri 20 - 25 oC.

6. Nakon završene inkubacije sadržaj u petrijevci preliti lugolovom otopinom.

Page 22: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 21

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 5. SANITARNA BAKTERIOLOGIJA

______________________________________________________________________

Higijenska ispravnost vode, hrane i predmeta opće upotrebe je važno svojstvo koje se redovito ispituje

u okviru djelatnosti Zavoda za javno zdravstvo. Utvrđivanje higijenske ispravnosti pitke vode sastoji

se u dokazivanju patogenih mikroorganizama koji se prenose vodom. Bakteriološka pretraga ima tri

osnovna cilja:

1. odrediti je li voda kontaminirana ljudskim fekalijama

2. odrediti stupanj zaštite vodonosnoga sloja

3. istražiti djelotvornost tehnološkog postupka pročišćavanja vode

Prvi cilj se postiže dokazivanjem i određivanjem broja bakterija koje su indikator fekalne

kontaminacije, a drugi i treći se postižu određivanjem broja živih bakterija.

Kao indikatori fekalne kontaminacije odabrane su vrste bakterija koje se kao normalna mikroflora

gotovo isključivo ili pretežno nalaze u ljudskim fekalijama, a ima ih toliko da se lako mogu dokazati i

u velikim razrjeđenjima. Među takve ubrajamo koliformne bakterije (npr. E. coli), fekalne streptokoke,

sulfito-redukcijske klostridije i vrste iz rodova Salmonella i Proteus. Pod pojmom koliformne bakterije

podrazumjevamo gram-negativne, nesporogene štapićaste bakterije, aerobne ili fakultativno

anaerobne. Od biokemijskih osobina za njih je karakteristična mogućnost razgradnje šećera laktoze pri

37 °C, u tijeku 24 do 48 sati uz stvaranje ugljik-dioksida.

Metoda za dokazivanje koliformnih bakterija naziva se kolimetrija, a provodi se u tri faze koje se

nazivaju prethodni, potvrdni i završni test.

Page 23: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 22

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Zadatak 1: IZRADA DECIMALNIH RAZRIJEĐENJA

Izradite decimalna razrijeđenja uzorka vode (otpadne vode) dodavanjem 1 ml

originalnog uzorka u 9 ml sterilne fiziološke otopine te sukcesivno po 1 ml razrijeđenja

u novih 9 ml sterilne fiziološke otopine.

MATERIJAL:

1. 1 sterilna epruveta

2. stalak za epruvete

3. sterilna pipeta od 1 ml

4. propipeta

5. 70%-tni etanol

POSTUPAK:

1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i

kada se osuši upalite špiritnu lampu

2. U sterilnu epruvetu prebacite 9 ml sterilne fiziološke otopine i 1 ml uzorka vode

pomoču pipete (originala ili decimalnog razrijeđenja kojeg je priredio vaš

susjedni kolega).

Zadatak 2: NASAĐIVANJE WILSON-BLAIR (WB) PODLOGE

MATERIJAL:

6. 1 sterilna epruveta

7. stalak za epruvete

8. sterilna pipeta od 1 ml

9. propipeta

10. 1 epruveta s WB podlogom

11. vodena kupelj

12. 70%-tni etanol

Page 24: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 23

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

POSTUPAK:

1. U sterilnu epruvetu prebacite 1 ml uzorka vode (original ili pripremljeno

decimalno razrijeđenje) pomoču pipete. Označite epruvetu inicijalima, oznakom

grupe i decimalnim razrijeđenjem. Epruvetu stavite u vodenu kupelj na

predinkubaciju tijekom 20 minuta pri 80 °C. Za vrijeme predinkubacije

napravite drugi zadatak.

2. Nakon predinkubacije u epruvetu dodajte WB podlogu do polovice visine

epruvete. Uzorak i podlogu izmješajte trljanjem epruvete među dlanovima.

