Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Diplomsko delo
PRIPRAVA MAGNETNIH ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ β-GALAKTOZIDAZE
September, 2016 Kaja Jeromel
Kaja Jeromel
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
Diplomsko delo
Maribor, 2016
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje
Študent: Kaja Jeromel
Študijski program: univerzitetni študijski program I. stopnje Kemija
Predvideni strokovni naslov: diplomirani/a kemik/kemičarka (UN)
Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb
Komentor: Katja Vasić, univ. dipl. inž. kem. tehnol.
Maribor, 2016
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
I
Kazalo
Kazalo ........................................................................................................................................ I Izjava....................................................................................................................................... III Zahvala ................................................................................................................................... IV
Povzetek ................................................................................................................................... V Abstract ................................................................................................................................... VI Seznam tabel ......................................................................................................................... VII Seznam slik .......................................................................................................................... VIII Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................. X
1 Uvod in opredelitev problema ........................................................................................... 1
2 Teoretični del ..................................................................................................................... 2
2.1 Encim β-galaktozidaza ............................................................................................... 2 2.2 Imobilizacijske metode .............................................................................................. 2
2.2.1 Vezava na nosilec ............................................................................................... 3 2.2.2 Ujetje................................................................................................................... 3
2.2.3 Zamreženje ......................................................................................................... 3 2.3 Zamreženi encimski skupki (CLEAs) ........................................................................ 3
2.3.1 Priprava CLEAs .................................................................................................. 4
2.4 Magnetni zamreženi encimski skupki (mCLEAs) ..................................................... 4 2.5 Mrežni povezovalec glutaraldehid (GA).................................................................... 5
2.5.1 Fizikalne lastnosti glutaraldehida ....................................................................... 5 3 Eksperimentalni del ........................................................................................................... 6
3.1 Materiali in reagenti ................................................................................................... 6 3.2 Laboratorijska oprema in aparature ........................................................................... 6
3.3 Eksperimentalne metode ............................................................................................ 7 3.3.1 Postopek sinteze imobilizacije CLEAs ............................................................... 7 3.3.2 Imobilizacija β-galaktozidaze na maghemitne aminosilanske nanodelce in
priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov (mCLEAs)...................................... 9 3.3.3 Izvajanje testa aktivnosti pri različnih temperaturah ........................................ 10
3.3.4 Preverjanje stabilnosti CLEAs in mCLEAs pri izpostavljenosti različnim
temperaturam ................................................................................................................... 10 3.4 Analizne metode ...................................................................................................... 10
3.4.1 Učinkovitost imobilizacije ................................................................................ 10 3.4.2 Aktivnostni test ................................................................................................. 12
4 Rezultati in diskusija ....................................................................................................... 15 4.1 Ocena obarjanja encima v različnih obarjalnih reagentih ........................................ 15
4.2 Vpliv resuspendiranja po obarjanju ......................................................................... 16 4.3 Rezultati 3-urnega zamreženja encima β-galaktozidaze ob dodatku 1,5% (v/v)
mrežnega povezovalca GA ................................................................................................. 17 4.4 Rezultati spiranja po zamreženju encimskih skupkov ............................................. 18 4.5 Zamreženje encima ob prisotnosti albumina iz govejega seruma (BSA) in albumina
kokošjih jajc (EA) ............................................................................................................... 20 4.6 Vpliv časa stresanja ob dodatku GA pri sobni temperaturi na učinkovitost
imobilizacije in aktivnost imobilizirane β-galaktozidaze ................................................... 21 4.7 Vpliv časa stresanja ob dodatku GA pri 10°C na učinkovitost imobilizacije in
aktivnost imobilizirane β-galaktozidaze ............................................................................. 23
4.8 Primerjava časa zamreženja (2 uri) pri sobni temperaturi in temperaturi 10°C ...... 25
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
II
4.9 Aktivnost CLEAs in mCLEAs pri izvajanju aktivnostnega testa pri različnih
temperaturah ........................................................................................................................ 26
4.10 Vpliv skladiščenja CLEAs in mCLEAs pri različnih temperaturah na njuno
aktivnost .............................................................................................................................. 29 5 Zaključek ......................................................................................................................... 34 6 Literatura.......................................................................................................................... 35 7 Priloge .............................................................................................................................. 36
7.1 Bradfordova umeritvena krivulja ............................................................................. 36 8 Življenjepis ...................................................................................................................... 38
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
III
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.
Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:
Vir: Science direct (http://www.sciencedirect.com/)
Gesla: Število referenc
enzyme IN immobilization 749
cross linked enzyme aggregates IN CLEAs 451
β-galactosidase IN immobilization 33
Vir: Digitalna knjižnica Univerze v Mariboru (http://dkum.uni-mb.si/Iskanje.php)
Gesla: Število referenc
Zamreženi encimski skupki 10
β-galaktozidaza 3
Skupno število pregledanih člankov: 46
Skupno število pregledanih knjig: 4
Maribor, september 2016 Kaja Jeromel
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
IV
Zahvala
Rada bi se zahvalila svoji mentorici red. prof. dr. Maji Leitgeb
za vso potrpežljivost in pomoč pri vodenju in usmerjanju pri
izdelavi moje diplomske naloge.
Velika zahvala gre tudi somentorici univ. dipl. inž. kem. teh.
Katji Vasić, ki mi je stala ob strani pri eksperimentalnem delu
z dobrimi nasveti in nepogrešljivo pomočjo.
Še posebej pa se zahvaljujem moji družini in vsem, ki so vsa
leta študija verjeli vame.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
V
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
Povzetek
Namen diplomskega dela je bil pripraviti aktivne zamrežene encimske skupke (CLEAs) in
magnetne zamrežene encimske skupke (mCLEAs) iz encima β-galaktozidaze ter pri tem
doseči čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostanek aktivnosti encima β-galaktozidaze.
Pri tem smo optimirali parametre, da smo prišli do čim boljših rezultatov. Priprava CLEAs in
mCLEAs je bila sestavljena iz postopka obarjanja in zamreženja. Pri obarjanju smo med
drugim preučevali, katera organska topila so se izkazala kot najboljši obarjalni reagenti.
Zamreženje pa smo optimirali s spreminjanjem časa in temperature.
Ugotovili smo, da so najboljši obarjalni reagenti za pripravo CLEAs etanol, aceton, 1-
propanol in 2-propanol, za pripravo mCLEAs pa etanol, 1-propanol in 2-propanol. Optimalni
pogoji za pripravo CLEAs in mCLEAs so koncentracija encima β-galaktozidaze 50 mg/ml in
2-urno zamreženje pri 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca glutaraldehida
(GA). Ugotovili smo tudi, da so CLEAs in mCLEAs pri 2-urni izpostavljenosti na 50°C še
stabilni, medtem ko pri izpostavljenosti na 70°C njihova aktivnost upade.
Ključne besede: β-galaktozidaza, zamreženi encimski skupki, mrežni povezovalec,
obarjanje, zamreženje, imobilizacija
UDK: 543.645.4(043.2)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
VI
Preparation of magnetic cross-linked enzyme aggregates from β-galactosidase
Abstract
The purpose of the diploma work was to prepare cross-linked enzyme aggregates (CLEAs)
as well as magnetic cross-linked enzyme aggregates (mCLEAs) from the enzyme β-
galactosidase and achieve the highest efficiency of immobilization and the remaining
activity of the enzyme β-galactosidase. With this process we optimized the parameters to
achieve the best possible results. The preparation on CLEAs and the mCLEAs consisted of
two procedures: precipitation and cross-linking. With the first we were examining which
organic solvents worked out most beneficially. We optimized the cross-linking with
variations in time and temperature.
We determined that the best precipitated reagents for the preparation of CLEAs are ethanol,
acetone, 1-propanol and 2-propanol and for the preparation of mCLEAs are ethanol 1-
propanol and 2-propanol. The most optimal conditions for the preparation of CLEAs and
mCLEAs occur with the concentration of the enzyme β-galactosidase 50 mg/ml, at a 2 hours
cross-linking at 10°C with adding 1,5% (v/v) cross-linking agent glutaraldehyde (GA). We
also realized that CLEAs and mCLEAs still remain stable when exposed to 50°C for 2 hours,
but they lose their stability at 70°C.
