plática métodos rápidos

Mtodos Rpidos para Anlisis Microbiolgico de Alimentos

Q.F.B. Selene M. Garca Garza Biol. Miguel A. Rodrguez Vera

Mtodos Rpidos? para Anlisis Microbiolgico de Alimentos Mtodo Tradicional de Microbiologa - 3 a 4 das (o mas) - Tiempo=$$$Son mtodos (microbiolgicos, bioqumicos, fisiolgicos, inmunolgicos y serolgicos) para el aislamiento ms efectivo, la deteccin, caracterizacin y enumeracin ms rpida de microorganismos y sus productos que los mtodos convencionales en muestras clnicas, ambientales o de alimentos.**Mtodos Rpidos Modernos. Dra. Norma Heredia Rojas. RESPYN/ Revista de Salud Pblica y Nutricin. No. 5 2004

Los mtodos rpidos de acuerdo a lo que se busca*:Sistemas para facilitar la toma de muestras (hisopos, bolsas estriles, etc.) Mtodos para ayudar al procesamiento de las muestras (homogenizadores, etc.) Sistemas de cuantificacin microbiolgica (SimPlate y otros) Mtodos para identificacin y cuantificacin de microorganismos (Microbag, Vitek, etc.) Sistemas de identificacin mediante mtodos moleculares [PCR] (GDS, BAX, etc.) Mtodos inmunolgicos para deteccin y/o cuantificacin de microorganismos (VIP, EIA Assurance, etc.) Otros mtodos miscelneos

*Mtodos Rpidos Modernos. Dra. Norma Heredia Rojas. RESPYN/ Revista de Salud Pblica y Nutricin. No. 5 2004

Actualizado a las 12:51:19 a.m.

Martes, 6 de marzo de 2007

Ms de 50 personas se intoxican con mayonesa en IcaUna de las salsas que acompaa al pollo a la brasa, la mayonesa, fue la causa de la intoxicacin de ms de 50 personas, entre nios, adultos y ancianos, que acudieron la noche del domingo

FDA NewsFOR IMMEDIATE RELEASE P07-41 March 9, 2007

Media Inquiries: Mike Herndon, 301-827-6242 Consumer Inquiries: 888-SAFEFOOD

FDA Update on Peanut Butter RecallAs a follow-up to the recent Salmonella outbreak linked to peanut butter, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) is informing consumers that ConAgra has extended their recall of all Peter Pan peanut butter, and all Great Value peanut butter beginning with product code 2111, including peanut butter toppings,

TECNICAS DE MUESTREO

Para qu muestreamos?


BIOFILM O BIOCAPA


LIMPIEZA: Es el proceso qumico fsico de la eliminacin

de suciedad o de materias orgnicas de las superficies de los equipos.

SANITIZACIN: Resulta de la eliminacin o la matanza de

microorganismos incluyendo bacterias, y promueve la higiene para la prevencin de las enfermedades transmitidas por alimentos.

Dnde muestreamos?

SUPERFICIES EN CONTACTO CON PRODUCTO

Acero Inoxidable, aluminio, cobre, etc. Plstico Madera Tubera Mesas Cadenas

Manos Charolas Etc.

Cmo muestrear?

CON HISOPO ESTERIL

Cmo muestrear?

SUPERFICIE DE 100 cm RAYAR LA SUPERFICIE GIRAR EL HISOPO

Cmo muestrear?

SIEMPRE EN EL MISMO LUGAR INSERTAR DE INMEDIATO EN MVP

Cmo muestrear?

IDENTIFICAR EL HISOPO LLEVAR DE INMEDIATO A LAB.

SI_

NO_

SUPERFICIE DE 100 cm RAYAR LA SUPERFICIE GIRAR EL HISOPO SIEMPRE EN EL MISMO LUGAR INSERTAR DE INMEDIATO EN

NO USAR EL MISMO HISOPO NO UNA SOLA LINEA NO UN LADO DEL HISOPO NO EN DIFERENTE LUGAR NO GUARDAR HISOPO NO REVOLVER HISOPOS LLEVAR DE INMEDIATO A LAB. NO TOCAR HISOPO

MVP

IDENTIFICAR EL HISOPO LLEVAR DE INMEDIATO A LAB.