3. Inkubirati 48 h pri 37 °C.

Zadatak 3: NASAĐIVANJE ANDRADE LAKTOZE PEPTONSKE VODE (ALPV)

MATERIJAL:

1. Epruveta s ALPV-om i Durhamovom epruveticom

2. sterilna pipeta od 1 ml

3. propipeta

4. 3 sterilne epruvete za izradu decimalnih razrijeđenja

5. stalak za epruvete

6. dozator

7. sterilna fiziološka otopina

POSTUPAK:

1. Označite epruvetu s ALPV podlogom oznakom grupe, decimalnog razrijeđenja i

inicijalima.

2. U epruvetu s ALPV-om prebacite po 1 ml uzorka vode odgovarajućeg

decimalnog razrijeđenja pomoču pipete.

3. Inkubirati 48 h pri 44 °C.

Page 25: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 24

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Zadatak 4: NASAĐIVANJE ENDO-AGARA

MATERIJAL:

1. petrijevka sa Endo-agarom

2. sterilna pipeta od 1 ml

3. propipeta

4. štapić po Drigalskom

5. staklena čaša

6. špiritna lampa, šibice

7. 96%-tni etanol

POSTUPAK:

1. Na dno petrijevke s vanjske strane napisati grupu, inicijale i decimalno

razrijeđenje.

2. Na površinu ranije razlivenog Endo-agara prebacite 0.1 ml uzorka vode (original

ili decimalno razrijeđenje) pomoču pipete.

3. Uzmite savijeni stakleni štapić i uronite ga u čašu s etanolom pa ga prinesite

plamenu špiritne lampe i zapalite. Kada etanol izgori pomoću staklenog štapića

razmažite uzorak po cijeloj površini agara.

4. Uronite štapić u alkohol i spalite ga.

5. Inkubirati 48 h pri 37 °C.

Page 26: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 25

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 6. BRIS I ANTIBIOGRAM

______________________________________________________________________

ODREĐIVANJE BAKTERIOLOŠKE ČISTOĆE POVRŠINA (METODA BRISA)

Za određivanje stupnja kontaminacije bakterijama (broj živih bakterija) bilo koje površine najčešće se

upotrebljava metoda otirka ili brisa. Sterilan pravokutnik, najčešće izrađen od aluminija, unutrašnjih

dimenzija 5 x 4 cm, postavi se na dio površine kojoj se želi odrediti bakteriološku čistoću. S pomoću

sterilne vate na štapiću, koju smo ranije namočili u sterilnu fiziološku otopinu, prebriše se površina

unutar pravokutnika. Štapić s vatom se ponovo uroni u fiziološku otopinu u epruveti i dobro protrese

kako bi se bakterije prikupljene sa površine suspendirale u fiziološkoj otopini. Dobivenu suspenziju se

nasadi na hranjivi agar i inkubira pri 37 °C tijekom 48 sati. Broj razvijenih kolonija (CFU) se preračuna

na 1 cm2 ispitivane površine.

ISTRAŽIVANJE UTJECAJA ANTIBIOTIKA NA RAST BAKTERIJA

Antibiotik je kemijski spoj koji inhibira rast bakterija ili ih ubija uz minimalnu štetu za domaćina.

Ovakvo djelovanje ti spojevi postižu regulacijom transkripcije (quinoloni) ili translacije (tetraciklini,

makrolidi, aminoglikozidi), inhibicijom sinteze stanične stijenke (penicilini, cefalosporini),

narušavanjem strukture i funkcije stanične membrane ili blokirajući metaboličke puteve inhibicijom

enzima (sulfonamidi). Pri tome antibiotici iskorištavaju strukturne razlike prokariotskih i eukariotskih

stanica. Učinkovitost antibiotika ovisi o načinu uzimanja, smještaju infekcije, prisutnosti

interferirajućih spojeva, koncentraciji antibiotika u organizmu, preosjetljivosti prema antibioticima

(alergije) i otpornosti bakterije na antibiotik (plazmidi). S obzirom da ne postoji univerzalni antibiotik

koji bi podjednako unčikovito djelovao na sve poznate patogene prilikom odabira antibiotika s kojim će

se liječiti bolesnu osobu potrebno je odabrati lijek sa maksimalnim učinkom na bakteriju koja je

prouzročila infekciju. Ispitivanje utjecaja antibiotika na bakterije se obavlja tzv. difuzijskim testom.

