Upload
dinhxuyen
View
309
Download
6
Embed Size (px)
Citation preview
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 0
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku
Odjel za biologiju
Zavod za kvantitativnu ekologiju
Radni materijal
Praktikum iz mikrobiologije:
bakteriologija
doc. dr. sc. Goran Palijan
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 1
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 2
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Sadržaj:
______________________________________________________________________
Vježba 1. Bakteriološke podloge........................................................................................... 3
Priprema hranjive podloge
Razlijevanje hranjive podloge
Nasađivanje čvrste hranjive podloge I
Nasađivanje čvrste hranjive podloge II
Sterilizacija hranjive podloge
Vježba 2. Mikroskopski bakterijski preparati..................................................................... 8
Jednostavno pozitivno bojanje
Jednostavno negativno bojanje
Određivanje bakterija po Gram-u metodom s KOH
Vježba 3. Čista kultura........................................................................................................... 12
Morfologija kolonija
Određivanje broja bakterija
Izolacija čiste kulture
Vježba 4. Metaboličke osobine bakterija.............................................................................. 16
Stvaranje sumporovodika
Razgradnja želatine
Fermentacija ugljikohidrata
Hidroliza škroba
Vježba 5. Sanitarna bakteriologija....................................................................................... 21
Nasađivanje Wilson-Blair (WB) podloge
Nasađivanje andrade laktoze peptonske vode (ALPV)
Nasađivanje Endo agara
Vježba 6. Bris i antibiogram.................................................................................................. 25
Određivanje bakteriološke čistoće površina
Izrada antibiograma
Vježba 7. Obrada rezultata.................................................................................................... 28
Ispitivanje metaboličkih osobina bakterija
Sanitarna bakteriologija
Određivanje bakteriološke čistoće površina
Obrada antibiograma
Radni listovi................................................................................................................................... 30
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 3
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 1. BAKTERIOLOŠKE PODLOGE
______________________________________________________________________
Bakteriološka podloga je hranjivi medij koji svojim sastavom omogućuje rast bakterija. Njihova
osnovna namjena je uzgoj bakterija u laboratorijskim uvjetima, a radi upoznavanja biokemijskih
osobina, dijagnosticiranja bolesti, izrade antigena, antibiograma i dr.
Tipovi hranjivih podloga:
1. Podjela prema podrijetlu i sastavu:
-prirodne hranjive podloge (točan sastav nije poznat; npr. krv, mlijeko)
-sintetične hranjive podloge (poznatog sastava)
-polusintetične hranjive podloge (kombinacija 1 i 2)
2. Podjela prema konzistenciji:
-tekuće hranjive podloge (bujoni)
-polutekuće (polukrute) hranjive podloge
-čvrste hranjive podloge (agari)
Čvrstoća podloge postiže se dodatkom agara. U čvstim hranjivim podlogama koncentracija
agara je od 1 do 5 %, a u polutekućim od 0.1 do 0.5 %.
3. Podjela prema namjeni:
S obzirom na specifičnu namjenu varira i sastav podloge (npr. podloge opće namjene,
selektivne i diferencijalne hranjive podloge)
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 4
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Zadatak 1: PRIPREMA HRANJIVE PODLOGE
Formirajte sa svojim kolegama dvije grupe studenata te neka svaka grupa pripremi 150
ml čvrste hranjive podloge prema deklaraciji proizvođaća.
MATERIJAL:
1. dehidrirana hranjiva podloga (agarna podloga)
2. žlica
3. tehnička vaga
4. plastična čaša za vaganje podloge
5. destilirana voda
6. menzura od 100 ml
7. Erlenmeyerova tikvica od 250 ml
8. Boca za skuhanu podlogu
9. električno kuhalo
10. lonac
POSTUPAK:
1. Uključite električno kuhalo i stavite na njega lonac s otprilike 4 cm vode.
2. Odvažite na tehničkoj vagi praškastu dehidriranu podlogu potrebnu za pripravu 150
ml hranjive podloge.
3. U Erlenmeyerovoj tikvici suspendirajte potrebnu količinu agarne podloge u 150 ml
destilirane vode. Pripazite! Obavite kvantitativno prebacivanje podloge iz čaše za
vaganje u tikvicu.
4. Kada je voda u loncu prokuhala stavite u nju tikvicu sa suspendiranom podlogom.
Tijekom 10 minuta kuhanja povremeno promješajte sadržaj u tikvici. Pomozite se s
krpom kako vas vodena para ne bi opekla!
5. Nakon kuhanja otopljenu podlogu presipajte u za to predviđenu bocu.
Ovako pripremljenu podlogu je prije upotrebe potrebno sterilizirati prema
uputama proizvođaća.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 5
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Zadatak 2: RAZLIJEVANJE HRANJIVE PODLOGE
Izlijte čvrstu hranjivu podlogu (unaprijed pripremljenu i steriliziranu) u dvije sterilne
petrijevke i epruvetu. Epruvetu s tekućim agarom odložite na rub stalka za epruvete
kako bi se agar skrutnuo u kosom položaju. Tako će te prirediti tzv. kosi agar.
MATERIJAL:
1. sterilna hranjiva podloga (MPA = meat-pepton agar)
2. 2 sterilne petrijevke
3. 1 sterilna epruveta s čepom
4. drveni stalak za epruvete
5. špiritna lampa, šibice
6. vata
7. 70%-tni etanol
8. flomasteri
POSTUPAK:
1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i kada se
osuši upalite špiritnu lampu.
2. Označite petrijevke na vanjskoj strani dna s oznakom grupe i inicijalima. U sterilne
petrijevke ulijte sterilnu hranjivu podlogu. Poklopite. Ostavite da se podloga
skrutne.
3. Na epruveti povucite crtu u visini 2 do 3 cm od dna. Označite epruvetu s oznakom
grupe i inicijalima. Oznaku napišite u gornjem dijelu epruvete nešto ispod čepa.
4. Otpustite čep na boci s agarom.
5. U lijevu ruku uzmite epruvetu, malim prstom desne ruke skinite čep. Lijevom
rukom primite čep boce s hranjivom podlogom, a desnom rukom primite bocu i
nasipajte tekuću podlogu u epruvetu. Začepite bocu s hranjivom podlogom.