Avances en el Monitoreo de Calidad e Higiene La herramienta real en HACCP

Que es ATP?

Adenosin Trifosfato Paquete de energa que usan todas las clulas

Animales Vegetales Bacterias, levaduras y Hongos

Reaccin de BioluminiscenciaLuz

LuciferasaLuciferin

QuimiluminiscenciaLuciferinLuciferin

Bioluminiscencia ReducidaLuciferasa

Luz

Luz

Prevencin de Interferencias

Flickinger, Bruce. 1997. Food Quality June/July 1997 "Putting

LIGHTNING Sistema para Monitoreo de Higiene

El sistema Lightning es lder en el monitoreo de higiene desde 1996 Comprado por BioControl en Febrero, 2000. El desarrollo del nuevo luminmetro inici inmediatamente y termin en tiempo record.

Presentando el nuevo LIGHTNING MVP

Un Instrumento Multiples Pruebas Un Reporte

Tecnologia de ultima generacin

Microprocesador de ultima generacin PMT, la parte mas sensible del sistema es totalmente protegido Cmara de lectura con mecanismo exclusivo Teclado totalmente sellado

Teclado sellado

Mecanismo exclusivo de insercin del hisopo.

Camara de lectura con estabilizador optico.

Bateria de Litio

Multiples Pruebas

Higiene de superficies usando el dispositivo de muestreo de ATP Calidad de agua usando el dispositivo de muestreo de liquido Temperatura usando el sensor de temperatura MVP pH usando el electrodo MVP sin vidrio con compensacin de temperatura.

MVP ATP Dispositivo de muestreoPresionar hacia abajo Cmara de mezcla y disolucin

Punta del Hisopo

LIGHTNING MVP Dispositivo de muestreoCmara seca Enzimas Luciferina Luciferasa

Buffer

Punta vortex La solucin Buffer disuelve la enzima y pasa por dentro del tubo del hisopo.

LIGHTNING MVP Dispositivo de MuestreoEl buffer pasa dentro del hisopo y lava la punta del hisopo desde adentro hacia fuera formando una solucin donde se realiza la reaccin, en caso de que la punta del hisopo tenga ATP. La punta del hisopo esta posicionada mas arriba del nivel de lectura. Esto elimina la interferencia de lectura que tienen otros hisopos. No importa en que lado insertas el hisopo la lectura va ser siempre la misma.

Area de lectura de luz.

Dispositivo de muestreo de liquidos

MVP ATP

El dispositivo MVP para ATP en lquidos permite recolectar la muestra sin el uso de pipetas.

Cmara de Lectura con estabilizador de luz.

El equipo MVP puede detectar niveles muy bajos de ATP15x10-12 gramos de ATP (15 picogramos o 0.000,000,000,015 gramos of ATP) El aislador fotomtrico elimina la posibilidad de exponer el PMT a luz externa. Mejor precisin y mejor vida til del PMT.

Como Leer los ResultadosPantalla del Luminmetro Lectura de ATP Punto de Prueba Codigo 01 10

(nombre del punto de prueba) Busqueda < >

Falla Zona 3.5 Alerta Falla 2.5 3.0

Como interpretar los Resultados


Porque el punto Zona 2.5?(Hisopos Activados no abiertos) n = 490, media = 1.8, desv St. = 0.16140 120

80

60

40

20

0

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0

0.005%

99.99%

0.005%


Zona de Precaucin

Nmero de hisopos

100

0.0000000000015g ATP

Sanitizantes vs Dispositivos Muestreo del MVP

La solucin buffer neutraliza los sanitizantes aprobados para el uso en la industria de alimentos. Si el buffer no acta bien, los sanitizantes generan quimioluminiscencia interfirendo en los resultados.