Nakon što se od bolesne osobe uzme bris (grla, nosa...) napravi se suspenziju prikupljenih stanica. Po

tome ih se nasadi na hranjivu podlogu metodom razmaza po površini ranije razlivene podloge. Nakon

nasađivanja, na površinu agara se pomoću sterilne pincete stave diskovi od filter papira natopljeni

različitim antibioticima ili istim antibiotikom u različitim koncentracijama. Nakon inkubacije se

promotri oko kojih diskova (antibiotika) je došlo do inhibicije razvoja bakterija. U liječenju bi trebalo

primjeniti antibiotik sa najvećim učinkom.

Page 27: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 26

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Zadatak 1: IZRADA ANTIBIOGRAMA

Difuzijskim testom odrediti otpornost čiste bakterijske kulture prema antibioticima.

MATERIJAL:

1. čista kultura uzgojena na kosom agaru

2. sterilna hranjiva podloga

3. sterilna petrijevka

4. sterilna epruveta

5. stalak za epruvete

6. sterilna pipeta od 1 ml

7. propipata

8. sterilna fiziološka otopina

9. mikrobiološka ušica

10. špiritna lampa, šibice

11. 70%-tni etanol

12. pinceta

13. diskovi s različitim antibioticima

POSTUPAK:

1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i

upalite špiritnu lampu.

2. Označite petrijevku inicijalima i grupom, te naznačite tri pozicije (a, b i c) za

kasniju montažu diska impregniranog antibiotikom. Naznačite ih tako da budu

podjednako udaljeni među sobom te od ruba petrijevke

3. Izlijte sterilnu hranjivu podlogu u sterilnu petrijevku i ostavite da se skrutne.

4. Pomoću dozatora prebacite 1 ml sterilne fiziološke otopine u praznu epruvetu.

5. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.

6. Zahvatite dio bakterijske kolonije sterilnom mikrobiološkom ušicom i prebacite

u epruvetu s fiziološkom otopinom. Napravite suspenziju.

7. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.

8. Pomoču pipete prenesite 0.2 ml suspenzije na površinu hranjive podloge pa je

razmažite sterilnim štapićem po Drigalskom. Štapić spalite poslije upotrebe.

Page 28: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 27

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

9. Sterilnom pincetom postavite na površinu nasađene podloge tri diska od filter

papira natopljena različitim antibioticima. Postavite ih tako da budu podjednako

udaljeni među sobom te od ruba petrijevke. U radni materijal zabilježite koji

antibiotik se nalazi na kojoj poziciji.

10. Inkubirati 48 h na 37 oC. Nakon inkubacije odrediti zone inhibicije u

milimetrima.

Zadatak 2: ODREĐIVANJE BAKTERIOLOŠKE ČISTOĆE POVRŠINA

Metodom brisa odrediti ukupni broj bakterija na 1 cm2 površine po izboru.

MATERIJAL:

1. ravnalo ili trokut, olovka

2. sterilni štapić s vatom

3. sterilna pipeta od 1 ml

4. propipata

5. sterilna epruveta

6. stalak za epruvete

7. sterilna MPA podloga

8. sterilna petrijevka

9. špiritna lampa, šibice

10. fiziološka otopina

11. 70%-tni etanol

POSTUPAK:

1. Pomoću dozatora prebacite 5 ml sterilne fiziološke otopine u sterilnu epruvetu.

2. Odaberite u laboratoriju površinu koju želite ispitati pa na njoj običnom

olovkom nacrtajte pravokutnik 5 x 4 cm.

