Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Analytická HPLC
Příprava materiálu byla podpo řena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Část 22 – Analytická HPLC
Kvalitativní analýza
Cílem kvalitativní analýzy je identifikovat pík chromatogramu nebo konkrétní složku
v eluentu. Pokud je chemické složení zcela neznámé, můžeme využít při identifikaci některou
ze speciálních analytických technik. Další možností je získání většího množství materiálu
semi-preparativní nebo preparativní HPLC a ten potom analyzovat off-line různými
analytickými metodami.
Jestliže naopak ve vzorku předpokládáme přítomnost několika komponent, můžeme pro
nejjednodušší určení porovnat hodnoty k neznámých píků a referenčních látek, které byly
naměřeny za stejných chromatografických podmínek. Jestliže se shodují retenční časy píků,
mohlo by se jednat o stejné látky. Nicméně měly by být provedeny ještě další experimenty,
aby byla identifikace spolehlivější:
a) Referenční látka je přimíchána do vzorku. Zkoumaný pík by měl být vyšší, bez toho
aniž by byla přítomna raménka nebo se projevilo rozšiřování píku. Kolona s větším
Analytická HPLC
počtem teoretických pater má větší schopnost rozlišit dvě podobné látky se
srovnatelným chromatografickým chováním.
b) Stejný test by měl být proveden i s jinou mobilní a nejlépe i jinou stacionární fází.
Fáze by měly mít diametrálně rozdílné vlastnosti (třeba normální vs reverzní fáze).
Pokud sledovaný pík nejeví ani při jedné analýze známky separace, je velmi
pravděpodobné, že se jedná o identické látky.
Už jsme zmínili, že zkoumaný pík musí být důkladně analyzován, aby mohl být určen
s potřebnou jistotou. K dalšímu zlepšení kvalitativní analýzy můžeme dospět i bez větších
výdajů následujícími postupy:
a) Specifičtější detektor přispívá k identifikaci píku. RI detektor je univerzální a zachytí
všechny složky, ale UV detektor dává odezvu jen pro absorbující látky a fluorescenční
detektor reaguje jen na fluoreskující sloučeniny. Ještě vyšší specificity
(u fluoreskujících látek) může být dosaženo nastavením excitační a emisní vlnové
délky.
b) Změna zaznamenávané vlnové délky UV detektoru musí být doprovázena stejnou
odezvou signálu vzorku i reference. To znamená, že relativní nárůst i pokles by měl
být stejný. Poměr absorbancí při dvou vlnových délkách je specifický pro každou
látku.
c) Poměr signálů UV a za ním zapojeného RI detektoru (nebo jiné dvojice detektorů) je
za daných podmínek pro látku charakteristický.
Průkaznější, nicméně náročnější, jsou speciální metody. Zejména diodové pole a spřažené
techniky s hmotností spektrometrií jsou v kvalitativní analýze využívány.
Vlivem použitého rozpouštědla vzorku mohou vznikat píky související se změnou indexu
lomu eluentu (tzv. refractive index peaks) a nesmí být zaměňovány za píky analytu (obr.
níže). Vždy je lepší vzorek rozpouštět v samotné mobilní fázi, abychom se těmto
neočekávaným píkům vyhnuli. Nicméně pokud není možné vzorek rozpouštět v mobilní fázi,
můžeme provést slepý pokus s čistým solventem.
Porovnání retenčních časů je významně ovlivněno stabilitou průtoku mobilní fáze kolonou a
je tak méně citlivé než metoda nástřiku směsi reference se vzorkem.
Analytická HPLC
Stopová analýza
Jestliže je cílem analýzy kvantitativní nebo kvalitativní analýza látek v nízkých
koncentracích, je nezbytná optimalizace chromatografického systému. Při izokratické eluci
vždy platí, že je koncentrace v maximu píku cmax nižší než koncentrace v nástřiku ci.
kde:
Vi je objem nastříknutého vzorku,
VR je retenční objem, VR = tR F,
a N je počet teoretických pater kolony.
(S gradientovou elucí je cmax vyšší než vychází z výpočtu pomocí tohoto vzorce.)
Příklad
Je nastříknuto 10 µl roztoku s koncentraci zkoumaného analytu 1ppm (10-6 g ml-1). Retenční
objem odpovídajícího píku je 14 ml. K tomuto píku je vyčíslen počet teoretických pater
kolony na 10 000. Jaká je koncentrace v maximu píku (cmax)?
Řešení
Pro stopovou analýzu je nezbytné získat nejvyšší signál, to znamená nejvyšší možnou
koncentraci v maximu píku. Jak toho docílit?