Key words: β-galactosidase, cross-linked enzyme aggregates, cross-linking agent,
precipitation, cross-linking, immobilisation
UDK: 543.645.4(043.2)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
VII
Seznam tabel
4-1 Kvalitativna ocena obarjanja encima v različnih obarjalnih reagentih ............................ 15
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
VIII
Seznam slik
Slika 2-1 Funkcije encima β-galaktozidaze [2]......................................................................... 2
Slika 2-2 Prikaz različnih imobilizacijskih metod [3] .............................................................. 3
Slika 3-1 Prikaz obarjanja, ki smo ga ocenili na neuspešno ..................................................... 8
Slika 3-2 Prikaz obarjanja, ki smo ga ocenili na uspešno ......................................................... 8
Slika 3-3 Prikaz CLEAs po centrifugiranju ter odvzemu supernatanta, na katerih smo
opravili vse meritve ................................................................................................................... 9
Slika 3-4 Prikaz mCLEAs po centrifugiranju ter odvzemu supernatanta, na katerih smo
opravili vse meritve ................................................................................................................. 10
Slika 3-5 Prikaz obarvanosti raztopin pri Bradfordovi metodi ............................................... 11
Slika 3-6 Nastanek β-D-galaktoze in o-nitrofenola iz o-nitrofenol- β-galaktozida (hidroliza)
[12] .......................................................................................................................................... 12
Slika 3-7 Prikaz obarvanosti pri aktivnostnem testu. Bolj kot je bila raztopina rumene barve,
višja je bila izmerjena aktivnost. ............................................................................................. 13
Slika 4-1 Prikaz učinkovitosti in preostale aktivnosti po obarjanju encima s koncentracijo
100 mg/ml v vseh obarjalnih reagentih in po resuspendiranju z 900 µl pufra PBS ............... 16
Slika 4-2 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 3-urnem
zamreženju encima s koncentracijama 50 in 100 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA ...................................................................................................................... 17
Slika 4-3 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 3-urnem
zamreženju encima s koncentracijama 50 in 100 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA ...................................................................................................................... 18
Slika 4-4 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 3-urnem
zamreženju encima s koncentracijo 50 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca
GA in dveh spiranjih z 900 µl pufra PBS ............................................................................... 19
Slika 4-5 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 3-urnem
zamreženju encima s koncentracijo 50 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca
GA in dveh spiranjih z 900 µl pufra PBS ............................................................................... 19
Slika 4-6 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs ob dodatku BSA
in EA v razmerju 3:1in pri uporabi koncentracije encima β-galaktozidaze 50 mg/ml in 100
mg/ml ...................................................................................................................................... 20
Slika 4-7 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 in 3-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri sobni temperaturi
(T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ................................................ 21
Slika 4-8 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 in 3-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri sobni temperaturi
(T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ................................................ 22
Slika 4-9 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 in 3-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob
dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ..................................................................... 23
Slika 4-10 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 in 3-
urnem zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C
ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ................................................................ 24
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
IX
Slika 4-11 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 -urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C in sobni
temperaturi (T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ............................ 25
Slika 4-12 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 -urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C in sobni
temperaturi (T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ............................ 26
Slika 4-13 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima
β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v)
mrežnega povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 50°C .................................................. 27
Slika 4-14 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima
β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v)
mrežnega povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 70°C .................................................. 27
Slika 4-15 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob
dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 50°C v primerjavi
z aktivnostim testom opisanim v poglavju 3.4.2. ................................................................... 28
Slika 4-16 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob
dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 70°C v primerjavi
z aktivnostnim testom opisanim v poglavju 3.4.2. ................................................................. 29
Slika 4-17 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima
β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v)
mrežnega povezovalca GA po inkubiranju na 50°C 2 uri ...................................................... 30
Slika 4-18 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima
β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v)
mrežnega povezovalca GA po inkubiranju na 70°C 2 uri ...................................................... 31
Slika 4-19 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob
dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA po inkubiranju na 50°C 2 uri v primerjavi z
neinkubiranimi CLEAs in mCLEAs ....................................................................................... 32
Slika 4-20 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob
dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA po inkubiranju na 70°C 2 uri v primerjavi z
neinkubiranimi CLEAs in mCLEAs ....................................................................................... 32
Slika 7-1 Prva Bradfordova umeritvena krivulja .................................................................... 36
Slika 7-2 Druga Bradfordova umeritvena krivulja ................................................................. 36
Slika 7-3 Tretja Bradfordova umeritvena krivulja.................................................................. 37
Slika 7-4 Četrta Bradfordova umeritvena krivulja ................................................................. 37
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
X
Uporabljeni simboli in kratice
Simboli c množinska koncentracija (mol/l)
M molarnost (mol/l)
V prostornina (ml, μl)
A absorbanca (nm)
Grški simboli
masna koncentracija (mg/ml)
φ prostorninski delež (% (v/v))
Kratice
BSA albumin iz govejega seruma
CLEAs zamreženi encimski skupki
EA albumin iz kokošjih jajc
GA glutaraldehid
mCLEAs magnetni zamreženi encimski skupki
NaBH3CN natrijev-cianoborov hidrid
NH2 amino skupina
PBS fosforni pufer
PEHA pentaetilenheksamin
pH vrednost pH
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
1
1 Uvod in opredelitev problema
Encimi so naravni katalizatorji, ki so biokompatibilni, biorazgradljivi in pridobljeni iz
obnovljivih virov. Industrijsko uporabo encimov pogosto ovira pomanjkanje dolgoročne
stabilnosti in težka ponovna uporaba encima. Te pomanjkljivosti lahko odpravimo z
imobilizacijo encima. Imobiliziran encim je encim, ki je vezan na inertno, netopno snov.
Prednost imobiliziranih encimov je, da se lahko ponovno uporabijo in da se pri imobilizaciji
stabilizirajo. Imobiliziran encim lahko zagotavlja večjo odpornost na spremembe pogojev,
kot so pH ali temperatura. Pomembni so za komercialne namene, saj imajo številne prednosti
v samih stroških in procesu reakcije. [3][35][11]
Diplomsko delo zajema predvsem področje imobilizacije in zamreženja encima β-
galaktozidaze.
Ukvarjali smo se z imobilizacijo β-galaktozidaze brez nosilca, pri kateri nastanejo zamreženi
encimski skupki (CLEAs). Prednost CLEAs je, da v enem koraku izvedemo čiščenje in
vezavo encima. Dodajanje organskih topil vodni raztopini proteinov vodi do njihovega
obarjanja, naslednja faza za pripravo CLEAs pa je zamreženje v obliki encimskih skupkov.
Za zamreženje uporabimo mrežni povezovalec. Največkrat je to glutaraldehid (GA), zaradi
ugodne cene in enostavne uporabe. Pomembno je, da uporabimo optimalno količino le-tega,
saj lahko drugače pride do deaktivacije encima. Po zamreženju CLEAs ločimo s
centrifugiranjem in dobimo zamrežene skupke encimov. [1][8]
Prednosti CLEAs so, da jih lahko pripravimo iz neobdelanih encimov, nimamo stroškov z
nosilci, čiščenje in vezavo encima opravimo v enem koraku, njihovo skladiščenje je
enostavno, imajo visoko katalitsko produktivnost, enostavno jih je ločiti in tudi ponovno jih
lahko uporabimo. [15]
Glavni namen diplomskega dela je bila priprava aktivnih zamreženih encimskih skupkov in
magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz encima β-galaktozidaze in sočasna
optimizacija parametrov, da bi dosegli čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostanek
aktivnosti encima. Iskali smo tudi najbolj primerne obarjalne reagente. Diplomsko delo
obsega opis vseh uporabljenih eksperimentalnih in analiznih metod, nekaj teoretičnih
dejstev, na koncu pa so predstavljeni in interpretirani še doseženi rezultati.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
2
2 Teoretični del
2.1 Encim β-galaktozidaza Ima tri encimske aktivnosti. Cepi lahko disaharidno laktozo, da se tvorita glukoza in
galaktoza, ki nadalje vstopata v proces glikolize in se uporabita kot vir energije. Katalizira
lahko transgalaktozilizo laktoze do alolaktoze ali pa lahko cepi alolaktozo v monosaharide.
Uporablja se v genetiki, molekularni biologiji in drugih znanostih. V molekularni biologiji se
običajno uporablja kot reporterski označevalec (marker) za spremljanje genske ekspresije.
Uporablja pa se tudi za blaženje simptomov laktozne intolerance. [3][11]
Slika 2-1 Funkcije encima β-galaktozidaze [2]
2.2 Imobilizacijske metode Imobilizacija encima je ponavadi zahteva za uporabo encima kot industrijskega
biokatalizatorja. Imobilizacijske tehnike so bile v zadnjem času zelo močno orodje za
izboljšanje skoraj vseh lastnosti encima, npr. stabilnost, aktivnost in selektivnost. [6]
Metode imobilizacije encimov lahko razdelimo v tri kategorije: vezava na nosilec, ujetje in
zamreženje.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
3
Slika 2-2 Prikaz različnih imobilizacijskih metod [3]
2.2.1 Vezava na nosilec
Vezava na nosilec je lahko fizikalna (npr. hidrofobne in van der Waalsove interakcije),
ionska ali kovalentna. Fizikalna vezava pri strogih industrijskih pogojih visoke koncentracije
reaktanta in produkta ter pri veliki ionski moči je običajno preveč šibka, da bi encim obdržali
na nosilcu. Ionska vezava je večinoma močnejša. S kovalentno vezavo imobiliziramo le
nizke koncentracije encimov, kar pa preprečuje uhajanje encima s površine nosilca.
Tipični nosilci za imobilizacijo encimov so sintetične smole, biopolimeri ter anorganske
trdne snovi, kot so npr. silicijev dioksid (angl. "silica") SiO2 ali zeoliti. [3]
2.2.2 Ujetje
Pri tej metodi gre za ujetje encima v zamrežen polimer. Običajno so vključene organske in
anorganske matrice polimera, kot so poliakrilamidni in silikatni sol-gel. Encim se lahko
deaktivira ali pa se izgubi. [3]
2.2.3 Zamreženje
Zamreženje je navzkrižno povezovanje encimskih agregatov ali kristalov. Tehnika
zamreženja proteina preko reakcije, npr. glutaraldehida z reaktivno NH2 skupino na površini
proteina, je bila odkrita več kot 40 let nazaj. Kljub temu zamreženi encimi kažejo nizko
ohranitev dejavnosti, slabo ponovljivost in majhno mehansko stabilnost. Zaradi svoje
želatinaste strukture je z njimi tudi težko ravnati. [3]
Vezava na nosilec je postala najbolj razširjena encimska imobilizacijska metoda.
2.3 Zamreženi encimski skupki (CLEAs)
Znano je, da dodajanje soli, vodotopnih organskih topil ali neionskih polimerov k vodnim
raztopinam proteinov vodi do njihovega obarjanja v skupke, ki so povezani z nekovalentnimi
vezmi, brez motnje njihove terciarne strukture torej brez denaturacije.
Navzkrižno povezovanje oz. zamreženje teh skupkov jih naredi trajno netopne, medtem ko
agregati vzdržujejo svojo superstrukturo. Zato se pojavi njihova katalitična aktivnost. To je
privedlo do razvoja nove skupine imobiliziranih encimov: CLEAs. Odkar se obarjanje
uporablja za čiščenje encimov, metoda s CLEAs v bistvu združuje čiščenje in imobilizacijo v
eno skupno operacijo, ki ne zahteva zelo čistega encima. [1]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
4
Če encim izkazuje omejeno termično stabilnost in nizko toleranco na organska topila, je
idealen kandidat za stabilizacijo z imobilizacijo.
CLEAs imajo številne prednosti v smislu industrijskih aplikacij. Ni potrebe za zelo čisti
encim. Lahko jih pripravimo iz zelo nedodelanih oz. surovih encimskih pripravkov. Kažejo
visoko katalitsko produktivnost in preprosto okrevanje in recikliranje. Na splošno imajo
izboljšano skladiščenje in operativno stabilnost glede na denaturacijo s toploto, organskimi
topili in avtolizo. So tudi stabilni proti izpiranju v vodnem mediju. Še ena lastnost CLEAs
je, da je odlična metoda za stabilizacijo kvartarnih struktur multimernih encimov.