Sterilizirajte otvor epruvete i čepa u plamenu špiritne lampe i začepite epruvetu.
Epruvetu naslonite na donju policu drvenog stalka za epruvete kako bi se agar
skrutnuo u skošenom položaju = kosi agar.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 6
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Zadatak 3: NASAĐIVANJE ČVRSTE HRANJIVE PODLOGE 1
Pripremljenu čvrstu hranjivu podlogu u petrijevci nasadite/inokulirajte zrakom. Na taj
način će te provesti tzv. aerokontaminaciju sterilne podloge mikroorganizmima koji
lebde u zraku.
MATERIJAL:
1. Sterilna hranjiva podloga u petrijevci.
POSTUPAK:
1. Petrijevku s hranjivom podlogom nasadite zrakom tako da je ostavite otklopljenu
tijekom 15 minuta. Jedan student neka nasađivanje zrakom obavi tako da otvorenu
petrijevku stavi u struju zraka sušila za ruke u toaletu tijekom tri uzastopna ciklusa
puhanja. Drugi student neka odloži otvorenu petrijevku u suhi sterilizator. Ostali
studenti neka mjesto (prostoriju) na kojem žele obaviti kvalitativno ispitivanje
kakvoće zraka samostalno odaberu na prostoru Odjela za biologiju.
2. Inkubirati tijekom 48 h pri 25 °C.
Zadatak 4: IZRADA DECIMALNIH RAZRIJEĐENJA
U sterilnu epruvetu prebacite 9 ml sterilne fiziološke otopine pomoću dozatora.
Epruvete složite u stalak. U prvu epruvetu dodajte 1 ml dravske vode te je označite s
oznakom 10-1. Epruvetu dobro promučkajte između dva prsta. Zatim iz te epruvete
prebacite 1 ml u narednu epruvetu s 9 ml sterilne fiziološke otopine. Epruvetu označite
s 10-2. Promučkajte epruvetu te ponovite postupak kako bi priredili i decimalno
razrijeđenje 10-3.
Zadatak 5: NASAĐIVANJE ČVRSTE HRANJIVE PODLOGE 2
Pripremljenu čvrstu hranjivu podlogu u petrijevci nasadite uzorkom dravske vode ili
pripremljenim decimalnim razrijeđenjem metodom razmazivanja pomoću savijenog
staklenog štapića.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 7
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
MATERIJAL:
1. sterilna hranjiva podloga u petrijevci
2. savijeni stakleni štapić, sterilna pipeta od 1 ml
3. drveni stalak za epruvete
4. špiritna lampa, šibice, etanol u čaši od 100 ml
5. uzorak dravske vode
POSTUPAK:
1. Na površinu ranije razlivenog hranjivog agara prebacite 0.1 ml uzorka vode pomoću
pipete. Pipetu iz paketa vaditi tako da se paket primi u ruku, a drugom rukom
izvadite pipetu.
2. Uzmite savijeni stakleni štapić i uronite ga u čašu s etanolom pa ga prinesite
plamenu špiritne lampe i zapalite. Kada etanol izgori pomoću staklenog štapića
razmažite uzorak po cijeloj površini agara
3. Uronite štapić u alkohol i spalite ga.
4. Inkubirati 48 h pri 37 °C.
Zadatak 5: STERILIZACIJA HRANJIVE PODLOGE
Sterilizacija je uništavanje ili uklanjanje vegetativnih stanica i endospora. Može se
obaviti na različite načine: toplinom, zračenjem, filtriranjem, ultrazvukom,
kemikalijama (sterilantima). Više o pojedinim metodama naći će te u predavanjima i
literaturi.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 8
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 2. MIKROSKOPSKI BAKTERIJSKI PREPARATI
______________________________________________________________________
Bojanje bakterijskih stanica se obavlja radi lakšeg proučavanja svijetlosnim mikroskopom.
Dvije skupine boja:
1) bazične - imaju pozitivno nabijene skupine na sebi (najčešće pentavalentni dušik).
Npr. metilensko modrilo, kristal violet, safranin, malahitno zelenilo, bazični fuksin.
2) kisele - imaju negativno nabijene skupine na sebi (hidroksilnu i/ili karboksilnu).
Npr. eozin, roze bengal, kiseli fuksin, nigrozin.
Obojenost neke molekule potječe od područja bogatog dvostrukim vezama. Taj dio molekule se naziva
kromofor. Za stanicu i stanične strukture boja se veže ionskim, kovalentnim i hidrofobnim vezama.
Razlikujemo dva tipa bojanja:
1) jednostavno - utvrđivanje veličine i oblika te rasporeda bakterijskih stanica i bakterijskih
struktura (npr. bičeva)
- upotrebljava se 1 do 2 %-tna otopina samo jedne boje u vodi ili etanolu
2) složeno ili diferencijalno
- za utvrđivanje građe bakterijskih staničnih struktura
- prilikom bojanja se primjenjuje barem dvije boje, a može biti upotrijebljen
mordant (sredstvo za nagrizanje koje intenzivira obojenje)
- npr. bojanje po Gramu, bojanje endospora
- Hans Kristijan Gram 1884. godine otkrio da se bakterijske stanice može
podijeliti u dvije velike skupine (gram pozitivne - G+ i gram negativne - G-) s
obzirom na različitu mogućnost njihovog odbojavanja, a što je posljedica razlika
u strukturi bakterijskih staničnih stijenki.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 9
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Zadatak 1: JEDNOSTAVNO POZITIVNO BOJANJE
Pripremite mikroskopski bakterijski preparat koristeći bakterijski materijal od jedne
odabrane kolonije razvijene na agarnoj podlozi koju ste nasadili aerokontaminacijom.
U jednostavno obojanom, fiksiranom preparatu odredite oblik bakterijskih stanica i
oblik njihovih nakupina.