Electrodo MVP Combinado pH/Temp

Sin vidrio, ideal para usar en fbricas de alimentos No se quiebra Sistema de calibracin de 3 buffer

MVP Sensor Temperatura

Sonda en acero inoxidable

-20C to 105 C Calibracin directa

Reporte exclusivo LIGHTNING TRAX

Un Reporte:

Facil para gerenciar e integrar resultados El software LIGHTNING MVP TRAX es fcil de usar para hacer graficas individuales y tambien para combinar multiples parmetros indicadores, pH + Tem + ATP. El programa LIP es un programa gratis de BioControl para usuarios Lightining; permite el usuario comparar sus resultados con resultados de otras fabricas.MVP Results Fresh Cut Packing Conveyer9 80

8

70

pH limit

7

60

6 Temper atur e (F) 50 ATP and pH 5 40 4 30 3 20

temp limit

ATP limit

2

ATP Result 1 10 pH Temp (F) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0

Test Points on Conveyer

TRAX Tendencia en un parametro

Tendencias en multi parmetros14.0 100 90 13.0 12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

TRAX

Zone/pH

70 60 50 40 30 20 10 0 Zone pH Temp

Test Points

Temp

80

FLASH

Analisis de Proteina

Pruebas de Proteina fueron historicamente usadas en el rea clinica y aplicaciones de R&D Las primeras aplicaciones en la industria de alimentos empezaron en los ultimos 5 aos

Principio Deteccin de ProteinaTodas las pruebas de proteina tienen como base estos principios:

Algunos pptidos o aminocidos reaccionan con protenas formando complejos con radicales especificos. Esta reaccin produce un cambio de color Para que la proteina sea detectable, se debe hisopar la superficie. Una solucin de hidratacin (o activacin) es necesaria para catalizar la reaccin entre la protena y los pptidos o aminocidos

Tecnologia Deteccin ProteinaVentajas

Proteina es un buen indicador de eficiencia de limpieza: Gran parte de los alimentos tienen proteina en su composicin Residuo muy dificil de eliminar

No es necesario equipos para hacer la prueba Excelente costo beneficio Puede ser usado por personal no tcnico

Resultos Rapidos Resultados en real time permite acciones immediatas

Tecnologia Deteccin ProteinaRestricciones

No especifica Otras estructuras quimicas pueden generar reacciones cruzadas Proteina debe estar soluble Nivel de sensibilidad de 20-50ug El alimento tiene que tener cantidad suficiente de proteina Resultados no son cantitativos

Como Funciona FLASH

Detected Protein Soluble Protein

Proteina Detectada Proteina Soluble

Proteina No Soluble

Insoluble Protein

FLASH Protein Detection

Como usar FLASH

Activate. Tocar el hisopo en la almohada para activarlo

Swab hisopar 10 cm x 10 cm de No activado rea

Activado

ResultadosLeyendo Resultados: Color verde/azul en el hisopo indica presencia de proteina en la superficie muestreada.

Negativo

Positivo

Positivo

Positivo

SIMPLATE Tecnologa de Sustrato Cromognico aplicado a Anlisis de Alimentos y Monitoreo Ambiental.

Mtodo que permite la Deteccin y Cuantificacin de: 1) Cuenta Total de Bacterias 2) Coliformes Totales y E. coli 3) Hongos y Levaduras 4) Enterobacterias 5) Campylobacter

FUNDAMENTOSimPlate TPC CI y Y&M-CI Tecnologa de Color Indicador

Reduccin Bioqumica: Mtodo basado en reacciones de reduccin. El crecimiento de los microorganismos reduce la Resazurina Azul a Resofurina Rosa y/o Dihidrorresofurina Inocoloro. Pocillos (+) cambian de color Azul a Rosa, Rojo, Naranja, Caf.