Pomembna lastnost je tudi njihova velikost delčkov (angl. "particle size"), ki je ponavadi v
območju 5 nm do 50 nm. Zelo lahko jih ločimo s filtracijo, še boljše pa s centrifugiranjem.
Imajo nizke pridelovalne stroške, saj ne potrebujemo dragih nosilcev. [3]
2.3.1 Priprava CLEAs
Priprava zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) je postopek brez uporabe nosilca, saj
združujemo encime v 3D strukturo. Razdeljena je na več korakov. Prvi korak je obarjanje, ki
je lahko uspešno ali pa ga ocenimo za neuspešno. Če dobimo belo oz. motno suspenzijo, to
pomeni, da smo encim oborili uspešno. Obarjanje moramo izvajati počasi in sicer tako, da k
obarjalnemu reagentu po kapljicah dodajamo raztopino encima. Drugi del postopka priprave
CLEAs pa je zamreženje encimskih skupkov. Dodamo mrežni povezovalec oz. zamreževalo
in nato vse skupaj točno določen čas zamrežujemo. Dobimo suspenzijo, ki vsebuje CLEAs
in preostali prosti encim. Ta pristop je najbolj preprost in natančen način za določanje
aktivnosti CLEAs. Zelo pomemben je čas zamreženja, saj ravno ta določa čas
izpostavljenosti encima obarjalnemu reagentu. Prav tako je pomembno, katero zamreževalo
(angl. "cross-linker") uporabimo. Čas, potreben za popolno zamreženje, je odvisen tudi od
temperature. Nasplošno naj bi veljalo zamreženje pri sobni temperaturi, ki naj bi trajalo 3
ure, vendar z optimizacijo vseh parametrov (koncentracija mrežnega povezovalca,
temperatura zamreženja, čas zamreženja ...) lahko dosežemo boljše rezultate. [8]
2.4 Magnetni zamreženi encimski skupki (mCLEAs) Magnetni zamreženi encimski skupki so pripravljeni z adicijo funkcionaliziranih amino
magnetnih nanodelcev kot dodatek v encimsko raztopino. Iz te raztopine s pomočjo
obarjanja pridobimo agregate oz. skupke, ki se potem zamrežijo skupaj z nanodelci.
Nanodelci imajo zaradi svoje velikosti veliko površinsko območje, zato jih lahko prevlečemo
z velikim številom amino skupin. Poleg tega zaradi magnetnih lastnosti magnetnih
nanodelcev dobimo mCLEAs, ki jo lahko zlahka nadzorujemo in ločimo od reakcijske zmesi
že samo z uporabo magnetnega polja. S tem se lahko izognemo centrifugiranju in filtraciji.
[7]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
5
2.5 Mrežni povezovalec glutaraldehid (GA)
Med številnimi razpoložljivimi zamreževalnimi sredstvi je glutaraldehid nedvomno daleč
najbolj uporabno sredstvo na različnih področjih kot so mikroskopija, encimska tehnologija,
biomedicina in farmacevtske znanosti. Je linearni dialdehid (C5H8O2) s 5 ogljikovimi atomi.
Je brezbarvna, oljnata tekočina, ki je topna v vseh razmerjih v vodi in alkoholih kot tudi v
organskih topilih. Je zelo uporaben zaradi svoje tržne dostopnosti in nizkih stroškov, poleg
tega pa ima tudi visoko reaktivnost. Hitro reagira z aminsko skupino in je učinkovitejši od
drugih aldehidov pri tvorjenju termično in kemično stabilne vezi.
Glutaraldehid je pogosto uporabljen kot blago zamreževalno sredstvo pri imobilizaciji
encimov, saj reakcija v vodni raztopini pufra tako poteče pod pogoji blizu fiziološke pH,
ionske trdnosti in temperature.
V literaturi sta največkrat omenjeni dve metodi z uporabo glutaraldehida: tvorba
tridimenzionalne mreže kot posledica intermolekularnega zamreženja in vezava na netopni
nosilec (npr. najlon, zamreženi proteini, kot sta želatina ali goveji serum albumin (BSA),
polimeri z amino skupino, …) .
Koncentracijo encima in glutaraldehida moramo skrbno nadzorovati, da preko zamreženja
dobimo v vodi netopne derivate encimov. Paziti moramo, da izberemo takšne pogoje, da se
intermolekularno zamrežujejo molekule encimov in ne prihaja do intramolekularnega
zamreženja, ki ga ponavadi povzročijo nizke koncentracije encima in glutaraldehida. Znano
je, da količina uporabljenega zamreževala vpliva na stopnjo oziroma obseg zamreženja.
Encimska aktivnost je obratno sorazmerna koncentraciji uporabljenega glutaraldehida, saj
lahko obsežno zamreženje povzroči izkrivljanje oziroma popačenje strukture encima.
Uspeh glutaraldehida kot zamreževala je posledica njegove večkomponentne narave, kjer je
prisotnih več oblik v ravnotežju raztopine reagenta pri določenem pH. [5]
2.5.1 Fizikalne lastnosti glutaraldehida
Glutaraldehid se pojavlja kot prozorna oziroma brezbarvna tekočina z gostoto 1,06 g/ml.
Njegovo tališče je pri -14°C, vrelišče pa pri 187°C. Topen je v vodi, etanolu, ocetni kislini,
kloroformu, etru in drugih organskih topilih. Nevarni so njegovi hlapi, ki dražijo nos, oči in
kožo. Glutaraldehid ni vnetljiv, uporablja se predvsem kot razkužilo in zamreževalno
sredstvo. [13]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
6
3 Eksperimentalni del
3.1 Materiali in reagenti Uporabili smo naslednje kemikalije:
Encim β-galaktozidaza iz Aspergillus oryzae, Sigma
2-nitrofenol β-D-galaktopiranozid, Sigma
BSA – albumin iz govejega seruma, Sigma-Aldrich
EA-albumin iz kokošjih jajc, Sigma-Aldrich
Na2CO3 – natrijev karbonat, brezvodni, Kemika Zagreb
Glutaraldehid, Sigma-Aldrich
C2H3NaO2- natrijev acetat, brezvodni, Kemika Zagreb
PEHA – pentaetilenheksamin, Aldrich
NaBH3CN- natrijev cianoborov hidrid, Merck
Coomassie Brilliant Blue G 250, Merck
Aceton, Carlo Erba reagents
Etanol, Sigma Aldrich
1-propanol, Merck
2-propanol, Sigma-Aldrich
n-heksan, Merck
metanol, Carlo Erba reagents
1-butanol, Merck
Acetonitril, Sigma-Aldrich
Amonijev sulfat, Fluka Chemika
Dietil eter, Sigma-Aldrich
3.2 Laboratorijska oprema in aparature
Steklene čaše (30 ml, 50 ml, 100 ml)
Steklene bučke (100 ml)
Steklena palčka
Spatula
Grelnik
Magnet
Centrifugirke (50 ml)
Mikrocentrifugirke (1,5 ml, 2ml)
Stojalo za (mikro) centrifugirke
Pipete (0,1 ml, 1 ml, 5 ml)
Termometer
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
7
pH-meter, Hanna Instruments, Madžarska
Vorteks, Mikro+Polo, Slovenija
Tehtnica, Sartorius, Nemčija
Stresalnik, Heidolph Unimax 1010, Nemčija
Centrifuga, Eppendorf Centrifuge 5804R, Nemčija
UV-VIS spektrofotometer, Varian Cary 50 Probe
Magnetno mešalo, Rotamix Slovenija
Sušilnik (Binder, Nemčija)
3.3 Eksperimentalne metode
3.3.1 Postopek sinteze imobilizacije CLEAs
Postopek za pripravo zamreženih encimskih skupkov (angl. "cross-linked enzyme
aggregates") je sestavljen iz dveh stopenj:
obarjanja in
zamreženja
3.3.1.1 Obarjanje encima β-galaktozidaze
Izbrali smo nekaj organskih topil, ki naj bi bili potencialni dobri obarjalni reagenti. Pri
obarjanju je bil volumski delež obarjalnega reagenta 90% (v/v) in volumski delež encima
10% (v/v). V centrifugirko smo odpipetirali 900 μl obarjalnega reagenta in mu kasneje
počasi po kapljicah dodali 100 μl raztopine encima. Vse skupaj smo obarjali 40 minut ob
konstantnem stresanju in na koncu raztopino centrifugirali 5 minut pri 11 000 rpm/minuto.
Po končanem centrifugiranju smo odpipetirali supernatant, izmerili koncentracijo proteinov
po Bradfordovi metodi in izmerili aktivnost encima. Glede na rezultate smo določili, kateri
obarjalni reagenti so najboljši, preostale pa izločili.
Kot obarjalne reagente smo preizkusili naslednja organska topila:
Aceton
Etanol
1-propanol
2-propanol
n-heksan
metanol
1-butanol
Acetonitril
Amonijev sulfat (0.1M, 0.2M, 0.5M, 1M, 2M, 2.5M, 3M)
Dietil eter
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
8
Slika 3-1 Prikaz obarjanja, ki smo ga ocenili na neuspešno
Slika 3-2 Prikaz obarjanja, ki smo ga ocenili na uspešno
3.3.1.2 Zamreženje encima β-galaktozidaze v encimske skupke (CLEAs)
Zamrežene encimske skupke dobimo s postopkom obarjanja, opisanega v poglavju 3.3.1.1 in
s postopkom zamreženja encima.
Za zamreženje smo sprva uporabili različne kombinacije encima in stabilizacijskih proteinov
BSA ter EA.
obarjali smo encim (100 mg/ml ali 50 mg/ml): 100 μl encima smo počasi po
kapljicah dodajali v raztopino obarjalnega reagenta in mešali 40 minut
BSA+PEHA: v mikrocentrifugirko smo odpipetirali 100 μl encima, 100 μl BSA
(goveji serum albumin) in 200 μl PEHA (pentaetilenheksamin) ter mešali 40 minut.
BSA+EA: v razmerju 3:1 smo zmešali 300 μl BSA (30 mg/ml) in 100 μl EA (50
mg/ml). 100 μl te mešanice smo zmešali s 100 μl encima (100 mg/ml ali 50 mg/ml)
in dodali 200 μl PEHA ter mešanico mešali 20 minut. Sledilo je obarjanje s 100 μl
mešanice in nadaljnjo mešanje 40 minut.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
9
Obarjanje smo preizkušali z različnimi obarjalnimi reagenti: aceton, etanol, 1-propanol, 2-
propanol, 1-butanol, n-heksan, metanol, acetonitril, dietil eter in amonijev sulfat. Pripravili
smo raztopino encima (100 ali 50 mg/ml). 100 μl te raztopine smo obarjali v 900 μl
obarjalnega reagenta. Raztopino smo mešali 40 minut. Nato je nastopila stopnja zamreženja.
Dodali smo mrežni povezovalec glutaraldehid (1,0 % (v/v) ali 1,5 % (v/v)) in mešali še 2 ali
3 ure. Mešali smo pri sobni temperaturi ali pri 10°C. Po pretečenem času smo dodali še 100
μl 100 mM NaBH3CN ter stresali še dodatnih 40 minut. Po končanem zamreženju smo
raztopino centrifugirali 5 minut na 11 000 rpm/min. Odpipetirali smo supernatant, v katerem
smo izmerili koncentracijo proteinov po Bradfordovi metodi, peletek pa smo uporabili za
aktivnostni test. V primeru, da se nam oborina po prvem centrifugiranju ni dobro posedla,
smo ponovno centrifugirali in nato odvzeli supernatant, v katerem smo nadalje opravili
meritve.
Slika 3-3 Prikaz CLEAs po centrifugiranju ter odvzemu supernatanta, na katerih smo opravili vse
meritve
Testirali smo tudi rezultate po dveh spiranjih. Prvo spiranje je sledilo po obarjanju,
zamreženju in centrifugiranju. Ko smo odvzeli supernatant, smo dodali 900 μl pufra PBS in
ponovno centrifugirali 3 minute na 11 000 rpm/min. Po prvem spiranju smo prav tako
odvzeli supernatant za merjenje koncentracije proteinov, na peletku pa smo naredili
aktivnostni test.
Isti postopek je bil za vzorce po dveh spiranjih, kjer smo vzorce ponovno sprali z 900 μl PBS
in meritve opravili po identičnem postopku kot pri prvem spiranju.
3.3.2 Imobilizacija β-galaktozidaze na maghemitne aminosilanske nanodelce in priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov (mCLEAs)
Pripravili smo si mešanico encima z aminosilanskimi delci: 5 mg aminosilanskih nanodelcev
smo dodali 100 μl encima (50 g/ml) in 300 μl pufra PBS.
Mešanico smo stresali 40 minut. Po stresanju smo 100 μl mešanice obarjali v 900 μl
obarjalnega reagenta. Sledil je enak postopek kot pri pripravi zamreženih encimskih
skupkov. Opisan je v poglavju 3.3.1.2
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
10
Slika 3-4 Prikaz mCLEAs po centrifugiranju ter odvzemu supernatanta, na katerih smo opravili vse
meritve
3.3.3 Izvajanje testa aktivnosti pri različnih temperaturah
Regente za aktivnostni test smo pripravili po klasičnem postopku, vendar smo vzorce med
testom za 10 minut izpostavili na 50°C in 70°C. Tako smo ugotavljali spremembe aktivnosti.
3.3.4 Preverjanje stabilnosti CLEAs in mCLEAs pri izpostavljenosti različnim temperaturam
CLEAs in mCLEAs smo pripravili po že znanem in v prejšnjih poglavjih opisanem postopku
pri optimalnih pogojih (2 uri zamreženja pri 10°C in ob dodatku 1,5% (v/v) glutaraldehida).
Kasneje smo vzorce izpostavili za 2 uri temperaturam 50°C in 70°C ter na koncu izmerili
preostalo aktivnost encima imobilizirane β-galaktozidaze.
3.4 Analizne metode
3.4.1 Učinkovitost imobilizacije
3.4.1.1 Bradfordova metoda za določevanje skupnih proteinov
Pripravili smo Bradfordov reagent po naslednjem postopku: v 50 ml 95% etanola in v 100
ml 85% (v/v) fosforne kisline (H3PO4) smo raztopili 100 mg Coomassie Brilliant Blue ter
razredčili z Milli-Q vodo do oznake 1 L.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
11
Kasneje smo pripravili umeritveno krivuljo: za pripravo smo uporabili protein albumin v
koncentracijskem območju od 0 do 1 mg/L. Natehtali smo 10 mg albumina in mu dodali 1
ml Milli-Q vode. 10 mg/ml smo razredčili po naslednjem postopku:
samo Milli-Q voda (Blank)->0,0 mg/ml
20 µl albumina (10mg/ml) + 980 µl Milli-Q vode -> 0,2 mg/ml
40 µl albumina (10mg/ml) + 960 µl Milli-Q vode -> 0,4 mg/ml
60 µl albumina (10mg/ml) + 940 µl Milli-Q vode -> 0,6 mg/ml
80 µl albumina (10mg/ml) + 920 µl Milli-Q vode -> 0,8 mg/ml
100 µl albumina (10mg/ml) + 980 µl Milli-Q vode -> 1,0 mg/ml
Vzorec za določanje smo pripravili tako, da smo v mikrocentrifugirko odpipetirali 1 ml
Bradfordovega reagenta in mu dodali 20 µl vzorca. Mikrocentrifugirko smo zvorteksirali in
inkubirali 15 minut na sobni temperaturi. Absorbanco smo merili pri 595 nm, za slepi vzorec
pa smo namesto vzorca vzeli 20 µl Milli-Q vode.
Bolj kot je bila raztopina obarvana modro, več je bilo prisotnega prostega encima v vzorcu.
Slika 3-5 Prikaz obarvanosti raztopin pri Bradfordovi metodi
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
12
3.4.1.2 Izračun učinkovitosti imobilizacije
Po Bradfordovi metodi za določanje proteinov smo iz dobljenih podatkov izračunali
učinkovitost imobilizacije, ki nam pove, koliko encima se je uspelo vezati na površino
magnetnih nanodelcev.
Enačba za izračun učinkovitosti imobilizacije:
100)(
(%)
i
si
c
cc
(3.1)
Kjer so:
ρ koncentracija imobiliziranega encima (mgencim/gnosilec)
ci koncentracija prostega encima (mg/ml)
cs koncentracija encima v spiranjih (mg/ml)
Vvzorec volumen vzorca (ml)
mn masa nosilca (magnetnih nanodelcev) (g)
3.4.2 Aktivnostni test
Aktivnost encima β-galaktozidaze smo določali po naslednjem principu:
Slika 3-6 Nastanek β-D-galaktoze in o-nitrofenola iz o-nitrofenol- β-galaktozida (hidroliza) [12]
Pri aktivnostnem testu β-galaktozidaze smo morali upoštevati naslednje pogoje: T=37°C,
pH=6.0, A405nm
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
13
Potrebovali smo 4 različne reagente.
- Reagent A smo pripravili iz 100 mM natrijevega acetatnega pufra, ki smo ga raztopili
v 100 ml deionizirane vode. Raztopino smo pri 37°C umerili na pH 6.0 z 1M HCl.
- Reagent B smo pripravili iz 2,0 mM o-nitrofenol β-D-galaktopiranozida z 0,01%
(v/v) BSA (goveji serum albumin) v 100 ml reagenta A. Tudi to smo po potrebi
umerili na pH 6.0 pri 30°C.
- Reagent C pa smo pripravili iz 1000 mM natrijevega karbonata, ki smo ga raztopili v
100 ml deionizirane vode.
- Reagent D je predstavljal raztopino encima β-galaktozidaze ali pelet, na katerem smo
testirali aktivnost.
Aktivnostni test smo izvajali tako, da smo s pomočjo mililitrske pipete dozirali reagente.
Najprej smo dodali 500 µl reagenta B, kasneje dodali 300 µl deionizirane vode, premešali in
inkubirali na 37°C ter na koncu dodali 200 µl našega vzorca, ki ga je skoraj vedno
predstavljal pelet (CLEAs ali mCLEAs), oziroma reagent D. Vzporedno smo po enakem
postopku izvajali slepo probo (blank), pri kateri smo namesto reagenta D dodali 200 µl
deionizirane vode. Mešali smo natanko 10 minut in po tem času dodali 4 ml reagenta C.
Vzorce smo centrifugirali na 11 000 rpm 5 minut in nato izmerili absorbanco pri 405 nm.
Bolj kot je bila raztopina rumene barve, višja je bila izmerjena aktivnost vzorca.
Slika 3-7 Prikaz obarvanosti pri aktivnostnem testu. Bolj kot je bila raztopina rumene barve, višja je
bila izmerjena aktivnost.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
14
3.4.2.1 Izračun preostale aktivnosti
Aktivnost encima smo izračunali po naslednji enačbi:
2,06,410
5)(/
dfAAencimamlU sv (3.2)
Pri čemer so:
5 celotni volumen vzorca (ml)
10 čas testa (min)
4,6 milimolarni koeficient ekstinkcije o-nitrofenila pri 405 nm
df razredčitveni faktor
0,2 volumen porabljenega encima (ml)
As absorbanca slepe probe
Av absorbanca vzorca
Preostala aktivnost je tako:
100(%) encimačistegaaktivnost
CLEAaktivnostA (3.3)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
15
4 Rezultati in diskusija
4.1 Ocena obarjanja encima v različnih obarjalnih reagentih
Obarjanje je potekalo tako, da smo 100 µl encima (γ =100 mg/ml) po kapljicah obarjali v
900 µl obarjalnega reagenta. Obarjanje smo ocenili kot uspešno v primeru nastanka bele
oborine. V primeru tvorbe dveh faz pa smo obarjanje ocenili za neuspešno. Motno oz. belo
oborino smo dobili v primeru etanola, acetona, 1-propanola, 2-propanola, acetonitrila in
metanola. V primeru n-heksana, dietil etra, 1-butanola in amonijevega sulfata (0.1M, 0.2M,
0.5M, 1M, 2M, 2.5M, 3M) pa smo dobili dve fazi in obarjanje ocenili kot neuspešno ter ta
organska topila enostavno izločili. Če je bilo obarjanje uspešno, je sledilo centrifugiranje, pri
katerem se je oborina dobro ločila od supernatanta.
Rezultate prikazuje tabela 4-1.
