Preparación Células Competentes

Dr. Jesús Lee-BorgesDr. José M. PlanasDra. Liza JiménezUniversidad de Puerto Rico – AguadillaDepartamento de Ciencias Naturales

Objetivos

Repasar principios básicos y protocolo de preparación de bacterias competentes.

Preparar bacterias competentes. Realizar protocolo de transformación.

Pasos a seguir para la clonación:

Aislamiento Amplificación (PCR) Digestión ER : Plásmido y DNA a clonar Ligación (in vitro, ligasa) Transformación (bacterias competentes) Selección “Screening”

capaces de permitir la entrada de DNA a través de su membrana

Células competentes

Maneras de obtener bacterias competentes

Comerciales Preparando

“stocks” de manera local

Factores críticos en obtener transformación

La pureza de los reactivos usados en los buffers de transformación

La etapa de crecimiento de las células Bacterias crecidas del “stock” original y

almacenadas a -70 C Lag Log Plateau

La limpieza del equipo usado Presencia de detergentes

Métodos para obtener células competentes

Electroporación (electrotransformación) Neuman et al. 1982,

Potter et al. 1984, Fromm et al. 1985, Chu et al. 1987)

Mas fácil, mas eficiente Transformación química

CaCl2

Electroporación

Aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto.

Las membranas se despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, DNA,...) que se encuentran alrededor.

Ventaja: se aplica a millones de células a la vez; se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones).

Transformación química

Competent Cells CSHL DNA Learning Center.

Mandel & Higa (1970) CaCl2

Reacción de Transformación

http://www.dnalc.org/view/15916-DNA-transformation.html

Protocolo

1. Empezamos con E. coli en caldo de LB2. Centrifugar 4000 rpm por 10 minutos3. Decantar el medio, invertir el tubo por 1

minuto4. Resuspender el “pellet” en 1 ml de 0.1 M

CaCl2 (en hielo) (Cl-/ Ca+2 / Hielo)5. Centrifugar por 10 minutos6. Decantar7. Repetir el paso 4

Protocolo (continuación)

8. Transferir 1.0 mL de las bacterias competentes a un tubo de ensayo.

9. Añadir la reacción de ligación.10. Transferir los tubos a un baño de maría a

42°C por 90 segundos “Heat shock”11. Regresar los tubos al hielo por 2 minutos.12. Añadir 175 uL de LB, mezclar usando el

“Vortex”

Protocolo (cont.)

12. Transferir la mezcla de las células competentes + el DNA recombinante al LB soft agar, mezclar.

13. Colocar el LB soft agar sobre una placa de LB agar y mezclar hasta que cubra la placa completa (doble capa)

14. Esperar hasta que se endurezca, invertir la placa e incubarla a 37°C por 8-12 horas.

¿Preguntas?