FUNDAMENTOSimPlate TPC y Y&M Cuenta Total y Hongos y Levaduras

FUNDAMENTOSimPlate CEc Coliformes Totales

FUNDAMENTOSimPlate CEc E. coli

PROCEDIMIENTOPreparacin de la Muestra

Pesar 10 g medir 10 ml de muestra. Adicionar 90 ml de Diluyente estril (Agua destilada, Buffer de fosfatos, Agua peptonada). Homogenizar.

Procedimiento de la Prueba

Prueba IndividualAgregar 9 ml o 9.9 ml de Diluyente estril al medio SimPlate y mezclar. Transferir 1 ml o 0.1 ml de la muestra homogenizada al medio y Agitar. Vaciar la solucin que contiene la muestra y el medio en el centro de la placa.

Procedimiento de la Prueba

Adicionar 0.1 ml de Suplemento A en la placa, para evitar la formacin de burbujas. Mover la placa en crculos sobre la superficie para distribuir uniformemente en todos los pocillos la mezcla del medio y la muestra. Inclinar ligeramente la placa hacia la cavidad de la esponja para eliminar el exceso de medio.

D) IncubacinSimPlateCuenta Total(TPC-CI y TPC)

Temperatura35 C 2 C

Tiempo24 h 28 h

Coliformes totales y E. coli(CEc-Ci y CEc)

35 C 2 C

24 h 28 h

Hongos y Levaduras(Y&M-CI y Y&M)

22 C 25 C 30 C 2 C

72 h 2 h 48 h

INTERPRETACIN DE RESULTADOS SimPlate Color IndicadorCuenta Total y Hongos y LevadurasDespus de transcurrido el tiempo de Incubacin:

Observar el cambio de color del lquido de los pocillos con respecto al color base (antes de incubar).

Pocillos (+) = Pocillos que hayancambiado de Azul / Morado a Rosa, Rojo, Naranja, Caf, Blanco.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS SimPlate FluorescenteCuenta Total y Hongos y LevadurasDespus de transcurrido el tiempo de Incubacin:

Pocillos (+) = Pocillos que presentan FluorescenciaAzul bajo luz UV (365 nm).

8 Pocillos (+) = 16

INTERPRETACIN DE RESULTADOS SimPlate Color IndicadorColiformes Totales y E. coliDespus de transcurrido el tiempo de Incubacin:

Pocillos (+) para Coliformes Totales =Pocillos que hayan cambiado de Azul / Morado a Rosa, Rojo, Naranja, Caf, Blanco.

Pocillos (+) para E. coli = Pocillos quepresentan Fluorescencia Azul bajo luz UV (365 nm).

INTERPRETACIN DE RESULTADOS SimPlate FluorescenteColiformes Totales y E. coliDespus de transcurrido el tiempo de Incubacin:

Pocillos (+) para Coliformes Totales = Pocillos que hayancambiado de Amarillo/Naranja a Rojo oscuro.

Pocillos (+) para E. coli = Pocillos quepresentan Fluorescencia Azul bajo luz UV (365 nm).

INTERPRETACIN DE RESULTADOS Contar los Pocillos (+) Utilizar la tabla de conversin SimPlate para determinar el Nmero de microorganismos por placa. Si la muestra es 0.1 ml se multiplica el No. de microorganismos por 10. Si se realizan diluciones se multiplica el No. de microorganismos por el factor de dilucin.

No. de Pocillos (+) = UFC NMP por placa

CMO REPORTAR LOS RESULTADOS?Pocillos (+) = 9 Sin Dilucin: 18 UFC o NMP.

9 = 18

TPC-CIDilucin 1:10 : No. de Microorganismos = (Poblacin) x (Factor de dilucin) No. de Microorganismos = (18) x (10) Resultado = 180 UFC o NMP.

