“PRODUCCION, PURIFICACION Y CARACTERIZACION

“PRODUCCION, PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE TANASA PRODUCIDA POR Aspergillus niger, EN

FERMENTACION EN MEDIO SOLIDO”

T E S I S

Que para obtener el título de Maestro en Biotecnología

PRESENTA:

M. en C. Elvia Inés García Peña

Asesores: Dr. Ernesto Favela Torres. Dr. Gunasekaran Paramasamy. Dr. Christopher Augur. México D.F. 8 de Noviembre de 1996.

Universidad Autónoma Metropolitana

Unidad Iztapalapa

INDICE 1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3 2.1. Fermentación en medio sólido 3 2.2 Aspergillus niger 8 2.3 Enzimas 11 2.3.1 Tanasa 13 2.3.1.1 Características 13 2.3.1.2 Mecanismos de acción 15

2.3.1.3 Fuentes de obtención 16 2.3.1.4 Producción en fermentación en medio sólido (FMS) 17

2.3.1.5 Producción en fermentación en medio líquido (FML) 18 2.3.1.6 Aplicaciones de la tanasa 19 2.4 Taninos 20 2.4.1 Definición y clasificación 20 2.4.2 Función de los taninos en plantas 22 2.4.3 Propiedades biológicas 23 3. OBJETIVOS 25 3.1 Objetivo general 25 3.2 Objetivos particulares 25 4. MATERIALES Y MÉTODOS 26 4.1. Microorganismos 26 4.2 Conservación de las cepas 27 4.3 Medios de cultivo 27 4.4 Producción 29 4.4.1 Producción del inóculo 29 4.4.2 Fermentación 29 4.4.3 Obtención del extracto 29

4.5 Técnicas analíticas 29 4.5.1 Determinación de la técnica para medir actividad enzimática 29 4.5.2 Determinación de la actividad enzimática asociada al micelio 31 4.5.3 Evaluación de la humedad 32 4.5.4 Determinación de la proteína 32 4.6 Purificación 32 4.6.1 Tratamiento del extracto enzimático crudo 32 4.6.2 Electroenfoque 32 4.6.3 Técnicas cromatográficas 33 4.7 Caracterización 35 4.7.1 Temperatura óptima 35 4.7.2 pH óptimo 35 4.7.3 Electroforesis 35 5. RESULTADOS 37 5.1 Determinación de la técnica de evaluación de la actividad enzimática 37 5.2 Selección de la cepa para la producción del extracto enzimático 40 5.3 Incremento de la actividad enzimática 42 5.4 Evaluación de la actividad enzimática asociada al micelio 46 5.5 Purificación y caracterización 47 5.5.1 Determinación del protocolo de purificación y caracterización 47 a) Prepurificación 47 b) Cromatografía de intercambio aniónico 48 5.5.2 Protocolo de purificación del extracto enzimático 54 a) Electroenfoque 54

b) Segundo electroenfoque 56 c) Cromatografía de intercambio aniónico 57 d) Tamizaje molecular 58

5.6 Caracterización 61 6. CONCLUSIONES GENERALES 67 7. REFERENCIAS 68

Introducción

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1. INTRODUCCION. Los taninos con compuestos fenólicos, presentes en vegetales. No se sabe con

exactitud su función, sin embargo se piensa que tienen que ver con procesos de respiración y mecanismos de defensa de las plantas contra el ataque de insectos y/o rumiantes. De acuerdo a su estructura y reactividad los taninos se dividen en taninos hidrolizables y taninos condensados, los primeros se subdividen en galotaninos y elagitaninos (Haslam, 1961). El ácido tánico es el más común de los taninos y pertenece al grupo de los galotaninos, ya que su estructura consta de una molécula de glucosa unida a nueve moléculas de ácido gálico por medio de enlaces de tipo éster.

Las propiedades biológicas de los taninos son comúnmente el resultado de su

habilidad para formar complejos con las proteínas. La presencia de taninos puede tener efectos negativos principalmente en los tres aspectos siguientes: - Cuando están presentes en forrajes, debido a que por su alta astringencia disminuyen la ingesta voluntaria del alimento animal, así como causan problemas de digestibilidad (Griffiths, 1979) y baja producción de los animales (Kumar y Singh, 1984). - Cuando están presentes en aguas residuales de tenerías o de algunas industrias alimenticias, ya que estas últimas son altamente tóxicas y difíciles de tratar por métodos convencionales (Krisknamoorty, 1972). - Y cuando se encuentran en exceso en ciertos productos como: tés, jugos, cervezas o vinos porque provocan túrbidez, lo cual afecta la calidad final del producto.

Se han propuesto varias vías de remoción de taninos, entre las cuales se cuenta con algunos métodos biológicos o enzimáticos. Los últimos han resultado bastante exitosos, se ha demostrado que algunas especies de microorganismos son capaces de crecer y aprovechar a los taninos como fuente de energía. La tanasa (tannin acyl hydrolase E.C. 3.1.1.20) es una enzima capaz de hidrolizar los enlaces éster del ácido tánico (Yamada et al, 1968). Los extractos con actividad tanasa son usados actualmente en la industria alimenticia para disminuir concentraciones elevadas de taninos responsables de efectos no deseables en el procesamiento de alimentos, tales como, la túrbidez del té instantáneo o de los jugos de frutas. La tanasa varias aplicaciones potenciales entre los cuales tenemos: la industria del vino para mejrar la calidad del mismo, esta enzima también podría usada para disminuir los efectos antinutricionales de los taninos, cuando estos están presentes en algunos forrajes. En la industria farmacéutica es útil para la producción de trimetropin, producto que se obtiene en base a ácido gálico. Actualmente todos los extractos de tanasa se producen con especies fúngicas en fermentación en medio líquido (Okamura y Yuasa, 1986; Okamura et al, 1987). La principal desventaja del sistema de producción, consiste en que la enzima se encuentra fuertemente asociada al micelio del microorganismo, lo cual obliga a desarrollar algunos métodos de aislamiento de elevados costos económicos, esto encarece mucho el proceso de

Introducción

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producción, por lo cual no se han podido explotar comercialmente todos los usos potenciales de la enzima. La fermentación sólida puede ser una alternativa para la producción de esta enzima, ya que se ha demostrado que en este sistema de fermentación la tanasa es completamente extracelular, como muchas otras enzimas producidas en FMS. La tanasa es una enzima inducible (Doi et al, 1973, Beverini y Metche, 1990), cuya producción por especies fúngicas ha sido ampliamente estudiada en medio líquido. Existen solamente dos reportes acerca de la producción de la enzima en FMS (Lenkha y Lonsane, 1994; Chatterjee et al, 1996) donde se corrobora el hecho de que la enzima es completamente extracelular. A lo largo del presente estudio se determinaron algunas condiciones de producción de la tanasa de Aspergillus niger en FMS, así como se obtuvo un protocolo para la purificación de la enzima. La purificación es un primer paso, esencial en el estudio de las propiedades físicas y biológicas de una proteína. Estos estudios permiten un conocimiento más profundo de las características de la enzima y también el desarrollo de nuevas líneas de trabajo a nivel de Biología molecular y producción de la tanasa.

Revisión bibliográfica

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2. REVISION BIBLIOGRAFICA.

2.1. Fermentación en medio sólido. La fermentación sólida puede definirse como aquella en la cual, el crecimiento

microbiano y la formación de productos ocurre en la superficie de sustratos o soportes sólidos. Este tipo de fermentación incluye a numerosos procesos microbianos naturales bien conocidos, por ejemplo, el crecimiento de microorganismos en el suelo, el composteo, la pudrición de la madera, el cultivo de hongos comestibles y la producción artesanal de alimentos orientales (Cannel y Moo-Young, 1980).

La fermentación en medio sólido se distingue de los cultivos sumergidos por el

hecho de que el crecimiento ocurre cerca de superficies de materiales sólidos con bajos contenidos de humedad, entre 30 y 80% (Laukevics et al, 1984). Los sustratos tradicionales, usados para la producción de alimentos fermentados orientales en estado sólido, incluyen una variedad de productos agrícolas, tales como arroz, cebada, trigo, mijo, maíz, etc. También sustratos no tradicionales pueden ser usados para el desarrollo de procesos de interés industrial, por ejemplo, residuos agrícolas, como el bagazo de caña (Carrizales, 1993; Solís-Pereira et al, 1996).

La principal característica de las fermentaciones en medio sólido, es la de ofrecer un

ambiente selectivo a bajas humedades para microorganismos miceliales que producen una gran variedad de enzimas extracelulares, superficialmente unidas o libres y que puedan crecer en altas concentraciones de nutrientes. Estos microorganismos incluyen un gran número de hongos filamentosos y unas cuantas bacterias, tales como Actinomicetos, además de unas cuantas cepas de Bacillus. Las fermentaciones sólidas no han sido tan ampliamente estudiadas como los cultivos sumergidos, a pesar de que en Oriente se usan como procesos tradicionales para producción de alimentos y metabolitos. Algunas de las características de la fermentación en medio sólido se enlistan a continuación: 1. Las fermentaciones sólidas tradicionales se llevan a cabo, por lo general, con mezclas de

flora microbiana nativa. 2. Los sustratos sólidos proveen ambientes selectivos para un gran número de hongos

filamentosos y algunas bacterias. 3. Los sustratos sólidos naturales proveen mezclas de fuentes energéticas y diversas y

complejas fuentes de nutrientes, los cereales usados como sustrato pueden o no ser completos, con respecto a los requerimientos nutricionales del microorganismo.

4. Los sustratos tradicionales contienen pocos compuestos carbonados simples. Sin embargo, la mayor parte del peso seco de dichos sustratos esta compuesto de biopolímeros de alto peso molecular, tales como, almidón, celulosa, hemicelulosa, pectina, proteína y lípidos, los cuales requieren ser hidrolizados enzimáticamente para su asimilación.

5. Las enzimas hidrolíticas que se requieren para la asimilación de sustratos por los microorganismos son, generalmente extracelulares.


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6. Las mezclas de fuentes de carbono de alto y bajo peso molecular, llevan a seguir complejos patrones de inducción, represión e inhibición de la regulación del metabolismo microbiano.

7. La interface gas-líquido provee una zona para el intercambio de oxígeno y bióxido de carbono y para la transferencia de calor. También constituye un área de superficie de transferencia de humedad, lo cual tiene una influencia biológica.

8. Los hongos comúnmente empleados para estas fermentaciones son aerobios obligados y necesitan obtener oxígeno de la fase gaseosa, bajo condiciones relativamente estacionarias para la transferencia de gas.

9. La densidad de biomasa en la fase acuosa puede ser muy alta, conduciendo a demandas extremas de oxígeno y altas tasas de producción de bióxido de carbono, al final de la fermentación. Debido a que los procesos quimioheterotrofos son exotérmicos, las tasas de generación de calor debidas a la formación de la biomasa están también restringidas a condiciones limitantes de transferencia de calor.

Los sustratos sólidos pueden ser vistos como mezclas gas-líquido-sólido, en los que

la fase acuosa esta íntimamente relacionada con las superficies sólidas en varios estados de sorción y en contacto con una fase gaseosa del ambiente externo. Dependiendo del contenido de humedad del soporte, parte del agua está estrechamente enlazada a la superficie sólida y algo de agua se encuentra libre en regiones capilares del soporte (Cannel y Moo-Young, 1980). La interfase gas-líquido provee una zona de intercambio de oxígeno y bióxido de carbono y de transferencia de calor.

De acuerdo a la composición química de sustratos agrícolas, estos pueden

clasificarse en sustratos simples y en sustratos complejos. La fase sólida puede constituir una rica y compleja fuente de nutrientes que puede ser completa o incompleta de acuerdo a los requerimientos nutricionales del microorganismo que vaya a ser cultivado. Aunque los sustratos sólidos generalmente contienen algunos compuestos carbonados, la mayor parte del peso seco esta formado por polímeros complejos que requieren de una hidrólisis enzimática para ser usados como fuente de carbono y energía, a diferencia de los cultivos sumergidos, donde generalmente se usan muy bajas proporciones de fuentes complejas de carbono.