Příklad
Pro separaci z úlohy výše byla použita kolona o délce 15 cm, vnitřním průměru 4,6 mm a
náplní 5 µm. Koncentrace v maximu píku 0,028 ppm poskytla signál 1mV na UV detektoru.
Vypočtěte intenzitu signálu při následujících podmínkách (všechny ostatní parametry
zůstávají nezměněny).
a) délka kolony je 25 cm,
Analytická HPLC
b) vnitřní průměr kolony je 3 mm,
c) náplň kolony tvoří částice o průměru 3,5 µm.
Řešení
a) Jestliže je náplň nové kolony identické kvality, je výška teoretického patra H stejná.
Proto je počet teoretických pater N, stejně tak retenční objem VR, 25 cm dlouhé kolony
1,7 násobně vyšší (25 : 15 = 1,7).
odpovídající signálu 0,8 mV.
b)
odpovídající signálu 2,4 mV.
c) S identickou náplní kolony s částicemi 3,5 µm bude teoretický počet pater 1,4 krát
vyšší (5,0 : 3,5 = 1,4).
odpovídající signálu 1,2 mV.
Je jasné, že nejmenšího ředění a nejvyššího píku je dosaženo, jestliže je použita krátká
a hlavně úzká kolona s největším možným počtem teoretických pater. Separační účinnost
kolony je důsledkem její kvality, použití dobré náplně, ale nikoliv její délky. Delší kolona
dává nižší koncentrace v maximech píků, protože VR stejně jako N jsou úměrné délce kolony
LC, tudíž cmax závisí na . S danou koncentrací vzorku ci je ředění píků menší s větším
objemem nástřiku, vyšším počtem pater a menším retenčním objemem.
Dříve zmíněná rovnice může být napsána i jiným způsobem (protože a
):
Analytická HPLC
kde:
dC je vnitřní průměr kolony,
ε je celková porozita,
k je retenční faktor,
LC je délka kolony,
a H je výška teoretického patra.
Nyní je nejlepší strategie zřejmá:
- Použít kolonu s malým vnitřním průměrem. Dvojnásobné zúžení znamená čtyřnásobné
zvýšení cmax
- Použít krátkou kolonu
- Použít náplň kolony s malou výškou teoretického patra. Toho je dosaženo menšími
částicemi, výborným plněním a stacionární fází s dobrými vlastnostmi přenosu hmoty.
Kolona musí být provozována ve svém van Deemterovském optimu
- Eluovat analyt s malým retenčním faktorem
Ačkoli jsou preferovány krátké kolony, musí být zároveň dostatečně dlouhé k dosažení dělení
směsi. Metoda musí být optimalizována s ohledem na stopové složky.
Z rovnice rovněž vyplývá, že látkové množství vzorku (neboli součin ciVi) by mělo být velké.
Může dokonce docházet i k přetížení kolony majoritní složkou pokud není ovlivněno rozlišení
stopového píku (obr. níže). Nicméně objem nástřiku je na druhou stranu omezen kvůli
rozšiřování píku. Největší objem nástřiku, který způsobí rozšiřování pásů do 9% je dán:
Analytická HPLC
Je možný i alternativní způsob zápisu rovnice (protože retenční čas a rychlost
průtoku ):
Pokud máme k dispozici dostatečné množství vzorku (např. analýzy potravin), je možné
nastříknout Vi max, i když budou dříve eluované píky široké nebo hlavní složka přetíží kolonu
(za předpokladu, že se tím nezmění rozlišení pro stopový analyt).
Tím pádem bude koncentrace v maximu píku definována ze spojených rovnic pro cmax
a Vi max:
Toto je nejpříznivější situace pro izokratickou eluci (a 9% rozšiřování píků) i přes to, že je
čtyřnásobné ředění poměrně velké.
Všimněte si, že za těchto podmínek (dostatečné množství analytu a nástřik Vi max) nemají dříve
zmíněné požadavky, jako jsou dostatečně krátká a úzká kolona, malá výška teoretického patra
a krátký retenční čas, žádný význam. Jestliže Vi max neovlivňuje rozlišení, rovnice cmax =
0,24ci platí i pro široké, dlouhé a špatně naplněné kolony. Nicméně je vždy žádoucí
optimalizovat separační proces, protože tím ušetříme čas a množství potřebného solventu.
Ve stopové analýze musíme rovněž vzít v úvahu některé další skutečnosti:
a) Vyhýbáme se chvostování. Asymetrické píky jsou širší, a tím pádem i nižší než
symetrické píky.
Analytická HPLC
b) Gradientovou elucí jsou píky zužovány, a proto jsou i vyšší. Jestliže není možné
eluovat složku ve stopové koncentraci při nízkém retenčním faktoru, je doporučováno
využít gradientovou eluci. Může být použit skokový gradient, který je při správném
načasování jednoduchým a efektivním řešením.
c) Měli bychom použít detektor s nejnižším možným detekčním limitem. Detektory na
principu měření obecných vlastností, jako index lomu aj., nejsou pro stopové analýzy
vhodné. Používanější jsou detektory fluorescenční, elektrochemické, nebo UV
detektory, se kterými můžeme “maskovat” interferující nečistoty volbou vhodné
vlnové délky. Podobného efektu se dá docílit i pomocí MS detekce sledováním
charakteristického iontu. Zlepšení meze detekce až o několik řádů můžeme dosáhnout
derivatizací analytů. Při stopových analýzách může být občas přesnější kvantifikace
pomocí výšky píku, než integrací jeho plochy.
Ačkoli je pro kvantitativní analýzu nezbytný poměr signálu k šumu alespoň 10, pro
kvalitativní analýzu je postačující poměr lepší než 3.
Při stopové analýze je nejdůležitější správná příprava vzorku (pokud to jde i s
obohacením/zkoncentrováním analytu). Samotná HPLC poskytuje účinné možnosti
zakoncetrování. Pokud má rozpouštědlo malou eluční sílu, je vzorek zachycen a koncentrován
přímo na vstupu do kolony. Jestliže je potom použit eluent s vysokou eluční silou, omezuje se
rozšiřování píků a koncentrace v maximu píků jsou vysoké. Tento postup je nejefektivnější
pokud se dá provozovat při k = 0, tzn. s rozpouštědlem na čele. Tato technika je označováno
jako vytěsňovací chromatografie (displacement chromatography). Například se podařilo 4
000 krát obohatit fenoly ve vodách na stacionární fázi styren-divinylbenzenu. Pro oddělení
hlavního analytu od stopových látek může být využita technika přepínání kolony (column
switching).
Limity stanovitelnosti a detekce budou rozebírány i v jiné části textu.
Kvantitativní analýza
Signál detektoru je v HPLC mnohem více závislý na vlastnostech specifické složky než
v plynové chromatografii. Například absorpce UV je funkcí molárního absorpčního
koeficientu, který se pohybuje pro různé látky od 0 až po 10 000 l mol-1 cm-1. Absorpční
Analytická HPLC
koeficient se rovněž liší pro jednotlivé látky homologických řad. Z tohoto důvodu je nezbytné
vytvořit kalibrační závislost pro každou stanovovanou látku.
Kalibrace může být provedena třemi různými metodami: externím (vnějším) standardem,
interním (vnitřním) standardem a standardním přídavkem (viz obrázek dole). Celý postup je
zde vysvětlen na jednobodové kalibraci, i když je v každém případě lepší provádět kalibraci
alespoň na tři nebo více bodů. V takovém případě potom nejsou výpočty prováděny
jednoduchou trojčlenkou, jak je uváděno níže, ale pomocí regresní analýzy kalibračního
grafu. Kalibrační závislost by měla být lineární a měla by procházet počátkem
souřadnicového systému. Jestliže používáme ke kvantifikaci starší kalibraci, je možné, že se
současné chromatografické podmínky liší od těch minulých, a tím roste systematická chyba
měření. Pro kvantitativní analýzu můžeme využít plochy i výšky píků, v následujícím textu
slovem „signál“ budeme označovat obě možnosti.
Modelovým příkladem bude stanovení glukózy v limonádách. Obsah glukózy předpokládáme
asi kolem 5 g l-1. Tři kalibrační postupy v tomto případě budou následující:
a) Metoda externího standardu. Připravíme roztok standardu o známé koncentraci
6 g l-1 (není důležité, aby byla přesně 6,000 g l-1, ale musí být přesně známa). Plocha
píku tohoto roztoku Sstd byla 5400 a plocha píku neznámého vzorku Svz byla 3600.
Analytická HPLC
Analytická HPLC
b) Metoda interního standardu. Ke vzorku i ke standardu (z odstavce a) přidáme stejné
množství jiné látky, která není přítomna ve vzorku. Například přidáme fruktózu (obsah
v obou roztocích 10 g l-1). Plochy píků pro glukózu jsou stejné, jako v předchozím
případě. Plochy píků fruktózy jsou pro oba roztoky stejné, rovny 6300. Z uvedených
měření je možné vypočítat poměr signálů, který udává i poměr obsahu složek.
c) Metoda standardního přídavku. Do vzorku je přidáno známé množství analytu.
V tomto případě tedy přídavek glukózy 5 g l-1. Plochy píků jsou 3600 pro samotný
vzorek a 8100 pro vzorek s přídavkem.
Metoda externího standardu je nejjednodušší a měla by být použita jen pro jednodušší
analýzy. Nástřik musí být v tomto případě proveden s dobrou reprodukovatelností, proto je
doporučován nástřik vzorku s využitím zcela naplněné smyčky. Při vícebodové kalibraci není
vhodné nastřikovat různé objemy vzorku a referenčních standardů (např. 10, 20, 30, 40
a 50 µl), protože není možné zajistit dostatečnou přesnost a správnost těchto nástřiků. Je
výhodnější připravit množství kalibračních roztoků s různými koncentracemi a nastříknout
pokaždé stejný objem (pomocí zcela naplněné smyčky nebo alespoň stejným postupem,
kterým byl dávkován vzorek).
V případě kalibrace na vnitřní standard odchylky v objemu nástřiku nejsou podstatné. Tato
metoda je preferována, pokud je příprava vzorku složitá. Přídavek standardu probíhá před
samotnou úpravou vzorku. Výběr vhodného vnitřního standardu není jednoduchý. Musí být
dostatečně čistý, s přesně definovaným složením a podobnými vlastnostmi, jaké má analyt
zejména ohledně úpravy vzorku, chromatografické separace a samozřejmě konečné detekce.
Navíc by měl být pík standardu v chromatogramu vmezeřený mezi ostatními píky, ne na
začátku ani na konci záznamu.
Analytická HPLC
Standardní přídavek je elegantní metoda pokud máme k dispozici neomezené množství
vzorku. Umožňuje analýzu kalibrovat za realistických podmínek se všemi intercedenty, tedy
v aktuální matrici. Metody standardního přídavku a vnitřního standardu mohou být navzájem
kombinovány.
Definovat, jak často je třeba provádět kalibraci, je důležitou součástí validace analytických
postupů. Je rovněž nezbytné zvážit možné chyby v kalibračních křivkách. V obrázku níže je
vidět rozdíl mezi konstantní systematickou odchylkou a úměrnou systematickou odchylkou.
V prvním případě kalibrační křivka neprochází počátkem. Odchylka může být pozitivní (jako
v tomto grafu), ale i negativní. Při použití metody standardního přídavku tento typ chyby
nemůžeme určit! K řivka s úměrnou chybou má odlišný sklon, který může být větší nebo
menší. Oba typy odchylek se mohou objevovat současně a mohou být odhaleny určením
výtěžnosti.
Pro nalezení meze stanovitelnosti (LOQ) bylo navrženo mnoho metod. Musí být definována
nejnižší koncentrace analytu, kterou je potřeba stanovit s požadovanou správností a
opakovatelností. Nejpragmatičtějším přístupem je stanovit si horní limit standardní nejistoty
opakovatelnosti a najít jej experimentálně. Mělo by být analyzováno nejméně šest různých
koncentrací v okolí očekávaného LOQ a každá koncentrace stanovena nejméně šestkrát.
Analytická HPLC
Příklad
Bylo analyzováno šest roztoků různých koncentrací s matricí, každý z nich desetkrát.
Požadavek na opakovatelnost je specifikován maximální relativní standardní nejistotou 10%.
Byla zjištěna následující data:
c [ppm] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5 5,38 4,06 5,48 5,52 5,70 6,12 4,30 5,18 5,44 4,17
10 8,09 9,36 11,29 9,92 10,76 10,50 9,35 11,38 10,21 12,78
15 17,05 13,21 18,76 17,45 16,05 14,68 14,19 14,03 17,59 15,82
20 17,86 19,36 20,87 18,97 18,37 19,82 17,90 18,25 23,42 22,79
25 21,59 24,22 20,33 27,41 26,54 25,99 24,63 26,90 23,55 22,76
30 31,03 28,82 32,32 27,84 31,86 31,37 26,96 25,47 30,91 33,09
Jaký je LOQ?
Řešení
c [ppm] Průměr x
[ppm]
Standardní nejistota s(x)
[ppm]
RSD
[%]
5 5,14 0,71 13,8
10 10,4 1,31 12,6
15 15,9 1,82 11,5
20 19,8 2,00 10,1
25 24,4 2,37 9,7
30 30,0 2,54 8,5
Požadovaná odchylka je nalezena při LOQ rovném 20 ppm.
Limit stanovitelnosti záleží na vlastnostech analytu, které zaznamenává detektor a hodnotě k.
Mez detekce (LOD) je rovna 30% LOQ, to znamená, že v úloze by byl LOD = 7 ppm.
Gradiendová eluce může být zdrojem dalších chyb, proto je při kvantitativní analýze
doporučováno pracovat s elucí izokratickou. Mimo to je nezbytné, abychom udrželi průtok
(pro určení ploch píků) nebo složení mobilní fáze (pro určení výšek píků) konstantní (bude
ukázáno později v níže uvedeném obrázku).
Analytická HPLC
Vzorek by měl být rozpuštěn v mobilní fázi, protože pokud se liší rozpouštědlo a mobilní fáze
může být analýza méně přesná; je rovněž možné, že odezva detektoru je silně závislá na
rozpouštědle.
Závěrem je třeba říci, že kvantitativní analýza nesmí být prováděna, pokud je přetížena kolona
a pokud odezva detektoru není v lineární oblasti kalibrační závislosti. Je třeba prověřit tyto
okolnosti pro všechny experimenty. Správnost může být zlepšena termostatováním kolony.
Dále bychom si měli uvědomit, že není možné dělat kvantifikaci asymetrických píků. Ověření
analytických výsledků můžeme provést několika způsoby.
Výtěžnost
Pro zjištění možných chyb výsledků plynoucí z úprav vzorků nebo ze samotné matrice je
nezbytné určit funkci výtěžnosti a hodnotu výtěžnosti.
Postup (výtěžnost přípravy vzorku)
a) Analýzou čistého referenčního materiálu, který nebyl podroben postupu zpracování
vzorku (nebo byl vynechán krok úpravy). Vyčíslíme kalibrační přímku:
Kde:
y = signál
x0 = hmotnost nebo koncentrace referenčního analytu
a0 = úsek na ose y
b0 = směrnice přímky
b) Čistý referenční analyt je zpracován stejným postupem jako vzorek. Řešení plyne
z kalibrační funkce:
Kde xp je hmotnost nebo koncentrace analyzovaného referenčního materiálu po
zpracování.
c) Vypočítané hodnoty xp vyneseme do grafu proti příslušným hodnotám x0 a následně
určíme funkci výtěžnosti:
Analytická HPLC
Kde index „p“ vyjadřuje, že jde o parametr veličiny po zpracování vzorku.
d) Následně vypočítáme hodnotu výtěžnosti (recovery rate):
V ideálním případě by funkce výtěžnosti měla mít lineární průběh s úsekem ap = 0 a směrnicí
bp = 1. Pokud ap ≠ 0 je v postupu konstantní systematická chyba a jestliže je bp ≠ 1 postup
úpravy vzorku obsahuje úměrnou systematickou chybu.
Funkce i hodnota výtěžnosti mohou být určeny pro každý krok postupu úpravy vzorku zvlášť.
To nám dovolí jednoduše nalézt kritické části postupu a zaměřit se na jejich optimalizaci.
Následně můžeme stejnou metodiku použít i pro určení matricových efektů se vzorky
obohacenými přídavkem standardu.
Příklad
Následující plochy píků byly naměřeny pro roztok aflatoxinu bez úprav vzorku.
10 ng 2432
20 ng 4829
30 ng 7231
40 ng 9628
Stejné měření bylo provedeno po extrakci vzorku na pevnou fázi. Získaná data byla
následující:
10 ng 1763
20 ng 4191
30 ng 6617
40 ng 9050
Vypočítejte funkci i hodnotu výtěžnosti. Posuďte funkci výtěžnosti.
Řešení
a) Kalibrační křivka získaná lineární regresí je:
Analytická HPLC
Tato funkce má úsek na ose y (konstantní systematickou chybu). Důvod tkví
pravděpodobně v samotné HPLC separaci a měl by být nalezen a odstraněn později.
b)
Analogicky je x(20)=17,3 ng, x(30)=27,4 ng a x(40)=37,6 ng.
c) Funkce výtěžnosti je nalezena lineární regresí bodů [xp; x0] tedy [7,2; 10], [17,3; 20],
[27,4; 30] a [37,6; 40]:
Směrnice je téměř ideální, je zde pouze 1% úměrná systematická chyba. Na ose y je
patrné konstantní systematické vychýlení. Znamená, že nalezený obsah aflatoxinu
bude nižší o 2,91 ng. Z toho plyne, že extrakce na pevnou fázi musí být zlepšena.
d) Kvůli této chybě je hodnota výtěžnosti závislá na absolutní hmotnosti vzorku:
Analogicky je RR(20)=86,5%; RR(30)=91,3% a RR(40)=93,7%.
Odhad výšky a plochy píku pro kvantitativní analýzu
Pro dobře rozlišené píky jsou plocha i výška úměrné koncentraci analytu. Proto je možné
vybrat pro kvantifikaci libovolný z těchto parametrů. Obecně je integrace píku přesnější, ale
mělo by to být otestováno v rámci validace konkrétní metody. Pro stopovou analýzu je
naopak lepší posuzovat výšky píků, protože při nízkém poměru signál/šum je integrace
obtížná.
Při kvantifikaci píků narážíme na dva hlavní problémy, kterým je třeba věnovat pozornost:
vliv vnějšího parametru na výšku a plochu a chyby pocházející z překryvu píků.
Vliv retence a rychlosti toku na výšku a plochu píku
Vlivy t ěchto parametrů na kvantifikaci ukazuje obrázek níže.
a) Při izokratické separci je výška píku silně ovlivněna retencí (%B solventu). Rychle
eluované píky jsou úzké a vysoké (vysoký %B), ale píky s delší retencí jsou nízké a
Analytická HPLC
široké (nízký %B). Pro kvantifikaci pomocí výšky píku je nutné, aby bylo složení
mobilní fáze stejné při kalibračních měřeních a analýzách (například u namíchaných
eluentů z důvodu vypařování složky s nižším bodem varu během dne). Výška je
minimálně ovlivněna změnami v průtoku a je řízena van Deemterovou rovnicí.
b) Plochy píků, při použití koncentračně citlivých detektorů, jsou silně ovlivněny
změnami průtoku mobilní fáze. Pokud analyt protéká pomalu detekční celou, bude
i jeho pík v chromatogramu široký, ale výška píku je ovlivněna pouze koncentrací
v maximu, proto bude i plocha píku velká. Na druhou stranu pokud analyt protéká
rychle, bude plocha jeho píku malá. Z tohoto důvodu je pro kvantifikaci pomocí
plochy píků nutné použít čerpadla, které poskytují stabilní průtok mobilní fáze,
dokonce, i když se mění odpor. Plocha píku je minimálně ovlivněna %B.
Analytická HPLC
Překrývající se píky
Překryv píků je významným zdrojem chyb při kvantifikaci. Důvod je zcela zřejmý (viz
obrázek níže).
Analytická HPLC
Pokud integrátor rozdělí dva píky vertikální přímkou, jejich části přesahují a stávají se tak
součástí druhého píku. Ani rozdělení podle tečen místo vertikální přímky nevede k přesné
ploše píku (tato metoda je často používaná jako tzv. „rider peaks“).
Obrázek níže ukazuje vliv integrace pro různá rozlišení, asymetrie a pořadí eluce píků. Vlivy
s ohledem na plochy píků mohou být shrnuty v několika bodech:
a) S Gausovskými (symetrickými) píky je velký pík zvětšen a malý je naopak zmenšen
nehledě na pořadí, ve kterém jsou eluovány. Pouze pokud jsou oba píky symetrické
i stejně velké nedopouštíme se rozdělením svislou přímkou žádné chyby.
b) Pokud píky chvostují je plocha prvního z nich znevýhodněna a druhý je naopak
zvětšen nehledě na poměr velikostí signálů.
c) Poměr relativních chyb je nepřímo úměrný k poměru ploch píků. To znamená, že jsou
malé píky ovlivněny více.
Zde je několik rad, jak se vyhnout těmto chybám:
Analytická HPLC
a) Dosáhněte úplného rozlišení píků! Nezbytná hodnota rozlišení závisí na poměru
velikostí píků. Pro píky srovnatelné velikosti postačuje rozlišení R = 1,5, ale není
dostatečné pro rozdělení píků s poměrem velikostí 20:1 a více.
b) Určení výšky píku je v některých případech přesnější než integrace. Kvantifikace
pomocí výšky píků je téměř prosta chyb i v případě chvostování, kdy je malý pík
eluován před větším.
c) Vyhněte se chvostování. Chvostování snižuje rozlišení a má negativní vliv na integraci
malých píků před většími. Chvostování můžeme zabránit snížením mimokolonového
objemu v přístroji, dobrým naplněním kolony, použitím vhodné stacionární a mobilní
fáze, rozpuštěním vzorku ve vhodném rozpouštědle a nepřetěžování kolony.
Analytická HPLC
Chyby p ři integraci
Elektronické integrátory a datové systémy jsou nepostradatelné, ale z jejich používání
vyplývají i chyby, které mohou být přehlédnuty. K seznámení s touto problematikou může
pomoct kniha sepsaná Dysonem1 nebo jiné souhrnné práce. Mohou se objevit různé druhy
chyb, nejzávažnější jsou prezentovány v následujícím obrázku.