3. Sterilni štapić s vatom blago ovlažite fiziološkom otopinom.

4. Ovlaženim dijelom štapića prebrišite nacrtani kvadrat.

5. Stavite štapić u epruvetu s fiziološkom otopinom i dobro protresite kako bi se

prikupljene bakterije suspendirale.

6. Označite petrijevku inicijalima i grupom.

Page 29: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 28

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

7. Pomoču pipete prenesite 1 ml pripremljene suspenzije u praznu petrijevku.

8. U petrijevku dodajte ohlađenu agarnu podlogu te laganom rotacijom petrijevke

pomješajte uzorak s podlogom.

9. Inkubirati 48 h pri 37 oC.

10. Nakon inkubacije prebrojati kolonije i preračunati broj bakterija na 1 cm2

ispitivane površine.

Page 30: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 29

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 7. OBRADA REZULTATA

______________________________________________________________________

Zadatak 1: ISPITIVANJE METABOLIČKIH OSOBINA BAKTERIJA

Obradite rezultate ispitivanja fizioloških svojstava bakterija.

MATERIJAL:

1. epruveta s hranjivim bujonom, diskom i filter-papirom, nakon inkubacije

2. epruveta sa želatinom, nakon inkubacije i ohlađena

3. epruveta sa ALPV-podlogom

4. petrijevka sa škrobnim agarom, nakon inkubacije

5. lugolova otopina

POSTUPAK:

1. Da li je došlo do stvaranja crnog obojenja na filter-papiru ili disku?

2. Da li je želatina nakon hlađenja u hladnjaku u krutom ili tekućem stanju?

3. Lugolovom otopinom poprskati površinu petrijevki sa škrobnom hranjivom

podlogom nakon inkubacije. Što primjećujete?

Zadatak 2: SANITARNA BAKTERIOLOGIJA

Obradite rezultate sanitarne analize vode.

Zadatak 3: ODREĐIVANJE BAKTERIOLOŠKE ČISTOĆE POVRŠINA

Odredite ukupni broj bakterija na 1 cm2 odabrane laboratorijske površine

MATERIJAL:

1. hranjiva podloga inokulirana na Praktikumu 6. za određivanje ukupnog broja

bakterija na 1 cm2 odabrane laboratorijske površine

Page 31: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 30

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

2. brojači

3. lupe

4. alkoholni flomasteri

POSTUPAK:

1. Alkoholnim flomasterom označiti svaku koloniju izraslu na hranjivoj podlozi.

2. Označene kolonije prebrojati.

Zadatak 4: OBRADA ANTIBIOGRAMA

Među primijenjenim antibioticima odredite onaj na koji je bakterijska kultura

najosjetljivija.

MATERIJAL:

1. antibiogram

2. ravnalo

POSTUPAK:

1. Proučiti zone inhibicije i izmjeriti promjer svake zone u milimetrima

2. Odrediti antibiotik na koji je bakterija najosjetljivija.

Page 32: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 31

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

RADNI LISTOVI

______________________________________________________________________

VJEŽBA 1.

Za pripremu 150 ml hranjivog agara (Meat Peptone Agar – MPA) je potrebno odvagati ____ g

dehidrirane podloge te je suspendirati u destiliranoj vodi. Nakon pripreme podlogu se sterilizira

__________________.

Svojstvo agara (koje mu omogučava efikasnu primjenu u bakteriologiji) da ima različitu točku

taljenja i skrutnjivanja nazivamo ______________. Zbog ovog svojstva agar u temperaturnom

rasponu od 40 do 85 oC može biti _____________ ili ______________ ovisno o

početnom/prethodnom agregatnom stanju.

Nasađivanje podloge aerokontaminacijom spada u _______________ bakteriološke metode jer

se analizom ne može odrediti broj bakterija u jedinici volumena zraka. Kada se analizu provede

na način koji nam to omogučuje kažemo da je ona _______________.