Los procesos de fermentación sólida fueron clasificados por Ralph (1976), de

acuerdo al estado nutricional del sustrato en: soportes ricos en fuentes de nutrientes y soportes nutricionalmente inertes. El primer tipo de procesos permite el uso de medios definidos o complejos en estado natural. Muchos de los procesos en estado sólido pertenecen a esta última categoría y a diferencia de cultivos sumergidos la mayor parte de nutrientes son mezclas de polímeros complejos en ambiente de baja humedad, lo cual favorece la síntesis de enzimas extracelulares asociadas al metabolismo. Los procesos del segundo tipo comienzan a ser más frecuentes; se utilizan en la producción del ácido cítrico. O bien consisten en proceso con soportes inertes impregnados con nutrientes (Aido et al, 1982; Lakshmimayara et al, 1975).


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Las fermentaciones sólidas fueron también, clasificadas por Hesseltine en 1983, de acuerdo al estado físico del sustrato en: sólidos de baja humedad, que son fermentados sin agitación, con agitación ocasional, con agitación continua y sólidos suspendidos, que son fermentados en columnas empacadas a través de las cuales se circula líquido, éstos pueden ser estacionarios o agitados. Algunos ejemplos de estos tipos de fermentación se usan en la producción de: el tempeh, el miso y la salsa de soya, las aflatoxinas y el vino de arroz, respectivamente.

Los efectos fisiológicos de medios acuosos sobre la formación biomasa y productos

en hongos filamentosos ha sido ampliamente estudiada, sin embargo, es poca la información que se tiene a cerca de dichos efectos en fermentación en medio sólido. También existen áreas adicionales de interés fisiológico para organismos miceliales en fermentación en medio sólido, incluyendo fenómenos de transporte de solutos y diferenciación. Tschuya (1983), realizó estudios a cerca de el crecimiento fúngico y la diferenciación celular que ocurre con el tiempo en varios estados morfológicos, para favorecer la producción de metabolitos secundarios específicos en fermentación en medio sólido.

Recientemente se han desarrollado también, estudios sobre la producción de

enzimas pécticas, utilizando fermentación en medio sólido sobre: bagazo de caña de azúcar (Carrizales, 1983; Solís-Pereira et al, 1996) y salvado de trigo (Grilajal et al, 1981; Qadeer et al, 1985; Budiatman y Lonsane, 1987). El estudio de enzimas pécticas en medio sólido con medios sintéticos impregnados sobre soporte inerte, permitió definir el comportamiento de los hongos filamentosos en relación a la composición del medio de cultivo, la influencia de la actividad de agua, la liberación de calor (Oriol, 1987), así como la transferencia de gases. Por otra parte, la recuperación de metabolitos en estas condiciones se realiza por prensado, lo que permite obtener un producto concentrado (Roussos, 1985).

Las cinéticas de crecimiento fúngico en cultivos sumergidos con una sola fuente de

carbono pueden ser lineales o exponenciales dependiendo del estado fisiológico del microorganismo. Sin embargo, el uso de modelos cinéticos para el crecimiento fúngico en medio sólido con sustratos no inertes nutricionalmente no es fácil de obtener, debido a la naturaleza nutricional compleja del sustrato y a la dificultad de estimar tasas de formación de biomasa en presencia del sustrato. También existen algunas dificultades en modelamientos de transferencia de masa y calor, influenciadas por las características ya mencionadas. Las ventajas de la fermentación sólida, citadas por Hesseltine en 1972, incluyen lo siguiente:

1. Los sustratos sólidos solo requieren la adición de agua; pero también otros nutrientes pueden ser añadidos.

2. Se pueden obtener productos muy concentrados, debido a que se usan pequeñas cantidades de agua con sustratos muy concentrados.


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3. La baja humedad reduce problemas de contaminación. 4. Las condiciones para el crecimiento de hongos filamentosos son similares a los

“hábitats” naturales. 5. La aireación se facilita debido a los espacios entre partículas de sustrato. 6. Las tasas de producción pueden ser más altas que las que se obtienen en cultivo

líquido y son muy reproducibles. 7. El producto y los sólidos fermentados pueden ser separados fácilmente, los

productos se extraen mediante la adición directa de solventes o bien por presión. 8. Los productos obtenidos pueden ser directamente incorporados al alimento animal.

Cannel y Moo-Young (1980), agregan como una de las ventajas de la fermentación sólida, el hecho de que al tener volúmenes de agua muy reducidos, el espacio ocupado por el equipo de fermentación es pequeño en relación a las altas tasas de producción y además no se producen grandes volúmenes de agua de desecho.

Las desventajas mencionadas por Hesseltine (1972) en el mismo trabajo, son las siguientes:

1. La fermentación con agitación continua requiere altos gastos energéticos. 2. La adición de agua o nutrientes en etapas iniciales de la fermentación incrementa

el riesgo de contaminación. 3. Los sustratos agrícolas pueden requerir algún tipo de pretratamiento cuando se

busca que sean nutricionalmente asimilables. 4. Un gran número de trabajos deben ser realizados para hacer posible procesos a

gran escala.

Aunstrup (1979, ha citado algunas proteasas, amilasas, pectinasas, lactasa, amiloglucosidasas y renina como ejemplos de proteínas que pueden ser producidas por ésta técnica.

Tabla 1. Enzimas de interés industrial producidas en fermentación en medio sólido.

Enzima

Organismo Referencia

Celulasa Trichoderma viride Toyama, 1976 Trichoderma viride Chanhal, 1985 Trichoderma harzianum Deschamps et al, 1985 Amiloglucosidasa Aspergillus niger Alazard y Raimbault, 1981 β- glucosidasa Aspergillus phoenicus Deschamps y Huet, 1984 a,b α- galactosidasa Aspergillus awamori Selman, 1980 Invertasa Aspergillus awamori Selman, 1980 Lactasa Scopulariopsis pp Pastore y Park, 1980 Aspergillus niger Cayle, 1973 Fusarium moniliforme Macris, 1981


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La principal característica de este tipo de fermentación, es el crecimiento de microorganismos en sustratos predominantemente sólidos. El nivel de humedad en este tipo de fermentaciones está entre 30-80% y para la producción de enzimas se encuentra en la región de 60% (Laukevics et al, 1984). Los hongos son los microorganismos que se adaptan mejor y por tal razón la mayoría de preparaciones enzimáticas obtenidas por este método son de origen fúngico (Tabla 1).

La fermentación sólida ha sido usada hace varios siglos, en dos áreas: la preparación

de alimentos orientales fermentados y en la elaboración de quesos. Sin embargo, durante mucho tiempo no hubo un entendimiento apropiado de los principios bioquímicos y microbiológicos de estos procesos.

El proceso tradicional japonés “koji”, involucra el crecimiento de hongos

filamentosos, tales como A. orizae en una mezcla de sustratos tales como arroz, trigo o soya para producir una mezcla de enzimas amilolíticas y proteóliticas extracelulares, las cuales serán posteriormente usadas para hidrolizar otros sustratos y provocar cambios de sabor (Hesseltine y Wang, 1967; Yamada, 1979; Stienkraus, 1983).

Lonsane et al (1985) y Moo-Young (1980), describieron el diseño de diferentes

tipos de fermentadores usados para la fermentación en medio sólido. El tipo de tambor rotatorio consiste en un dispositivo cilíndrico horizontal, usualmente montado sobre rodamientos que proveen al mismo tiempo soporte y actúan como dispositivo rotatorio. Bafles internos ayudan al mezclado en este tipo de reactor. Un ejemplo de su uso de éste fermentador, fue reportado por Toyama (1976), para la producción de celulasa con Trichoderma viride y un laboratorio a pequeña escala fue desarrollado por Silman (1980) y Nishio et al (1979). Alternativamente, los recipientes cilíndricos horizontales pueden ser suplidos por canales cilíndricos montados en ejes agitadores, para obtener una mezcla más efectiva del sustrato (Pamment et al, 1978, Laukevics et al, 1984). Sistemas de bandejas y lechos, también han sido utilizados. En algunos casos bandejas de unos pocos centímetros de profundidad han sido montadas en rejillas y aire es pasado sobre la superficie de éstas (Lankevics et al, 1984). Otro tipo de reactor (Toyama, 1976) usa un sistema de dos bandejas rotatorias, en las cuales salvado parcialmente fermentado pasa de la primer bandeja rotatoria a la otra donde se finaliza la fermentación. Grandes lechos de sustrato pueden también ser usadas (Terui et al, 1958, 1959). Estos pueden ser lechos en los cuales se acondiciona un dispositivo de agitación mecánica (Toyama, 1976). El uso de sistemas de “lechos” fluidizados para la fermentación sólida de A. sojae en salvado de trigo, también ha sido reportado (Akao y Okamoto, 1984). La producción de proteasa alcalina, α amilasa y pectinasa fue reportada en éste último sistema. El medio usado frecuentemente fue salvado de trigo húmedo o una mezcla de salvado de trigo y algunas sales.

Para la fermentación en medio sólido, se adicionan básicamente medios simples,

contando con que la mayor parte de los requerimientos nutricionales del microorganismo sean cubiertos con el cereal. El pretratar el sustrato puede ser una ventaja, ya que esto puede incrementar su susceptibilidad al ataque microbiano y/o a minimizar su tendencia a


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formar partículas de aglomerados. Los pretratamientos incluyen procedimientos de aplastamiento, ruptura y pulverización (Hesseltine, 1972; Lonsane et al, 1985).

La esterilización del medio de fermentación se puede realizar mediante vapor, se

debe tener en cuenta que nunca se alcanzan niveles tan altos de esterilidad como los usados para el cultivo líquido. Sin embargo, debido a las condiciones del cultivo sólido se inhibe el crecimiento de bacterias potencialmente contaminantes. Después de la esterilización y subsecuente enfriamiento, el material es inoculado con una suspensión de esporas de la cepa fúngica elegida o con un inóculo vegetativo. El crecimiento del micelio, dependiendo del microorganismo, puede tomar de 1 a 10 días a temperatura controlada en un rango entre 25-40ºC. El control de la humedad y la temperatura del material fermentado puede ser un problema debido a la producción de calor metabólico y a que las pérdidas de agua del cultivo pueden ser altas. Narahara et al (1984), demostraron que la producción de proteasa en un cultivo de arroz (koji) con A. orizae decreció cuando la humedad fue menor a 40%, mientras que la producción de α amilasa no se vio fuertemente afectada por el contenido de humedad.

Generalmente un riguroso control del pH no es posible, pero se puede regular

mediante el uso de medios con ciertas fuentes de nitrógeno y sales (Raimbaut y Alazard, 1980). El monitoreo del progreso de la fermentación es generalmente más complicado que en sistemas de fermentación líquida. La medida directa de la biomasa fúngica no es posible pero se usan métodos indirectos. Algunos involucran la determinación de la glucoasamina (Smith, 1980) y el nivel de ergosterol fue también recomendado como posible medida del crecimiento fúngico (Matchan et al, 1985). También la tasa de consumo de O2, fue también usada para estimar la biomasa (Kun et al, 1985). En otro estudio el crecimiento del micelio de A. orizae cultivado en arroz fue estimado a partir de la evolución del CO2 (Sagama y Okajaki, 1979). Saucedo-Castañeda et al en 1992, reportaron la utilización de cromatografía de gases en fermentación en medio sólido para estimar el crecimiento de Schwanomyces castelli, levadura usada como organismo modelo. Córdova en 1992, describe un método de estimación de la biomasa determinando la proteína del micelio y las esporas del microorganismo.

2.2. Aspergillus niger.

Los hongos representan una diversa variedad de microorganismos. Muchas especies

fúngicas juegan roles importantes y benéficos, debido a que son fuente de productos farmacéuticos como antibióticos, mientras otros son usados comúnmente en la manufactura de productos alimenticios y aditivos. Sin embargo, también existen especies que ocasionan daños y se consideran microorganismos patógenos de plantas y animales o son agentes de infestación postcosecha. La habilidad para controlar las actividades de estos microorganismos requiere un entendimiento de los mecanismos de su reproducción y crecimiento. Son microorganismos no fotosintéticos, son organotróficos, tienen requerimientos nutricionales simples y sus procesos metabólicos y biosintéticos son muy variados. Los hábitats de los hongos son muy diversos, algunos son acuáticos y viven principalmente en el agua dulce, pero también se conocen algunos hongos marinos. Sin embargo, la mayor parte de hongos tienen hábitats terrestres, sea en la tierra o en la materia


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vegetal muerta y estos dos tipos desempeñan una función crucial en la mineralización del carbono orgánico en la naturaleza.