MATERIJAL:
1. bakterijske kolonije razvijene na krutoj hranjivoj podlozi
2. predmetnica i pokrovnica
3. mikrobiološka ušica
4. špiritna lampa, šibice
5. fiziološka otopina
6. metilensko-modrilo
7. kadica za bojanje, drvene štipaljke
8. filter papir ili staničevina,
9. imerzijsko ulje, 70%-tni etanol
10. mikroskop
POSTUPAK:
1. Predmetnicu očistite od masnoća vatom natopljenom 70%-tnim etanolom i osušite.
2. Na suhu predmetnicu kapnite kap sterilne fiziološke otopine pomoću dozator boce
na sredinu predmetnice pa u nju prenesite malo bakterijske kulture pomoću sterilne
mikrobiološke ušice.
3. Razmutite sadržaj pa ga razvucite po predmetnici u što tanjem sloju. Osušite na
zraku.
4. Fiksirajte preparat provlačenjem predmetnice kroz plamen špiritne lampe 8 puta
(zagrijavajte s donje strane!). Preparat držite drvenom štipaljkom.
5. Predmetnicu smjestite na stalak nad kadicom za bojanje i kapalicom prelijte razmaz
metilenskim modrilom.
6. Nakon 2 minute isperite boju mlazom vode, a preparat osušite staničevinom (ne
trljati!) i strujom toplog zraka iznad špiritne lampe (držati 20-tak cm iznad
plamena).
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 10
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
7. Kapnite na preparat kap imerzionog ulja, a kapljicu prekrijte pokrovnicom te je
lagano pritisnite. Promatrajte pod mikroskopom. Nakon povećanja od 400x na
pokrovnicu kapnite kap imerzionog ulja i promatrajte pod imerzionim objektivom
(1000x).
8. Sliku preparata nacrtati i opisati.
Zadatak 2: JEDNOSTAVNO NEGATIVNO BOJANJE
U jednostavno obojanom, fiksiranom preparatu odredite oblik bakterijskih stanica i
oblik njihovih nakupina. Proučite je li bakterija kapsulirana.
MATERIJAL:
1. bakterijske kolonije razvijene na krutoj hranjivoj podlozi
2. 2 predmetnice i pokrovnica
3. mikrobiološka ušica
4. tuš
5. filter papir ili staničevina
6. imerzijsko ulje,
7. 70%-tni etanol
8. mikroskop
¸ POSTUPAK:
1. Predmetnicu očistite od masnoća vatom natopljenom 70%-tnim etanolom. Osušite
na zraku.
2. Na suhu predmetnicu kapnite kap tuša bliže jednom od krajeva predmetnice pa u
nju prenesite malo bakterijske kulture sterilnom mikrobiološkom ušicom.
3. Razmutite sadržaj pa ga razvucite u što tanjem sloju preko cijele predmetnice. Za to
upotrijebite novu predmetnicu držeći je pod približno 45o.
4. Osušite preparat na zraku. Ne fiksirati ga toplinom!
5. Kapnite na preparat kap imerzionog ulja, a kapljicu prekrijte pokrovnicom te je
lagano pritisnite. Promatrajte pod mikroskopom. Nakon povećanja od 400x na
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 11
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
pokrovnicu kapnite kap imerzionog ulja i promatrajte pod imerzionim objektivom
(1000x).
6. Sliku preparata nacrtati i opisati.
Zadatak 3: ODREĐIVANJE BAKTERIJA PO GRAM-U METODOM S KOH
Pomoću razrijeđene otopine kalijevog-hidrooksida odredite strukturalna svojstva
stanične stijenke bakterijskih stanica tj. pripadnost bakterija po Gramu.
MATERIJAL:
1. bakterijske kolonije razvijene na krutoj hranjivoj podlozi
2. predmetnica
3. kapalica
4. 3%-tni kalijev hidrooksid (KOH)
5. mikrobiološka ušica
6. špiritna lampa, šibice
POSTUPAK:
1. Predmetnicu očistite od masnoća vatom natopljenom u 70%-tni etanol.
2. Na suhu predmetnicu kapnite kap 3%-tne otopine KOH na sredinu predmetnice pa u
nju prenesite malo bakterijske kulture pomoću sterilne mikrobiološke ušice.
3. Razmutite sadržaj i nakon 30-tak sekundi lagano podižite mikrobiološku ušicu iz
kapljice do udaljenosti 1-2 cm. Što primjećujete?
4. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 12
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 3. ČISTA KULTURA
______________________________________________________________________
Zadatak 1: MORFOLOGIJA KOLONIJA
Kolonija je makroskopska nakupina stanica iste vrste nastala iz jedne ili više istovrsnih
stanica (manje nakupine). Prema tome, kolonija se sastoji od jednog ili nekoliko
klonova.
Pregledajte petrijevke nasađene aerokontaminacijom. Proučite izgled kolonija i njihova
morfološka obilježja. Što primjećujete? Kakva im je morfologija (oblik, boja, površina,
oblik ruba i dr.)? Pomozite si u promatranju ručnim lupama, a po tome proučite detalje
kolonija pomoću binokularnih lupa. Pomoću eze dotaknite kolonije kako bi im ispitali
konzistenciju.
Zadatak 2: ODREĐIVANJE BROJA BAKTERIJA
Dvije su osnovne grupe metoda za određivanje broja bakterija. To su posredne i neposredne metode.
