PRÁCTICA Nº10

Universidad Nacional Mayor de San MarcosUniversidad del Perú (DECANA DE AMÉRICA)

Facultad de Farmacia y BioquímicaEscuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE FARMACOLOGÍA, BROMATOLOGÍA Y TOXICOLOGÍA

DOCENTE: DRA. TERESA GALLARDO

GRUPO: C3

ALUMNOS:

COLONIA OCHOA, BRUNO CUYA LÓPEZ, EDILBERTO DIAZ MARTINEZ, HEYDEE GIURFA TUTAYA, LILIANA OBLITAS BARBOZA, JEAN PIERRE

CICLO: DÉCIMO

AÑO: 2013

práctica n° 2 DETECCIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS

2I. INTRODUCCIÓN

Las bacterias pertenecientes al género Salmonella, familia Enterobacteriaceae, se caracterizan por ser bacilos gram negativos, anaerobios facultativos, utilizan citrato como única fuente de carbono y poseen metabolismo de tipo oxidativo y fermentativo. Dentro de su clasificación taxonómica, actualmente se describen dos especies: S. enterica y S. bongori, donde la primera a su vez se subdivide en seis subespecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonea, houtenae e indica; Salmonella enterica subespecie enterica representa 99% de los serotipos aislados, siendo estos últimos determinados por los antígenos somáticos (O), flagelares (H) y capsulares o de superficie (Vi). Es así como se describen mas de 2500 serotipos o serovares de este género (Ejemplo: Salmonella enterica subespecie enterica serotipo enteritidis o su abreviatura científicamente aceptada, Salmonella enteritidis). La salmonelosis se presenta en términos generales, dentro de dos espectros clínicos: el primero, la fiebre entérica más conocida como fiebre tifoidea, caracterizada por ser un cuadro febril sistémico cuyos agentes etiológicos son S. typhi y S. paratyphi, donde el hombre se comporta como único huésped; y el segundo, la gastroenteritis, caracterizada por síntomas como dolor abdominal, malestar general, vómito, diarrea y en algunos casos fiebre, frecuentemente relacionado a previo consumo de alimentos contaminados de origen animal, es importante tener en cuenta que en los pacientes adultos inmunocomprometidos con infección por Salmonella no tifoidea, existe mayor mortalidad relacionada con bacteriemia recurrente4,5 Los serotipos de Salmonella más representativos a nivel mundial son S. enteritidis y S.typhimurium (24,1% y 6,6% de los brotes atribuidos a estos serovares respectivamente); ubicándose así como el principal microorganismo bacteriano implicado (46,9%) dentro del espectro de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA), seguido del Staphylococcus aureus, gracias a su extraordinaria capacidad de colonización y adaptación a diversos hospederos animales, donde las aves cumplen un papel protagónico.

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA - UNMSM

3II. MARCO TEÓRICO

SALMONELOSISEs una enfermedad cuyos síntomas más comunes son: dolor abdominal súbito, diarrea, náuseas, vómitos y fiebre. En ancianos y lactantes provoca una deshidratación que puede ser mortal. En el Perú esta enfermedad se viene notificando en diferentes partes del país, llamando la atención los brotes de infección en grandes grupos de personas que acuden a servicios de alimentación, sobre todo en el norte del país. En el año 1977, ocurrió un serio brote en la Universidad de Trujillo que afectó a cerca de 600 estudiantes y en la que se aisló Salmonella agona, de los huevos de gallinas infectadas que se utilizaron en la preparación de la mayonesa. El agente etiológico es una bacteria denominada Salmonella, de la que se reconocen

alrededor de 2,200 serotipos, distribuidos en todo el mundo, siendo alrededor de 200 los prevalentes en lugares y épocas diferentes. Esta bacteria se desarrolla a temperaturas de 8 °C a 45 °C, es sensible al calor y muere sobre la temperatura de los 60 °C.

Detección de Salmonella

La detección rutinaria de salmonelas supone una secuencia de pre enriquecimiento, enriquecimiento, siembra en placas de medios selectivos, aislamiento e identificación.

