Métodos Selectivos y Eficientes para la Purificación de enzimas

Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como catalizadores

Curso Posgrado Ciencias y Tecnologías Químicas

Curso Posgrado 2012 Contenido

- Introducción - Purificación de lipasas por adsorción interfacial - Purificación de enzimas por mecanismos de afinidad

1. Máxima actividad catalítica

Extracto crudo de enzima

Purificación

+

Ej. 100 mg enzima/g soporte

-Empleo a Nivel Industrial

-Ampliación rango sustratos no naturales

Importancia de purificación de enzimas Curso Posgrado 2012

Importancia de purificación de enzimas

2. Eliminación Reacciones indeseables

R CO

NH

R' COO R''

E2

E1

Reacción deseada

Reacción a evitar

Lipasa C. antarctica A

Esterasa enantioselectiva

Curso Posgrado 2012

Tetrahedron:Asymmetry.2002, 13,2653-2659

Purificación de enzimas a escala laboratorio

Adsorción de todas las enzimas (1mg de muestra enzima/ml) Desorción selectiva de nuestra enzima Varios procesos cromatográficos… No importa tiempo ni dinero

Curso Posgrado 2012

Purificación Industrial de enzimas

Métodos sencillos, rápidos y baratos Pocos pasos cromatográficos

Curso Posgrado 2012

Purificación de lipasas por adsorción interfacial

Curso Posgrado 2012

Lipasa en solución acuosa

Conformación cerrada

(forma inactiva)

Conformación abierta

(forma activa)

Lid Sitio activo

Área hidrofílica

Área hidrofóbica

Curso Posgrado 2012

Área hidrofílica

Área hidrofóbica

Conformación abierta

Conformación cerrada

Sitio activo

Gota de grasa

Lid

Activación interfacial de lipasas Curso Posgrado 2012

Superficie Hidrofóbica

Pequeños bolsillo hidrofóbicos… Solo se absorben aFI Adsorción selectiva de lipasas

Aumento de actividad hacia substratos solubles pequeños

BAJA FUERZA IONICA

Purificación por absorción interfacial

+

Curso Posgrado 2012

Método 1: Soportes Hidrofóbicos

Curso Posgrado 2012

Grupos butil, fenil, octil, octadecil…

Baja fuerza iónica

+ 25ºC, pH 7

Microambiente hidrofóbico

CADENAS HIDROFOBICAS SUPERFICIE HIDROFOBICA

Adsorción sobre diferentes soportes hidrofóbicos Curso Posgrado 2012

-Mayor dilución enzima

-Menor fuerza iónica Mayor velocidad de adsorción

Purificación más rápida

Formas Monoméricas

Forma Dimérica

Curso Posgrado 2012

Efecto de la fuerza iónica en la adsorción de lipasa de R. niveus en octil-agarosa

pH 7 and 4°C

Sin sulfato amonico

0.1 M sulfato amónico

1M sulfato amónico

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 Time (min)

Res

idua

l act

ivity

(%)

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 Time (min)

Res

idua

l act

ivity

(%)

Sob

Curso Posgrado 2012

Biotechnol. Bioeng. 1998, 58: 486-493

9466

45

30

20,1

1 2 3 4 5 6 7

Mw (KDa)

9466

45

30

20,1

1 2 3 4 5 6 7

Mw (KDa)

PFL

Purificación sobre octil-ararosa

TAL TLL CAL-B

Curso Posgrado 2012

Lipasa de Candida antarctica B (CAL-B)

Lipasa de Pseudomonas fluorescens (PFL)

Lipasa de Thermomyces lanuginosa (TLL)

Lipasa de Thermus aquaticus (TAL)

J. Mol. Cat B: Enzymatic. 2002,19-20,279-286 Biomacromolecules. 2004, 5,249-254

1 2 3 4 5 6

BTL2

97.0 66.0 45.0

30.0

20.1

14.4

Mw

octil hexyl butil

Adsorción de BTL2 a distintos soportes hidrofóbicos Curso Posgrado 2012

Lipasa de Bacillus thermocatenulatus (BTL2)

Diferente hidrofobicidad

Purificación de 3 lipasas del extracto de A. niger (ANL)

octil octadecil

Purificación de distintas lipasas vía adsorción sobre distintos soportes hidrofobicos

ANL

ANL

Curso Posgrado 2012

Biotechnol Bioeng. 2005,92,773-779

Sobrenadante de octil adsorbido Sobre octadecil

FUERZA DE ADSORCION

OCTIL

0.2% TRITON

0.6% TRITON

Curso Posgrado 2012

Biotechnol Bioeng. 2005,92,773-779

Curso Posgrado 2012 Efecto de la purificación en la selectividad

Biotechnol Bioeng. 2005,92,773-779

Método 2: Proteína Hidrofóbica

Curso Posgrado 2012

Adsorción sobre hidrofobinas inmovilizadas

Monómero Hidrofobina

Distinto tamaño

Distinta composición parte hidrofóbica

Modificación química o genética

Hakanpää et al. Protein Sci. 2006 15: 2129-2140

Anfipática

Área hidrofílica

Área hidrofóbica

Trichoderma reesei HFBII

Parte hidrofílica

Parte hidrofobica

Curso Posgrado 2012

:NH2 :NH2

:NH2

glioxil-agarosa

24 h

NaBH4 30 min

O HO HO H CH

N

CH

NO H

O HCH

N

Zona rica en Lys

25ºC, pH 10.1

CH2

NH

CH2

NH

CH2

NH

CH2

OH

Unión Multi-puntual

Soporte Inerte

Preparación de la Matrix

Dioxano/triton x-100 6:4

Curso Posgrado 2012

Baja fuerza iónica

+

25ºC, pH 7

Curso Posgrado 2012

Biomacromolecules.2003,4,204-210

Efecto de la adsorción sobre hidrofobinas en las propiedades catalíticas de lipasas

soluble 0

10

20 30

40 50

60 70

80 90

100

0 20 40 60 80

Tiempo (horas)

% A

ctiv

idad

resi

dual

Estabilidad. CAL-B, pH 7,50ºC.