Los hongos se pueden diferenciar de las bacterias porque las células fúngicas son

mucho mayores y contienen núcleo, vacuolas y mitocondrias típicas de las células eucarióticas. Poseen una estructura vegetativa, micelio. A partir del micelio fúngico y partículas citoplasmáticas brotan ramas hifales que pueden llegar al aire, sobre la superficie y de estas ramas aéreas se forman esporas, llamadas conidias. Los conidias son esporas asexuadas, muy pigmentadas y resistentes a la desecación, calentamiento, congelación y algunos agentes químicos, que ayudan a la dispersión del hongo hacia nuevos habitats. Cuando se forman los conidios, cambia el color blanco del micelio, tomando el color de los conidios, los cuales pueden ser negros, azul-verdes, rojos o cafés. La existencia de estas esporas da a la capa micelial una apariencia mas bien pulverulenta. Los conidios se consideran esporas asexuadas porque en su formación no participa ningún evento de reproducción sexual.

Algunos mohos producen también esporas sexuales, formadas como resultado de

una reproducción sexual. Esto ocurre tanto por la fusión de gametos unicelulares o de hifas especializadas que reciben el nombre de gametangios. Por otra parte, se pueden formar esporas sexuales por la fusión de dos células haploides para producir una célula diploide, la cual sufre entonces meiosis y una mitosis para originar esporas individuales

El micelio consta de una masa de citoplasma multinucleado encerrada dentro de un

sistema de tubos rígidos y ramificados que son bastante uniformes en cuanto a su diámetro. Los tubos que encierran al protoplasma representan una estructura protectora homóloga a la pared celular de un organismo unicelular. Normalmente un micelio surge de la germinación y posterior crecimiento de una sola célula reproductora, o espora. Después de la germinación, la espora emite un largo filamento o hifa que se ramifica repetidamente a medida que se va alargando para formar un sistema ramificado de hifas que constituye el micelio. Así, una hifa común es un tubo nucleado que contiene citoplasma, se le denomina cenocítico. El crecimiento fúngico esta característicamente confinado a los ápices de las hifas; a medida que el micelio se extiende, el contenido citoplasmático puede desaparecer de las regiones centrales más viejas. El tamaño del micelio no es fijo; en tanto que haya nutrientes disponibles, el crecimiento por extensión de hifas puede continuar. Ni las esporas, ni el micelio de los hongos superiores son capaces de realizar movimientos. En la Tabla 2, se menciona la clasificación y características principales de los hongos.

Aunque los hongos son un grupo grande y muy variado, tres grupos de hongos

tienen una gran importancia práctica: las levaduras, las setas y los mohos. Las levaduras son hongos unicelulares y la mayor parte de ellas están clasificadas con los Ascomicetos. Las setas son hongos filamentosos que forman estructuras grandes llamadas cuerpos fructificantes, que es la parte comestible de la seta. Muchas setas viven como micorrizas, en tanto que otros viven sobre materia orgánica muerta en la tierra o en los troncos de los árboles.


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Tabla 2. Clasificación y características más sobresalientes de los hongos. Grupo

Nombre común

Hifas Representante típico

Tipo de espora sexual

Hábitats

Ascomicetos Hongo de saco

Septadas Nuerospora Sacharomyces Morchella

Ascospora Suelo, materia vegetal en descomposición

Basidiomicetos Hongo de clava

Septadas Amanita (seta venenosa), Agaricus (seta comestible)

Basidiospora Suelo, materia vegetal en descomposición

Cigomicetos Mohos del pan

Cenocíticos Mucor, Rhizopus

Cigospora Suelo, materia vegetal en descomposición

Oomicetos Mohos de agua

Cenocíticos Allomyces Oospora Acuáticos

Deuteromicetos Hongos imper-fectos

Septadas Penicillium Aspergillus

Ninguna Suelo, materia vegetal en descomposición

Los mohos son hongos filamentosos están ampliamente esparcidos en la naturaleza

y se les ve comúnmente crecer sobre diversos tipos de sustratos. Pertenecen al grupo de Deuteromicetos y también son denominados hongos imperfectos, debido a que en algunos de ellos no se ha podido determinar ciclo sexual. Dentro de este grupo se encuentran las especies de Aspergillus y Penicillium.

Los hongos filamentosos, han evolucionado con una gran diversidad bioquímica y

un sistema enzimático que los hace capaces de sobrevivir en hábitats excepcionalmente variados. Debido a su enorme versatilidad metabólica y a la facilidad para cultivarlos son ampliamente usados para la producción de sustancias de interés comercial con gran variedad de aplicaciones industriales, tales como, productos alimenticios, enzimas (amilasa, glucosa oxidasa, glucoamilasa, celulasa, hemicelulasa, pectinasa, proteinasa, catalasa y poligalacturonasa), metabolitos primarios y secundarios, tales como ácido orgánicos (ácido cítrico, ácido gálico y ácido glucónico) y también antibióticos. Además de su importancia económica, los hongos filamentosos tienen propiedades biológicas interesantes, tales como, su complejo ciclo de vida, su diferenciación celular, sus rutas metabólicas altamente reguladas y su eficiencia en secreción de proteínas, las cuales los hacen atractivos como modelos para la investigación biológica básica de organismos eucarióticos (Van den Hondel y Punt, 1990).

Un hongo filamentos muy conocido es Aspergillus niger, el cual pertenece al grupo

de Aspergillus “negros”. Este grupo de hongos poseen la característica de pigmentación negra en las cabezas conidiales y es probablemente el más común en el género de Aspergillus. Una representación esquemática de su ciclo de vida se presenta en la Figura 1.


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Figura 1. Ciclo de vida de Aspergillus niger.

A. niger esta presente en todas partes del mundo y se encuentra en casi todo tipo de

sustratos (alimentos, textiles, pieles, plantas, etc.). También puede crecer en 20% de ácido tánico (Rippel, 1939), un sustrato en el que muchos microorganismos no son capaces de crecer. Tal particularidad hace de A. niger un microorganismo fácil de aislar entre otros microorganismos sean bacterias, hongos o levaduras (Van den Berg, 1992).

Recientemente, se han publicado varias revisiones sobre la transformación e

ingeniería genética de hongos filamentosos (Fincham, 1989; Timberlake y Marshall, 1989; Goosen et al, 1992). Algunas cepas de A. niger, han sido estudiadas a nivel molecular para mejorar su característica de usar ácido pánico como sustrato. Bot et al (1988), obtienen las cepas N888, N920 y T2A de A. niger, a partir de la cepa N402, una mutante con conidiosporas cortas.

Existen también un gran número de publicaciones acerca de la utilización de varias

cepas de Aspergillus para la producción de diversas enzimas (Candle, 1973; ALAZARD Y Raimbault, 1981; Deschamps y Huet 1984, a, b; Silman, 1980; Solís-Pereira, 1993; Solís-Pereira, 1996). En el último siglo, las enzimas microbianas han sido ampliamente usadas en la manufactura de alimentos y bebidas. Sin embargo, las actuales aplicaciones para el uso de enzimas incluyen áreas tales como la conversión de biomas, el tratamiento de desechos y la manufactura de productos químicos. Se estima que el mercado para las enzimas industriales asciende a 650 millones de dólares (Berkha et al, 1992).

2.3. ENZIMAS.

Una enzima es un catalizador biológico que lleva a cabo reacciones bioquímicas a

muy altas velocidades y con un elevado grado de especificidad. En su ausencia la mayoría


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de las transformaciones químicas requeridas para mantener activas las células tardarían mucho tiempo en efectuarse o simplemente no procederían. Su nombre proviene del griego y significa “en la levadura”, ya que a finales del siglo pasado, cuando se creó el término, se pensaba que estos compuestos sólo actuaban en el interior de las células.

Las enzimas se subdividen en seis clases: 1. oxidoreductasas, 2. transferasas, 3.

hidrolasas, 4. liasas, 5. isomerasas y 6. ligasas. Las enzimas de las tres primeras clases catalizan reacciones de transferencia con estequiometria: A + B → P + Q, pero cada clase tiene características diferentes. Las oxidoreductasas catalizan reacciones en las cuales 1 o más electrones (usualmente 2) son transferidos de un donador (agente reducido) a un aceptor (agente oxidado). En muchas oxidoreductasas el sustrato oxidado puede permanecer como un donador de iones hidrógeno y por eso estas enzimas también reciben el nombre de deshidrogenasas. Las hidrolasas catalizan reacciones hidrolíticas, es decir, reacciones en las que el H2O es el aceptor de grupos transferidos. Muchas de las enzimas de importancia económica son hidrolasas y son por lo general de origen microbiano, la mayoría de ellas son extracelulares, aunque también existen algunas intracelulares. Las transferasas son todas aquellas enzimas que catalizan reacciones de transferencia, que no son oxidoreductasas o hidrolasas. Las liasas catalizan reacciones de eliminación, donde una unión es rota sin oxidoreducción o hidrólisis, y en muchos casos presentan la siguiente estequiometria A→P+Q. Las isomerasas catalizan reacciones con estequiometria A→P, es decir, reacciones con una sola molécula. Las ligasas son responsables de la asociación de dos moléculas con la hidrólisis simultánea de ATP o una molécula similar, comúnmente con estequiometria A+B+C→P+Q+R. En todos los casos la estequiometria puede ser leída en ambas direcciones. Las seis clases se subdividen en subclases, para explicar el tipo de reacción más específicamente. La producción de enzimas ocurre en todas las células vivas, donde éstas catalizan y regulan reacciones de rutas bioquímicas esenciales para la existencia del sistema vivo. Los programas genéticos para la síntesis de este tipo de biomoléculas están almacenados en las moléculas de ADN (Cornish-Bowden y Cárdenas, 1987).

Las enzimas extracelulares son originalmente definidas como enzimas externas a la

pared celular y pueden estar en el medio circundante. En general, los sustratos para este tipo de enzimas son moléculas de pequeño peso molecular, es decir, azucares, amino ácidos, ácidos carboxílicos, los cuales son capaces de atravesar la membrana. La síntesis de enzimas extracelulares es generalmente regulada por una complicada red de relaciones metabólicas y la actividad enzimática puede ser influenciada por algunos compuestos que la inhiben o la inducen para asegurar la coordinación óptima del metabolismo celular. Algunas de ellas son llamadas enzimas “claves metabólicas”, son enzimas alostéricas. Sus propiedades catalíticas son reguladas mediante cambios conformacionales en su estructura tridimensional.

El transporte a través de la membrana es el primer evento de secreción, por tanto, el

término secreción se puede usar para hacer referencia al paso transmembrana de la proteína y el término extracelular para las proteínas que siguen ese proceso (Borris, 1987). Por tanto, es interesante describir el proceso de la secreción durante la biosíntesis de éstas proteínas. La exportación del polipéptido naciente a través del citoplasma de la membrana


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se lleva a cabo desde que la síntesis de la cadena del polipéptido ocurre en la región membranal polisomal. En células eucarioticas, el organelo que transporta proteínas a través de la membrana es el retículo endoplasmático (RE). Existe evidencia de que el segmento peptídico localizado en el extremo terminal del polipéptido llamado “peptido de señal”, es responsable de dirigir a la proteína a través del RE en eucariotes.

La hipótesis del “peptido señal” fue formulada para explicar la observación de que

las proteínas eucarioticas son sintetizadas en poliribosomas unidos a la membrana del RE y son transportadas a través de la multicapa de fosfolípidos de manera transnacional (Cornish-Bowden y Cárdenas, 1987).

2.3.1. Tanasa (Tannin acyl hydrolase EC 3.1.1.20).

La tanasa (Tannin acyl hydrolase EC 3.1.1.20), es una enzima que hidroliza los

enlaces éster del ácido tánico metilado, así como también, la ruptura en los enlaces éster inter-cadena del mismo ácido, produciendo ácido gálico y glucosa. (Yamada et al, 1968). Adachi et al (1968), demostraron que la tanasa producida por A. flavus en medio líquido, es una glicoproteína que contiene el 25.4% de hexosa. El contenido de hexosa como constituyente molecular la modifica confiriéndole propiedades inusuales, tales como su alta solubilidad en agua y el que no precipite en soluciones saturadas con sulfato de amonio. Su pI se encuentra alrededor de pH 4 (Adachi et al, 1968).

2.3.1.1. Características. Se han realizado numerosos trabajos acerca de la producción, aislamiento,

purificación y características de la tanasa producida por especies de Aspergillus en fermentación en medio líquido (FML). La mayoría de los autores coinciden en que bajo las condiciones de la FML, la principal característica de la tanasa es que se encuentra asociada al micelio del microorganismo.