El pre - enriquecimiento se puede llevar a cabo o no, dependiendo del grado de probabilidad de que en el alimento existan células dañadas. Se utiliza cuando se analizan alimentos que han sido calentados, congelados y desecados y en aquellos alimentos en los que he de esperar que se encuentren células de salmonelas en escaso número.

El enriquecimiento selectivo tiene por finalidad inhibir el crecimiento de otros microorganismos a la vez que permite que las salmonelas crezcan. Se consigue mediante el empleo de compuestos químicos inhibidores, de una temperatura y una


4duración de la incubación determinadas, que permiten que la proporción de salmonelas con respecto a los demás microorganismos aumente. Los caldos selectivos que se utilizan habitualmente son el caldo de tetrationato con verde brillante, el caldo selenita con cistina y el caldo con cloruro de magnesio – verde malaquita de Rappaport – Vassiliadis. La presencia de salmonellas se determina sembrando muestras de los caldos de enriquecimiento en placas de medios selectivos. Los medios para siembra en placa que se emplean habitualmente son el verde brillante con o sin sulfadiazina, el desoxicolato xilosa lisina, el sulfito de bismuto, el agar entérico de Hektoen.

III. PARTE EXPERIMENTAL

PROCEDIMIENTO:

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO

Transferir 25g o 25ml del matraz con 225ml de agua peptonada, incubar a 37º C durante 24 h.

AGUA PEPTONADA TAMPONADA

Asegura a mantener el pH durante 24horas, lo que sumado al período de incubación permite el incremento de células que son sensibles a la disminución del pH.

A éstos medios se les puede adicionar sustancias que contrarresten las sustancias inhibidoras que están presentes en algunos alimentos; asimismo se debe asegurar el pH que es un factor muy importante para el crecimiento de Salmonella.

AGUA PEPTONADA TAMPONADATemperatura 37°CTiempo de incubación 24 horas


5MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

Usamos dos caldos el cual contiene sustancias inhibidoras que estimulan la multiplicación de salmonellas y reducen el crecimiento de demás microorganismos competitivos

Llevamos 1 mL del cultivo anterior a 10 mL de caldo selenito cistina Llevamos 1 mL del cultivo anterior a 10 mL de caldo tetrationato verde brillante

IV. RESULTADOS

AISLAMIENTO SELECTIVO

Medio de cultivo Agar Hektoen Entérico

La morfología y color de las colonias en agar Hektoen entérico son las siguientes:

Colonias verdes con centro negro: microorganismos no fermentadores de lactosa con producción de H2S.

Colonias verdes: microorganismos no fermentadores de lactosa. Colonias anaranjadas: microorganismos fermentadores de lactosa.


6AGAR SULFITO BISMUTO

Colonias típicasLas colonias típicas de la Salmonella typhi son marrones o negras, algunas veces con brillo metálico alrededor de las colonias. Algunas cepas producen colonias verdes con poco o ningún oscurecimiento.

AGAR VERDE BRILLANTE

Es un medio altamente selectivo utilizado para el aislamiento de microorganismos pertenecientes al género Salmonella con excepción de la Salmonella typhi.

Colonias típicasLas colonias típicas del género Salmonella son pequeñas, incoloras, rosadas o fucsias, transparentes u opacas, sobre el medio coloreado de rosado a rojo.


7IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

a) TSI (Triple azúcar hierro)

Pico: Alcalino (lactosa y sacarosa negativo)Fondo: Presencia de FeS (coloración negra), producción de H2S.

b) LIA (Agar Lisina Hierro)

Reacción alcalina (púrpura, descarboxila lisina) Producción de coloración negruzca (producción de H2S)

Observaciones: La presencia de gran cantidad de FeS es debido al tiempo de incubación antes de la lectura. Para evitar esta interferencia el método señala que se debe dar lectura a las 24 horas. Por motivos de la práctica se realizó la lectura a las 48 horas.


8V. DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en la presente práctica demuestran la presencia de Salmonella sp. el cual puede ser contaminante de diversas muestras de alimentos. El hallazgo de Salmonella y otras enterobacterias en alimentos son un serio riesgo para la salud por la asociación durante la infección con estas bacterias a gastroenteritis en sujetos inmunocompetentes, cuadros clínicos invasivos severos en sujetos inmunosuprimidos y con complicaciones focales en menor frecuencia1.

El aislamiento e identificación de Salmonella sp. se realizó según los métodos estandarizados de análisis microbiológicos en alimentos. Este proceso se recomienda hacerlo en seis pasos: desde el enriquecimiento de la cepa y su aislamiento hasta su identificación por pruebas bioquímicas y serológicas 5,6.

Los resultados del aislamiento de colonias de Salmonella en agar selectivo fueron positivos. En el agar bismuto sulfito las colonias mostraron un centro negro rodeado de un borde claro y con brillo metálico por la reducción de iones de bismuto que se transforman en bismuto metálico 5. En el agar verde brillante las colonias fueron de color rosado, transparentes lo que indica que no fermentaron la lactosa presente en el agar. En el agar Hektoen las colonias fueron verde azuladas con centro negro, esta coloración oscura indica que las colonias son productoras de SH2.

En la identificación final de Salmonella sp. las colonias sospechosas observadas en el medio de cultivo diferencial se someten a pruebas de reacción bioquímica con el fin de confirmar la presencia de la bacteria. En general a Salmonella sp. se le realiza un conjunto de pruebas que incluyen la producción de indol, rojo de metilo, Voges – Proskauer, citrato, TSI, hidrólisis de urea, deaminación de la fenilalanina, descarboxilación de la lisina, arginina y ornitina, motilidad, hidrólisis de gelatina, utilización de malonato, fermentación de glucosa con producción de ácido y gas, fermentación de lactosa y sacarosa, lipasa, ADNasa, transformación nitrato – nitrito y fermentación de manosa7,8. Sin embargo, para el objetivo de la presente práctica, solo se realizaron algunas de ellas (TSI y LIA) porque son las más recomendadas en los diferentes métodos de identificación de dicha bacteria.

El resultado obtenido en la prueba de TSI (A/K con formación de SH2 y producción de CO2) y el obtenido en la prueba de LIA (alcalina y formación de SH2) nos confirma que se trata de una especie de Salmonella; sin embargo, debemos descartar la


9presencia de Salmonella typhi y Salmonella paratyphi porque ninguna de ellas produce SH2

9.

VI. CONCLUSIÓN

El microorganismo analizado corresponde a la enterobacteria del género Salmonella sp.

VII. CUESTIONARIO

1. ¿Qué otras pruebas bioquímicas adicionales recomienda la FDA en la detección de la salmonella en alimentos además del TSI y LIA?

Otras pruebas adicionales que recomienda la FDA cuando la salmonella no da reacciones típicas son:

CALDO DE LACTOSA ROJO FENOL O CALDO DE LACTOSA PÚRPURA

Del TSI, inocular el caldo con una pequeña cantidad de cultivo. Incubar 48 ± 2 h en 35°C, examinar después de 24 h.

Positivo - producción ácida (amarillo) y producción de gas en tubo de fermentación interior. Considerar la sola producción de ácido como reacción positiva. La mayor parte de cultivos de Salmonella dan resultado negativo de prueba, indicado por ninguna formación de gas en el interior del tubo de fermentación y rojo (cuando el rojo fenol es el indicador) o púrpura (con púrpura bromocresol como indicador) en todas partes del medio.

CALDO DE SACAROSA ROJO FENOL O CALDO DE SACAROSA PÚRPURA Descartar como no Salmonella,los cultivos que dan pruebas de sacarosa positivas, excepto aquellos que dan ácido en la inclinación del TSI y reacciones positivas en el LIA

MR-VP caldo Inocular el medio con la pequeña cantidad de crecimiento de cada inclinación de TSI clasificada sospechosa de Salmonella. Incube 48 ± 2 h en 35°C.

Vogues-Proskauer (VP) Realizar a temperatura ambiente de la siguiente manera: Transfiera 1 mL de 48 h de cultivo un tubo de ensayo limpio e incube el resto del caldo un tiempo adicional de 48 h en 35°C. Agregar 0,6 mL alfa-naftol y agitar bien. Agregue 0,2 mL de solución KOH al 40 % y agitar bien. Para intensificar y apresurar la reacción, agregue unos cristales de creatina. Resultados leídos después de 4 h; el desarrollo de color rosado- rojo en todas partes


10del medio es la prueba positiva. La mayor parte cultivos de Salmonella son VP Negativas, indicadas por la ausencia de desarrollo de color rosado-rojo en todas partes del caldo.

Rojo metilo: A 5 mL de cultivo de 96 horas del caldo VP, agregue 5-6 gotas del indicador rojo metilo. La mayor parte cultivos de Salmonella da la prueba positiva, indicada por el color rojo difuso en el medio. Un color distinto, como el amarillo es la prueba negativa. Descartar, como Salmonella, los cultivos que no dan positivo.

Agar Citrato Simmon: Inocular este agar usando aguja de inoculación con cultivo proveniente de agar TSI no clasificado. Inocular rayando la inclinación y picando el extremo. Incubar 96 ± 2 h en 35°C. Lectura: Positivo - presencia de crecimiento, por lo general acompañado por cambio en color de verde a azul. La mayor parte cultivos de Salmonella son citrato - positivas. Negativo - ningún crecimiento o muy poco crecimiento y ningún cambio en color.

2. Cómo observo las colonias de salmonella en el agar hektoen. Explique el fundamento bioquímico.

La morfología y color de las colonias en agar Hektoen entérico son las siguientes:

Colonias verdes con centro negro: microorganismos no fermentadores de lactosa con producción de H2S.

Colonias verdes: microorganismos no fermentadores de lactosa. Colonias anaranjadas: microorganismos fermentadores de lactosa.

Fundamento: En el medio de cultivo la proteosa peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo microbiano. La lactosa, sacarosa y salicina son los hidratos de carbono fermentables. Las sales biliares inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, de algunos coliformes y de la mayoría de las cepas de Pseudomonas spp. El azul de bromotimol y la fucsina ácida son los indicadores de la fermentación de hidratos de carbono, mientras que el citrato de hierro actúa como indicador de la formación de SH2ma partir del tiosulfato debido a que se forma sulfuro de hierro, compuesto de color negro. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante.

3. Explique el fundamento del crecimiento de Salmonella en el caldo tetrationato.

La Base de Caldo Tetrationato es utilizada como un medio de enriquecimiento selectivo para especies de Salmonella que pueden estar presentes en pequeñas cantidades y que compiten con otras bacterias de la flora intestinal.En este medio la peptona provee la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y aminoácidos. La selectividad del medio está dada por la combinación del tiosulfato de sodio y tetrationato (el tetrationato es formado en el medio con la adición de yodo y yoduro de potasio en solución). Los organismos que tienen la enzima tetrationato reductasa proliferan en el medio. Las sales biliares suprimen


11el desarrollo de coliformes e inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. El carbonato de calcio neutraliza y absorbe los metabolitos tóxicos.

4. ¿Cuál es el fundamento del sistema API? Usos.

Fundamento: Son medios, deshidratados o no, que se encuentran contenidos en microtubos los cuales se rehidratan o siembran mediante una suspensión bacteriana y luego se cultivan. Luego se incuban y en este proceso el metabolismo del microorganismo genera cambios en el medio de cultivo que se aprecian por un cambio de color de éste o al añadir reactivos. Los cambios ocurridos se interpretan mediante tablas de lectura o mediante un programa de ordenador.

Cada prueba de cada microtubo tiene un fundamento propio que es el mismo que se usa para las pruebas tradicionales que son realizadas individualmente.

