Arnis Strods

01.11.2013.

Plūsmas citometrija (Flow cytometry)Cytos=šūna; metria=mērījums (no latīņu val.)

Asins šūnas Hromosomas

Aļģes Protozoji

Tehnika mikroskopisku daļiņu saskaitīšanai un analizēšanai, suspendējot tās šķidruma plūsmā un analizējot šādu plūsmu ar dažādiem detektoriem.

Nedaudz vēstures

• 1934 - pirmais mēģinājums šūnu skaitīšanai plūsmā - Andrew Moldavan

• 1963 - pirmais analītiskais instruments

• Komerciāli pieejami plūsmas citometri kopš 1970tajiem gadiem

Mūsdienu plūsmas citometri spēj analizēt vairākus simtus tūkstošušūnu dažu sekunžu laikā

Phywe AG of Gottingen – 1969Pirmais komerciālais plūsmas citometrs, kas uzbūvēts ap Zeiss fluorescento mikroskopu

Priekšrocība salīdzinājumā ar tradicionālajām mikroskopijas

metodēm

Šūnu virsmas raksturošana Šūnu ploīdijas noteikšana Šūnas cikla pētījumi Intracelulārā Ca++ līmeņa noteikšana Membrānas potenciāla mērījumi pH mērījumi Mitohondriju funkcionalitātes novērtēšana u.c.

PlūsmaOptikaElektronika

Sistēmas pamatdaļas:

BD FACSAria II

Nesējšķīduma trauks zem spiediena

filtrs

parauga iešprices kamera

mēģene ar paraugu

Flow Cell

Nesējšķīduma plūsma Parauga plūsma

mijiedarbības punkts

atsevišķi pilieni

atkritumu trauks mēģenes vai plate savākšanai

(Suspensija – monodispersa sistēma)

parauga plūsmaSheath plūsma

lāzeru stari

Sheath plūsmaparauga plūsma

Sheath plūsma

lāzeru stari

Sheath plūsma

zems parauga spiediens augsts parauga spiediens

Hidrodinamiskā fokusēšana – process, kas fokusē parauga plūsmu nesējšķīdumā (sheath)

sheath fluid pievadi

parauga pievads

Violet Laser (405 nm)

Blue Laser (488 nm)

Red Laser (635 nm)

Optical fibers Prisms Focuslenses

Flow Cell

564–606 nm

750–810 nm

> 670 nm

SSC

515–545 nm

1 optical fiberper laser

Eritrocīti

T šūna

Monocīts

Neitrofilaisgranulocīts

Bazofilais granulocīts

Eozinofilais granulocīts

7 – 10 m10 – 15 m

10 – 20 m

Koherents gaismas avots (488 nm)

Izkliede uz priekšuForward scatter (FSC)Šūnu izmērs (488 nm)

Forward scatter (FSC)

mēra pa ienākošās gaismas asi

proporcionāls šūnu izmēram / šūnu virsmai (tikai ideāli apaļām šūnām)

Sānu izkliedeSide scatter

(SSC)Granularitāte (488 nm)

Side scatter (SSC)

mēra 90O leņķī no ienākošās gaismas

proporcionāla šūnu «kompleksumam» (granularitātei)

Fluorescence - process, kurā ķīmisks savienojums emitē gaismu pēc gaismas vai cita elektromagnētiskā starojuma absorbcijas.

= 488 nm

Emitētā fluorescences gaisma

Antiviela

Ierosinošā gaisma

Fluorohroma molekula

520 nmHO

CO2H

O

C

Fluorohroms – absorbē ienākošās gaismas enerģiju.Atbrīvo absorbēto enerģiju:- ar vibrāciju un izkliedē siltumu- emitē fotonu ar lielāku viļņa garumu (mazāku enerģiju)

Ethidium

PE

cis-Parinaric acid

Texas Red

PE-TR Conj.

PI

FITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488 Ierosinošie lāzeri

Fluorohromi, spektri

Zilais (488nm) Sarkanais (633nm) Violetais (408nm)/nearUV (375nm)

Katram fluorohromam raksturīgs konkrēts optimālais ierosināšanās gaismas diapazons.

Svarīgi iepazīties ar pieejamā instrumenta iespējām...

495 nm 520 nm

Stokes Shift is 25 nmFluoresceinmolecule

Flu

ores

cnec

e In

tens

ity

Wavelength

Iespēja paraugā izšķirt specifiskas šūnu populācijas, kas ekspresē interesējošos marķierus

Liu et al., 2005. Mining the complement system for lupus biomarkers. Clinical and Applied Immunology Reviews

FITC

FIT

C

101 104103 102

Relatīvā fluorescences intensitāte

Not

iku

mu

sk

aits

FITC

FITCFIT

C

FITC

FITC

FITCFIT C

FITC

Fluorescences intensitāte ir proporcionāla pie šūnām saistīto antivielu skaitam:

Negatīvā populācija

Pozitīvā populācija

Savāktā fluorescences gaisma

Filtru veidi:

Time ~ 3.2 s

Time ~ 3.2 s Time ~ 3.2 s

V

1

2

3

Pulse

e-

e-

12

3 12

3

Gaismas signāli tiek pārvērsti elektroniskā signālā ar fotodetektoru palīdzību:1)Fotodiode – spēcīgāka signāla uztveršanai (FSC fotodiode)2)Fotopavairotājs (PMT - PhotoMultiplier Tube) – vājāku signālu detekcijai

(SSC un fluorescences signāli)

PMT tuvākā skatā:

Impulsa veidošanās

Galvenie datu attēlošanas veidi:

«Dot plots» Histogramma

FACSAria izmanto FACSDiVa programmatūru un datus var saglabāt FCS 2.0 vai FCS 3.0 failu veidā

• WinMDI, FlowJo, WinList, Weasel• CyFlogic• Infinicyt

• Flowing Software...un arī Excel

Citas brīvpieejas programmas:

FACS – Fluorescence Activated Cell SortingPlūsmas citometrijas viens no variantiem, kad iespējams šūnas ne tikai kvantitatīvi un kvalitatīvi detektēt, bet arī pēc šīm īpašībām fiziski atdalīt vienu no otras.

2. Tiek pielikts spriegums pjezokristālam

3. Atdalās lādēti pilieni

4. Deflekcijas plātnes pievelk vai atgrūž lādētos pilienus

5. Nelādētie pilieni nonāk atkritumos

6. Tiek savākti lādētie pilieni, kas satur interesējošās daļiņas

(Vibrācija ar frekvenci 90000 Hz/s – tik pat daudz pilienu veidojas sekundes laikā!)

Plūsmu iespējams sadalīt 2 vai 4 daļās

1. Paraugs ģenerē gaismas izkliedi un fluorescentos signālus. Tiek pieņemts lēmums, balstoties uz šķirošanas stratēģiju

Un šādi dabā

Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienos reizē

Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienos

uz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu

• Šķiro tikai 1 populāciju uzreiz• Var nodefinēt:

dažādas populācijas bedrītēsprecīzu šūnu skaitu bedrītē

Precizitāte 99%

Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienosuz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu

uz mikroskopa slaidiem

Izkārtojums uz slaida:

Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienosuz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšuuz mikroskopa slaidiem

custom device – nodefinējam savu izkārtojumu uz kaut kā ko var uzlikt uz plašu paliktņa, piemēram,

petri trauks, apakštasīte, utt.utjp.(max – 25 kolonnas, 60 rindas)

???

Arnis Strods a.strods@biomed.lu.lv

Dalāmies!