POSREDNO – bakterijski uzorak se prenese u okoliš (medij) u kojem će uzrokovati vizualni efekt (porast
kolonije na krutoj podlozi ili zamućenje tekuće podloge)
1. Kochova metoda
-brojanje kolonija na agarnoj podlozi u petrijevci
-služi određivanju broja živih stanica
-prebrojava se petrijevke na kojima je broj kolonija od 25 do 300; ovaj raspon se postigne
nasađivanjem više decimalnih razrijeđenja
-prebrojavanje se obavlja uz pomoć povečala
-broj kolonija odgovara broju bakterijskih stanica u uzorku samo ako se svaka kolonija razvila
od jedne bakterijske stanice; zbog toga se broj kolonija označava kao broj jedinica koje tvore
kolonije ili CFU (eng. colony forming units)
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 13
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
-broj CFU = broj kolonija / nasađeni volumen * recipročna vrijednost nasađenog decimalnog
razrijeđenja
-nasađivanje uzorka na petrijevku je moguće napraviti na tri naćina:
a) razmazivanjem uzorka po površini skrutnutog agara u petrijevci pomoću staklenog
štapića savinutog pod 90° (eng. spread plate)
b) mješanjem uzorka sa tekućim agarom (eng. pour plate); postoje dvije inačice: u
petrijevku se najprije doda uzorak pa agar; uzorak i agar se pomiješaju u epruveti pa po
tome izliju u petrijevku
c) membranska filtracija – filter na kojem su se zadržale bakterije se prenese na površinu
agara u petrijevci
2. MPN metoda (eng. Most Probable Number)
-služi za određivanje najvjerojatnijeg broja bakterija (koliformnih)
-statistička metoda zasnovana na teoriji vjerojatnosti
3. Turbidimetrijska metoda
-broj bakterija se određuje usporedbom izmjerene optičke gustoće bakterijske suspenzije sa
standardnom krivuljom
NEPOSREDNO – za određivanje ukupnog broja bakterija (živih i mrtvih) direktnim promatranjem
1. Brojanjem u Petroff-Hauserovoj komorici
-brojanje se obavlja u komorici određenog volumena pomoću svjetlosnog mikroskopa, a pri
povećanju od 400x u Th. komorici odnosno 1000x u P-H komorici.
2. Brojanjem nakon jednostavnog bojanja fluorescentnom bojom
-brojanje se obavlja pomoću epifluorescentnog mikroskopa
-bakterijske stanice se imobilizira na membrani uređaja za membransku filtraciju; oboja ih se
fluorescirajućom bojom (npr. DAPI, AO); promatra pod povećanjem 1000 x ili više.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 14
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Odredite ukupni broj bakterija razvijen nakon aerokontaminacije. Rezultate zabilježite
zajedno sa nazivom lokaliteta/prostorije u kojoj ste obavili aerokontaminaciju.
MATERIJAL:
1. hranjiva podloga nasađena aerokontaminacijom
2. brojači
3. lupe
4. alkoholni flomasteri
POSTUPAK:
1. Alkoholnim flomasterom označiti svaku koloniju izraslu na hranjivoj podlozi.
2. Označene kolonije prebrojati.
Zadatak 3: IZOLACIJA ČISTE KULTURE
Presađivanje/precjepljivanje je sterilno prenošenje mikroorganizama s jedne hranjive
podloge na drugu. Služi pripravi i održavanju kultura mikroorganizama na krutim ili
tekućim hranjivim podlogama.
S obzirom da mikroorganizmi u okolišu žive u zajednicama za potrebe laboratorijskog
uzgoja razvijeni su postupci izolacije čistih kultura. Takva kultura se sastoji od samo
jedne vrste stanica. Zbog toga su takve kulture pogodne za istraživanje uzgojnih,
morfoloških i biokemijskih osobina. Čista kultura se dobiva izolacijom pojedinačnih
kolonija iz mješovite kulture razvijene na agaru.
Prenesite na kosi agar bakterijski materijal prikupljen od jasno izolirane kolonije. Na
ovaj način je izolirana čista kultura koja se sastoji od samo jedne bakterijske vrste.
MATERIJAL:
1. bakterijske kolonije razvijene na podlozi nasađenoj pruganjem
2. sterilan, kosi hranjivi agar
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 15
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
3. stalak za epruvete
4. mikrobiološka ušica
5. špiritna lampa, šibice
6. 70%-tni etanol
POSTUPAK:
1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i kada se
osuši upalite špiritnu lampu.
2. U desnu ruku uzmite mikrobiološku ušicu i sterilizirajte je u plamenu špiritne
lampe.
3. Lijevom rukom odignite poklopac petrijevke s kolonijama. Mikrobiološkom ušicom
zahvatite malo od jedne jasno izolirane kolonije, vratite poklopac na petrijevku.
4. U jednom potezu opišite cik-cak trag po površini kosog agara. Prije zatvaranja
spalite otvor epruvete i čep. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.
5. Inkubirati tijekom 48 h, pri 25 oC
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 16
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 4. METABOLIČKE OSOBINE BAKTERIJA
______________________________________________________________________
Prilikom identifikacije mikroorganizama potrebno je odrediti morfološke (određivanje oblika, veličine,
pokretljivosti, reakcija na bojenje), serološke, molekularno biološke i biokemijske (metaboličke)
osobine. Biokemijske osobine predstavljaju sposobnosti razgradnje pojedinih kemijskih spojeva tj.
sinteze enzima odgovornih za tu razgradnju. Zbog toga se u hranjivu podlogu dodaju odgovarajući
spojevi (npr. ugljikohidrati) ili je već čitava podloga prikladna za ispitivanje biokemijskih osobina (npr.
proteinske podloge). Razgradnjom ovih spojeva će nastati vidljive promjene ili će te promjene tek
postati vidljive nakon dodatka odgovarajućeg indikatora. Npr:
STVARANJE SUMPOROVODIKA
Prilikom razgradnje proteina bakterije metaboliziraju i aminokiseline sa sumporom (metionin i cistein).
Kao posljedica toga stvaraju i oslobađaju plin sumporovodik (H2S). U reakciji s indikatorom, olovnim
acetatom [Pb(OOCCH3)2], razvije se olovni sulfid koji je crne boje.
LIKVEFAKCIJA (OTAPANJE) žELATINE (IZVANSTANICNA PROTEOLITICKA AKTIVNOST)
Umjesto agarne podloge bakterije se nasadi na želatinu. Nakon inkubacije se podloge smjesti u
hladnjak jer je pri sobnoj temperaturi želatina tekuća. Pozitivna reakcija (razgradnja želatine) se
dogodila u onom uzorku u kojem je želatina ostala tekuća i nakon hlađenja.
FERMENTACIJA UGLJIKOHIDRATA
Andrade laktoza peptonska voda (ALPV) je tekuća podloga u kojoj je izvor ugljika za heterotrofni
metabolizam mliječni šećer laktoza. Laktoza je disaharid građen od glukoze i galaktoze. Razgradnjom
laktoze dolazi do zakiseljavanja medija što rezultira promjenom boje ALPV podloge koja iz žute i
bistre tekućine pređe u ružičastu i mutnu. Istovremeno dolazu do oslobađanja ugljik dioksida kojega se
može detektirati pomoću tzv. Durhamovih epruvetica.