Bilješke:

Page 33: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 32

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 2.

Kod jednostavnih bojanja upotrebljavamo samo ______________ boju. Pri tome se kod

jednostavnog negativnog bojanja oboji ______________ preparata, a kod jednostavnog

pozitivnog bojanja ________________ _____________.

U metodi određivanja pripadnosti bakterija po Gramu s KOH zbog djelovanja hidrooksida

dolazi do puknuća stanične stijenke i lize ______ bakterija. Posljedično je došlo do povećanja

viskoznosti kapljice jer se u nju oslobodila bakterijska _______.

Jednostavno pozitivno bojanje

(vidno polje)

Opišite sliku te navedite ukupno povećanje.

Jednostavno negativno bojanje

(vidno polje)

Opišite sliku te navedite ukupno povećanje.

Metoda određivanja pripadnosti bakterija po Gramu s KOH

(predmetnica)

Page 34: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 33

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 3.

Bakterijska kolonija je ________________ nakupina ____________ bakterijskih stanica.

Dvije su osnovne grupe metoda za određivanje broja bakterija: 1._______________ i

2.____________.

Radi omogućavanja laboratorijskog proućavanja bakterija razvijeni su postupci izolacije

_________ ___________.

Čista kultura se dobiva izolacijom ______________ ___________ iz mješovite kulture

razvijene na agaru.

Značajke bakterijskih kolonija na čvrstim podlogama

Oblik kolonija: okrugao, vretenast, nepravilan, nitast, korijenast Presjek kolonija: plosnat, uzdignut, konveksan, bradavičast, pupolik Rub kolonija: gladak, valovit, končast, resičav, rastrgan Izgled površine: hrapava, glatka, sluzava Prozirnost: prozirna, poluprozirna, neprozirna (mutna) Boja: žuta, narančasta, crvena, bijela, smeđa, zelena, plava Konzistencija: suha, vlažna, sluzava, maziva, žilava Miris: po užegloj masti, truleži, medu, fermentiranom voću

Page 35: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 34

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

Različiti morfološki oblici bakterijskih kolonija razvijeni na agarnoj podlozi u petrijevci nakon aerokontaminacije. Bilješke:

Page 36: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 35

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 4.

Stvaranje sumporovodika je posljedica katabolizma __________.

Dovršite jednadžbu: H2S + Pb(OOCCH3)2 → _______ + ________

Laktoza je _________ šećer građen od __________ i ___________.

Do razgradnje polimernih molekula (npr. želatine i škroba) dolazi zbog izlučivanja

______________.

ALPV s Durhamovim epruveticama. Lijevo negativna, desno pozitivna reakcija.

Ljubičasto obojani škrobni agar nakon reakcije s Lugolovom otopinom i radijalna obezbojena zona u

kojoj je škrob razgrađen.

Page 37: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 36

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 5.

Endo agar je primjer djelomično ______________ i _____________ podloge.

E. coli na endo agaru razvija crvene kolonije ___________ _____________.

Uzorak za nasađivanja Wilson-Blair podloge je predinkubiran na 80 oC kako bi se iniciralo

_____________ ___________.

Wilson-Blair podloga s razvijenim kolonijama Clostridium sp.

Bilješke:

Page 38: Radni materijal Praktikum iz mikrobiologije: bakteriologijabiologija.unios.hr/.../predavanja/mikrobiologija-bakteriologija.pdf · 3 Zavod za kvantitativnu ekologiju Praktikum iz mikrobiologije

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________ 37

Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju

VJEŽBA 6.

Stupanj kontaminacije bakterijama neke površine se određuje metodom ________.

Ispitivanje utjecaja antibiotika na bakterije se obavlja ________ _________.

Difuzijski test otpornosti bakterijske kulture na antibiotike. Najveća zona inhibicije rasta

bakterija indicira najučinkovitiji antibiotik.

Bilješke: