Bol. San. Veg. Plagas, 34: 563-571, 2008

Presencia de Mycosphaerella pinodes causando enfermedad encultivos de guisante y tirabeque en la costa de Granada (España)

F. J. CARRETERO, F. DIÁNEZ, M. DE CARA, M. SANTOS, J. C. TELLO

La reiterada presencia en hojas, estípulas. tallos, zarcillos, flores y vainas de manchasnecróticas de color marrón, en principio puntiformes y evolucionando a manchas más omenos circulares que evocaban la presencia de una ascochitosis en las plantaciones bajoinvernadero de guisantes (Pistan salivan, var. vulgare), y tirabeques (P. sativum var.macrocarpon) que se cultivan para consumo en fresco, motivaron el estudio taxonómi-co que se presenta en este articulo. Las dificultades taxonómicas existentes para separaren la ascochitosis del guisante a los tres agentes incitantes que se citan en la literatura,fueron aplicados sobre 21 aislados obtenidos de los cultivos de la costa de Granada.

Los resultados evidencian que 9 de los aislados produjeron las aseas que permitieronasignarlos a Mycosphaerella pinodes (anamorfo Ascochyta pinodes). Sin embargo los 12aislados restantes no pudieron ser identificados ni como Ascochyta pisé ni comoAscochyta pinodes atendiendo para ello a la tabicación y dimensiones de las picnidios-poras, presencia de clamidosporas y formación de cristales de oxalato cálcico. Dichosaislados no tenían las características de Phoma tnedicaginis var. pinodella y por ello fue-ron asignados a Ascochyta sp.

F. J. CARRETERO, F. DIÁNEZ, M. DE CARA, M. SANTOS, J. C. TELLO. Departamento deProducción Vegetal. Universidad de Almería. Cañada de San Urbano. s/n. 04120. Alme-ría (España)

Palabras clave: ascochitosis, Pisum sativum.

INTRODUCCIÓN

La producción de guisantes para verdeoen Andalucía fue de 792 ha, y 7.758 t de pro-ducción en el año 2004 (JUNTA DE ANDA-LUCÍA, 2005). Esta superficie está ocupadapor el guisante común, Pisum sativum LIN-NEO cuyos cultivares se enmarcan, mayori-tariamente, en P. sativum L. var. VulgareSCHÜBL et MART (MARuro, 2002). aun-que una proporción pequeña se encuadradentro de P. sativum L. var. macrocarponSER. y P. sativum L. var. sacharum SER.,éstos últimos conocidos vulgarmente comotirabeques o come-todo; denominación moti-vada por el hecho de ser consumidas tanto

las semillas como las vainas. En la costa deGranada y Almería ha existido una gran tra-dición en este cultivo para verde, censando laJunta de Andalucía en 2005, una superficiede 296 ha, con una producción total de 2.928t sin separar guisante de tirabeque.

La "ascochitosis" del guisante es unaenfermedad en cuya etiología acoge variasespecies de hongos formadoras de picnidios(figuras 1 y 2), cuyas denominaciones anti-guas, realizadas a partir de los anamorfos,fueron: Ascochyta pisi LIB, Ascochytapinodes JONES, y Ascochvta pinodellaJONES. La dificultad para diferenciar lastres especies, combinando tamaño de espo-ras y expresión de síntomas en plantas

Figura I. Picnidios típicos de Ascochyta sp. Figura 2. Picnidio con cirro de Ascochyta sp.

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enfermas, se fue resolviendo progresiva-mente. De esa manera queda A. pisi, mien-tras que A. pinodes pasó a denominarse porsu teleomorfo como Mycosphaerella pino-des (BERK & BLOXAM) VESTERGRENy a A. pinodella se le asignó el de Phomamedicaginis (MALBR.& ROUM) var. pino-della (JONES) BOEREMA en base a laproducción de conidios unicelulares ( MES-

SIAEN et al, 1995; TELLO et al, 1988; BRE-

TAG y RAMSEY, 2001)Las micosis causadas por las tres especies

tienen una sintomatología diferente: A. pisiproduce manchas redondeadas ligeramentehundidas, limitadas por un característicoborde hundido y en cuyo centro se formannumerosos picnidios, visibles a simple vistacomo una punteadura negra. Se presentan lasmanchas en foliolos, estípulas, vainas ytallos. Rara vez, A. pisi, se presenta en laparte baja de la planta. M. pinodes y P. medi-caginis var. pinodella pueden, en expresiónsevera de ambas, no diferenciarse por sínto-mas. Sin embargo, M. pinodes, presenta unossíntomas iniciales consistentes en un motea-do oscuro e irregular en hojas, tallos, zarci-llos, vainas y estípulas, en la parte baja de laplanta. Las manchas, bajo condiciones favo-rables, se agrandan dando lugar a un caracte-rístico dibujo en anillos concéntricos, alter-nando los bordes claros y oscuros de marrón,manchas que en la base del tallo se alarganmostrando tonos azules o rojizos. P. medica-

ginis var. pinodella no suele tener síntomasaéreos, circunscribiéndose a una podredum-bre oscura en el hipocotilo que alcanza a laraíz principal con el consiguiente secado dela planta (MEssiAEN et al., 1995; TELLO et al.,1988; BRETAG y RAMSEY, 2001).

El trabajo que se presenta recoge unainvestigación sobre la etiología de la asco-chitosis observada en los cultivos de guisan-te y tirabeque bajo invernadero de la costa deGranada, concretamente en el término muni-cipal de Albuñol, durante las campañas2003-2004 y 2004-2005, donde los síntomasde ascochitosis eran abundantes y llegaban asecar las plantas. Las apreciaciones visualesen el campo permitieron, además, diagnosti-car la presencia de mildiu (Peronospora pisi)mezclado con las ascochitosis.

MATERIAL Y MÉTODOS

Las cepas estudiadas procedían tanto dehojas (figura 3) como de vainas (figura 4) consemillas contaminadas (figura 5) y de pétalosde flores (figura 6).Los aislamientos a partirdel material vegetal enfermo, se hicierontomando pignidios con una aguja enmangadadesinfectada bajo la lupa estereoscópica ysembrendo en medio PDA. Un total de 21 ais-lados fueron utilizados para su identificación.

Los medios de cultivo utilizados fueron:PDA, Agar-guisante, V8 y Agar-cloruropotásico preparados tal como indican TELLO

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Figura 3. Sintomatología típica de ascochitosis

Figura 4. Sintomatología típica de ascochitosisen hojas. en vainas.

et al. (1991). Con objeto de forzar la pro-ducción de peritecios se usó un medio a basede agar-agua donde se dispusieron hojassumergidas de guisante que fueron previa-mente desinfectadas con óxido de propilenocomo indican para las hojas de clavel TELLOet al. (1991). Las incubaciones se hicieronen el ambiente del laboratorio, en cámarabajo luz fluorescente continua y bajo luzultravioleta.

Los criterios taxonómicos utilizados fue-ron los indicados por BOEREMA et al. (1965),DORENBOSCH (1970), BOEREMA y VERHOE-VEN (1979), TELLO et al. (1988), HANLIN(1990), MESSIAEN eral. (1995) y BRETAG yRAMSEY (2001).

Figura 5. Sintomatología típica de ascochitosisen granos.

Las evaluaciones sobre la septación de losconidios se hicieron a partir de las esporas deun picnidio tomando 10 campos en elmicroscopio (ocular 10x y objetivo 40x) ycomputando todos los conidios de cadacampo, teñidos con lactofucsina (0.1 g defucsina en 100 ml de ácido láctico). Eldimensionado de conidios (figura 7) y ascos-poras se hizo sobre 50 unidades por aislado.Todos los aislados tenían cuando se hicieronlas medidas, 30 días de incubación.

Debido a que las cepas perdían conmucha facilidad su capacidad para producirpicnidios o peritecios, hubo que regenerar-las. Para ello se utilizaron semillas de gui-sante, desinfectadas (30 mm n en lejía comer-cial de 40 g de Cl activo por litro y posterioraclarado con agua), que se hicieron germinaren PDA sobre el que se repicaban los aisla-dos (figura 8).

Los criterios adoptados para realizar laidentificación de los 21 aislados han sido: 1)presencia de peritecios; 2) presencia de cla-midosporas; 3) formación de cristales deoxalato en PDA; 4) tabicación de las picni-diosporas; 5) dimensionado de ascas, ascos-poras y picnidiosporas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El cuadro 1 resume la presencia de peri-tecios (figura 9) y ascosporas (figura 10),pudiéndose comprobar que de los 21 aisla-

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Cuadro 1. Presencia de ascocarpos y ascosporas producidos en medio agar-agua con hojas de guisanteCódigo de cepas

N" de cepas estudiadas Presencia de ascocarpos Ausencia de ascocarposy ascosporas y ascosporas

Ase-1, Asc-3, Asc-4, Ase-9, Asc-2, Asc-5, Asc-6, Asc-7, Asc-B,21

Asc-11, Asc-12, Asc-13, Asc-10, Asc-14, Asc-15, Asc-I6,Asc-19, Asc-20

Ase-17, Ase-18, Ase-21

Cuadro 2: Tabicación de picnidiosporas en 21 cepas de Ascochyta aisladas de guisantes y tirabeque. Los datos sehan calculado sobre un mínimo de 50 y un máximo de 116 pienidosporas procedentes de un solo picnidio.

CÓDIGO Sin tabique I tabique 2 tabiques

Asc-I 8,4% 91,6% 0,0%

Asc-2 14,4% 84,0% 1,6%

Asc-3 18,8% 81,2% 0.0%

Asc-4 11.0% 873% 1,7%

Asc-5 25,2% 74,8% 0,0%

Asc-6 6,1% 93,9% 0,0%

Asc-7 12,9% 87,1% 0,0%

Asc-8 10,5% 895% 0,0%

Asc-9 20,0% 80,0% 0,0%

Asc-10 1 I ,7% 883% 0,0%

Ase-11 17,4% 82,6% 0,0%

Asc-12 9,6% 90,4% 0,0%

Ase-13 30,4% 69,6% 0.0%

Asc-14 0,0% 100,0% 0,0%

Asc-15 0,0% 100,0% 0,0%

Asc-16 0,0% 100,0% 0,0%

Asc-17 0,0% 98,0% 2,0%

Asc-18 0,0% 68,0% 32,0%

Ase-19 0,0% 100,0% 0,0%

Asc-20 0,0% 100,0% 0.0%

Asc-21 0,0% 100,0% 0,0%

Cuadro 3. Dimensiones de las picnidiosporas de Ascochyta pinodes y Ascochyta sp (las medidas se hicieron sobre50 picnidiosporas procedentes de un pienidio y se expresan con la media seguida de las desviación típica).

aisladoMycosphaerella pinodes Ascochyla sp.

Código delongitud (pm) anchura (pm) longitud (pm) anchura (pm)

Ase-14 10,95 ± 1,88 3,02 ± 0,81

Asc-15 1221 ± 2,44 4,38 ± 0,78

Asc-21 14,52 ±1,45 4,41 ± 0,63

Asc-1 10,61 ± 1,50 3,49 ± 0,80

Asc-9 11.78 ± 1,24 4,38 ± 0,87

Asc-19 12.53 ± 0,92 4,89 ± 023

Asc-20 11,81 ± 1,48 4,64 ± 0,68

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Figura 6. Sintomatología típica de ascochitosis en flores

dos estudiados, 9 presentaron el teleomorfoy ello permitiría admitir que dichos aisladospodrían ser asignados dentro de la especieM. pinodes (anamorfo A. pinodes). Lasaseas presentaron ocho ascosporas en suinterior, monotabicadas, conformadas pordos células iguales, cuyo contorno tiende aser triangular. Según MESSIAEN eta! (1995)las dimensiones para las ascas son del ordende 50-80 x 10-15 pm y las ascosporas de 17x 8 pm. Dos de las cepas (Asc-19 y Asc-20)presentaron ascas con las siguientes dimen-siones 57,52 ± 17.10 x 11,29 ± 1,94 pm y53,63 ±6. 80 x 9,53 ± 0,93 pm respectiva-mente. Las ascosporas medían 12,88 ± 1,93x 4,92 ± 0,16 pm. Estas dimensiones podrí-an considerarse comparables a las propor-cionadas por los autores consultados paralas aseas pero no para las ascosporas. Encualquier caso, el carácter fundamental paralas 9 cepas fue la formación de la formasexual.

¿Cómo considerar entonces, las 12 cepasque no produjeron la facies ascígena? ¿Per-tenecían al anamorfo de M pinodes? ¿Podíanencuadrarse en una de las otras dos especiesque conforman el "complejo" de la ascochi-tosis?.

BOEREMA y BOLLEN (1975) considerancomo un carácter fundamental en la taxono-mía de Phoma y Ascochyta, la conidiogéne-sis. TELLO et al (1988) aceptan este criteriocomo bueno para identificar P. medicaginisvar. pinodella patógeno en plantaciones de

guisante de Murcia. El primer aspecto abor-dado fue el de la tabicación de las picnidios-poras, cuya evaluación se resume en el cua-dro 2. Aunque TELLO et al, (1988) encuen-tran que para 9 cepas aisladas de guisante,dos de ellas no podrían ser asignadas aPhoma por la tabicación, en las 7 restanteslas picnidiosporas fueron mayoritariamenteno tabicadas, asignándolas por tanto a P.medicaginis var. pinodella. En el cuadro 2aparecen todas agrupadas como cepas pro-ductoras de picnidiosporas monotabicadas y,a veces, bitabicadas, lo cual orientaría laasignación al género Ascochyta.

¿Cuál especie: A. pisi o A. pinodes?MESSIAEN et al. (1995) informaron sobre

el tamaño de las picnidiosporas. Así, para A.pisi los valores son de 13,9 x 4,2 pm y paraA. pinodes lo son de 8-16 x 3-6,5 pm. Lasdimensiones de varias cepas obtenidas eneste estudio se resumen en el cuadro 3.

El cuadro 3 provee de una informacióninteresante, por cuanto permite compararaislados que produjeron el teleomorfo conaquellos que no lo produjeron. A partir deellos podría decirse que tienen unas dimen-siones bastante parecidas, dimensiones quesegún se desprende de MESSIAEN et al.(1995), podrían estar tanto dentro de los ran-gos dados tanto para A. pisi como para A.pinodes y que serían muy superiores a lospresentados por TELLO et al. (1988) para P.medicaginis var. pinodella. Por lo tanto, nose podría atribuir con este carácter una asig-

Figura 7. Conidios típicos de Ascochyta sp.

Figura 9. Ascas de Mycosphaerella pinodes. Fig. 10. Detalle de ascosporas de Mycosphaerella pinodes.

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nación específica dentro de las dos especiesde Ascochyta que conforman la micosisobservada.

¿Podrían otros caracteres morfológicosservir para separar ambas especies deAscochyta? BOEREMA et al. (1965), DOREN-

BOSH (1970) y BOEREMA (1976), considera-ban la producción de cristales de oxalato cál-cico como un distintivo de P. medicaginisvar. pinodella. PUNITHALINGAM y GIBSON

(1976) y TELLO et al (1988) consideran quelos aislados tienen una versatilidad cierta a lahora de producir los cristales en forma deabanico (figura 11). El otro carácter sería laproducción de clamidosporas (figura 12).BRETAG y RAMSEY (2001) mencionan su pro-ducción para A. pinodes pero no hacen men-ción de tal carácter para A. pisi.

Figura 8. Regeneración en semilla de Ascochyta sp.Mycosphaerella pinodes sobre medio de cultivo PDÁ

El cuadro 4 resume la presencia de clami-dosporas y de cristales de oxalato cálcico paralas cepas estudiadas. Parece evidente que lasclamidosporas no distinguen entre los aisladosde Ascochyta sp. (cepas Asc-5, Asc-6, Asc-7,Asc-8, Ase-10, Asc-14, Ase-15, Asc-16, Asc-17, Asc-18, Asc-21) y los de M. pinodes.Todas las cepas, menos dos, producen clami-dosporas lo cual si se admite la sugerencia deBRETAG y RAMSEY (2001), podrían ser asigna-das a A. pinodes. Sin embargo, los cristales deoxalato cálcico no son producidos por los ais-lados que produjeron el teleomorfo y desdeeste punto de vista los aislados designadoscomo Ascochyta sp. no podrían encuadrarse

Presencia de clamidosporas Formación de cristales

NoSISiNO

SiSI

SiNo

No

NoNo

AbundantesAbundantes

NoSi

CÓDIGO

Asc-1 Ase-2 Ase-3 Asc-4 Ase-5 Ase-6 Asc-7 Asc-8 Asc-9 Ase- 10Ase-11 Ase-12 Ase-13 Ase-14 Ase-15 Ase-16 Ase- 17

Ase- 18 Ase-19 Ase-20Asc-21

Abundantes No

Abundantes No

Abundantes No

Abundantes NoSiNo

Abundantes No

AbundantesSi

Abundantes No

NOAbundantes No

Abundantes No

Abundantes No

Abundantes No

AbundantesAbundantes

BOL. SAN. VEG. PLAGAS. 34,2008 569

Cuadro 4. Producción de cristales de oxalato cálcico en abanico y de clamidosporas por aisladosde Ascochyta en PDA

como A. pinodes. No obstante, sorprende conrespecto a las cepas de M. pinodes la forma-ción tan uniforme de cristales de oxalato.

Existe, como consecuencia del plantea-miento taxonómico y de la fragmentaria

bibliografía disponible y consultada, unadificultad importante para asignar una u otraespecie a 12 aislados de los 21 estudiados.Por el tamaño de las picnidiosporas se apro-ximan a A. pinodes mas que a A. pisi, pero

Figura II. Cristales de oxalato cálcico en forma de abanico.

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Figura 12. Clainidosporas de Ascochyta sp.

este carácter es demasiado débil para utili-zarlo como definitivo. Debilidad que se apre-cia igualmente para la producción de clami-dosporas y cristales de oxalato. Tampoco lossíntomas observados en el campo permitenasignarlos a una u otra especie de Ascochyta,máxime cuando aparecieron manchas en lospétalos equiparables a las originadas en unprincipio por A. pinodes pero no referidos enla literatura consultada. Por lo tanto, pareceprudente denominar a 12 de las 21 cepas

estudiadas como Ascochyta sp. Este es unode los casos de taxonomía clásica de hongos,donde el análisis molecular podría comple-mentar con éxito al exámen morfológico ycultural de los especímenes.

Estimamos que es esta la primera vez enEspaña que se presentan datos taxonómicossuficientes como para asegurar que M. pino-des (anamorfo: A. pinodes) produce enfer-medad en guisantes y tirabeques para consu-mo en fresco y cultivados en invernadero.

ABSTRACT

CARRETERO, F. J., F. DIÁNEZ, M. DE CARA, M. SANTOS, J. C. TOLLO. 2005. Presenceof Mycosphaerella pinodes causing disease on pea and snow pea crops in Granadascoast (Spain). Bol. San. Veg. Plagas, 34: 563-571.

Presence of brown-coloured necrotic spots on leaves, stipulae, stems, tendrils, flow-ers and pods, firstly punctiform and developing to more or less rounded spots, evokedpresence of ascochytosis on Pisum sativum var. vulgare and P. sativum var. macrocarpongreenhouse crops. This fact moved lo study the complex taxonomy of 21 isolates thatcould be collected from affected plants, trying lo include them in one of three reponedspecies involved with the disease. Nine isolates developed asci and were assigned loMycosphaerella pinodes (anamorph Ascochyta pinodes). However, the 12 other isolatescoulern be identified as Ascochyta pisi or Ascochyta pinodes, attending to septation anddimensions of pycnidiospores, presence of chIamydospores and formation of calcium-oxalate crystals. ft can be affirm that those isolates didn't approach lo Phoma medicagi-nis var. pinodella and they were assigned to Ascochyta sp.

Key word: Ascochytosis, Pisum sativum.

BOL. SAN. VEG. PLAGAS, 34,2008 571

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(Recepción: 10 abril 2008)(Aceptación: 20 octubre 2008)