TIPOS DE MÉTODOS RÁPIDOS

MÉTODOS RÁPIDOS

• Os métodos rápidos tomaram impulso na década de 90 com o impacto dos custos crescentes com lead time para a liberação dos produtos para o mercado consumidor.

• Podemos dizer hoje que os métodos rápidos e a automação fazem parte de uma área dinâmica da microbiologia aplicada que tem como áreas principais:

MÉTODOS RÁPIDOS

• O isolamento dos microrganismos.• A detecção precoce.• A identificação dos microrganismos.• A quantificação dos microrganismos.

Métodos rápidosidentificação

MÉTODOS RÁPIDOS

• Métodos rápidos para identificação microbiana• Vitek –depende do crescimento bacteriano,

utilização de carbohidratos e substratos bioquímicos.

• Tempo de incubação 2 a 24 horas • Capacidade de 30 a 60 amostras por dia• Biblioteca > 350 especies bacterianas e

leveduras

Métodos rápidos

• Métodos rápidos para identificação microbiana

• Biolog – depende do crescimento microbiano e baseia-se na utilização de carbohidratos

• Tempo de incubação – 2 a 72 horas• Capacidade de 100 amostras por dia • Biblioteca > 2000 espécies bacterianas e

olores e leveduras

Métodos rápidos

• Métodos rápidos para identificação microbiana• Phoenix – depende do crescimento

microbiano , baseia-se na utilização de substratos bioquímicos e sensibilidade aos antibióticos

• Tempo de incubação - 3 horas• Capacidade de 100 amostras por dia• Biblioteca > 230 espécies bacterianas

Métodos rápidos

• Métodos rápidos para identificação microbiana• MIDI – SHERLOCK MIS - baseia-se na

identificação dos ácidos graxos extraídos de colônias isoladas .

• Tempo de análise de +/- 2 horas • Capacidade de 100 amostras por dia• Biblioteca de >1500 espécies bacterias e fungos

e bolores.

Métodos rápidos

• Dupont Qualicon + Riboprinter – ribotipagem de fragmentos de DNA

• Pathogenetix- marcação fluorescente do DNA• Capacidade de identificar culturas mistas • Bilbioteca extensa > 1000 microrganismos• Outras técnicas –

Espectroscopia Raman• FT-IR

Métodos rápidos

• MALDI-TOF ( MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION – TIME OF FLIGHT)

• Baseia-se na análise e detecção de um grande espectro de proteínas, capaz de discriminar espécies estreitamente relacionadas. A matriz utilizar as proteínas foi mudada para que possibilitasse as proteínas ribossomicas ,

• Neste sistema os microrganismos são colocados em uma placa que contem uma matriz polimérica

Métodos rápidos

• A placa é irradiada com um laser que vaporiza a amostra ionizando as moléculas que são aspiradas e elevadas a um detetor.

• Dependendo da molécula o tempo de chegada será diferente (time of flight), os dados obtidos através destas leituras são comparados a uma base algorítimica que contém uma biblioteca possibilitando a identificação de bactérias, leveduras e fungos.

Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos

• Bioluminescência – técnica baseada no princípio da medição da quantidade de Adenosina trifosfato (ATP).

• E + LH2 +ATP → E-L2-AMP+ PP• E-LH2-AMP + O2 → oxiluciferina + CO2 +AMP

+LUZ• E= Enzima luciferase, lh2 = luciferina , E-LH2-

AMP = COMPLEXO LUCIFERASE-LUCIFERINA -AMP

Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos

• Equipamentos que utilizam a técnica do ATP -CELSIS,HITACHI,LONZA

Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos

• GeneDisc –Pall Corp. –princípio – amostras são filtradas em membrana e lisadas através de reagentes específicos –adiciona-se polimerase e desoxinucleotídeos em uma placa própria que contém os primers e os probes .

• Quando o DNA de interesse é amplificado ,um sinal fluorescente do probe é detectado e medido . O equipamento vem com 6 probes que permite a realização do teste limite USP em até 1 hora.

Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos

• IMPEDÂNCIA-CONDUTÂNCIA – baseia-se na propriedades que os microrganismos têm de alterar a transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura.

• Exemplos Rabit, Malthus ,Bactometer

Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos

• Outras técnicas disponíveis ´- light scattering, PCR.

• Testes de esterilidade – inoculação direta em meio de cultura , medição de CO2

• BACTEC, BACT/ALERT

Métodos rápidos de alta sensibilidade

• Capacidade de detectar 1 célula – bactérias, leveduras, fungos e esporos.

• Carga microbiana de matérias primas , controle em processo, produtos acabados , água e testes de esterilidade.

• Vantagens sobre o teste tradicional 14 dias vs 1 a 3 horas

• Para amostras filtráveis.

Métodos rápidos de alta sensibilidade

• Millipore –Milliflex Rapid e Quantum• Sensibilidade -1UFC após o crescimento• Rapid –ATP• Sensibilidade 1 UFC• Tempo de incubação -24 horas• Carga microbiana, matérias primas , produtos

acabados, água e testes de esterilidade.

Métodos rápidos de alta sensibilidade

• Milliflex Quantum • Sensibilidade 1 UFC• Quantum –coloração vital , amostra é filtrada

e a membrana é inoculada em meio contendo substrato fluorescente , que libera o fluorocromo no citoplasma celular.

• Um leitor permite a quantificação das colonias e mesmo a identificação dos microrganismos.

Métodos rápidos de alta sensibilidadee

• AES Chemunex D-Count e BactiFlow• Sensibilidade 10 a 50 UFC• Carga microbiana de matérias primas, controle

em processo, produtos acabados e água.• Coloração vital e citometria de fluxo

Métodos rápidos de alta sensibilidade

• Citometria de fluxo – o sistema marca o ácido nucléico com um corante fluorescente , sendo que a amostra é lida em um citometro de fluxo .

• Amostra filtrada em um filtro membrana ,sendo que o microrganismo retido no filtro é marcado com um substrato não fluorescente

• O metabolismo microbiano atua enzimaticamente liberando o fluorocromo, possibilitando a detecção pelo laser.

Métodos rápidos de alta sensibilidade

• AES Chemunex –ScanRDI• Sensibilidade 1 UFC• Carga microbiana de matérias primas, controle

em processo, produtos acabados, água e testes de esterilidade.

• Tempo 1,5 horas .• Princípio – coloração vital e citometria de fase

sólida.