4-1 Kvalitativna ocena obarjanja encima v različnih obarjalnih reagentih
Obarjalni reagent Opažanja
etanol bela oborina
aceton bela oborina
1-propanol bela oborina
2-propanol bela oborina
n-heksan 2 fazi
acetonitril bela oborina
1-butanol 2 fazi
metanol bela oborina
dietil eter 2 fazi
amonijev sulfat (0.1M, 0.2M, 0.5M, 1M, 2M, 2.5M in
3M)
2 fazi
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
16
4.2 Vpliv resuspendiranja po obarjanju
Po obarjanju smo testirali še aktivnost resuspendiranega encima. Resuspendiranje smo
izvedli tako, da smo po obarjanju vzorec centrifugirali ter odvzeli supernatant. Nato smo na
peletek dodali 900 µl pufra PBS ter izmerili aktivnost po istem postopku.
Slika 4-1 prikazuje primerjavo dobljenih rezultatov po samem obarjanju in po obarjanju ter
dodatnem resuspendiranju.
Pri obarjanju smo dosegli dobre rezultate, saj je aktivnost encima na peletku pri vseh vzorcih
znašala čez 100% in tudi učinkovitost imobilizacije je bila pri vseh obarjalnih reagentih nad
90%. Najvišjo preostalo aktivnost encima smo s 104,05% dosegli v primeru uporabe etanola
kot obarjalnega reagenta, najnižjo pa z 100,80% v primeru uporabe 2-propanola. Najvišja
učinkovitost imobilizacije je znašala 98,88% in sicer pri obarjanju z 1-propanolom, najnižja
pa je bila pri uporabi obarjalnega reagenta acetona in je znašala 93,77%.
Po uspešnem obarjanju je sledilo merjenje aktivnosti in učinkovitosti imobilizacije pri
resuspendiranem encimu. Najvišjo aktivnost zasledimo v primeru uporabe acetona kot
obarjalnega reagenta in sicer 86,03%. Sledi preostala aktivnost pri uporabi etanola in 1-
propanola s približno 85,50%, najslabšo aktivnost, ki znaša 81,07%, pa zasledimo pri
uporabi 2-propanola kot obarjalnega reagenta. Sklepamo, da se je preostanek encima
deaktiviral. Učinkovitosti imobilizacije so pri vseh obarjalnih reagentih zelo dobre, saj vse
znašajo več kot 99%.
Slika 4-1 Prikaz učinkovitosti in preostale aktivnosti po obarjanju encima s koncentracijo 100 mg/ml
v vseh obarjalnih reagentih in po resuspendiranju z 900 µl pufra PBS
0
20
40
60
80
100
120
10
30
50
70
90
110
130
150
170
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost po obarjanju [%]
Učinkovitost po resuspendiranju [%]
Aktivnost CLEAs po obarjanju [%]
Aktivnost CLEAs po resuspendiranju [%]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
17
4.3 Rezultati 3-urnega zamreženja encima β-galaktozidaze ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
Postopek zamreženja je trajal 3 ure ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca
glutaraldehida (GA). Preizkusili smo zamreženje encima s koncentracijo 50 mg/ml in
100 mg/ml.
Iz slike 4-2 lahko razberemo, da so se aktivnosti pri koncentraciji encima 100 mg/ml
nahajale med 80% in 90%. Najvišjo aktivnost smo dosegli v primeru uporabe acetona kot
obarjalnega reagenta z 89,37%, najnižjo pa v primeru uporabe etanola z 84,11%. Pri
koncentraciji encima 50 mg/ml so bile vse aktivnosti visoke in sicer okoli 100%. Najnižjo
aktivnost zaznamo v primeru uporabe etanola, pri katerem je le-ta znašala 94,71%. Najvišjo
aktivnost encima pa smo dosegli v primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta in sicer
103,62%.
Po dobljenih rezultatih smo sklepali, da je optimalna koncentracija encima β-galaktozidaze
za nadaljevanje 50 mg/ml, saj so se pri vseh vzorcih pokazale višje preostale aktivnosti
CLEAs kot pri koncentraciji 100 mg/ml.
Slika 4-2 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 3-urnem zamreženju
encima s koncentracijama 50 in 100 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
Pri pripravi mCLEAs smo uporabljali encim s koncentracijo 50 mg/ml. Prav tako kot pri
CLEAs, smo zamreževali 3 ure ob dodatku 1,5% (v/v) GA.
Slika 4-3 prikazuje učinkovitost imobilizacije in aktivnost na peletku po zamreženju
mCLEAs. Tako aktivnost kot učinkovitost imobilizacije sta bili v primeru uporabe acetona
kot obarjalnega reagenta najnižji. Učinkovitost imobilizacije je znašala 98,94%, preostala
aktivnost pa 75,12%. Sklepamo, da je preostanek encima pri uporabi acetona kot obarjalnega
reagenta deaktiviral. V primeru uporabe obarjalnih reagentov etanola, 1-propanola in 2-
propanola pa smo dosegli odlične rezultate.
0
20
40
60
80
100
120
10
30
50
70
90
110
130
150 P
reo
stal
a ak
tivn
ost
[%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%] (encim 100 mg/mL)
Učinkovitost imobilizacije [%] (encim 50 mg/mL)
Aktivnost CLEAs [%] (encim 100 mg/mL)
Aktivnost CLEAs [%] (encim 50 mg/mL)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
18
Učinkovitost imobilizacije je v primeru uporabe vseh obarjalnih reagentov znašala 100%,
aktivnost pa je bila v primeru uporabe vseh treh obarjalnih reagentov nad 130%. Najvišja
aktivnost je bila v primeru uporabe 2-propanola in sicer 139,01%. V primeru, ko je
izmerjena aktivnost v primerjavi s prostim encimom zelo visoka, sklepamo, da je prišlo do
hiperaktivacije. Ta pojav naj bi bil posledica konformacijskih sprememb v proteinu v obliki
skupkov.
Slika 4-3 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 3-urnem zamreženju
encima s koncentracijama 50 in 100 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
4.4 Rezultati spiranja po zamreženju encimskih skupkov
Ker smo želeli odstraniti nezamrežen encim, smo po zamreženju supernatant odpipetirali in
mu dodali 900 µl pufra PBS, ponovno odpipetirali supernatant in peletku ponovno dodali
900 µl pufra PBS. S tem smo vzorec dvakrat sprali in nato spranemu peletku izmerili
aktivnost.
Na sliki 4-4 in 4-5 so prikazani rezultati za CLEAs in mCLEAs.
0
20
40
60
80
100
120
140
10
30
50
70
90
110
130
150
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%]
Aktivnost mCLEAs [%]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
19
Slika 4-4 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 3-urnem zamreženju
encima s koncentracijo 50 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA in dveh spiranjih
z 900 µl pufra PBS
Na sliki 4-4 lahko vidimo, da so po dveh spiranjih rezultati pri uporabi vseh obarjalnih
reagentov približno enaki. Pri uporabi vseh obarjalnih reagentov je bila učinkovitost
imobilizacije med 98% in 99%. Najvišjo aktivnost smo dobili v primeru uporabe etanola kot
obarjalnega reagenta, znašala je 94,72%, najnižjo pa v primeru uporabe acetona, in sicer
91,13%.
Slika 4-5 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 3-urnem
zamreženju encima s koncentracijo 50 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA in
dveh spiranjih z 900 µl pufra PBS
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
60
80
100
120
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%]
Aktivnost CLEAs [%]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
20
40
60
80
100
120
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%]
Učinkovitost imobilizacije [%]
Aktivnost mCLEAs [%]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
20
Slika 4-5 prikazuje učinkovitost imobilizacije in aktivnost encima po zamreženju in dveh
spiranjih mCLEAs. Aktivnosti so bile v primeru uporabe vseh obarjalnih reagentov zelo
visoke, znašale so od 129,57% do 133,99%. Najvišjo aktivnost, 133,99%, smo dosegli v
primeru uporabe 2-propanola, sledile so aktivnosti v primeru uporabe obarjalnih reagentov
etanola, acetona in na koncu 1-propanola z aktivnostjo 129,57%. Učinkovitosti imobilizacije
so bile v primeru uporabe vseh obarjalnih reagentov visoke, nad 99%.
Pri CLEAs in mCLEAs smo dobili po dveh spiranjih zelo dobre rezultate. Aktivnost je v
primerjavi z rezultati, izmerjenimi takoj po zamreženju, za nekaj odstotkov padla, ampak še
vedno ostala zelo visoka.
4.5 Zamreženje encima ob prisotnosti albumina iz govejega seruma (BSA) in albumina kokošjih jajc (EA)
Preučevali smo vpliv dodatka stabilizacijskih proteinov in sicer albumina iz govejega seruma
(BSA) in albumina kokošjih jajc (EA) na preostalo aktivnost imobiliziranega encima.
Uporabili smo kombinacijo teh dveh stabilizacijskih proteinov, v razmerju 3:1. Tudi tukaj
smo preverjali aktivnost za koncentracijo encima 50 mg/ml in 100 mg/ml. Pri obeh smo
dodali 1,0% mrežnega povezovalca GA in zamreževali 3 ure.
Slika 4-6 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs ob dodatku BSA in EA v
razmerju 3:1in pri uporabi koncentracije encima β-galaktozidaze 50 mg/ml in 100 mg/ml
Iz slike 4-6 hitro razberemo, da so aktivnosti ob dodatku BSA in EA v razmerju 3:1 precej
upadle. V primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta opazimo znatno znižanje
aktivnosti pri obeh koncentracijah. Pri koncentraciji encima 50 mg/ml je aktivnost upadla na
1,73%, medtem ko je pri koncentraciji encima 100 mg/ml upadla na 10,87%. V primeru
uporabe etanola kot obarjalnega reagenta je pri koncentraciji encima 50 mg/ml aktivnost
upadla na 0,46%, pri koncentraciji 100 mg/ml pa je bila malo višja in je znašala 78,63%.
0
20
40
60
80
100
120
10
30
50
70
90
110
130
150
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%] (encim 50 mg/mL)
Učinkovitost imobilizacije [%] (encim 100 mg/mL)
Aktivnost CLEAs [%] (encim 50 mg/mL)
Aktivnost CLEAs [%] (encim 100 mg/mL)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
21
V primeru uporabe 2-propanola kot obarjalnega reagenta je aktivnost pri koncentraciji
encima 50 mg/ml upadla na 25,75%, pri koncentraciji encima 100 mg/ml pa na 33,85%.
Najboljše, a vseeno ne tako zelo dobre rezultate, smo dobili v primeru uporabe 1-propanola.
Aktivnost je upadla na 55,79% pri koncentraciji encima 50 mg/ml, pri koncentraciji encima
100 mg/ml pa je znašala 80,13%. Učinkovitosti imobilizacije so prav tako upadle. Pri
koncentraciji encima 50 mg/ml je bila najvišja učinkovitost imobilizacije dosežena v primeru
uporabe acetona kot obarjalnega reagenta (96,63%), najnižja pa v primeru uporabe
obarjalnega reagenta etanola (73,98%). Pri koncentraciji encima 100 mg/ml pa so bile
učinkovitosti imobilizacije malo višje. Najvišjo smo dosegli v primeru uporabe acetona
(98,09%), najnižjo pa v primeru uporabe obarjalnega reagenta etanola (87,84%).
4.6 Vpliv časa stresanja ob dodatku GA pri sobni temperaturi na učinkovitost imobilizacije in aktivnost imobilizirane β-galaktozidaze
Pri sobni temperaturi smo CLEAs in mCLEAs ob dodatku 1,5% (v/v) zamreževali 2 uri in 3
ure.
Slika 4-7 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 in 3-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri sobni temperaturi (T=25°C) ob
dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
Iz slike 4-7 razberemo, da smo pri 2-urnem zamreženju najvišjo aktivnost dosegli v primeru
uporabe 1-propanola kot obarjalnega reagenta. Sledijo aktivnosti v primeru uporabe etanola
in acetona kot obarjalnega reagenta, najslabšo aktivnost (97,78%) pa smo dosegli v primeru
uporabe obarjalnega reagenta 2-propanola. Učinkovitosti imobilizacije so bile v primeru
uporabe vseh obarjalnih reagentov odlične, saj so vse znašale nad 99%. Pri 3-urnem
zamreženju smo najvišjo aktivnost prav tako dosegli v primeru uporabe 1-propanola
(95,07%), sledita aktivnosti pri uporabi obarjalnega reagenta 2-propanola z 94,69% in
acetona z 91,95%. Najnižjo aktivnost pa imamo v primeru uporabe obarjalnega reagenta
etanola, in sicer 90,17%. Učinkovitost imobilizacije je bila najnižja pri uporabi etanola kot
obarjalnega reagenta (97,24%), pri uporabi ostalih obarjalnih reagentov pa je bila nad 98%.
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
10
30
50
70
90
110
130
150
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
] Učinkovitost imobilizacije [%] (3h zamreženja)
Učinkovitost imobilizacije [%] (2h zamreženja)
Aktivnost CLEAs [%] (3h zamreženja)
Aktivnost CLEAs [%] (2h zamreženja)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
22
Slika 4-8 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 in 3-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri sobni temperaturi (T=25°C) ob
dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
Na sliki 4-8 so prikazani rezultati po 2-urnem in 3-urnem zamreženju mCLEAs. Najvišjo
aktivnost smo dosegli pri 3-urnem zamreženju v primeru 1-propanola (103,28%), najnižjo pa
v primeru 2-propanola (97,78%). Pri 2-urnem zamreženju smo dosegli aktivnosti okoli
100%, razen v primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta, pri katerem je aktivnost
znašala 39,67%. Ponovno smo sklepali, da je preostanek encima v primeru uporabe
obarjalnega reagenta acetona deaktiviral.
Pri CLEAs in mCLEAs vidimo, da je učinkovitost imobilizacije tako pri 2. urah in 3. urah
približno enaka. Aktivnost pri CLEAs je za nekaj odstotkov boljša pri 2-urnem zamreženju,
medtem ko je aktivnost pri mCLEAs pri 2-urnem in pri 3-urnem zamreženju približno enaka.
Glede na rezultate sklepamo, da je optimalen čas zamreženja β-galaktozidaze v (magnetne)
zamrežene encimske skupke 2 uri.
0
20
40
60
80
100
120
10
30
50
70
90
110
130
150
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%] (3h zamreženja)
Učinkovitost imobilizacije [%] (2h zamreženja)
Aktivnost mCLEAs [%] (3h zamreženja)
Aktivnost mCLEAs [%] (2h zamreženja)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
23
4.7 Vpliv časa stresanja ob dodatku GA pri 10°C na učinkovitost imobilizacije in aktivnost imobilizirane β-galaktozidaze
Pri 10°C smo CLEAs in mCLEAs ob dodatku 1,5% (v/v) zamreževali 2 uri in 3 ure.
Slika 4-9 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 in 3-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku
1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
Zamreženje CLEAs pri 10°C nam prikazuje slika 4-9. Pri 2-urnem zamreženju smo najvišjo
aktivnost zaznali v primeru 1-propanola, le-ta je znašala 117,98%, najnižjo pa smo zaznali v
primeru uporabe 2-propanola kot obarjalnega reagenta (98,58%). Učinkovitosti imobilizacije
so bile v vseh primerih nad 99%, najboljša je bila pri uporabi etanola, pri katerem smo
dosegli 100% učinkovitost.
Pri 3-urnem zamreženju pa smo najvišjo aktivnost dobili v primeru 1-propanola in 2-
propanola, obe sta znašali okoli 111%, sledila je aktivnost, ki smo jo dosegli v primeru
uporabe etanola kot obarjalnega reagenta, najnižjo pa smo izmerili v primeru uporabe
acetona in sicer 96,86%. Učinkovitost imobilizacije je bila pri 3-urnem zamreženju za nekaj
odstotkov nižja kot pri 2-urnem zamreženju. Najnižja, v primeru uporabe acetona, je znašala
88,44%, najvišja, v primeru uporabe 2-propanola kot obarjalnega reagenta, pa 99,34%.
0
20
40
60
80
100
120
140
10
30
50
70
90
110
130
150
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%] (3h zamreženja)
Učinkovitost imobilizacije [%] (2h zamreženja)
Aktivnost CLEAs [%] (3h zamreženja)
Aktivnost CLEAs [%] (2h zamreženja)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
24
Slika 4-10 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 in 3-urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku
1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
Zamreženje mCLEAs pri 10°C nam prikazuje slika 4-10. Pri 2-urnem zamreženju najbolj
izstopa uporaba obarjalnega reagenta acetona, pri katerem je aktivnost znašala 0,00%. V
supernatantu po Bradfordovi metodi nismo zasledili preostankov proteina, zato sklepamo, da
se je encim ustrezno zamrežil. Glede na rezultate in preostalo aktivnost v primeru uporabe
acetona kot obarjalnega reagenta sklepamo, da je prišlo do koagulacije oziroma zakrnjenja
encima, kar prinaša za posledico deaktivacijo encima. Koagulacija je ireverzibilen proces.
Pri uporabi obarjalnega reagenta, v našem primeru acetona, se encim izobori v manj ugodno
konformacijo, kar povzroči veliko izgubo aktivnosti in koagulacijo encima. Pri ostalih
obarjalnih reagentih so aktivnosti visoke. Najvišjo aktivnost smo dosegli pri uporabi 2-
propanola (108,82%), sledi aktivnost v primeru uporabe etanola z 106,88% in na koncu še
aktivnost v primeru uporabe 1-propanola kot obarjalnega reagenta z 103,84%. Učinkovitosti
imobilizacije so visoke, skoraj 100% tako pri uporabi 2-propanola, 1-propanola in etanola, v
primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta pa je znašala 94,08%.
Pri 3-urnem zamreženju smo zaznali najslabšo aktivnost prav tako v primeru uporabe
obarjalnega reagenta acetona, znašala je 31,74%. Tudi tukaj sklepamo, da je prišlo do
deaktivacije. V primeru uporabe ostalih obarjalnih reagentov so bili rezultati boljši. Najvišjo
aktivnost smo dosegli v primeru 1-propanola in sicer 109,70%. Z 109,04% mu je sledila
aktivnost v primeru uporabe obarjalnega reagenta 2-propanola, v primeru uporabe
obarjalnega reagenta etanola pa je znašala preostala aktivnost 92,88%. Učinkovitosti
imobilizacije so bile visoke, nad 99%, razen v primeru uporabe acetona kot obarjalnega
reagenta je učinkovitost znašala 98,36%.
0
20
40
60
80
100
120
10
30
50
70
90
110
130
150
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%] (3h zamreženja)
Učinkovitost imobilizacije [%] (2h zamreženja)
Aktivnost mCLEAs [%] (3h zamreženja)
Aktivnost mCLEAs [%] (2h zamreženja)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
25
Kot pri zamreženju pri sobni temperaturi (poglavje 4.6), nam zamreženje pri 10°C povzroči
približno enako učinkovitost imobilizacije tako pri 2. urah in 3. urah zamreženja. Tudi tukaj
je aktivnost pri večini primerov boljša pri 2-urnem zamreženju.
Glede na rezultate predvidevamo, da je ob dodatku GA pri 10°C optimalno 2-urno
zamreženje (magnetnih) zamreženih encimskih skupkov β-galaktozidaze.
4.8 Primerjava časa zamreženja (2 uri) pri sobni temperaturi in temperaturi 10°C
Glede na poglavje 4.6 in 4.7, smo se odločili, da primerjamo, pri kateri temperaturi sta
najboljši učinkovitost imobilizacije in preostala aktivnost.
Slika 4-11 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 -urnem zamreženju
encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C in sobni temperaturi
(T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
Slika 4-11 za CLEAs nam prikazuje, da je aktivnost na peletku za kar nekaj odstotkov višja
pri 10°C. V primeru etanola je aktivnost pri 2-urnem zamreženju na sobni temperaturi
znašala 102,04%, pri 10°C pa 109,30% V primeru acetona kot obarjalnega reagenta je
aktivnost na sobni temperaturi znašala 100,86% medtem ko je pri 10°C 108,56%. Prav tako
je pri uporabi 1-propanola bila boljša aktivnost pri 10°C (117,98%) in ne pri sobni
temperaturi (103,28%). Tudi v primeru uporabe obarjalnega reagenta 2-propanola je
aktivnost na 10°C, ki je znašala 98,58%, bila višja kot pri sobni temperaturi, pri kateri je
aktivnost znašala 97,78%. Učinkovitost imobilizacije je bila v primeru uporabe vseh
obarjalnih reagentov, tako pri 2-urnem kot pri 3-urnem zamreženju, nad 99%, v primeru
uporabe etanola pa je v obeh primerih zamreženja znašala 100%.