ŠKROBNI AGAR ZA DOKAZIVANJE RAZGRADNJE POLIMERNIH UGLJIKOHIDRATA
Škrob je polisaharid velike molekularne mase. Zbog toga mora biti hidroliziran na manje podjedinice
kako bi ih se moglo unjeti u stanicu. Razgradnju polimera obavljaju ekstracelularne amilaze.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 17
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Agarnu podlogu se obogati škrobom. Nakon razvoja kolonija površinu agara se prelije lugolom. U
okolici kolonija sa sposobnošću razgradnje škroba se pojavi prozirna zona dok ostatak podloge poprimi
plavo-ljubičasto obojenje zbog reakcije lugolove otopine sa nerazgrađenim škrobom.
Zadatak 1: STVARANJE SUMPOROVODIKA
Odrediti metaboličku sposobnost stvaranja sumporovodika bakterijskom kulturom
izoliranom metodom pruganja (uzorak dravske vode).
MATERIJAL:
1. čista bakterijska kultura na kosom agaru ili jasno izolirane kolonije na petrijevci
2. epruveta s hranjivim bujonom
3. 1 sterilna epruveta
4. stalak za epruvete
5. sterilna pipeta od 1 ml
6. propipeta
7. dozator
8. mikrobiološka ušica
9. špiritna lampa, šibice
10. filter papir impregniran olovnim acetatom
11. pinceta
12. čep od staničevine za montiranje impregniranog filter papira
13. 70%-tni etanol
POSTUPAK:
1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i kada se
osuši upalite špiritnu lampu.
2. Označite epruvetu s hranjivim bujonom s oznakom grupe i inicijalima.
3. Pomoću dozatora prebacite 3 ml sterilne fiziološke otopine u praznu epruvetu.
4. Sterilnom mikrobiološkom ušicom zahvatite dio bakterijskog materijala s kosog
agara ili s jasno izolirane kolonije i suspendirajte ga u epruveti s fiziološkom
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 18
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
5. otopinom. Pomoću pipete prebacite 1 ml suspenzije u epruvetu s hranjivim
bujonom.
6. Montirajte traku filter papira impregniranog olovnim acetatom u epruvetu tako da
kraj trake bude 5 mm od površine bujona. Pri tome se koristite sterilnim čepom od
staničevine umotanom u aluminijsku foliju. Epruvetu držite u stalku. Traku filter
papira umetnite u epruvetu i držite pincetom na potrebnoj udaljnosti od površine, a
slobodnom rukom začepite epruvetu.
7. Inkubirati 48 h pri 37 oC.
NAPOMENA: nasađivanje podloga u prvom i drugom zadatku napravite s istom pipetom.
Zadatak 2: FERMENTACIJA UGLJIKOHIDRATA
Odrediti metaboličku sposobnost razgradnje disaharida laktoze bakterijskom kulturom
izoliranom metodom pruganja (uzorak dravske vode).
MATERIJAL:
1. suspenzija bakterija izrađena od čiste kulture
2. epruveta sa ALPV tekućom podlogom (andrade laktoza peptonska voda)
3. stalak za epruvete
4. sterilna pipeta od 1 ml
5. propipeta
6. špiritna lampa, šibice
POSTUPAK:
1. Označite epruvetu s ALPV tekućom podlogom oznakom grupe i inicijalima.
2. Pomoču pipete prebacite 1 ml suspenzije pripremljene u prvom zadatku u epruvetu s
ALPV tekućom podlogom.
3. Inkubirati 48 h pri 37 oC.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 19
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Zadatak 3: RAZGRADNJA ŽELATINE
Odrediti metaboličku sposobnost razgradnje želatine bakterijskom kulturom izoliranom
metodom pruganja (uzorak dravske vode).
MATERIJAL:
1. suspenzija bakterija izrađena od čiste kulture
2. epruveta sa želatinom
3. stalak za epruvete
4. mikrobiološka ušica
5. špiritna lampa, šibice
POSTUPAK:
1. Označite epruvetu sa želatinom oznakom grupe i inicijalima.
2. Sterilnu mikrobiološku ušicu uronite u suspenziju bakterijskih stanica.
3. Nasadite želatinu ubodom cijelim žičanim dijelom mikrobiološke ušice.
4. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.
5. Inkubirati 48 do 72 h pri 37 oC.
6. Nakon inkubacije epruvete sa želatinom staviti u hladnjak. Pregled obaviti nakon
par sati hlađenja želatine u hladnjaku.
Zadatak 4: HIDROLIZA ŠKROBA
Odrediti metaboličku sposobnost razgradnje polimernog ugljikohidrata (škroba)
bakterijskom kulturom izoliranom metodom pruganja (uzorak dravske vode).
MATERIJAL:
1. suspenzija bakterija izrađena od čiste kulture
2. sterilna petrijevka
3. stalak za epruvete
4. sterilni štapić s vatom
5. sterilni škrobni agar
6. špiritna lampa, šibice
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 20
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
POSTUPAK:
1. Označite petrijevku na vanjskoj strani dna s oznakom grupe i inicijalima.
2. Izlijte sterilni škrobni agar u sterilnu petrijevku i ostavite da se skrutne.
3. Preostalu suspenziju iz zadatka 1 izlijte iz epruvete u metalni čep, a epruvetu vratite
u stalak.
4. Namočite sterilni štapić s vatom u suspenziju te povucite trag u obliku jedne linije
po površini škrobnog agara.
5. Inkubirati 48 h pri 20 - 25 oC.
6. Nakon završene inkubacije sadržaj u petrijevci preliti lugolovom otopinom.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 21
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 5. SANITARNA BAKTERIOLOGIJA
______________________________________________________________________
Higijenska ispravnost vode, hrane i predmeta opće upotrebe je važno svojstvo koje se redovito ispituje
u okviru djelatnosti Zavoda za javno zdravstvo. Utvrđivanje higijenske ispravnosti pitke vode sastoji
se u dokazivanju patogenih mikroorganizama koji se prenose vodom. Bakteriološka pretraga ima tri
osnovna cilja:
1. odrediti je li voda kontaminirana ljudskim fekalijama
2. odrediti stupanj zaštite vodonosnoga sloja
3. istražiti djelotvornost tehnološkog postupka pročišćavanja vode
Prvi cilj se postiže dokazivanjem i određivanjem broja bakterija koje su indikator fekalne
kontaminacije, a drugi i treći se postižu određivanjem broja živih bakterija.