Barhomeuf et al, 1994 b, purificaron tanasa de A. niger, producida en fermentación

en medio líquido. Estos estudios permitieron la obtención de las propiedades de la tanasa producida por A. niger que se resumen a continuación en la Tabla 3. Todas las características enlistadas en la Tabla son aplicables tanto a la tanasa de A. niger como de A. flavus., excepto la temperatura optima de la enzima que para A. flavus es de 70ºC (Adachi et al, 1968). El proceso de aislamiento y purificación, usado por esos autores (Barhomeuf et al, 1994), consistió en cuatro etapas. La enzima cruda se obtuvo por disrupción física del micelio por congelación-descongelación y la adición de Concavalin A, los materiales insolubles fueron separados por centrifugación y el sobrenadante fue filtrado a través de una membrana de nylon. El filtrado fue sometido a ultrafiltración tangencial. La enzima pura fue obtenida por cromatografía de alta presión con un material denominado Protein-pak SW 300 seguida por ultrafiltración en Centricon 100 kDa.


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Tabla 3. Propiedades de la tanasa producida por A. niger en fermentación en medio líquido. Característica.

Valor

Punto isoeléctrico 4.3 Peso molecular 186,000 Azucares 43% pH óptimo actividad tanasa 6.0 actividad esterasa 5.0 pH de estabilidad 3.5-8.0 Temperatura óptima 35 ºC Temperatura de estabilidad 4-45 ºC Inhibidores (% de inhibición) DPF, ZnCl2, FeCl3, CuSO4 Inactivadores o-fenantrolina, P.M.S.F, EDTA-2-

mercaptoetanol-tioglicolato de sodio-MgSO4, CaCl2, MnCl, CoCl2

La enzima hidroliza compuestos éster de ácido gálico, excepto el 3,4dihidroxi

metilbenzoato, pero no hidroliza otros sustratos análogos tales como el estearil, lauril y acetil galato (Iibuchi et al, 1972).

Tabla 4. Ácido gálico y análogos como inhibidores de la tanasa. Inhibidores Tipo de inhibición

Ácido benzoico no inhibe 3-metil ácido benzoico no inhibe

2,6 di-hidroxi ácido benzoico inhibición no competitiva orto-hidroxi ácido benzoico inhibición competitiva meta-hidroxi ácido benzoico inhibición competitiva Para-hidroxi ácido benzoico inhibición competitiva 2,3 dihidroxi ácido benzoico inhibición competitiva 2,5 dihidroxi ácido benzoico inhibición competitiva 3,4 dihidroxi ácido benzoico inhibición competitiva 3,5 dihidroxi ácido benzoico inhibición competitiva

3, 4, 5 trihidroxi ácido benzoico (Acido gálico) inhibición competitiva 1, 2, 3 trihidroxi benceno (pirogalol) inhibición competitiva

1, 2 dihidroxi benceno inhibición competitiva 1,3 dihidroxi benceno inhibición competitiva

En la Tabla 4, se muestran algunos inhibidores, los sustratos análogos que no tienen

hidroxilos fenólicos, tales como, el ácido benzoico y el ácido 3 metil benzoico no inhiben la actividad enzimática, mientras que aquellos que inhiben la actividad enzimática competitivamente requieren la presencia del grupo carboxilo. El 2,6 dihidroxi ácido benzoico es el único que presenta inhibición no competitiva.


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2.3.1.2. Mecanismos de acción.

La tanasa hidroliza principalmente ácido tánico produciendo glucosa y ácido gálico.

Los intermediarios de la hidrólisis son la 1,2,3,4,6-pentagaloil glucosa, la 2,3,4,6-tetragaloil glucosa y dos tipos de monogaloil glucosa. Cuando el sustrato es el ácido tánico metilado o metil galato se obtiene de la hidrólisis ácido gálico y metanol, al llevar a cabo una cromatografia no se detecta ácido m-digálico (Iibuchi et al, 1972).

El más común de los taninos es el ácido tánico, puede o no estar metilado, está

compuesto por un mol de glucosa y nueve moles de ácido gálico. En la Figura 2, se observan las estructuras de una molécula de ácido tánico metilado y no metilado, cuando el ácido tánico no esta metilado, la molécula de glucosa se unirá por medio de enlaces de tipo éster a el radical R2 (ácido digálico) en los carbonos 1, 2, 3 y 4 y al radical R1 (ácido gálico) en el carbono 6. Si el ácido tánico esta metilado el radical R2 será reemplazado por R3 (m-digalato metilado).

H- C - O - R2 OH -CO - OH H- C - O - R2 OH R2 - O - C - H O R1 = Ácido gálico (B) H- C - O - R2 OH -CO- OH H- C OH O - CO -- OH CH2 - O - R1 OH Glucosa (A) R2 = Ácido digálico (C). O- Me R - O-OC- O- Me O- Me O- OC - O- Me O- Me R3 = Acido dimetil gálico Figura 2. Moléculas que conforman el ácido tánico metilado o no metilado; glucosa (A), R1 = ácido gálico (B), R2 = ácido digálico (C) R3 = ácido dimetil gálico (D)

En un trabajo realizado por Beverini y Metche (1990), se logró detectar dos tipos de

actividades enzimáticas en el extracto obtenido de el cultivo de A. orizae. La detección de los dos tipos de actividades permitió el fraccionamiento de dos grupos de isoenzimas, mediante cromatografia de afinidad. El primer grupo se denominó Tanasa I, esta fracción es


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responsable de la degradación de ácido tánico que posee grupos metilo y el segundo grupo se llamo Tanasa II, presentó una fuerte afinidad por el ácido digálico e hidrolizó específicamente derivados poligálicos que tienen enlaces con carbohidratos.

Los taninos se fueron fraccionando en tres compuestos; ácido tánico, el cual no

presenta migración en los análisis de cromatografía, pentagaloilglucosa y tetragaloilglucosa. Después de una incubación de 12 horas la cantidad del último compuesto se incrementa y empiezan a aparecer ácidos gálico y di gálico, después de 24 h de incubación la cantidad de intermediarios se incrementa; están presentes digaloilglucosa y trazas de monogaloil glucosa. Hacia el final de la hidrólisis, predominan el ácido gálico y el digaloil glucosa, quedando finalmente solamente ácido gálico. Lo anterior podría sugerir que la actividad tanasa es mayor al inicio de la incubación, con la degradación de ácido tánico y la formación de ácidos gálico, digálico e intermediarios. La actividad esterasa se nota a partir de las 24 h de incubación transformando los intermediarios en ácido gálico (Beverini y Metche,1990).

Su actividad podría resumirse de la siguiente forma:

Tabla 5. Tipos de actividad enzimática mostrados por la enzima, dependiendo del sustrato presente.

Tipo de actividad Actúa sobre: De la hidrólisis se obtiene:

Tanasa

Actividad despolimerasa Enlace éster entre glucosa y ácido gálico en el ácido tánico.

- Glucosa. - Acido gálico. - Algunos intermediarios de la hidrólisis.

Actividad esterasa Enlace éster del ácido tánico metilado.

- Acido tánico. - Metanol

El sitio activo de la tanasa contiene una serina, lo cual la hace una típica enzima

esterasa.

2.3.1.3. Fuentes de obtención.

Es conocido que la producción de tanasa y la degradación de taninos hidrolizables,

se dá en medios fúngicos de especies de Aspergillus, incluyendo A. flavus, A. orizae, A joponicus, A. niger y también Penicillium sp. La producción de tanasa fue también reportada en levaduras (Aoki et al, 1976). Las bacterias son generalmente consideradas como altamente sensibles a los taninos, pero al aislar algunas se observó que son capaces de sobrevivir en presencia de taninos e incluso degradarlos (Basaraba, 1966). La producción de tanasa fue lograda en Bacillus pumilus, B. polymyxa, Corinebacterium sp y Kleibsiella pneumoniae en extractos de corteza de castaño como única fuente de carbono: la rápida degradación de la estructura de los taninos fue relacionada con la producción de


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tanasa extracelular (Alain et al, 1983). El ácido gálico fue el único producto de degradación observado con las cepas de Klebsiella pneumoniae, Corinebacterium sp y Bacillus polymyxa.

Los primeros trabajos sobre la producción de tanasa de Aspergillus niger datan de

1927 (Freudenberg et al, 1927), utilizando un medio con sulfato de amonio, fosfato dipotásico y sulfato de manganeso como nutrientes. Haslam et al, (1961), lograron purificar parcialmente la enzima del mismo hongo por cromatografía en una columna Dowex-2. Algunas propiedades de la enzima obtenida del medio de cultivo de Aspergillus orizae fueron reportadas por Yamada et al, (1967).

En 1968, se llevó a cabo la purificación de la tanasa de tres cepas de Aspergillus,

crecido en un medio adicionado con ácido tánico como fuente de carbono. En este estudio se hicieron varias determinaciones, realizadas a partir del extracto purificado obtenido del micelio del hongo. Los extractos de tanasa se obtuvieron de: A. niger, A. flavus y A. oryzae, las tres cepas crecidas en dicho medio presentaron un buen desarrollo así como una mayor producción de la enzima tanasa. El máximo en la producción de enzima se obtuvo a las 24 h de fermentación, decreciendo posteriormente.

2.3.1.4. Producción de tanasa en fermentación en medio liquido. La tanasa se encuentra en el micelio de Aspergillus flavus o Níger, crecidos en medio que contiene ácido tánico como única fuente de carbono, en fermentación en medio liquido. La formación de la enzima puede ser inducida y es mayor al inicio del crecimiento del microorganismo. También se logro detectar algo de actividad extracelualar, lo cual indica que un a pequeña cantidad de enzima se excreta (Yamada et al, 1968). Aparentemente la producción esta asociada al crecimiento (Doi et al, 1973).

Beverini y Metche (1987) sugirieron que la enzima tanasa probablemente se

encuentra entre la pared de la célula, por lo que se puede considerar que la enzima esta inmovilizada en el micelio. Debido a que la enzima se encuentra principalmente en el micelio se debieron desarrollar métodos más efectivos para poder recuperar el mayor porcentaje posible de enzima activa. Las últimas investigaciones muestran que la extracción de proteínas hidrofilitas por microemulsiones puede ayudar a desarrollar procesos muy eficientes de separación de proteínas. Godlen y Hatton en 1987, mostraron que una proteína funcional puede ser rápida y eficientemente extraída empleando micelas inversas. Esta técnica fue también aplicada para recuperar enzimas intracelulares (Gorvenco et al, 1987; Yokohama et al, 1988). En 1994, Barthomeuf et al b, publicaron un estudio de una nueva técnica para recuperar, aislar y purificar la tanasa producida por A. Níger. Este nuevo método consiste en recuperar la enzima por disrupción enzimática del micelio en combinación con una extracción miceliar inversa. Para la hidrólisis enzimática de la célula se usa una cinasa de Streptomyces griceus, con un porcentaje de recuperación de la actividad de aproximadamente 43%, es decir, se incrementa la efectividad de extracción en comparación con los métodos clásicos que molían el micelio en diferentes


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tipos de soluciones amortiguadoras, a partir de los cuales se recuperaba no mas del 5% de la enzima.

Las condiciones de producción usada para la obtención de tanasa de Aspergillus

flavus en fermentación líquida, fueron: un cultivo previo del microorganismo en extracto de malta y posterior transferencia a un medio con ácido tánico, incubándolo a 30ºC por 96 horas con agitación continua.

En un trabajo realizado por Doi et al (1972), se evaluaron algunas condiciones del

medio que controlan la producción de tanasa y su secreción. Dichas condiciones fueron: el efecto que tiene las diferentes fuentes de carbono, nitrógeno y el efecto del pH y la temperatura. En relación a las diferentes fuentes de carbono se obtuvo la mayor producción de la enzima en presencia de ácido gálico (3.02 UEl) como fuente de carbono, seguido por el ácido tánico (0.87 UE) y el metil galato (0.53 UEl). Al adicionar pequeñas cantidades (0.5%) de glucosa en el medio con ácido tánico como inductor se obtuvo mayor cantidad de tanasa extracelular. Se probaron también diferentes fuentes de nitrógeno y cuando se uso fosfato mono básico de amonio (NH4)H2PO4 se obtuvo la mayor producción de tanasa extracelular después de 40 h de cultivo. En cuanto al pH y la temperatura, se obtuvo la máxima producción de enzima pH 5.0 y 30 ºC, respectivamente.

Barthomeuf et al (1994), definieron también las mejores condiciones de producción

de la enzima en fermentación en medio líquido. Fueron usadas una temperatura de incubación de 32-33 ºC y una velocidad de agitación de 300 rpm al inicio del cultivo y después de 24 h de 450 rpm., debido a que la viscosidad del medio se incrementó por efecto del crecimiento del micelio. Con un nivel de oxígeno disuelto, automáticamente regulado a 30-40%; pH de 4.5 mantenido mediante la adición de hidróxido de amonio 10N. La producción, de acuerdo a estos autores, depende fuertemente de los dos últimos parámetros, una aireación insuficiente impide el crecimiento, mientras que una aireación excesiva favorece la oxidación de los taninos y tiene un efecto inhibitorio en la biosíntesis de la enzima. El pH fue también muy importante ya que a valores menores que 3.5 la enzima es inestable, mientras que a valores por encima de 5.0 se lleva a cabo la hidrólisis del sustrato y la difusión de la enzima en el medio. Bajo estas condiciones, el 75% de la tanasa se encontraba en el micelio y se logró el máximo de producción a las 29 h de cultivo.

2.3.1.5. Producción de tanasa en fermentación en medio sólido.

Lenkha y Lonsane en 1994, publicaron un estudio comparativo de la producción de

tanasa en fermentación sólida, sumergida y superficial, mostrando que en fermentación sólida se obtuvo 2.5 y 4.8 veces mayor actividad que en fermentación superficial y líquida, respectivamente, en aproximadamente la mitad del tiempo de producción. La enzima producida en medio sólido fue completamente extracelular a diferencia de la tanasa producida en medio líquido y superficial que fue intra y extracelular, además la tanasa extracelular mostró una buena estabilidad a altos valores de temperatura y pH.

Se hizo una purificación parcial de la enzima y esta demostró ser estable en un

rango de pH de 2.0 a 8.0, mientras las enzimas producidas en medio líquido y superficial


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fueron más sensibles. En cuanto a la temperatura las enzimas extracelulares tanto de fermentación sólida como líquida el óptimo fue a 60 ºC (Lenkha y Lonsane, 1994). La tanasa extracelular es aparentemente más estable ante agentes desnaturalizantes, lo cual puede deberse a que se dan cambios en la molécula proteínica durante la excreción de la célula, la modificación estructural aparentemente provee una barrera contra la inactivación.

En el trabajo mas reciente (Chatterjee et al, 1996), se optimizaron las condiciones

de producción de tanasa de Rhizopus orizae en fermentación en medio sólido. Las condiciones mas favorables determinadas por estos autores para la producción de la enzima incluyen un pH inicial de cultivo de 5, con un periodo de incubación de 4 días a 40ºC y una humedad de 72%. En este estudio se uso salvado de trigo como soporte impregnado con 2.5% de ácido tánico.

La tanasa es una enzima que se encuentra retenida o asociada al micelio cuando se

produce en fermentación en medio líquido, como lo corroboran los diversos estudios. Su obtención a nivel industrial resultaría bastante costosa y complicada debido a los procesos de extracción y purificación que se requerirían. Se han desarrollado diferentes técnicas de extracción y purificación, sin embargo, otra alternativa podría ser el producirla en fermentación en medio sólido aprovechando las numerosas ventajas de este sistema de fermentación y debido a que la enzima mostró ser completamente extracelular cuando se obtiene bajo las condiciones de la fermentación sólida.

2.3.1.6. Aplicaciones de la tanasa.

La tanasa tiene un uso extensivo en la manufactura de té instantáneo, vino y ácido

gálico, este último representa un sustrato de importancia para la síntesis química o enzimática de propil galato en la industria alimenticia y la trimetoprim en la industria farmacéutica. Además la tanasa tiene un uso potencial en la clarificación de la cerveza y jugos de frutas, proveyendo los fenoles inducidos en la maderización en vino, manufactura de bebidas con sabor de café y otras más.

Los principales taninos en los vinos son la catequina y epicatequina, que pueden

estar acompañadas de galocatequina y otros derivados galoiles. La cantidad de catequina en vinos blancos es del orden de 10 a 50 mg/l, mientras que en vinos tintos puede ser de hasta 800 mg/l (Ribéreau-Gayon, 1973). El 50% del color de los vinos tintos se debe a estos compuestos, sin embargo, si son oxidados a quinonas por contacto con el aire pueden formar cierta turbidez no adecuada. Por otro lado si la cantidad de taninos es excesiva puede darse también precipitados o demasiada astringencia de los vinos, estos problemas han sido solucionados con el uso de tanasa.

También se ha descubierto que la cerveza tiene cierta cantidad de taninos, sobre

todo antocianidinas. Cuando la cantidad de proteínas presente en la cerveza es demasiado elevada se pude dar la formación de precipitado y turbidez (Chapon, 1961), este problema representa un uso potencial para la tanasa.


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Se han descrito compuestos que son combinaciones de los dos tipos de taninos; por ejemplo, el galato de teoflavina, posible producto intermediario encontrado en la fermentación del té (Fennema, 1985). Al respecto existen varias patentes, las primeras registradas en el año 1977 (United States Patents No 4639375, 1977) donde se describen procesos para el tratamiento de las hojas de té con tanasa, de forma tal que, el té obtenido como producto final no forma turbidez al ser refrigerado y el té instantáneo obtenido a partir de la hojas tratadas con tanasa es de mejores características de solubilidad (United States Patents USP No 5445836, 1995; USP No 5258188, 1993; USP No 4639375, 1987). Además se reporta que la actividad antioxidante de extractos acuosos de hojas de té negro se incrementa, tratando dichos extractos con tanasa. Estos extractos son posteriormente incorporados en alimentos susceptibles a la oxidación de lípidos (USP No 4925681, 1990; USP No 4891231, 1990).

2.4. TANINOS. 2.4.1. Definición y clasificación.

Los taninos, son compuestos fenolitos presentes en vegetales. Pueden estar

constituidos como polímeros complejos de varias unidades. De acuerdo a su estructura y actividad se clasifican en taninos hidrolizables y taninos condensados (Haslam, 1975). Los taninos hidrolizables poseen un carbohidrato central, que funciona como poli alcohol, con varios ácidos carboxílicos fenólicos que se unen por enlaces de tipo éster. Por ser una molécula de tipo poliester puede ser hidrolizada en fragmentos simples. Este tipo de taninos pueden ser subdivididos en; galotaninos y elagitaninos, dependiendo si su estructura esta formada por ácido gálico (Figura 3A) o ácido elágico (Figura 3B).

OH COOH OH OH Acido gálico (A) O C O OH HO OH HO C O O Acido elágico (B) Figura 3. Componentes básicos de los taninos hidrolizables. Acido gálico, ácido elágico.

Los taninos condensados (Figura 4) no tienen un carbohidrato en el centro y son usualmente derivados de la condensación de precursores de flavonoides. Los principales


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taninos forrajeros son de tipo condensado y son principalmente derivados de leuco-antocianidinas (flavan-3,4-dioles) (Haslam, 1977). OH OH OH OH O O OH OH OH OH OH OH Catequina (A) Epicatequina (B) Figura 4. Estructura de los taninos condensados más comunes. Catequina (A), Epicatequina (B)

Las principales diferencias entre ambos tipos de taninos se presentan en la Tabla 6.

Tabla 7. Principales diferencias entre taninos hidrolizables y condensados. TANINOS HIDROLIZABLES

TANINOS CONDENSADOS

Se encuentran en extractos de Semillas turcas y chinas, Algarrobilla, Divi-divi y Valonea.

Este tipo de taninos se encuentran en los extractos de: Quebracho y Acacia

Poseen mayor proporción de carbohidratos en su estructura, usualmente glucosa

Poseen bajas proporciones da carbohidratos, lo cual los hace poco solubles

Se subdividen en: galotaninos y elagitaninos.

Son una familia de varios compuestos diferentes.

Galotaninos; su hidrólisis produce glucosa y ácido gálico, principalmente. Elagitaninos; su hidrólisis produce glucosa y ácido elagico (Figura 3), además de ácido gálico y otros

Están constituidos por tres anillos bencenicos unidos a diferentes radicales, dando origen a varios tipos de compuestos distintos. (Figura 4).

Presentan numerosos grupos carboxílicos, son muy susceptibles a formar complejos de proteína-tanino

No presentan grupos carboxílicos.

Poseen menos efectos inhibitorios Poseen mayores efectos inhibitorios, tanto en enzimas como en microorganismos

2.4.2. Función de los taninos en plantas.

En las plantas, los taninos pueden estar en las vacuolas o incorporados a la pared

celular. En muchas especies de plantas los taninos se acumulan y no participan en el


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metabolismo, las concentraciones acumuladas pueden ser muy altas. Dicha acumulación al parecer se da para proteger las partes vulnerables de las plantas de ataques microbianos, mediante la inactivación de enzimas extracelulares de bacterias u hongos y previene la germinación y crecimiento de esporas (White, 1957). Los taninos también juegan un papel importante en la protección de las plantas contra los herbívoros.

Algunos de los intermediarios metabólicos más reactivos encontrados en tejidos

vegetales son producidos mediante el complejo fenolasa, el cual es responsable de la orto-hidroxilación de los fenoles y de la deshidrogenación de orto-fenóles a quinonas (Mason, 1955). Se le han asignado varias funciones al sistema fenol-fenol oxidasa, concernientes a la respiración, el metabolismo intermediario, la regulación de potenciales redox y el efecto antibiótico. Aunque las plantas contienen numerosos ortodifenoles - taninos entre ellos- con la correcta configuración para la actividad fenolasa, estas sustancias parecen inaccesibles a la fenolasa antes de que ocurra un daño.

Mason (1955), sostiene que a nivel del metabolismo intracelular, los polifenoles son

un grupo importante y a nivel de todo el organismo las ligninas y flavonoides tienen importancia como compuestos estructurales y como pigmentos. La presencia de taninos en la superficie de la corteza de ciertos árboles y en algunos alimentos para animales confiere a estos tejidos resistencia física, mientras que en frutas su función es la de ayudar a la maduración y lograr un ambiente favorable para la subsecuente germinación y crecimiento en el suelo.

Los taninos y otras sustancias parecidas constituyen un muy buen mecanismo de

defensa contra parásitos (Mahadevan, 1982). El efecto de los taninos en la prevención de la germinación de esporas fue reportado por primera vez por Cook y Wilson (1915). También tienen influencia en el desarrollo de los perfiles del suelo, ya que afectan a las vías de descomposición de materia orgánica. Basaraba, 1966, reportó la inhibición de la nitrificación del amonio en el suelo mediante una preparación de taninos hidrolizables y condensados. Rice en 1964, probó el efecto de 20 extractos de diferentes plantas sobre Acetobacter vinelandi, Nitrobacter agilis, Nitrosoma europeae y Rizobium leguminosarum, 16 extractos inhibieron el crecimiento de estos microrganismos y 15 de ellos previnieron la nitrificación de Nitrosomonas (Basaraba y Starkey, 1966). Basaraba (1966), estudió también el efecto de los taninos en la oxidación de glucosa en varios organismos. En presencia de 0.5% (w/v) de taninos hidrolizables y condensados, la respiración exógena de Acetobacter vinelandu fue reducida en 50 y 85% y la de E. coli en 40 y 20%, respectivamente.

Kakirichi et al (1985), estudiaron las propiedades inhibitorias de 24 taninos aislados

a partir de drogas, sobre la transcriptasa reversa en el RNA de los virus que ocasionan los tumores cancerosos. Ellos demostraron que los taninos hidrolizables inhiben la polimerización del DNA catalizada por la transcriptasa reversa. Los dímeros de elagitaninos fueron más efectivos que las formas monoméricas y la trigaloilglucosa y la tetragaloilglucosa fueron menos inhibitorios que los galotaninos con un gran número de residuos galoil.


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2.4.3. Propiedades biológicas. Los taninos naturales son agentes reductores poderosos, que absorben oxígeno,

especialmente en soluciones alcalinas, formando productos de oxidación fuertemente coloridos. La oxidación de fenoles produce quinonas, que reaccionan con grupos tales como aminos y sulfidrilos para producir compuestos estables.

Los fenoles simples y los polifenoles forman asociaciones reversibles débiles con

varios tipos de sustratos, incluyendo celulosa y proteínas, con una afinidad determinada por su peso molecular y la configuración molecular de el fenol (Roux y Evelyn, 1958). Los taninos poseen mayor afinidad por las proteínas que por la celulosa, lo cual puede ser atribuido a los fuertes puentes de hidrógeno, con alta afinidad por el oxígeno carboxílico del grupo peptídico.

El gran número de grupos fenólicos en la molécula de taninos provee varios puntos

de ataque, con oportunidad estérica favorable para la unión mediante puentes de hidrógeno con los péptidos adyacentes de la cadena de proteínas, para formar complejos proteína-taninos. Los taninos hidrolizables, por poseer numerosos grupos carboxílicos, son susceptibles a formar puentes de hidrógeno dando origen a los complejos ya mencionados. El peso molecular y el número de grupos sustituyentes determinan la reactividad de los taninos.

Las propiedades biológicas de los taninos son comúnmente el resultado de su

habilidad para formar complejos con las proteínas. Dichas características tienen una fuerte influencia en el efecto de la presencia de los taninos en diversas fuentes vegetales. El efecto de los taninos presentes en vegetales se puede agrupar en:

- La inhibición enzimática. - La inhibición microbiana. - Efecto de los taninos en forrajes. - Efecto de los taninos sobre organismos superiores. La actividad de muchos sistemas enzimáticos es inhibida por los taninos y la

actividad de estas enzimas se puede restablecer removiendo los taninos mediante polivinilpirrolidona. La inhibición de las enzimas es causada por la formación de un complejo enzima-tanino. Las cinéticas de inhibición no competitiva han sido reportadas para; la inhibición de β-glucosidasa por ácido tánico, para la inhibición de tripsina y α-amilasa por taninos condensados. La enzima tanasa no inhibe su actividad en presencia de taninos, ya que al ser una glicoproteína forma complejos débiles con los taninos, debido a que los puentes ocurren preferentemente con los carbohidratos que con la proteína (Strumeyer y Malin, 1970).

Algunos organismos son sensibles en diferentes grados al efecto inhibitorio de los

taninos sin embargo otros microorganismos pueden tolerar altas concentraciones de taninos y pueden degradar y utilizar los taninos como fuentes de carbono para su crecimiento. El


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grado de inhibición depende del tipo de tanino y del microorganismo (<biblio>). White (1957), sugirió que los taninos son tóxicos para los microorganismos, sin embargo, aparentemente el catabolismo de los sustratos simples tales como, azúcares y aminoácidos, no es significativamente afectado. El principal sitio de acción de los taninos en los microorganismos sensibles es en la pared celular, ya que se encontró que producen pleomorfismo, aumentando el tamaño del microorganismos sin dividirse (Simoncini, 1958; Henis et al, 1964). La reacción de los taninos con la pared celular puede deteriorar la permeabilidad (Hunter, 1960; Herz y Kaplan, 1968).

La productividad de animales alimentados con forraje de plantas que poseen taninos

puede ser baja, debido a que estos últimos reducen la calidad y disponibilidad de nutrientes. Los taninos causan astringencia en la boca de los animales. Los grandes tamaños de las moléculas de taninos previenen su absorción directa en el tracto digestivo. Los taninos hidrolizables pueden ser rotos en el intestino, en constituyentes fenólicos y azúcares, que pueden ser absorbidos (Glick y Joslyn, 1970, a), mientras los taninos condensados no son rotos en el tracto digestivo, altas cantidades de taninos condensados pueden producir gastritis e irritación.

El forraje con taninos no es ingerido por los animales, éstos también pueden

producir inhibición en las enzimas responsables de la digestión de fibra y proteína en los rumiantes. Otro efecto negativo de la presencia de taninos en la dieta, que se reporta, es que se nota una disminución de la calidad de los productos animales. Se da un deterioro del sabor y olor de la carne y un color extraño en los huevos.

Un gran número de tenerías vierten sus aguas residuales ricas en taninos a caudales

de ríos y lagos. Krishnamoonthy et al, 1972, reportaron que los taninos son tóxicos para animales acuáticos; 6.5 mg de taninos/l fueron letales para peces de agua dulce. Rao y Mariapan, 1972, reportaron que 320 mg de taninos/l fueron también tóxicos para un pez llamado Catla-Catla habitante de aguas dulces. Por otra parte las aguas residuales ricas en taninos constituyen un grave problema de contaminación ya que estas no son fáciles de tratar por métodos convencionales.

Objetivos

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3. OBJETIVOS. 3.1. OBJETIVO GENERAL. Purificar y caracterizar el sistema enzimático, una o mas enzimas, responsables de la hidrólisis del ácido tánico en una cepa de Aspergillus niger. Cuya característica es crecer en altas concentraciones del ácido. 3.2. OBJETIVOS PARTICULARES 3.2.1 Determinar la técnica más adecuada para medir la actividad tanasa. 3.2.2 Seleccionar la o las cepas de mayor producción de tanasa y mayor crecimiento. 3.2.3 Obtener la cinética de producción de tanasa en fermentación en medio sólido. 3.2.4 Determinar si la actividad enzimática tanasa, se encuentra asociada al micelio del microorganismo, cuando este crece en fermentación en medio sólido. 3.2.5 Determinar el protocolo de purificación del extracto enzimático crudo, obteniendo en fermentación en medio sólido. 3.2.6 Purificar la enzima del extracto fúngico 3.2.7 Caracterizar fisicoquímica y/o cinéticamente la enzima obtenida en cultivo sólido

Materiales y métodos

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4. MATERIALES Y MÉTODOS. 4.1. Microorganismo.

Se utilizaron tres cepas de Aspergillus niger, N888, N920 y T2A en fermentación en medio sólido (FMS), creciéndolas en 1% de ácido tánico como inductor. Las cepas fueron donadas por el Laboratorio de Biología Molecular y Genética, Universidad de Landbouw, Wageningen, Holanda.

Estas cepas de A. niger, fueron utilizadas para estudiar y mejorar su característica de usar el ácido tánico como sustrato, a nivel molecular. Bos et al (1988), obtienen las cepas N888, N920 y T2A de A. niger , a partir de la cepa N402, una mutante con conidiosporas cortas. Las cepas y su genotipo se muestran a continuación:

Tabla 7. Cepa original, cepas mutantes y cepa transformante de A. niger capaces de crecer en presencia de ácido tánico.

Cepa Genotipo N420 cspA 1

N888 csp A1 , fwn A1, pyr A5, phe A1, tan X

N920 csp A1 , fwn A1, pyr A5, phe A1, tan- X

T2A (cepa transformante) csp A1 , fwn A1, pyr A5, phe A1, tan X

Nota: La definición de las abreviaturas es la siguiente: cspA1, fwnA1 coloración café de las conidiosporas, pyrA5 auxotrofia a uridina, pheA1 auxotrofia a fenilalanina, tanX capacidad de crecer en altas concentraciones de ácido tánico.

Las cepas poseen mutaciones provocadas con luz UV, las cuales les confieren

ciertas características fácilmente detectables que son usadas como marcadores genéticos. Dichas características consisten en auxotrofias, es decir, las cepas necesitan para crecer ciertos componentes en este caso fenilalanina (pheA1), uridina (pyrA5) y solución de vitaminas. Por otro lado las mutaciones también afectan las rutas metabólicas responsables de la coloración de las esporas, por lo cual estas cepas poseen conidiosporas con una coloración café (fwn A1) en vez de la pigmentación negra característica de A. niger. Otra característica mencionada en la Tabla 7 es su capacidad de crecer en ácido tánico, ya que la cepa N920 de A. niger, no es capaz de crecer en medio con 20% de ácido tánico, mientras que la N888, si puede crecer a ésta concentración de ácido tánico.


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4.2. Conservación.

Las cepas fueron conservadas en matraces de 250 ml con el medio de propagación, a 4ºC y resembradas cada 15 días.

Por otro lado se conservó una suspensión de esporas en glicerol 40% a -10ºC,

durante periodos más largos. 4.3. Medios de cultivo.

Se utilizaron dos tipos de medios de cultivo, el de propagación de la cepa y los de producción de la tanasa. En la tabla se muestra la composición de ambos tipos de medio. Tabla . Medios de cultivo para propagación y producción Medio de propagación

(g/l) Medio de producción

(g/l) NaNO3 6.0 --- NH4NO3 --- 2.0 Sacarosa 3.0 --- Glucosa --- 0.5 Acido tánico --- 10.0 KH2PO4 1.5 1.0 MgSO4.7H2O 0.5 0.2 KCl 0.5 --- FeSO4.7H2O 0.001 0.0025 MnCl2.6H2O 0.001 0.004 CuSO4. 5 H2O 0.001 --- ZnSO4. 7 H2O 0.001 --- CaCl2.2H2O --- 0.02 Na2MoO4.2H2O --- 0.002 Agar 15.0 --- Peptona de caseína 1.0 1.0 Extracto de levadura 1.0 1.0 Solución de vitaminas

2* 2*

Fenilalanina 1** 1** Uridina 1** 1** Nota: * se usaron 2 ml/l de medio de cultivo, ** 1ml/100 ml de medio.

Solución de vitaminas. La solución de vitaminas contenía los siguientes compuestos (g/l): tiamina 0.1, rivoflavina 1.25, PABA 0.1, nicotinamida 1.0, piridoxina 0.5, biotina 0.002, ácido pantotenico 0.1.


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En cuanto a las soluciones de aminoácidos, las concentraciones utilizadas fueron: fenilalanina 0.2 g/l y uridina 0.25 g/l. Estas soluciones fueron previamente esterilizadas mediante filtración en membrana de 0.2 micras.

Ambos tipos de medios de cultivo se complementaron con extracto de levadura y

peptona de caseína (1g/l), el pH se ajustó a 5.8, con NaOH 1M y se esterilizaron a 15 lb/m2, durante 15min. Una vez que el medio estaba estéril y a temperatura ambiente, se le agregaron las soluciones de vitaminas, fenilalanina y uridina.

Los primeros experimentos fueron llevados a cabo con las tres cepas de Aspergillus

niger con las que se contaba, realizando fermentaciones en medios sólido con 1% de ácido tánico, como inductor. Posteriormente se decidió usar la cepa N888, con la cual se evaluó el incremento de la actividad enzimática, modificando el medio de cultivo para la producción enzimática, como se observa en la Tabla 8. Cabe mencionar que en este experimento no se incrementó en las mismas proporciones la concentración de los factores de crecimiento (fenilalanina, uridina y sol de vitaminas). Tabla 9. Descripción de los cuatro distintos medios evaluados con 2, 4, 10 y 20% de ácido tánico y los componentes incrementados 2, 5 y 10 veces, respectivamente. Control

(g/l) 2 C

(g/l) 5 C

(g/l) 10 C (g/l)

KH2PO4 1.0 2.0 5.0 10.0 NH4NO3 2.0 4.0 10.0 20.0 MgSO4.7H2O 0.2 0.4 1.0 2.0 CaCl2.2H2O 0.02 0.04 0.1 0.2 MnCl2.6H2O 0.004 0.008 0.02 0.04 Na2MoO4.2H2O 0.002 0.004 0.01 0.02 FeSO4.7H2O 0.0025 0.005 0.125 0.025

Ácido tánico 20+ 40+ 100+ 200+ Glucosa 5.0 10.0 25.0 50.0 Peptona de caseína

1.0 1 1 1

Extracto de levadura

1.0 1 1 1

Solución de vitaminas

2* 2* 2* 2*

Fenilalanina 1** 1** 1** 1** Uridina 1** 1** 1** 1** Nota: C corresponde al medio usado como control, + equivale a un porcentaje de 2, 4, 10 y 20 % de ácido tánico, respectivamente, * se usaron 2 ml/l de medio de cultivo, ** 1ml/100 ml de medio.


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4.4. Producción. 4.4.1. Producción del inóculo.

Matraces de 125ml con 30 ml de medio de cultivo para propagación, fueron inoculados con las tres cepas de Aspergillus niger e incubados durante 5 días a 30ºC. Las esporas de cada una de las cepas fueron suspendidas, utilizando una solución 0.05% de Tween 80. La suspensión de esporas fue colocada en Cámara de Neubawer, obteniendo la cuenta de esporas presentes.

4.4.2. Fermentación.

La fermentación en medio sólido (FMS) se realizó usando como soporte inerte, bagazo de caña, el cual fue lavado, secado y tamizado en mallas 20 y 30 (tamaño de partícula). El bagazo de caña tratado fue esterilizado a 1.2 kg/cm2 con 10 ml de solucion de ácido tanico durante 15 minutos y posteriormente mezclado con 150 ml de medio del cultivo reportado por Lenkha y Lonsane, con el volumen restante de solución de ácido tánico y con la suspensión de esporas, obteniendo una humedad inicial de 70%, una concentración de 1% (p/p) de ácido tánico y una concentración de inóculo de 2x107 esporas/g de bagazo de caña seco.

Para cada de las cepas evaluadas, se empacaron columnas de vidrio (19x2.3 cm) con

el bagazo inoculado a una densidad de empaque de 0.2 g/cm3. Las columnas fueron incubadas a 30ºC en un baño con temperatura controlada y se les inyectó aire saturado de agua por medio de un burbujeador a un flujo de 0.2 cm3/min. Durante las cinéticas se tomaron muestras cada 24 horas, durante 72 horas de fermentación.

4.4.3. Obtención del extracto.

El bagazo de caña fermentado se desempacó, obteniéndose en total 11 g por columna. A 10 gramos se les agregaron 10 ml de agua destilada (1:1), prensándolos a 142.86 kg/cm2 para obtener el extracto y un gramo fue separado para determinar humedad por diferencia de peso en cada una de las muestras, también se determinó el pH. Las muestras fueron almacenadas a 4ºC, para posteriormente determinarles actividad enzimática. 4.5. Técnicas analíticas. 4.5.1. Determinación de la técnica para medir actividad enzimática.

La actividad enzimática de extractos obtenidos con tres cepas de Aspergillus niger en fermentación en medio sólido (FMS), se determinó utilizando tres técnicas distintas, la


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técnica espectrofotométrica, la técnica cromatográfica y la técnica de descenso de pH. La metodología seguida para cada una de éstas se describe a continuación. a) Técnica espectrofotométrica.

La reacción enzimática se desarrollo según la técnica descrita por Iibuchi et al (1968). Se agregó un 1 ml de extracto enzimático crudo, a tubos de ensaye con 4 ml de solución de ácido tánico 0.35% (p/v) disuelto en solución amortiguadora de citratos 0.05 M, pH 5.5. Los tubos fueron incubados en un baño a 30ºC, durante 15 minutos. Se tomó 0.1 ml de la mezcla de reacción enzimática y se diluyó en 10 ml de etanol 90% para detener la reacción enzimática. Finalmente se determinó la absorbencia a 212 y 259 nm de longitud de onda en un espectrofotómetro Shimatsu UV 160A. Los valores de absorbencia fueron usados para obtener las concentraciones de ácido gálico y tánico presentes en la mezcla de reacción, utilizando la siguiente relación: Abs212 = Cat 212 εat 212 + Cag 212 εag 212 Abs259 = Cat 259 εat 259 + Cag 259 εag 259 donde Abs = Absorbencia. C = Concentración. ε = Coeficiente de extinción molar. at = ácido tánico ag = ácido gálico

Los coeficientes de extinción para el ácido gálico (εag 212 = 81.046, εag 259 = 24.628) y para el ácido tánico (εat 212 = 72.800, εat 259 = 19.553) corresponden a la pendiente de la curva obtenida al graficar diferentes concentraciones de ácido gálico y tánico contra sus respectivas absorbencias, determinadas a 212 y 259 nm. Estas longitudes de onda corresponden a los picos máximos de absorción de dichos ácidos.

Unidad enzimática

Una unidad de actividad enzimática (UE) se definió como la cantidad de enzima necesaria para producir un µmol de ácido gálico por mililitro de extracto enzimático crudo por minuto, bajo las condiciones de análisis. b) Técnica cromatográfica (HPLC)

La actividad enzimática se desarrollo de acuerdo a el método reportado por Beverini y Metche (1990). Se agregaron 50 µl de extracto enzimático a tubos de ensaye con 1 ml de solución de ácido tánico 0.51 g/l (p/v) en solución amortiguadora de acetatos 0.1M pH 5.0.


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Los tubos fueron incubados en un baño con temperatura controlada a 30ºC, durante 30 minutos. Para detener la reacción enzimática se utilizaron 200 µl de solución de HCl 2 N.

Para los controles de cada muestra se desarrolló la actividad enzimática agregando

los 200µl de HCl antes de adicionar el extracto enzimático.

Condiciones de análisis

Para el análisis de ácido gálico se utilizó un equipo de HPLC (Thermo Separation Produtcs). Con las características que se enlistan a continuación: bombas Constametric 3200 y 3500 (Thermo Separation Products), integrador Lctalk HPLC Software. Otros accesorios utilizados fueron: equipo de filtración de solventes (todos los solventes usados fueron grado HPLC), jeringa Hamilton (100 µl), sonicador Branson 2200. Las condiciones de cromatográficas fueron las siguientes: Columna: Spherisorb ODS2 5µl Fase móvil: metanol, ácido fórmico 1% (v/v) en relación 5:95. Velocidad de flujo: 2 ml/min. Volumen de inyección: 20 µl. Detección: la detección se realizó a 280 nm en detector Spectromonitor 5000 (Thermo Separation Products)

Se realizó la curva de referencia, la cual nos permitió relacionar el área resultante de gálico con la concentración de éste ácido. La unidad de actividad enzimática se definió de la misma forma que para el primer método, pero bajo las condiciones de análisis de ésta técnica. c) Técnica de descenso de pH.

Tubos de ensaye con 10 ml de solución de ácido tánico 1 g/l (p/v) fueron incubados a 30ºC. El pH de la solución de ácido tánico se ajustó a 5.0 con solución de NaOH 0.1 M. A cada tubo se le agregó 1 ml de extracto enzimático para desarrollar la reacción. Los cambios de pH debidos a la reacción enzimática, se determinaron a los 5, 10, 15 y 20 min, usando un pH metro (Conductronic).

Unidad enzimática.

Una unidad enzimática (UE) se defino como la velocidad de descenso de pH, debida a la hidrólisis de ácido tánico, bajo las condiciones de análisis.

4.5.2. Determinación de la actividad enzimática asociada al micelio.

Se trituraron 10 g de bagazo residual del prensado en un mortero, usando aproximadamente 50 ml de nitrógeno líquido. Posteriormente se agregaron 15 ml de


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solución amortiguadora de acetatos 1M pH 5.0. Se mantuvo en refrigeración ésta mezcla durante 15 minutos y posteriormente se volvió a prensar a 1.2 kg/cm2 , obteniéndose un nuevo extracto al que se le midió actividad enzimática por HPLC.

4.5.3. Evaluación de la humedad.

La humedad determinada por diferencia de peso seco, se evaluó en cada una de las muestras de bagazo fermentado obtenidas durante las cinéticas de producción en FMS. Dos gramos de bagazo fermentado se colocaron en una estufa a 60 º C, durante 24 horas. Posteriormente se pesaron, obteniendo la humedad de la muestra, de acuerdo a la siguiente formula; %Humedad = Pi - Pf x 100 Pi donde: Pi = Peso inicial de la muestra. Pf = Peso final de la muestra seca. 4.5.4. Determinación de la proteína de las distintas fracciones enzimáticas.

El análisis de proteína se realizó mediante la técnica de Bradford (1976). A 800 µl de muestra enzimática se le agregaron 200 µl de reactivo de Bradford (BioRad). Se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos y posteriormente se obtuvo la absorbencia a una longitud de onda de 595 nm, en el espectrofotómetro (Shimatsu UV160 A). 4.6. Purificación. 4.6.1. Tratamiento del extracto enzimático crudo.

El extracto enzimático obtenido después de 120 horas de fermentación en medio sólido (con 10% de ácido tánico) con la cepa N888 de A. niger, fue centrifugado a 7000 rpm, durante 30 minutos a 4ºC.

Posteriormente fue filtrado en membrana de 0.2 micras y dializado en agua

desionizada para realizar el electroenfoque y en solución amortiguadora de acetatos 0.1M pH 5.5 para ser inyectado en columnas de FPLC. 4.6.2. Electroenfoque.

El extracto enzimático crudo (40ml) fue centrifugado, filtrado y dializado en 4 litros de agua durante 24 horas a 4ºC. Se diluyó hasta 50ml con agua destilada y se realizó un electroenfoque usando un Rotofor de cámara cilíndrica (BioRad) con una capacidad máxima de 50 ml. Dicha cámara se encuentra dividida por membranas de intercambio iónico en 20 compartimientos.


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Se adicionaron Anfolitas (moléculas cargadas) en un rango de pH entre 3 y 9 (Biolyte 3/9, BioRad) a la solución enzimática en relación 1% (v/v). La solución fue colocada en la cámara del Rotofor, estabilizada a temperatura de -5ºC con ayuda de un sistema refrigerante, llevando a cabo un electroenfoque a 15W de potencia constante, durante 4 horas, usando una fuente de poder modelo 3000X (PowerPac, BioRad). Una vez finalizado el electroenfoque, el contenido de la cámara fue colectado en 20 fracciones de 2.5 ml, utilizando una bomba de vacío.

Se midió el pH en cada fracción, inmediatamente después del análisis y

posteriormente las fracciones fueron almacenadas a 4ºC para determinarles actividad enzimática por el método de HPLC, proteína por el método de Bradford (1976). Las fracciones fueron corridas en un gel de electroforesis con poliacrilamida 12.5%, según la técnica reportada por Lammeli en 1970.

Las fracciones que mostraron actividad enzimática después del primer

electroenfoque fueron mezcladas (10ml) y diluidas a un volumen final de 50 ml para realizar un nuevo electroenfoque en el Rotofor, sin adición de anfolitas, en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Después de 4 horas se volvieron a colectar 20 fracciones de 2.5 ml, midiéndoles nuevamente el pH, la actividad enzimática y la proteína. 4.6.3. Técnicas cromatográficas.

Todos los análisis cromatograficos fueron realizados en equipo de FPLC, cromatografia líquida de baja presión, Biologic Work Station (BioRad), con colector de fracciones BioRad, modelo 2128. La detección de la proteína eluida se llevo a cabo en línea con un detector (BioRad), mediante celda UV a 280 nm. El esquema del equipo se muestra en la siguiente Figura 5.

Figura. Esquema del equipo de FPLC, 1. Computadora con paquete de control de todo el sistema (Biologic System Software), 2. Columnas, 3. Válvula de inyección y purga, 4. Bombas, 5. Detector, celda UV, 6. Colector.


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Los primeros experimentos fueron conducidos a determinar el protocolo de purificación de la enzima. a) Prepurificación.

El extracto enzimático crudo, centrifugado y dializado aún presentaba muchas impurezas tales como, pigmentos, y otros compuestos. Se realizó una etapa previa de prepurificación del extracto usando una precolumna EconoPac (BioRad), de tipo fuertemente básico (intercambiador aniónico) con grupo funcional N+ (CH3)3. Dicha columna fue conectada al equipo de FPLC descrito en la anterior sección.

Antes de realizar el análisis, la columna fue previamente estabilizada con solución

amortiguadora de acetatos 0.1M pH 5.5, esta última fue también usada como fase móvil. Posteriormente se realizó la elusión de las proteínas retenidas en la columna con 1M de NaCl. Se uso un flujo de 1ml/min, colectando fracciones cada minuto. La detección de la proteína eluida se realizó en línea a 280 nm de absorbencia.

Para el primer experimento se inyectaron 5 ml de extracto enzimático crudo. En los

posteriores experimentos se inyectaron también 5 ml de extracto pero concentrados 3 veces por ultrafiltración. La actividad enzimática se determinó por HPLC en las fracciones separadas. b) Cromatografía de intercambio aniónico.

Las fracciones que mostraron actividad enzimática después de la etapa de prepurificación se usaron para realizar una nueva cromatografia de intercambio aniónico. Usando una columna BioQ de BioRad, también de tipo fuertemente básico, con empaque poroso que constituye una modificación de N+ (CH3)3, como grupo funcional.

Esta etapa se realizó el mismo equipo de FPLC descrito en la sección 4.6.2. Se uso

como fase móvil una solución amortiguadora de acetatos y solución de NaCl 0.1M a un flujo de 0.5 ml/min, colectando fracciones cada minuto. Adicionalmente se aplico un gradiente de 0 a 1 M de NaCl. Asimismo se obtuvo un perfil de elusión de proteína a 280 nm de longitud de onda.