Usos:

Identificación de microorganismos gram positivos, gram negativos y levaduras. Diagnóstico de enfermedades infecciosas (laboratorio clínico), bancos de sangre.Uso industrial: control de calidad de productos cosméticos, nutracéuticos, agro, comida y biomedicametos.

5. ¿Cómo se realiza la identificación serológica de Salmonella?

La detección de la presencia de los antígenos O, Vi Y H de Salmonella se realiza por aglutinación en placa con los sueros apropiados a partir de colonias puras y después de eliminar las cepas autoaglutinables.

a) Eliminación de cepas autoaglutinables: colocar una gota de solución salina en una placa de vidrio. Con un ansa dispersar parte de la colonia para obtener una suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en círculos por 30 a 60 segundos. Observar el resultado contra un fondo oscuro preferiblemente con ayuda de una lupa. Si la cepa aglutina es considerada autoaglutinable y no debe someterse a la determinación serológica, ya que los resultados no son confiables.

b) Determinación del antígeno somático O:

Antisuero polivalente (O): emulsionar una ansada de cultivo de 24 h - 48 h tomado a partir del pico de flauta del TSI o preferiblemente del triptosa agar sangre base (sin sangre) con 2 ml de solución salina 0.85% y colocar una gota sobre la placa de vidrio. Agregar una gota del antisuero polivalente O y mezclar con un aguja o ansa limpia y estéril. Inclinar con movimientos una y otra vez durante un minuto. Observar el


12resultado contra un fondo oscuro y con buena luz. Considerar cualquier grado de aglutinación como positivo.

Antisuero (O) de grupo: utilizar antisueros de grupo, incluyendo el Vi y realizar el mismo procedimiento que para el antisuero polivante (O).

c) Determinación del antígeno flagelar (H): A partir del pico de flauta del TSI inocular un caldo BHI e incubar 4h - 6 h a 35°C hasta crecimiento visible (para realizar el test el mismo día) o caldo tripticasa soja-triptona e incubar 24 h ± 2 h a 35 °C (para realizar el test al día siguiente). Agregar 2.5 ml de solución salina fisiológica formolada a 5 ml de cualquiera de los caldos arriba mencionados. Colocar 0.5 ml de una dilución apropiada del antisuero polivalente flagelar (H) en un tubo para serología y agregar 0.5 ml del antígeno. Realizar un control de autoaglutinación mezclando 0.5 ml de solución salina fisiológica formulada con 0.5 ml del antígeno. Incubar la mezcla en baño de agua 48°C - 50°C. Observar a intervalos de 15 minutos y leer el resultado final en 1 h.

BIBLIOGRAFÍA

1. Iván Alberto Méndez, Carlos Andrés Badillo. Caracterización microbiológica de Salmonella en alimentos de venta callejera en un sector universitario de Bogotá, Colombia. Julio a octubre de 2010. Revista de los estudiantes de medicina de la universidad industrial de Santander.

2. GUÍA PARA LA COMERCIALIZACIÓN SEGURA DE ALIMENTOS EN BODEGAS. URL disponible en: [ http://bvs.minsa.gob.pe/local/minsa/1055_DIGESA40.pdf]

3. ICMSF. MICROORGANISMS IN FOODS 5: CHARACTERISTICS OF MICROBIAL PATHOGENS. Volume 5.

4. FDA. U.S Food and drug administration. URL disponible en: [http://www.fda.gov/default.htm]

5. María del Carmen Pascual, Vicente Calderón y Pascual. Microbiología Alimentaria: Metodología analítica para alimentos y bebidas. 2° Edición. Ed. Díaz de Santos. España, 2000.

6. Auxiliares Sanitarios de la Comunidad Autónoma de las Illes Balears. 1° Edición. Ed. MAD. España, 2002.

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9. María Inés Caffer. Manual de Procedimientos. Diagnóstico y Caracterización de Salmonella sp. URL disponible en: [http://fos.panalimentos.org/]

10. Análisis microbiológico de los alimentos. URL disponible en: [http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimentos_Vol_I.pdf]


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