Kao indikatori fekalne kontaminacije odabrane su vrste bakterija koje se kao normalna mikroflora
gotovo isključivo ili pretežno nalaze u ljudskim fekalijama, a ima ih toliko da se lako mogu dokazati i
u velikim razrjeđenjima. Među takve ubrajamo koliformne bakterije (npr. E. coli), fekalne streptokoke,
sulfito-redukcijske klostridije i vrste iz rodova Salmonella i Proteus. Pod pojmom koliformne bakterije
podrazumjevamo gram-negativne, nesporogene štapićaste bakterije, aerobne ili fakultativno
anaerobne. Od biokemijskih osobina za njih je karakteristična mogućnost razgradnje šećera laktoze pri
37 °C, u tijeku 24 do 48 sati uz stvaranje ugljik-dioksida.
Metoda za dokazivanje koliformnih bakterija naziva se kolimetrija, a provodi se u tri faze koje se
nazivaju prethodni, potvrdni i završni test.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 22
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Zadatak 1: IZRADA DECIMALNIH RAZRIJEĐENJA
Izradite decimalna razrijeđenja uzorka vode (otpadne vode) dodavanjem 1 ml
originalnog uzorka u 9 ml sterilne fiziološke otopine te sukcesivno po 1 ml razrijeđenja
u novih 9 ml sterilne fiziološke otopine.
MATERIJAL:
1. 1 sterilna epruveta
2. stalak za epruvete
3. sterilna pipeta od 1 ml
4. propipeta
5. 70%-tni etanol
POSTUPAK:
1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i
kada se osuši upalite špiritnu lampu
2. U sterilnu epruvetu prebacite 9 ml sterilne fiziološke otopine i 1 ml uzorka vode
pomoču pipete (originala ili decimalnog razrijeđenja kojeg je priredio vaš
susjedni kolega).
Zadatak 2: NASAĐIVANJE WILSON-BLAIR (WB) PODLOGE
MATERIJAL:
6. 1 sterilna epruveta
7. stalak za epruvete
8. sterilna pipeta od 1 ml
9. propipeta
10. 1 epruveta s WB podlogom
11. vodena kupelj
12. 70%-tni etanol
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 23
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
POSTUPAK:
1. U sterilnu epruvetu prebacite 1 ml uzorka vode (original ili pripremljeno
decimalno razrijeđenje) pomoču pipete. Označite epruvetu inicijalima, oznakom
grupe i decimalnim razrijeđenjem. Epruvetu stavite u vodenu kupelj na
predinkubaciju tijekom 20 minuta pri 80 °C. Za vrijeme predinkubacije
napravite drugi zadatak.
2. Nakon predinkubacije u epruvetu dodajte WB podlogu do polovice visine
epruvete. Uzorak i podlogu izmješajte trljanjem epruvete među dlanovima.
3. Inkubirati 48 h pri 37 °C.
Zadatak 3: NASAĐIVANJE ANDRADE LAKTOZE PEPTONSKE VODE (ALPV)
MATERIJAL:
1. Epruveta s ALPV-om i Durhamovom epruveticom
2. sterilna pipeta od 1 ml
3. propipeta
4. 3 sterilne epruvete za izradu decimalnih razrijeđenja
5. stalak za epruvete
6. dozator
7. sterilna fiziološka otopina
POSTUPAK:
1. Označite epruvetu s ALPV podlogom oznakom grupe, decimalnog razrijeđenja i
inicijalima.
2. U epruvetu s ALPV-om prebacite po 1 ml uzorka vode odgovarajućeg
decimalnog razrijeđenja pomoču pipete.
3. Inkubirati 48 h pri 44 °C.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 24
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Zadatak 4: NASAĐIVANJE ENDO-AGARA
MATERIJAL:
1. petrijevka sa Endo-agarom
2. sterilna pipeta od 1 ml
3. propipeta
4. štapić po Drigalskom
5. staklena čaša
6. špiritna lampa, šibice
7. 96%-tni etanol
POSTUPAK:
1. Na dno petrijevke s vanjske strane napisati grupu, inicijale i decimalno
razrijeđenje.
2. Na površinu ranije razlivenog Endo-agara prebacite 0.1 ml uzorka vode (original
ili decimalno razrijeđenje) pomoču pipete.
3. Uzmite savijeni stakleni štapić i uronite ga u čašu s etanolom pa ga prinesite
plamenu špiritne lampe i zapalite. Kada etanol izgori pomoću staklenog štapića
razmažite uzorak po cijeloj površini agara.
4. Uronite štapić u alkohol i spalite ga.
5. Inkubirati 48 h pri 37 °C.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 25
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 6. BRIS I ANTIBIOGRAM
______________________________________________________________________
ODREĐIVANJE BAKTERIOLOŠKE ČISTOĆE POVRŠINA (METODA BRISA)
Za određivanje stupnja kontaminacije bakterijama (broj živih bakterija) bilo koje površine najčešće se
upotrebljava metoda otirka ili brisa. Sterilan pravokutnik, najčešće izrađen od aluminija, unutrašnjih
dimenzija 5 x 4 cm, postavi se na dio površine kojoj se želi odrediti bakteriološku čistoću. S pomoću
sterilne vate na štapiću, koju smo ranije namočili u sterilnu fiziološku otopinu, prebriše se površina
unutar pravokutnika. Štapić s vatom se ponovo uroni u fiziološku otopinu u epruveti i dobro protrese
kako bi se bakterije prikupljene sa površine suspendirale u fiziološkoj otopini. Dobivenu suspenziju se
nasadi na hranjivi agar i inkubira pri 37 °C tijekom 48 sati. Broj razvijenih kolonija (CFU) se preračuna
na 1 cm2 ispitivane površine.