CAMBIA A COLOR ROSA COLOR MORADO ORIGINAL

Cuenta Total (TPC)8 Pocillos (+) = 16 UFC

Coliformes Totales (Cec)10 Pocillos (+) = 22 UFC

E. coli (Cec)10 Pocillos (+) = 22 UFC

VIPTecnologa que tiene como base cientfica la tcnica de Flujo Lateral InmunoPrecipitacin Visual para deteccin de patgenos en muestras de alimentos y ambientales.

La prueba VIP tiene reactivos exclusivos que forman un Complejo antgeno-anticuerpocromognico si el microorganismo patgeno esta presente en la muestra, asegurando altos niveles de sensibilidad y especificidad exigidas por AOAC, FDA y USDA. VIP para la deteccin de: Listeria monocytogenes y Listeria sp. (AOAC997.03)

EHEC E. coli O157:H7 (AOAC 996.09) Salmonella (AOAC 999.09)

VIP SalmonellaSensibilidad y EspecificidadEstudio de Aprobacin Oficial AOAC 999.09No. De cepas probadas VIP Salmonella No. De cepas (+) Met. Trad.

Salmonella No Salmonella

307 219

304 (99 %) 7 (96.8 %)

98.2% 96.2%

VIP ListeriaSensibilidad y EspecificidadEstudio de Aprobacin Oficial AOAC 997.03 780 Muestras de 20 tipos diferentes de alimentos fueron analizados utilizando VIP Listeria.VIP ListeriaSensibilidad Especificidad 95.8% 99.95%

Met. Trad.92.7% 97.6%

VIP EHECSensibilidad y EspecificidadEstudio de Aprobacin Oficial AOAC 996.09 1050 Muestras de 19 tipos diferentes de alimentos fueron analizados utilizando VIP EHEC.VIP EHEC Met. Trad.

Sensibilidad

99.94%

98.7%

Especificidad

97.30%

97.6%

FUNDAMENTOAntigeno

M1 EHEC

Latex + Anticuerpos

Resultado Positivo

Control

FUNDAMENTO

VIP Listeria

AOAC 997.03 Procedimiento

1)

2)

3)

4)

VIP Listeria


1)

2)

3)

4)

VIP EHECA. 8 h de EnriquecimientoPreparacin del MedioPrecalentar 225 ml de agua destilada estril a 42C, durante la noche antes del uso. Agregar 7.1 g de medio mEHEC en 225 ml de agua estril precalentada y Disolver.

AOAC 996.09 ProcedimientoPruebaTransferir 0.1 ml del Caldo enriquecido inactivado en el pocillo del Dispositivo VIP EHEC.

Enriquecimient oAgregar 25 g de muestra a 225 ml del medio mEHEC Muestra preparado.

InactivacinMezclar la muestra enriquecida y transferir 4 ml a un tubo de ensayo.

Homogenizar durante 2 min. Incubar a 42C durante 8 h. Incubar a 1525 C durante 1520 min. Inactivar a 100 C

VIP EHEC


B. 18 - 28 h de EnriquecimientoPrueba EnriquecimientoAgregar 25 g de muestra a 225 ml de Caldo Soya Tripticasa modificado con novobiocina Muestra (mTSB+n) y Mezclar. Transferir 0.1 ml de Caldo Soya Tripticasa en el pocillo del Dispositivo VIP EHEC.

Incubar a 1525 C durante 10 min.

VIPINTERPRETACIN DE RESULTADOS

Prueba Positiva (+)* Los Resultados Positivos son presuntivos y deben ser confirmados.

Prueba Negativa (-)

Prueba Invlida

1-2 TESTPrueba rpida cualitativa para la deteccin de Salmonella mvil en alimentos, ingredientes y muestras ambientales.

FUNDAMENTO Esta basado en la inmovilizacin de la Salmonella en un medio mvil por anticuerpos polivalentes H (flagelares). La inmovilizacin de la Salmonella mvil resulta en la formacin de una banda de clulas bien definida (Inmunobanda).