1
N. Dyson, Chromatographic Integration Methods, Royal Society of Chemistry, London, 2nd edn, 1998.
Analytická HPLC
Druhy chyb
a) Nedostatek datových bodů. Ke správnému popisu tvaru píku je potřeba zaznamenat
minimálně 10 bodů. Jestliže je sběr datových bodů příliš pomalý, nebude možné
správně určit výšku ani plochu píku. Vyhlazování původních dat pomocí integrátoru
není v tomto případě správné řešení. Rychlost sběru dat se může a někdy i musí měnit
během záznamu chromatogramu.
b) Příliš vysoká časová konstanta. Pomalá elektronika detektoru nebo integrátoru
zkresluje výstupní signál. Platí, že plocha píku je téměř neovlivněna, výška je
Analytická HPLC
zmenšena a chvostování vzroste. Bude zegistrováno snížení rozlišení mezi
sousedícími píky.
c) Vysoko položená prahová hodnota signálu (treshold). Integrátor rozezná pík, pokud je
signál výš než základní linie. Treshold by měl být správně nastaven a musí být nad
hodnotou šumu. V každém případě je plocha i výška píku zmenšena, pokud je treshold
nastaven přliš vysoko.
d) Velký šum. Není možné provádět správnou integraci, pokud je malá hodnota podílu
signál/ šumu. Výsledky budou nahodilé dokonce, i když bude použit datový systém
dovolující definovat základní linii až po dokončení analýzy. Pro dobrou integraci píku
by měl byt podíl signál/šum alespoň 10.
e) Drift základní linie. Integrátor obvykle počítá s přímou základní linií. Jestliže je
skutečná základní linie zakřivená, bude vypočtená plocha menší než skutečná.
f) Neúplné rozlišení. Nákres ukazuje pouze dva nejčastější problémy. Je lepší použít
rozdělení tečnami nebo kolmicí? S výjimkou ideálních případů je důsledkem špatného
rozlišení vždy chyba v integraci. Asymetrie píků je dokonce ještě zásadnější.
V řadě případů nejsou chyby v integraci kompenzovatelné nástřikem standardů a určením
kalibračních faktorů, protože roztoky standardů jsou obvykle méně složité než reálné vzorky.
Detekční vlnová délka
Pokud používáme klasický UV detektor, musíme zvolit určitou vlnovou délku pro záznam
chromatogramu (samozřejmě to není potřeba při využití detektoru s diodovým polem – diode
array detector). Je potřeba zohlednit několik skutečností:
a) UV spektra různých složek vzorku, hlavně vlnové délky jejich absorpčních maxim;
b) molární absorpční koeficienty v maximech a při vlnové délce, která nakonec bude
vybrána k záznamu chromatogramu;
c) retenční faktory různých složek. Při izokratické eluci jsou píky postupně širší, a proto i
nižší;
d) důležitost jednotlivých složek vzorku (v některých případech je třeba kvantifikovat
pouze jedinou složku).
Analytická HPLC
Čím jsou píky nižší, tím více je ovlivňuje šum. Tím je zhoršena přesnost a pravděpodobně i
správnost kvantitativní analýzy. Proto by měly být píky důležitých komponent eluovány co
nejdříve a detekovány ve svých absorpčních maximech. Obecně platí, že při detekci na
kratších vlnových délkách je analýza méně robustní, je větší nebezpečí, že se objeví tzv.
systémové píky. Základní linie je při gradientové separaci náchylnější k driftování.
Je nutné vhodnost zvolené vlnové délky ověřit na daném přístroji a provádět pravidelně testy
aparatury, abychom byli schopni zaručit dlouhodobou správnost. Dokonce i malá odchylka od
správné vlnové délky může znamenat zásadní chybu v analytických výsledcích.
V chromatogramech níže by měla být správná vlnová délka pro stanovení nitropenty
(poslední pík) 214 nm, což je absorpční maximum látky. Pokud je vlnová délka změněna na
216 nm důsledkem chyby v nastavení nebo nezaregistrovanou změnou v optice přístroje,
poklesne plocha píku nitropenty na 85% skutečné hodnoty, zatímco ostatní píky tak podstatně
ovlivněny nejsou.
Derivatizace
Detekce je největší problém spojený s HPLC. Pokud nemůžeme použít citlivý detektor (např.
fluorescenční), je detekční limit mnohem vyšší než v plynové chromotografii s plamenovým
ionizačním detektorem. Derivatizační reakce jsou vhodným nástrojem pro zvýšení detekčního
limitu v kapalinové chromatografii.
Analytická HPLC
Derivatizace je definovaná změna analytu pomocí chemické reakce a může být provedena
před nástřikem (předkolonová derivatizace), nebo mezi kolonou a detektorem (pokolonová
derivatizace).