ISTRAŽIVANJE UTJECAJA ANTIBIOTIKA NA RAST BAKTERIJA
Antibiotik je kemijski spoj koji inhibira rast bakterija ili ih ubija uz minimalnu štetu za domaćina.
Ovakvo djelovanje ti spojevi postižu regulacijom transkripcije (quinoloni) ili translacije (tetraciklini,
makrolidi, aminoglikozidi), inhibicijom sinteze stanične stijenke (penicilini, cefalosporini),
narušavanjem strukture i funkcije stanične membrane ili blokirajući metaboličke puteve inhibicijom
enzima (sulfonamidi). Pri tome antibiotici iskorištavaju strukturne razlike prokariotskih i eukariotskih
stanica. Učinkovitost antibiotika ovisi o načinu uzimanja, smještaju infekcije, prisutnosti
interferirajućih spojeva, koncentraciji antibiotika u organizmu, preosjetljivosti prema antibioticima
(alergije) i otpornosti bakterije na antibiotik (plazmidi). S obzirom da ne postoji univerzalni antibiotik
koji bi podjednako unčikovito djelovao na sve poznate patogene prilikom odabira antibiotika s kojim će
se liječiti bolesnu osobu potrebno je odabrati lijek sa maksimalnim učinkom na bakteriju koja je
prouzročila infekciju. Ispitivanje utjecaja antibiotika na bakterije se obavlja tzv. difuzijskim testom.
Nakon što se od bolesne osobe uzme bris (grla, nosa...) napravi se suspenziju prikupljenih stanica. Po
tome ih se nasadi na hranjivu podlogu metodom razmaza po površini ranije razlivene podloge. Nakon
nasađivanja, na površinu agara se pomoću sterilne pincete stave diskovi od filter papira natopljeni
različitim antibioticima ili istim antibiotikom u različitim koncentracijama. Nakon inkubacije se
promotri oko kojih diskova (antibiotika) je došlo do inhibicije razvoja bakterija. U liječenju bi trebalo
primjeniti antibiotik sa najvećim učinkom.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 26
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Zadatak 1: IZRADA ANTIBIOGRAMA
Difuzijskim testom odrediti otpornost čiste bakterijske kulture prema antibioticima.
MATERIJAL:
1. čista kultura uzgojena na kosom agaru
2. sterilna hranjiva podloga
3. sterilna petrijevka
4. sterilna epruveta
5. stalak za epruvete
6. sterilna pipeta od 1 ml
7. propipata
8. sterilna fiziološka otopina
9. mikrobiološka ušica
10. špiritna lampa, šibice
11. 70%-tni etanol
12. pinceta
13. diskovi s različitim antibioticima
POSTUPAK:
1. Prebrišite radnu površinu vatom/ubrusom natopljenim 70%-tnim etanolom i
upalite špiritnu lampu.
2. Označite petrijevku inicijalima i grupom, te naznačite tri pozicije (a, b i c) za
kasniju montažu diska impregniranog antibiotikom. Naznačite ih tako da budu
podjednako udaljeni među sobom te od ruba petrijevke
3. Izlijte sterilnu hranjivu podlogu u sterilnu petrijevku i ostavite da se skrutne.
4. Pomoću dozatora prebacite 1 ml sterilne fiziološke otopine u praznu epruvetu.
5. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.
6. Zahvatite dio bakterijske kolonije sterilnom mikrobiološkom ušicom i prebacite
u epruvetu s fiziološkom otopinom. Napravite suspenziju.
7. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.
8. Pomoču pipete prenesite 0.2 ml suspenzije na površinu hranjive podloge pa je
razmažite sterilnim štapićem po Drigalskom. Štapić spalite poslije upotrebe.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 27
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
9. Sterilnom pincetom postavite na površinu nasađene podloge tri diska od filter
papira natopljena različitim antibioticima. Postavite ih tako da budu podjednako
udaljeni među sobom te od ruba petrijevke. U radni materijal zabilježite koji
antibiotik se nalazi na kojoj poziciji.
10. Inkubirati 48 h na 37 oC. Nakon inkubacije odrediti zone inhibicije u
milimetrima.
Zadatak 2: ODREĐIVANJE BAKTERIOLOŠKE ČISTOĆE POVRŠINA
Metodom brisa odrediti ukupni broj bakterija na 1 cm2 površine po izboru.
MATERIJAL:
1. ravnalo ili trokut, olovka
2. sterilni štapić s vatom
3. sterilna pipeta od 1 ml
4. propipata
5. sterilna epruveta
6. stalak za epruvete
7. sterilna MPA podloga
8. sterilna petrijevka
9. špiritna lampa, šibice
10. fiziološka otopina
11. 70%-tni etanol
POSTUPAK:
1. Pomoću dozatora prebacite 5 ml sterilne fiziološke otopine u sterilnu epruvetu.
2. Odaberite u laboratoriju površinu koju želite ispitati pa na njoj običnom
olovkom nacrtajte pravokutnik 5 x 4 cm.
3. Sterilni štapić s vatom blago ovlažite fiziološkom otopinom.
4. Ovlaženim dijelom štapića prebrišite nacrtani kvadrat.
5. Stavite štapić u epruvetu s fiziološkom otopinom i dobro protresite kako bi se
prikupljene bakterije suspendirale.
6. Označite petrijevku inicijalima i grupom.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 28
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
7. Pomoču pipete prenesite 1 ml pripremljene suspenzije u praznu petrijevku.
8. U petrijevku dodajte ohlađenu agarnu podlogu te laganom rotacijom petrijevke
pomješajte uzorak s podlogom.
9. Inkubirati 48 h pri 37 oC.
10. Nakon inkubacije prebrojati kolonije i preračunati broj bakterija na 1 cm2
ispitivane površine.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 29
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 7. OBRADA REZULTATA
______________________________________________________________________
Zadatak 1: ISPITIVANJE METABOLIČKIH OSOBINA BAKTERIJA
Obradite rezultate ispitivanja fizioloških svojstava bakterija.