1-2 TEST PROCEDIMIENTOA) Preparacin de la Muestra y Enriquecimiento1) Preparacin de la Muestra y Pre-EnriquecimientoPesar 25 g de muestra. Adicionar 225 ml de Caldo Lactosado estril (medio de Pre-Enriquecimiento). Homogenizar. Incubar a 35 - 37C durante 24 h.

1-2 TEST PROCEDIMIENTOA) Preparacin de la Muestra y Enriquecimiento * Para Carne Cruda y Productos altamente contaminados:Enriquecimiento Selectivo

Transferir 1 ml del Pre-Enriquecimiento a 9 ml Caldo Tetrationato verde brillante activado con Yodo-Yoduro (TBG) y Agitar. Incubar a 42C en bao mara durante 6-8 h.

1-2 TEST PROCEDIMIENTOB) Procedimiento de la Prueba

1) Agregar la solucin Yodo-Yoduro

Colocar el 1-2 Test con la tapa negra hacia arriba y Abrir la tapa. Agregar 1 gota del Reactivo #1 (solucin Yodo-Yoduro) a la cmara de inoculacin (Tapa negra). Tapar y Agitar.

1-2 TEST PROCEDIMIENTOB) Procedimiento de la Prueba2) Quitar el Tapn (pulg) de la Cmara de Inoculacin

Colocar el 1-2 Test con la tapa negra hacia arriba y Abrir la tapa. Quitar el tapn (plug) de la cmara utilizando una pinza estril y desechar.

1-2 TEST PROCEDIMIENTOB) Procedimiento de la Prueba3) Inoculacin* Para productos Procesados

Transferir 0.1 ml de la Muestra Enriquecida a la Cmara de Inoculacin (Tapa Negra).

3) Inoculacin* Para Carne Cruda y Productos altamente Contaminados Transferir 1.5 ml de Caldo Tetrationato a la cmara de Inoculacin (Tapa negra) previamente vaciada.


4) Cortar la Punta de la Tapa BlancaColocar el 1-2 Test con la Tapa Blanca hacia arriba y Quitar la tapa. Cortar la punta de la Tapa Blanca con tijeras estriles y Desecharla.


5) Agregar el AnticuerpoAbrir la Tapa Blanca (Cmara de movilidad). Agregar 1 gota del Reactivo #2 (Anticuerpo) en el pocillo formado en el gel de la cmara de movilidad por la punta de la Tapa.


6) IncubacinColocar los 1-2 Tests inoculados con la Tapa Blanca hacia arriba en la incubadora. Incubar a 3537C durante 1430 h.

1-2 TEST C) INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Colocar el 1-2 Test cerca de una luz de alta intensidad, con la tapa blanca hacia arriba.

Observar el gel en la Cmara de Movilidad por todos los lados girando el 1-2 Test 360 frente a la fuente de luz.

1-2 TEST C) INTERPRETACIN DE RESULTADOSResultados Positivos (+) Indicado por la presencia de una banda blanca (Inmunobanda) en forma de U o de menisco. El resultado positivo indica de forma presuntiva que la muestra contiene Salmonella.

1-2 TEST C) INTERPRETACIN DE RESULTADOSResultados Negativos (-) Si no hay formacin de la banda despus del tiempo de incubacin mnimo de 14 horas, la prueba es negativa. 1-2 Test negativos pueden presentar turbidez uniforme en la cmara de movilidad como resultado del movimiento de otras bacterias en el gel.

1-2 TEST D) CONFIRMACIN Confirmar las muestras presuntivas positivas siguiendo el procedimiento de AOAC Internacionales. Obteniendo a la Salmonella desde al Caldo Tetrationato en la cmara de inoculacin.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS

1-2 Test POSITIVO es indicado por la presencia de la inmunobanda en forma de U.

1-2 Test NEGATIVO es indicado por la ausencia de la inmunobanda.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Inmunbanda en forma de Menisco

Inmunbanda de forma Asimtrica

Inmunobanda asimtrica hacia la derecha.

Inmunbanda asimtrica hacia la izquierda.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

GRACIAS

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