Předkolonová derivatizace
Výhody
a) Mohou být libovolně zvoleny reakční podmínky
b) Reakce může být pomalá
c) Derivatizace může sloužit i jako čistící a procesní krok
d) Přebytek činidla může být odstraněn
Nevýhody
a) Během delší reakční doby se mohou tvořit vedlejší produkty
b) Reakce by měla být kvantitativní
c) Různé složky vzorku získají derivatizací podobné vlastnosti. To může vést ke snížení
chromatografické selektivity.
Pokolonová derivatizace: reakční detektory
V tomto případě je činidlo přidáno do eluentu proudícího z kolony. Obecně by měl mít roztok
činidla vysokou koncentraci, aby bylo ředění omezeno na minimum. Reakční cela je
vyhřívána, protože reakce většinou probíhají rychleji při vyšší teplotě.
Výhody
a) Reakce nemusí proběhnout kvantitativně
b) Může být zařazen jiný detektor před derivatizací, tzn. kolona → UV detektor →
reakce s fluorescenčním činidlem → fluorescenční detektor
c) Může být použit vysoce specifický detektor (např. imunoassay)
d) Je možné analyzovat látky, které dávají po reakci identické produkty (např.
formaldehyd), protože separace je předřazena detekci
Nevýhody
Analytická HPLC
a) Reakce musí probíhat v použité mobilní fázi, což může být omezující
b) Samo činidlo by nemělo být detekovatelné. Postkolonová derivatizace s cílem zlepšit
UV detekci je prakticky vyloučena, protože všechna používaná činidla silně absorbují
v UV oblasti.
Třemi nejvýznamnějšími typy reakčních detektorů jsou:
a) Otevřené kapiláry. Čím je kapilára užší, tím pozorujeme menší rozšiřování píků;
průměr 0,3 mm je vhodný. Obrovskou výhodou je použití specificky prohnuté
(spletené) kapiláry (knitted tube), aby došlo k dobrému promísení, a tím minimalizaci
rozšiřování píků. Kapiláry jsou vhodné k reakcím, které proběhnou do 1 min (pro
knitted tube až 5 min).
b) Plněné (bed) reaktory. V podstatě se jedná o kolony, které jsou plněny neporézním
materiálem (např. skleněné kuličky). Neporézní náplň je zcela nezbytná, protože
umožňuje vznik různých proudů, a tím mísení. Reaktory jsou vhodné pro derivatizace,
které probíhají mezi 0,5 a 5 minutami. Náplně v kolonách mohou být opatřeny vrstvou
katalyzátoru nebo imobilizovaného enzymu, a tím se aktivně účastnit reakce.
c) Segmentované systémy. Tok kapaliny je segmentován, tzn. rozdělen do menších zón,
mezi kterými jsou bubliny nebo nemísitelná kapalina. Reakce probíhají pomalu (až 30
minut) a segmentací je zabráněno rozšiřování píků. Fáze jsou poté separovány před
detektorem, ale může být využito i elektronické potlačení vzniklého šumu.
Neočekávané píky: “host peaks” a systémové píky
Kdykoli je možné, že se v chromatogramu objeví nečekané pozitivní nebo i negativní píky.
Jestliže se tyto píky nedají reprodukovat, říkáme jim tzv. ghost peaks. Je nezbytné je
eliminovat, i když to může být zdlouhavé a časově náročné. Důvodem pro vznik
neočekávaných píků mohou být nejrůznější příčiny: bubliny v detektoru, nečistoty v mobilní
fázi, rozdělení složek mobilní fáze, vymývání stacionární fáze z kolony (column bleeding),
nedosažení rovnováhy během gradientových elucí, zbytky z předchozích nástřiků a mnoho
dalších.
Přesně reprodukované neočekávané píky jsou tzv. systémové píky. Objevují se v případě, že je
mobilní fáze směsí několika složek a použitý detektor reaguje na složky s různou citlivostí,
například máme-li v mobilní fázi stopové množství aromátů a detekce je prováděna při 254
Analytická HPLC
nm. Při nepřímé detekci musíme s objevením systémových píků počítat vždy, dokonce i když
je přechod od přímé na nepřímou detekci plynulý. K neočekávaným píkům můžeme rovněž
dospět, pokud ke snížení limitu detekce použijeme detekce na nižší vlnové délce než obvykle.
Neidentifikované systémové píky významně ovlivňují kvalitativní a kvantitativní analýzu
(identifikace může být obtížná, protože systémové píky mohou být dokonce neviditelné!).
Mohou způsobit zmenšení píků a zdvojení píků. Plochy individuálních píků závisí na jejich
relativní poloze vzhledem k systémovým píkům! Proto v obr. dole nejsou plochy píků
racemické směsi bupivakainu ekvivalentní.