1

Imunofluorescencija

• 1944. - Robert Coons – protutijela se mogu označiti molekulama koje imaju sposobnost fluorescencije

• fluorokromi - apsorbiraju svjetlost jedna valne duljine (ekscitacija), a emitiraju svjetlost druge valne duljine (emisija)

• fluorescencijski mikroskop – izvor UV svjetla – vizualizacija molekula protutijela obilježenih fluorokromom vezanih za antigene na stanicama ili tkivnim preparatima

2

Imunofluorescencija

Na koje regije protutijela se konjugiraju fluorokromi?

3

Imunofluorescencija

Koje su prednosti indirektnog bojenja staničnih ili tkivnih preparata pomoću

fluorescencijskih protutijela nad direktnim?

4

Detekcija IgM protutijela pomoću anti-IgM protutijela s konjugiranim rodaminom

Detekcija β stanica Langerhansovih otočića gušteraće pomoću protutijela specifičnih za enzim dekarboksilazu

glutaminske kiseline (GAD) konjugirana na zelenu fluorescencijsku boju (npr. fluorescein)

Detekcija α stanica pomoću protutijela specifičnih za hormon glukagon konjugirana na narančastu fluorescencijsku boju

(npr. rodamin)

5

Primjeri upotrebe -za identifikaciju subpopulacija limfocita (CD4+ i CD8+ subpopulacija T limfocita) -za identifikaciju pojedinih vrsta bakterija -za detekciju Ag-Ab kompleksa u autoimunim bolestima -za detekciju komponenti komplementa u tkivima -za lokalizaciju hormona i ostalih staničnih produkata, in situ (lokalizaciji antigena u tkivnim preparatima ili u subcelularnim odjeljcima) -može se koristiti za mapiranje lokacije ciljnih antigena Područje imunohistokemije, te fluorescencijske mikroskopije (izuzetno važne tehnike za istraživanje molekularne arhitektura tkiva ili organa)

Imunofluorescencija

6

Protočni citometar

7

Protočni citometar

Fluorescence activated cell sorter (FACSCalibur, Becton-Dickinson)

8

9

PRIMJENA (u klinici i istraživanju) – određivanje vrste i broja leukocita u uzorku krvi (koliko stanica eksprimira ciljni antigen, distribucija stanica u uzorku, veličina stanica) -analiziranje populacija stanica koje su označene s 2 ili čak 3 različita protutijela (svako označeno različitom fluorescencijskom bojom) (postoje brojne varijacije takvih multikolornih analiza) -protočna citometrija je jedna od ključnih metoda u imunologiji i staničnoj biologiji -tipizacija leukemija protočnim citometrom, odn. imunofenotipizacija -mjerenje subpopulacija T stanica (važan prognostični indikator za AIDS) - itd.....

Protočni citometar

10

PRIMJENA U ISTRAŽIVANJU U PODRUČJU BIOLOGIJE MORA: uzorak fotosintetskog pikoplantona iz mora pokazuje 3 različite populacije

Protočni citometar

11

Alternative reakcijama antigena i protutijela protein A i G

Protein A - Staphylococcus aureus Protein G - Streptococcus

12

Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks

avidin – glikoprotein iz bjelanjka jajeta streptavidin – bakterijski protein (Streptomyces avidinii) biotin – vitamin esencijalan za sintezu masti Ka: oko 1015

13

Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks

14

Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks

15

Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks

16

Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks

17

Imunoelektronska mikroskopija

Površina B-staničnog limfoma: Veće točke – protutijela specifična za MHC klasu II označena česticama zlata veličine 30 nm Manje točke – protutijela specifična za MHC klasu I označena česticama zlata veličine 15 nm

• vizualizacija specifičnih intracelularnih komponenti • oznaka visoke elektronske gustoće

– feritin (globularni protein plazme, veže željezo) – čestice koloidnog zlata

konjugirana na Fc regiju specifičnog protutijela (direktno bojanje) ili na sekundarno protutijelo (indirektno bojanje)