Glede na rezultate sklepamo, da je optimalno zamreženje pri 2h in 10°C.
-10
10
30
50
70
90
110
130
10
30
50
70
90
110
130
150
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%] (sobna temperatura)
Učinkovitost imobilizacije [%] (10°C)
Aktivnost CLEAs [%] (sobna temperatura)
Aktivnost CLEAs [%] (10°C)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
26
Slika 4-12 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 -urnem
zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C in sobni
temperaturi (T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA
Na sliki 4-12 takoj razberemo, da je aktivnost v primeru uporabe acetona v obeh primerih
zelo nizka. Kot je opisano že v poglavju 4.7, je razlog za tako nizko aktivnost deaktivacija
oziroma koagulacija (zakrknjenje) encima. V primeru uporabe etanola kot obarjalnega
reagenta je pri 2-urnem zamreženju pri sobni temperaturi aktivnost znašala 99,92%, pri 10°C
pa 106,88%. Tudi v primeru uporabe 1-propanola je bila višja aktivnost pri 10°C (103,84%)
v primerjavi z aktivnostjo pri sobni temperaturi (98,33%). Enako velja za obarjalni reagent
2-propanol, pri katerem je aktivnost pri 10°C znašala 108,82%, pri sobni temperaturi pa
99,53%.
Iz dobljenih rezultatov lahko sklepamo, da za mCLEAs ostanejo optimalni obarjalni reagenti
etanol, 1-propanol in 2-propanol (glede na rezultate poglavja 4.6 in 4.7).
Za CLEAs in mCLEAs velja, da so najboljši rezultati ob 2-urnem zamreženju pri 10°C.
4.9 Aktivnost CLEAs in mCLEAs pri izvajanju aktivnostnega testa pri različnih temperaturah
Preverjali smo, kako se spremeni aktivnost CLEAs in mCLEAs po zamreženju, če
aktivnostni test opravimo pri temperaturi 50°C in pri 70°C.
0
20
40
60
80
100
120
10
30
50
70
90
110
130
150
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Uči
nko
vito
st im
ob
iliza
cije
[%
]
Učinkovitost imobilizacije [%] (sobna temperatura)
Učinkovitost imobilizacije [%] (10°C)
Aktivnost mCLEAs[%] (sobna temperatura)
Aktivnost mCLEAs [%] (10°C)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
27
Slika 4-13 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima β-
galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 50°C
Kot lahko razberemo iz slike 4-13, je aktivnostni test pri 50°C pokazal aktivnosti v primeru
uporabe vseh obarjalnih reagentov nad 100%. Pri CLEAs smo najvišjo aktivnost dosegli v
primeru uporabe obarjalnega reagenta acetona, in sicer 117,29%, najnižjo pa v primeru
uporabe 1-propanola, in sicer 102,69%. Pri mCLEAs pa je bila najvišja aktivnost v primeru
uporabe 2-propanol (105,21%), najnižja pa v primeru uporabe etanola kot obarjalnega
reagenta (102,62%).
Slika 4-14 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima β-
galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 70°C
0
20
40
60
80
100
120
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Aktivnost na peletku [%] (CLEA)
Aktivnost na peletku [%] (mCLEA)
10
30
50
70
90
110
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Aktivnost na peletku [%] (CLEA)
Aktivnost na peletku [%] (mCLEA)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
28
Tudi pri aktivnostnem testu pri 70°C (slika 4-14) so se aktivnosti ohranile in znašale okoli
100%. Pri CLEAs je bila najvišja aktivnost v primeru uporabe 1-propanola (103,38%),
najnižjo pa v primeru uporabe etanola kot obarjalnega reagenta (98,29%). Prav tako kot pri
CLEAs je tudi pri mCLEAs bila najvišja aktivnost v primeru uporabe 2-propanola z
100,38%, takoj mu sledi aktivnost v primeru uporabe 1-propanola z 100,32% in etanola kot
obarjalnega reagenta z 97,94% kot najnižjo aktivnostjo.
Lažje interpretiramo rezultate, če jih primerjamo z aktivnostjo, izmerjeno pri aktivnostnem
testu, ki je opisan v poglavju 3.4.2. Aktivnost prostega encima, izmerjenega pri testu na
50°C oz. 70°C, primerjamo z aktivnostjo, izmerjeno pri aktivnostnem testu po predpisanih
pogojih. Aktivnost CLEAs oz. mCLEAs pri aktivnostnem testu na 50 oz. 70°C pa prav tako
primerjamo z aktivnostjo CLEAs oz. mCLEAs, izmerjeno pri aktivnostnem testu opisanem v
poglavju 3.4.2.
Slika 4-15 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima
β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 50°C v primerjavi z aktivnostim testom opisanim v
poglavju 3.4.2.
Kot vidimo iz slike 4-15, je aktivnostni test pri 50°C prinesel dobre rezultate. Preostala
aktivnost encima glede na encim izmerjen pri predpisanih pogojih v poglavju 3.4.2 je
znašala 92,56%. Najvišjo preostalo aktivnost pri CLEAs smo dosegli v primeru uporabe
acetona kot obarjalnega reagenta, ko se je ohranila 100%, sledila mu je aktivnost v primeru
uporabe 2-propanola z 94,95%, etanola z 88,24% in 1-propanola kot obarjalnega reagenta z
80,57%. Pri CLEAs je aktivnost izmerjena pri aktivnostnem testu na 50°C malo manjša v
primerjavi z aktivnostnim testom pri predpisanih pogojih v poglavju 3.4.2. Najvišjo
preostalo aktivnost mCLEAs pa smo v primerjavi z aktivnostnim testom pri predpisanih
pogojih dosegli v primeru uporabe 1-propanola kot obarjalnega reagenta. Ohranila se je
122,99% aktivnost, sledila mu je aktivnost v primeru uporabe 2-propanola z 118,63% in
etanola kot obarjalnega reagenta z 117,82%. mCLEAs pa so se rezultati v primerjavi z
rezultati izmerjenimi po predpisanih pogojih, opisanih v poglavju 3.4.2, izboljšali.
0
20
40
60
80
100
120
140
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Preostala aktivnost encima [%] Preostala aktivnost CLEA [%] Preostala aktivnost mCLEA [%]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
29
Slika 4-16 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima
β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 70°C v primerjavi z aktivnostnim testom opisanim v
poglavju 3.4.2.
Aktivnostni test na 70°C (slika 4-16) je prav tako prinesel precej dobre rezultate. A v
primerjavi z aktivnostnim testom opravljenim pri pogojih opisanih v poglavju 3.4.2 in pri
aktivnostnem testu na 50°C, je tukaj preostala aktivnost že malo upadla. Preostala aktivnost
prostega encima pri aktivnostnem testu na 70°C je v primerjavi z aktivnostnim testom pri
pogojih iz poglavja 3.4.2 78%. Pri CLEAs smo najvišjo preostalo aktivnost dosegli v
primeru uporabe 2-propanola z 78,47%, sledi aktivnost izmerjena v primeru uporabe acetona
z 73,64%, etanola z 70,14% in 1-propanola kot obarjalnega reagenta z 68,34%. Pri mCLEAs
pa je najvišja aktivnost bila v primeru uporabe 1-propanola kot obarjalnega reagenta, in sicer
86,91%, v primeru uporabe etanola in 2-propanola pa se je v primerjavi s pogoji opisanimi v
poglavju 3.4.2 ohranila približno 82% preostala aktivnost.
4.10 Vpliv skladiščenja CLEAs in mCLEAs pri različnih temperaturah na njuno aktivnost
CLEAs in mCLEAs smo v sprva skladiščili (peletek inkubirali) na 50°C. Preverjali smo
stabilnost CLEAs in mCLEAs.
Slika 4-17 prikazuje rezultate, ki smo jih dosegli z zamreževanjem ob dodatku 1,5% (v/v)
GA 2 uri pri 10°C, za kar smo v prejšnjih poglavjih ugotovili, da so optimalni pogoji, tako za
CLEAs kot tudi mCLEAs. Nato smo supernatant odcentrifugirali ter CLEAs in mCLEAs
izpostavili 50°C za 2 uri. Kasneje smo izmerili aktivnost po že znanem postopku. Pri CLEAs
smo uporabili vse 4 optimalne obarjalne reagente, pri mCLEAs pa smo, kot je opisano v
poglavju 4.7, izločili aceton in uporabili etanol, 1-propanol in 2-propanol.
0
20
40
60
80
100
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Preostala aktivnost encima [%]
Preostala aktivnost CLEA [%]
Preostala aktivnost mCLEA [%]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
30
Slika 4-17 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima β-
galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA po inkubiranju na 50°C 2 uri
Slika 4-17 prikazuje izmerjeno aktivnost po 2-urnem inkubiranju peletka na 50°C. Pri
CLEAs je bila najvišja aktivnost v primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta in sicer
je znašala 119,88%, najnižja pa v primeru uporabe 1-propanola z 96,31%. Pri mCLEAs pa je
aktivnost že upadla. Aktivnost je še posebej v primeru uporabe etanola zelo upadla, na
9,04%, kar pomeni, da mCLEAs v primeru uporabe obarjalnega reagenta etanola pri 50°C
niso več stabilni. Vzrok je visoka temperatura, ki mCLEAs deaktivira. Tudi v primeru
uporabe 1-propanola je aktivnost upadla na 55,22%. Najvišjo aktivnost pri mCLEAs smo
dosegli v primeru obarjalnega reagenta 2-propanola, kjer je znašala 95,76%. Torej mCLEAs
so pri inkubiranju na 50°C dobro stabilni le v primeru uporabe 2-propanola kot obarjalnega
reagenta.
Rezultati so pri CLEAs dobri, saj znaša aktivnost v primeru uporabe vseh obarjalnih
reagentov nad 96%, torej se je aktivnost po 2 urah inkubiranja na 50°C zelo ohranila. Glede
na te rezultate smo se odločili, da preizkusimo, kakšno aktivnost bodo CLEAs in mCLEAs
ohranili po 2 urah inkubiranja na 70°C.
Postopek je bil enak kot pri inkubiranju na 50°C.
0
20
40
60
80
100
120
140
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Aktivnost na peletku (CLEA)
Aktivnost na peletku (mCLEA)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
31
Slika 4-18 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima β-
galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA po inkubiranju na 70°C 2 uri
Pri rezultatih iz slike 4-18 se takoj razbere, da se aktivnost ni ohranila in tako lahko trdimo,
da CLEAs in mCLEAs niso stabilni pri temperaturi 70°C. Pri uporabi vseh obarjalnih
reagentov vidimo, da je aktivnost zelo nizka. Najvišjo aktivnost smo dosegli pri CLEAs v
primeru uporabe 2-propanola, ta je znašala 14,94%, pri mCLEAs pa v primeru uporabe
etanola kot obarjalnega reagenta, kjer je znašala 2,40%. Sklepamo, da je vzrok za
deaktivacijo previsoka temperatura.
Za lažjo primerjavo smo izračunali preostalo aktivnost. Preostalo aktivnost za inkubiran
prosti encim smo izračunali glede na prosti encim, ki ga nismo inkubirali. Za inkubirano
CLEAs in mCLEAs pa smo preostalo aktivnost prav tako izračunali glede na neinkubirano
CLEAs in mCLEAs.
Rezultati so prikazani na sliki 4-19 in 4-20.
0
20
40
60
80
100
120
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Aktivnost na peletku (CLEA) Aktivnost na peletku (mCLEA)
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
32
Slika 4-19 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima
β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA po inkubiranju na 50°C 2 uri v primerjavi z neinkubiranimi CLEAs in mCLEAs
Kot vidimo, je aktivnost inkubiranega prostega encima v primerjavi z aktivnostjo
neinkubiranega prostega encima za 12 odstotkov nižja. Pri inkubiranju CLEAs se je
aktivnost ohranila v primeru uporabe vseh obarjalnih reagentov. Najvišja preostala aktivnost,
glede na aktivnost neinkubirane CLEAs, je bila v primeru uporabe acetona in je znašala
96,76%, najnižja pa je bila v primeru uporabe etanola kot obarjalnega reagenta (80,35%). Pri
mCLEAs pa se aktivnost, razen v primeru uporabe obarjalnega reagenta 2-propanola
(101,07%), ni ohranila. Pri uporabi etanola kot obarjalnega reagenta je padla za kar 90%, pri
uporabi 1-propanola pa se je znižala za 35%.
Slika 4-20 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima
β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega
povezovalca GA po inkubiranju na 70°C 2 uri v primerjavi z neinkubiranimi CLEAs in mCLEAs
0
20
40
60
80
100
120
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Preostala aktivnost encima [%]
Preostala aktivnost CLEA [%]
Preostala aktivnost mCLEA [%]
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol
Pre
ost
ala
akti
vno
st [
%]
Preostala aktivnost encima [%]
Preostala aktivnost CLEA [%]
Preostala aktivnost mCLEA [%]
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
33
Ker se je aktivnost pri CLEAs pri inkubiranju na 50°C ohranila, smo preverili še, kako je pri
inkubiranju na 70°C. Inkubiranemu prostemu encimu se je aktivnost dobro ohranila
(97,36%), CLEA in mCLEA pa sta popolnoma deaktivirali v vseh obarjalnih reagentih. Tako
pri CLEAs kot mCLEAs je aktivnost, v primerjavi z aktivnostjo neinkubirane CLEAs in
mCLEAs, padla za več kot 90%, razen pri CLEAs v primeru uporabe 2-propanola kot
obarjalnega reagenta za 85%. To pomeni, da CLEAs in mCLEAs na temperaturi 70°C niso
več stabilni.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
34
5 Zaključek
V diplomskem delu smo preučevali pripravo zamreženih (magnetnih) encimskih skupkov
(CLEAs oz. mCLEAs) β-galaktozidaze in določali aktivnost encima po imobilizaciji.
Preizkušali smo različna organska topila kot obarjalne reagente ter preverjali, pri katerih je
aktivnost po zamreženju najvišja. Višja aktivnost pomeni boljši obarjalni reagent. Preizkušali
smo tudi, kakšna je aktivnost po spiranju s pufrom PBS, kako se skupki odzivajo pri
različnih testih aktivnosti, do katere temperature so stabilni in ohranijo svojo aktivnost.
Uspešno smo sintetizirali tako magnetne kot nemagnetne zamrežene encimske skupke.
Zamreženi encimski skupki oz. CLEAs so vsebovali encim β-galaktozidazo in glutaraldehid,
kot mrežni povezovalec. Za obarjanje smo ugotovili, da so najbolj optimalni obarjalni
reagenti organska topila etanol, aceton, 1-propanol in 2-propanol. Magnetni zamreženi
encimski skupki oz. mCLEAs pa so vsebovali encim β-galaktozidazo, aminosilanske
nanodelce, pufer PBS in mrežni povezovalec glutaraldehid. Za optimalno obarjanje pa smo
uporabili etanol, 1-propanol in 2-propanol.
Ugotovili smo, da je za pripravo CLEAs in mCLEAs optimalna koncentracija encima za
obarjanje 50 mg/ml in da je optimalna koncentracija mrežnega povezovalca GA 1,5% (v/v).
S spreminjanjem časa zamreževanja smo ugotovili, da je optimalen čas stresanja oz.
zamreženja po dodatku mrežnega povezovalca glutaraldehida (GA) 2 uri. Raziskovali smo
tudi vpliv temperature zamreženja in ugotovili, da dobimo boljše rezultate ob zamreženju na
10°C kot pri sobni temperaturi.
V našem delu smo raziskovali termično stabilnost zamreženih encimskih skupkov ter s tem
vpliv temperature na njihovo aktivnost. Ugotovili smo, da so CLEAs pri temperaturi do
50°C do neke mere še stabilni in ohranjajo svojo aktivnost, pri temperaturi 70°C pa
aktivnosti ne ohranijo in niso stabilni. mCLEAs pa deaktivirajo že pri izpostavljenosti na
50°C in svoje aktivnosti pri tej temperaturi kot tudi pri 70°C ne ohranijo.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
35
6 Literatura
[1] R.A. Sheldon. Cross-linked enzyme aggregates (CLEAs): stable and recyclable
biocatalysts. Biochemical Society Transactions, 35 (6), 2007.
[2] D.H. Juers, B.W. Matthews, R.E. Huber. LacZ β-galactosidase: Structure and function
of an enzyme of historical and molecular biological importance. The Protein Society.
www.proteinscience.org, 2012.
[3] R.A. Sheldon, S. van Pelt. Enzyme immobilisation in biocatalysis: why,what and how.
Chem Soc Rev. 42 (6223), 2013.
[4] L. Cao, F. van Rantwijk, R.A. Sheldon. Cross-Linked Enzyme Aggregates: A Simple
and Effective Method for the Immobilization of Penicillin Acylase. Organic letters,
Vol 2, No. 10 (1361-1364), 2000.
[5] I. Migneault, C. Dratguenave, M.J. Bertrand, K.C. Waldron. Glutaraldehyde: behavior
in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.
BioTechniques, 37 (790-802), 2004.
[6] C. Mateo, J.M. Palomo, G. Fernandez-Lorente, J.M. Guisan, R. Fernandez-Lafuente.
Improvements of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization
techniques. Enzyme and Microbial Technology, 40 (1451-1463), 2007.
[7] S. Talekr, V. Ghodake, T. Ghotage, P. Rathod, P. Deshmukh, S. Nedar, M. Mulla, M.
Ladole. Novel magnetic cross-linked enzyme aggregates (magnetic CLEAs) of alpha
amylase. Boiresource Technology, 123 (542-547), 2012.
[8] R. Schoevaart, M.W. Wolbers, M. Gulubovic, M. Ottens, A.P.G. Kieboom, F. van
Rantwijk, L.A.M van der Wielen, R.A. Sheldon. Preparation, Optimization, and
Structures of Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs). Biotechnology and
Bioengineering. 2004.
[9] P. Lopez-Serrano, L. Cao, F, van Rantwijk, R.A. Sheldon. Cross-linked enzyme
aggregates with enhanced activity: application to lipases. Biotechnology Letters, 24
(1379-1383), 2002.
[10] Jose M. Guisan. Immobilization of Enzymes and Cells. Second edition. New Jersey:
Humana Press, 2006.
[11] https://en.wikipedia.org/wiki/Immobilized_enzyme (dostop dne 1.7.2016)
[12] http://microbeonline.com/onpg-test-%CE%B2-galactosidase-principle-procedure-
results/ (dostop dne 25.7.2016)
[13] https://en.wikipedia.org/wiki/Glutaraldehyde (dostop dne 6.8.2016)
[14] Roger A. Sheldon. Cross-Linked Enzyme Aggregates as Industrial Biocatalysts.
Organic Process Research & Development, 15 (212-223), 2011.
[15] Roger A. Sheldon. Characteristic features and biotechnological applications of cross-
linked enzyme aggregates (CLEAs). Appl Microbiol Biotechnol, 92 (467-477), 2011.
[16] F. Šulek, D.P. Fernandez, Ž. Knez, M. Habulin, R.A. Sheldon. Immobilization of
horseradish peroxidase as crosslinked enzyme aggregates (CLEAs). Process
Biochemistry, 46 (765-769), 2011.
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
36
7 Priloge
7.1 Bradfordova umeritvena krivulja
Na spodnjih slikah so prikazane Bradfordove umeritvene krivulje.
Slika 7-1 Prva Bradfordova umeritvena krivulja
Slika 7-2 Druga Bradfordova umeritvena krivulja
y = 0,6805x R² = 0,9989
-0,1000
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0,6000
0,7000
0,8000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
abso
rban
ca p
ri 5
95
nm
koncentracija BSA [mg/mL]
Umeritvena krivulja
y = 0,7331x R² = 0,9937
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0,6000
0,7000
0,8000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
abso
rban
ca p
ri 5
95
nm
koncentracija BSA [mg/mL]
Umeritvena krivulja
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
37
Slika 7-3 Tretja Bradfordova umeritvena krivulja
Slika 7-4 Četrta Bradfordova umeritvena krivulja
y = 0,7703x R² = 0,9952
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
abso
rban
ca p
ri 5
95
nm
koncentracija BSA [mg/mL]
Umeritvena krivulja
y = 0,608x R² = 0,9979
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
abso
rban
ca p
ri 5
95
nm
koncentracija BSA [mg/mL]
Umeritvena krivulja
Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze
38
8 Življenjepis