Hidrofobina-lipasa

Octil-lipasa

Curso Posgrado 2012

Método 3: Lipasa

Curso Posgrado 2012

Adsorción específica

Lipasa inmovilizada

baja fuerza iónica

Otras proteínas

Esterasa

Ej: 5mM fosfato

detergente Lipasa purificada

Purificación via adsorción lipasa-lipasa: un nuevo concepto Curso Posgrado 2012

Requisitos del método: 1. Una enzima con grupos reactivos en la cara opuesta al lid 2. Un método de inmovilización a través de este área que permita conseguir una superficie inerte

Curso Posgrado 2012

Purificación via adsorción lipasa-lipasa: selección de la enzima

Estructura de la conformación abierta de la lipasa de Pseudomonas fluorescens (PFL)

Lisinas Lid

Zonas Hidrofóbicas

Lys en la cara opuesta al lid Lid y zona hidrofobica amplia

Curso Posgrado 2012

J.Cromatogr.A.2004, 1038, 267-273

:NH2 :NH2

:NH2

glioxil-agarosa

24 h

NaBH4 30 min

O HO HO H CH

N

CH

NO H

O HCH

N

Zona rica en Lys

25ºC, pH 10.1

CH2

NH

CH2

NH

CH2

NH

CH2

OH

Unión Multi-puntual

Soporte Inerte

Purificación via adsorción lipasa-lipasa: selección del soporte Curso Posgrado 2012

Baja fuerza iónica

+

25ºC, pH 7

Otras proteínas

Adsorción Específica

Lip-lip

Curso Posgrado 2012

Purificación de lipasa de Bacillus thermocatenulatus (BTL2)

J.Cromatogr A.2004, 1038, 267-273.

Extracto crudo de BTL2

Mw (kDa)

30

45

66

94

20.1

1 2 3

SDS,100ºC

1. Patrones de peso molecular 2. Extracto crudo de BTL 3. BTL purificada

5 mM Tampón fosfato pH 7

detergente

BTL2 purificada

Curso Posgrado 2012

30

43

66 94

20.1

1 2 3

Adsorción a soporte octil-agarosa a baja fuerza iónica

Mw (kDa)

30

45

66

94

20.1

1 2 3

Mw (kDa)

Adsorción a soporte Lipasa a baja fuerza iónica

Más Específica

Comparación de dos métodos de purificación de BTL

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

Purificación de enzimas por mecanismos de afinidad

Proteína HaloTag

Purificación de proteínas vía inmovilización HaloTag

Proteína de Fusión con HaloTag

Proteasa

Estrategias de purificación de enzimas

Resina HaloLink™

1. Inmovilización Selectiva

Cl

2. Lavado Proteína purificada

M. Urh et al. Cell Notes, 2006,14,15.

Curso Posgrado 2012

-

-

+

Proteínas recombinantes con colas de

poli-His COO

MeHis

HisHis

HisHis

His

COO

Purificación selectiva sobre soportes con quelatos metálicos

imidazol

Estrategias de purificación de enzimas

J. Porath et al. Nature. 1975, 258,598.

His

HisHis

HisHis

His1. Inmovilización

Selectiva 2. Lavado

Proteína purificada

Curso Posgrado 2012

Soporte cromatográfico

Concentración de

quelatos-Zn

% poli-His β-galactosidasa

adsorbida

% enzimas naturales

adsorbidas

* Velocidad de adsorción

Estándar

Alta densidad

30 µEqs/ml

>95%

32%

100

Baja densidad 3 µEqs/ml

>95%

<2%

10

Dextranos alta densidad

30 µEqs/ml

>95%

<2%

80

* 100 referido a la velocidad de inmovilización del soporte activado con 30 µmoles / mL sin recubrir

Curso Posgrado 2012

Adsorción de β-galactosidasa de thermus sp. con colas de polihistidina sobre soportes imac-Zn+2

Adsorción de β-galactosidasa de thermus sp. con colas de polihistidina sobre soportes imac-Zn+2

1- Patrones PM.

2- Extracto crudo.

3- Enzimas adsorbidas a soportes con alta densidad.

4- Enzimas adsorbidas a soportes con baja densidad.

94000

67000

43000

30000

20100

1 2 3 4 5

J. Chromatogr. A. 2001. 915, 97-106

Curso Posgrado 2012

Efecto del metal

Adsorción de glutaril acilasa de E. coli. con colas de polihistidina sobre diferentes soportes

Curso Posgrado 2012

Soporte cromatográfico

EPI-10-IDA

% enzimas naturales adsorbidas

% poli-His Glutaril acilasa

adsorbida

Cu2+

65

100

Zn2+ 5

100

Ni2+ <5

100

Co2+ <5 100

Cu2+

+ 7 mM imidazol <5

100

Biotechnol. Bioeng. 2001, 76, 269-276

Purificacion de enzimas con colas de histidina Curso Posgrado 2012

1- Patrones PM.

2- Extracto crudo.

3- Enzimas adsorbidas a soportes con alta densidad.

3

Biotechnol. Bioeng. 2001, 76, 269-276