MATERIJAL:
1. epruveta s hranjivim bujonom, diskom i filter-papirom, nakon inkubacije
2. epruveta sa želatinom, nakon inkubacije i ohlađena
3. epruveta sa ALPV-podlogom
4. petrijevka sa škrobnim agarom, nakon inkubacije
5. lugolova otopina
POSTUPAK:
1. Da li je došlo do stvaranja crnog obojenja na filter-papiru ili disku?
2. Da li je želatina nakon hlađenja u hladnjaku u krutom ili tekućem stanju?
3. Lugolovom otopinom poprskati površinu petrijevki sa škrobnom hranjivom
podlogom nakon inkubacije. Što primjećujete?
Zadatak 2: SANITARNA BAKTERIOLOGIJA
Obradite rezultate sanitarne analize vode.
Zadatak 3: ODREĐIVANJE BAKTERIOLOŠKE ČISTOĆE POVRŠINA
Odredite ukupni broj bakterija na 1 cm2 odabrane laboratorijske površine
MATERIJAL:
1. hranjiva podloga inokulirana na Praktikumu 6. za određivanje ukupnog broja
bakterija na 1 cm2 odabrane laboratorijske površine
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 30
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
2. brojači
3. lupe
4. alkoholni flomasteri
POSTUPAK:
1. Alkoholnim flomasterom označiti svaku koloniju izraslu na hranjivoj podlozi.
2. Označene kolonije prebrojati.
Zadatak 4: OBRADA ANTIBIOGRAMA
Među primijenjenim antibioticima odredite onaj na koji je bakterijska kultura
najosjetljivija.
MATERIJAL:
1. antibiogram
2. ravnalo
POSTUPAK:
1. Proučiti zone inhibicije i izmjeriti promjer svake zone u milimetrima
2. Odrediti antibiotik na koji je bakterija najosjetljivija.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 31
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
RADNI LISTOVI
______________________________________________________________________
VJEŽBA 1.
Za pripremu 150 ml hranjivog agara (Meat Peptone Agar – MPA) je potrebno odvagati ____ g
dehidrirane podloge te je suspendirati u destiliranoj vodi. Nakon pripreme podlogu se sterilizira
__________________.
Svojstvo agara (koje mu omogučava efikasnu primjenu u bakteriologiji) da ima različitu točku
taljenja i skrutnjivanja nazivamo ______________. Zbog ovog svojstva agar u temperaturnom
rasponu od 40 do 85 oC može biti _____________ ili ______________ ovisno o
početnom/prethodnom agregatnom stanju.
Nasađivanje podloge aerokontaminacijom spada u _______________ bakteriološke metode jer
se analizom ne može odrediti broj bakterija u jedinici volumena zraka. Kada se analizu provede
na način koji nam to omogučuje kažemo da je ona _______________.
Bilješke:
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 32
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 2.
Kod jednostavnih bojanja upotrebljavamo samo ______________ boju. Pri tome se kod
jednostavnog negativnog bojanja oboji ______________ preparata, a kod jednostavnog
pozitivnog bojanja ________________ _____________.
U metodi određivanja pripadnosti bakterija po Gramu s KOH zbog djelovanja hidrooksida
dolazi do puknuća stanične stijenke i lize ______ bakterija. Posljedično je došlo do povećanja
viskoznosti kapljice jer se u nju oslobodila bakterijska _______.
Jednostavno pozitivno bojanje
(vidno polje)
Opišite sliku te navedite ukupno povećanje.
Jednostavno negativno bojanje
(vidno polje)
Opišite sliku te navedite ukupno povećanje.
Metoda određivanja pripadnosti bakterija po Gramu s KOH
(predmetnica)
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 33
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 3.
Bakterijska kolonija je ________________ nakupina ____________ bakterijskih stanica.
Dvije su osnovne grupe metoda za određivanje broja bakterija: 1._______________ i
2.____________.
Radi omogućavanja laboratorijskog proućavanja bakterija razvijeni su postupci izolacije
_________ ___________.
Čista kultura se dobiva izolacijom ______________ ___________ iz mješovite kulture
razvijene na agaru.
Značajke bakterijskih kolonija na čvrstim podlogama
Oblik kolonija: okrugao, vretenast, nepravilan, nitast, korijenast Presjek kolonija: plosnat, uzdignut, konveksan, bradavičast, pupolik Rub kolonija: gladak, valovit, končast, resičav, rastrgan Izgled površine: hrapava, glatka, sluzava Prozirnost: prozirna, poluprozirna, neprozirna (mutna) Boja: žuta, narančasta, crvena, bijela, smeđa, zelena, plava Konzistencija: suha, vlažna, sluzava, maziva, žilava Miris: po užegloj masti, truleži, medu, fermentiranom voću
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 34
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
Različiti morfološki oblici bakterijskih kolonija razvijeni na agarnoj podlozi u petrijevci nakon aerokontaminacije. Bilješke:
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 35
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 4.
Stvaranje sumporovodika je posljedica katabolizma __________.
Dovršite jednadžbu: H2S + Pb(OOCCH3)2 → _______ + ________
Laktoza je _________ šećer građen od __________ i ___________.
Do razgradnje polimernih molekula (npr. želatine i škroba) dolazi zbog izlučivanja
______________.
ALPV s Durhamovim epruveticama. Lijevo negativna, desno pozitivna reakcija.
Ljubičasto obojani škrobni agar nakon reakcije s Lugolovom otopinom i radijalna obezbojena zona u
kojoj je škrob razgrađen.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 36
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 5.
Endo agar je primjer djelomično ______________ i _____________ podloge.
E. coli na endo agaru razvija crvene kolonije ___________ _____________.
Uzorak za nasađivanja Wilson-Blair podloge je predinkubiran na 80 oC kako bi se iniciralo
_____________ ___________.
Wilson-Blair podloga s razvijenim kolonijama Clostridium sp.
Bilješke:
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 37
Praktikum iz mikrobiologije - bakteriologija Zavod za kvantitativnu ekologiju
VJEŽBA 6.
Stupanj kontaminacije bakterijama neke površine se određuje metodom ________.
Ispitivanje utjecaja antibiotika na bakterije se obavlja ________ _________.
Difuzijski test otpornosti bakterijske kulture na antibiotike. Najveća zona inhibicije rasta
bakterija indicira najučinkovitiji antibiotik.
Bilješke: