PRELUCRAREA PROBELOR CONGELATE Tehnica secționării pieselor biologice congelate este apanajul laboratoarelor de

anatomie patologică şi permite analiza microscopică rapidă a unui preparat. Recoltarea, fixarea, secționarea, etalarea, colorarea, montarea și etichetarea se

desfășoară într-un timp foarte scurt (cca 10 minute) față de tehnica secțiunilor fine la parafină (cca 16 ore). La această metodă, etapele de fixare și includere se realizează în același timp, practic se suprapun.

Calitatea preparatului este însă diminuată față de probele incluse in parafină și secționate la microtom. Aplicațiile tehnicii de secționare a pieselor congelate

- efectuarea unui examen anatomopatologic rapid: o în cadrul tehnicii chirurgicale Mohr (chemiochirurgie) - o metodă simplă de

control microscopic 100% al marginilor unei probe chirurgicale; o pentru examinarea în timpul operator a unei tumori cu presupuse metastaze;

proba suspectă de a fi o metastază este prelucrată prin congelare și secționare la criotom iar rezultatul decide continuarea procedurii operatorii în sens radical sau conservator;

- evidențierea unor componente tisulare care se pierd la prelucrarea prin tehnici histologice uzuale (în care, de exemplu, folosirea formolului ca fixator dizolvă lipidele); se pot detecta lipidele, enzimele, mucopolizaharidele.

- efectuarea unor preparate care să permită detecția unor antigene, prin tehnici complementare de imunofluorescență sau imunohistochimie; aceste antigene pot fi mascate de fixarea cu formalină, motiv pentru care se poate opta pentru secționarea la criotom.

Materiale și echipamente necesare țesut proaspăt recoltat; metodele de recoltare sunt similare celor utilizate pentru țesuturile incluse în parafină;

criotom = un microtom pentru secţiuni congelate, amplasat într-o incintă frigorifică; grosimea secțiunilor este de 5-60m;

gel crioprotector OCT (Optimal Cutting Temperature) = un amestec de glicerol și rășini care împiedică formarea cristalelor de gheață în interiorul țesutului (fapt care ar afecta structura tisulară);

- soluții de colorare (fie albastru de toluidină fie clasica tehnică de colorare HE), lame, lamele, mediu de montare, alcool, xilol.

Tehnică de lucru 1. Recoltarea

Recoltarea se poate realiza prin metodele cunoscute (biopsie, puncție bioptică etc); 2. Fixarea și includerea 2.1 Metoda 1

Fixarea se realizează prin congelarea probei (implicit - metodă fizică) Congelarea probei se realizează într-un container special (fig.a)

Piesa este acoperită cu soluție crioprotectoare (fig.b) și sigilată cu o membrană PET. Congelarea se poate realiza și în sistemul de răcire al criotomului, pe o placă răcită la -58°C. Preparatele pot fi apoi stocate într-un congelator la -74°C, dacă nu sunt secţionate imediat. Incinta criotomului ajunge la -35°C

Incinta criotomului, vedere de sus

Incinta criotomului, detaliu al camerei de congelare, răcită la -35°C.

1=piston răcire instant (-58°C); 2=suport placă răcire instant; 3=port-obiect pentru piesa congelată; 4=cuțit

Panoul de comandă a criotomului, include afișaj pentru numărarea secțiunilor, grosimea

secțiunilor, modul de acționare a motorului de deplasare a portobiectului.

Pentru congelarea probelor, piesa de țesut se amplasează pe suportul răcit în incinta criotomului, pe placa de răcire, la -58°C. Inițial se adaugă o picatură de crioprotector.

Pentru congelarea probelor, piesa de țesut se amplasează pe suportul răcit în incinta criotomului, pe placa de răcire, la -58°C. Inițial se adaugă o picatură de crioprotector. Ulterior se adaugă mai mult agent crioprotector peste piesa tisulară.

(seamănă acum cu un ou-ochi…)

Peste piesă se coboară aplicatorul răcit și el la -58°C. Piesa este congelată simultan din partea superioară și inferioară. Se lasă la răcit (congelare = fixare + includere) câteva minute.

2.2. Metoda 2 Se amplasează țesutul în godeuri speciale incluse în placa de răcire.

Se acoperă țesutul cu gel crioprotector OCT.

Se amplasează mandrenul metalic peste gelul OCT. Se apasă ușor mandrenul peste godeu.

Aceste mandrenuri de oțel inoxidabil sunt pre-răcite pentru a fi utilizate în răcirea rapidă; modelul depe suprafața de contact ajută la maximizarea contactului cu gelul OCT și cu piesa de ţesut. Pentru a amplifica efectul de congelare, putem utiliza un bloc perforat, numit supra-mandren sau manșon. Manșoane Sunt paralelipipezi metalici, cu o perforație centrală care servesc pentru:

- congelare, prin aplicare peste mandren - detașarea blocului congelat din locașul

plăcii de congelare. Lovirea ușoară a tijei madrenului cu manșonul poate cliva planul de aderenţă al blocului format în godeu.

Se plasează manșonul peste tija mandrenului (stânga). Se înlătură blocul cu o lovitură ușoară asupra tijei mandrenului cu ajutorul manșonului (dreapta)

Blocurile congelate pot fi stocate la -80°C, dacă nu sunt secționate imediat.

Reducerea artefactelor rezultate din congelare Răcirea agentului crioprotector Congelarea şi formarea cristalelor de gheaţă începe imediat după ce ţesutul atinge placa de racire. Ţesuturile care conţin multă apă sau care sunt edemaţiate pot forma cristale de gheaţă care să le afecteze structura. Acest fenomen poate fi redus prin răcirea gelului OCT la frigider. Gelul crioprotector este folosit de obicei pentru biopsiile cerebrale, tiroidiene, pulmonare sau renale. Viteza de congelare este crescută prin această metodă. Pre-răcirea țesutului Țesuturile răcite rapid prezintă mai puține artefacte. Țesuturile primate din clinică au temperature cuprinse între temperatura corpului și temperatura camerei. Prerăcirea țesutului înainte de congelare (la zero grade) este utilă în accelerarea etapei de fixare+includere. Timp aproximativ de răcire la -24°C , utilizând un mandren răcit:

- godeu 18mm - 20 secunde - godeu 24mm - 35 secunde - godeu 30mm - 60 secunde

Containerul special de congelare este amplasat pe sistemul portobiect al criotomului. Blocul congelat cu țesutul trebuie să fie paralel cu lama cuțitului; acum se poate începe secţionarea.

În timpul secționării, care poate fi automată, semi-automată sau manuală, cu ajutorul unui penson se împiedică incurbarea secţiunilor.

Același fenomen poate fi evitat cu ajutorul unui panou de sticlă anti-incurbare, atașat și amplasat deasupra cuțitului.

În final secțiunile sunt preluate cu un penson și amplasate pe lamă.

Colorarea secțiunilor la gheață Colorarea secțiunilor din blocuri de țesut congelat se poate face fie pe secțiuni libere fie pe secțiuni lipite pe lame portobiect. Pentru secțiunile libere, bateria de colorare este formata din cutii Petri cu diametru mic prin care secțiunile se trec cu ajutorul unor baghete de sticla in forma de “L”. După colorare, aceste secțiuni se pescuiesc pe lame portobiect și se montează în medii apoase (glicerină, gelatină). Pentru secțiunile etalate pe lamă, colorarea se realizează cu diferiți coloranți și prim metode variate, în funcție de timpul disponibil. Colorațiile utilizate sunt cele folosite de obicei pentru secțiuni fine (albastru de toluidină sau hematoxilină eozină - colorații de rutină) sau sunt adaptate rezultatelor scontate (ex. imunofluorescență).

Colorarea secțiunilor lipite pe lame cu soluție 1% de albastru toluidina - etape de lucru Secțiunile lipite pe lamă, după secționarea la criotom, sunt hidratate dar conțin încă impurități, grăsimi. În consecință este necesară o clarificare cu xilol (solvent organic). Xilolul nu este miscibil cu apa, așadar, înainte de clarificare, secțiunile trebuie deshidratate, iar după clarificare, secțiunile trebuie rehidratate deoarece soluția de colorare este apoasă.

Etape:

DESHIDRATARE Alcool 90% se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii

Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

Alcool 100% se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

CLARIFICARE Xilol se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii

Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

REHIDRATARE Alcool 100% se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii

Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

Alcool 90% se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

COLORARE PROPRIU-ZISĂ

Albastru de toluidină, soluție 1%

se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă 30-60 secunde, apoi se scurge în vasul Petri

După colorare, secțiunile parcurg etapele de postcolorare, în funcție de mediul de montare:

- pentru un mediu de montare apos - se adaugă direct 1-2 picături de mediu de montare și se acoperă cu o lamelă; se elimină bulele de aer pin presarea ușoară a lamelei. Se poate examina la microscop;

- pentru un mediu de montare anhidru (Balsam de Canada) etapele sunt:

DESHIDRATARE Alcool 90% se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii

Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

Alcool 100% se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

CLARIFICARE Xilol se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

MONTARE Balsam de Canada se adaugă direct 1 picătură de mediu de montare și se acoperă cu o lamelă; se elimină bulele de aer pin presarea ușoară a lamelei. Se poate examina la microscop;

Rezultatele colorării cu albastru de toluidină: nuclei apar in albastru închis, iar citoplasma în albastru deschis.