La actividad enzimática fue evaluada en cada una de las fracciones mediante la

técnica de HPLC. Una vez determinada la concentración de NaCl en la que eluye la proteína de interés, el gradiente que se aplicó durante la cromatografía de intercambio aniónico fue entre 0 y 0.3 M de NaCl, las condiciones de análisis para la última cromatografía fueron iguales que las descritas en ésta sección.


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c) Tamizaje molecular.

Este tipo de cromatografía se llevo a cabo también en el FPLC. El extracto enzimático concentrado por ultrafiltración en membranas Filtron 10K, fue inyectado en columna Superdex 75 (Pharmacia Biotech) de 60x2.6 cm, con un rango de separación entre 3 y 70 Kdaltons, la cual fue estabilizada con la fase móvil antes de realizar la inyección. La fase móvil fue una solución amortiguadora de acetatos 0.1M pH 5.5. Se aplico un flujo isocrático de 1 ml/min, tomando fracciones cada minuto. Al igual que en todos los casos se obtuvo una gráfica del perfil de elución de proteínas a una absorbencia de 280 nm.

A estas fracciones se les midió actividad enzimática por la técnica de HPLC. Se

determino proteína por el método de Bradford en las fracciones con actividad tanasa, para realizar un gel de electroforesis. 4.7. Caracterización. 4.7.1. Temperatura óptima.

La temperatura óptima de la enzima se evaluó desarrollando la actividad enzimática a 30, 40, 50, 60, 70 y 80ºC, usando como sustrato una solución de ácido tánico (Sigma) 0.5 g/l en solución amortiguadora de acetatos 0.1 M pH 5.0, a la cual se le agregó 50 µl de extracto enzimático purificado. La mezcla de reacción se incubó durante 15 min a las temperaturas antes mencionadas y se detuvo la reacción enzimática con 200 µl de HCl 2N. Posteriormente las muestras se analizaron por cromatografía de alta presión (HPLC), en las mismas condiciones de análisis usadas en los anteriores experimentos.

4.7.2. pH óptimo.

Para determinar el pH óptimo de la enzima se prepararon varias soluciones amortiguadoras para cubrir un rango de pH entre 2 y 9. Se evaluó la actividad con solución de ácido tánico (Sigma) 0.5 g/l, preparada en las siguientes soluciones amortiguadoras: solución amortiguadora de citrato 0.5 M en un rango de pH entre 3 y 6, solución amortiguadora de acetatos 0.1 M en un rango entre 5 y 7 y solución amortiguadora de fosfatos en un rango en de pH entre 7 y 9. La actividad enzimática se determinó de la misma forma descrita anteriormente. 4.7.3. Electroforesis.

Se corrieron geles unidimensionales bajo condiciones desnaturalizantes, es decir, en

presencia de 0.1% de SDS. Las proteínas fueron solubilizadas hirviéndolas en presencia de SDS.


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Se usaron geles de 0.75 mm x 14 cm x 14 cm. El gel de separación fue preparado con una concentración final de poliacrilamida de 12.5%, usando solución de 30% de poliacrilamida/0.8% de bisacrilamida, solución amortiguadora de Tris.HCl/SDS, 4X, pH8.8, agua desionizada, 10% de persulfato de amonio y TEMED.

El gel usado en la parte superior del gel de separación fue preparado también con la solución de 30% de poliacrilamida/0.8% de bisacrilamida, agua desionizada, 10% de persulfato de amonio y TEMED, Leo para este se uso una solución amortiguadora de Tris.HCl/SDS, pH 6, en las proporciones establecidas en el”Currrent Protocols in Molecular Biology”, basado en la técnica reportada por Lammeli (1970).

Soluciones 30% de poliacrilamida/0.8% de bisacrilamida

Se mezclaron 30 gramos de archilamida y 0.8 gramos de N N/metil bisacrilamida en un volumen total de 100 ml de agua desionizada. Se filtro la solución a través de una membrana de 0.45 micras y se almaceno a 4 ºC en frascos color ámbar. Esta solución debe ser descartada cada mes, ya que la archilamida se hidroliza gradualmente a ácido acrílico y amonio. Solución amortiguadora Trisca/SDS, pp. 6.8 (0.5M de Trisca conteniendo 0.4% de SDS)

Se disolvieron 6.05 gramos de Gris base en 40 al de agua desgonzada. Se ajusto el pp. A 6.8 con 1M de Cl. y se adiciono agua hasta un volumen final de 100 al. Esta solución fue filtrada en membrana de 0.45 micras, se le adicionaron 0.4 gramos de SDS y se almaceno a 4 ºC.

Solución amortiguadora Tris.HCl/SDS, pH 8.8 (1.5M de Tris.HCl conteniendo 0.4% de SDS)

Se adicionaron 91 gramos de Tris base en 300 ml de agua y se ajusto el pH a 8.8

con una solución de HCl 1M. Se adiciono agua a un volumen total de 500 ml, la solución fue posteriormente filtrada, se le adicionaron 2 gramos de SDS y se almaceno a 4 ºC.

Los geles fueron corridos aplicando una corriente constante de 15 mA, por cada gel,

en un equipo de electroforesis de Bio Rad, usando solución amortiguadora de electroforesis con SDS. Posteriormente los geles fueron revelados con nitrato de plata.

Resultados y discusión

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5.5.2. Purifcación. a) Primer etapa: Electroenfoque.

El electroenfoque constituye una técnica de alta resolución para la separación de proteínas. Las proteínas serán separadas por su punto isoléctrico pI (punto en el cual la carga neta de las proteínas es cero), estableciendo un gradiente de pH mediante el uso de anfolitas, pequeñas moléculas cargadas. La mezcla de anfolitas y proteínas migraran hasta alcanzar su pI gracias a la aplicación de un campo eléctrico.

En la Figura 19, se muestran los resultados obtenidos durante el primer

electroenfoque. Se estableció un gradiente lineal de pH entre 2.4 y 10.2. La actividad enzimática se concentró en las cuatro primeras fracciones cercanas al cátodo del Rotofor en un rango de pH entre 2 y 4, con un máximo (1.25 UE/ml) en la tercera fracción en un valor de pH de 3.8. Esto podría indicar que el pI de la tanasa se encuentra alrededor de este valor de pH. La actividad enzimática no se detectó en una sola fracción debido a que al extraer las proteínas separadas durante el análisis algunas de ellas difunden.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Fracción

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a (U

E/m

l)

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

Prot

eína

(mg/

ml)

Figura 19. Perfil de actividad enzimática (•), proteína (-) y gradiente de pH ( ), en las fracciones resultantes del electroenfoque

Durante este análisis el pH es un factor muy importante, ya que define además de la separación de las diferentes proteínas, el punto isoeléctrico de la enzima de interés. En la Tabla 12, se muestran los valores de pH y la actividad enzimática obtenidos en las 20 fracciones resultantes del electroenfoque.


55

Tabla 12. Gradiente de pH establecido y actividad enzimática obtenidos en las fracciones obtenidas durante el primer electroenfoque.

Fracción Valor de pH Actividad enzimática (UE/ml)

1 2.19 0.61 2 3.00 0.84 3 3.78 1.05 4 3.97 0.59 5 4.37 0.043 6 4.75 0.0062 7 5.35 0.00038 8 5.78 0.0051 9 6.24 0.0013 10 6.65 0.00019 11 6.92 0.0036 12 7.18 0.00076 13 7.35 0.00076 14 7.67 0.00068 15 7.81 0.00057 16 8.05 0.0007 17 8.40 0.0007 18 8.65 0.00017 19 9.0 0.00072 20 9.6 0.00019

Figura 20. Gel de poliacrilamida, después del primer electroenfoque. Carriles: 1 patrón de proteínas, 2-5 corresponden a las fracciones 1,2,3,4 obtenidas en el electroenfoque, presentan actividad tanasas, 6-9 corresponden a fracciones sin actividad enzimática.


56

De la misma forma que la actividad enzimática, la proteína se concentró en las cuatro primeras fracciones, la mayor concentración de proteína se encontró en la fracción 2. Durante éste primer paso de separación se eliminó un 65% de proteínas sin actividad tanasa.

Las fracciones que mostraron actividad enzimática, se usaron para realizar una

electroforesis con poliacrilamida 12.5%. Los resultados que se presentan en la Figura 20, nos llevaron a decidir usar solamente las fracciones de la 2 a la 4 para continuar las etapas de purificación, ya que en la primer fracción se podían observar bandas proteicas contaminantes de bajo peso molecular muy sobresalientes que no se encontraban en las fracciones de la 2 a la 4, donde se encontró la mayor actividad enzimática. b) Segunda etapa: Electroenfoque.

La Figura 21, muestra el perfil de proteínas determinado por el método de Bradford (1976) y la actividad enzimática, obtenidos durante el segundo electroenfoque.

Las fracciones de la 2 a la 4 con actividad tanasa se mezclaron, obteniendo un

volumen final de 10ml con 1.25 UE/ml. Con dicha mezcla se realizó un nuevo electroenfoque, en las mismas condiciones que el primero pero sin la adición de anfolitas. Durante éste análisis, el gradiente que se estableció con las anfolitas no fue completamente lineal, mostró valores casi constantes entre pH 4 y 5. Sin embargo se inició en un valor de pH 2 y se alcanzó un pH de 9 en las últimas fracciones. Esto se debió a que en estas fracciones existían solamente anfolitas en un rango de pH entre 2 y 5 ya que no se añadieron más anfolitas. Durante esta etapa se buscaba hacer un refraccionamiento de proteínas en un rango de pH más pequeño.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fracción

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a(U

E/m

l)

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5Pr

oteí

na (m

g/m

l)

Figura 21. Perfil de actividad enzimática (•), proteína (-) y gradiente de pH ( ), en las fracciones resultantes del segundo electroenfoque


57

La actividad enzimática se detectó nuevamente en un rango de pH entre 2 y 4, en las cuatro primeras fracciones, observando un máximo en la segunda fracción (1.27 UE/ml ), en este punto el valor de pH fue de 3.78, lo cual coincide con lo obtenido en el primer electroenfoque. De la misma forma las proteínas, se concentraron en estas cuatro fracciones.

c) Tercer etapa: Cromatografía de intercambio aniónico.

El intercambio iónico es una de los métodos cromatográficos más comúnmente usados en la purificación de proteínas. Este método involucra la adsorción de las proteínas a grupos cargados de un soporte sólido, seguida por su elución, fraccionamiento y colección, con una solución amortiguadora de alta fuerza iónica. Se usó esta técnica, debido a que en experimentos previos se había demostrado su utilidad para separar la tanasa aplicando un gradiente de NaCl entre 0 y 0.3M.

En la Figura 22, se observa el perfil de elución de proteínas, determinadas

espectrofotométricamente a 280 nm y la actividad enzimática. Se obtuvieron cuatro picos de proteína a lo largo del gradiente entre 0 y 0.3M de NaCl y un pico eluido con 1M de NaCl, usando un flujo de 0.5 ml/min. La actividad enzimática se encontró en 10 fracciones de 0.5 ml en el segundo y tercer pico de elución, con máximos (1.3 UE/ml) que eluyeron a una concentración de 0.12 y 0.13M de NaCl, respectivamente.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Fracción

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a(U

E/m

l)

0

0,25

0,5

Abs

(280

nm

)

Figura 21. Perfil de actividad enzimática (•), proteína (-) y gradiente de NaCl, en las fracciones obtenidas en columna de intercambio aniónico BioQ. Se observa el gradiente entre 0.- 0.3 M de NaCl desde el inicio del análisis hasta los 83 minutos y después se aplicó un flujo isocrático de 1M de NaCl de los 85 hasta los 90 minutos del análisis.


58

Las fracciones con actividad enzimática fueron usadas para realizar un gel de electroforesis con 12.5% de poliacrilamida, observando aproximadamente 5 bandas proteicas en las fracciones de la 29 a la 38 y un mayor número de bandas en las fracciones posteriores a ésta última, lo cual se debió probablemente a que los picos donde se detectó actividad enzimática no están perfectamente separados. Las 9 fracciones fueron mezcladas y utilizadas para continuar la purificación.

d) Cuarta etapa. Cromatografía de permeación en gel o tamizaje molecular.

La cromatografía de permeación en gel o tamizaje molecular es una forma de cromatografía de partición, usada para separar moléculas de diferentes tamaños. El principio de esta técnica consiste en la partición de las moléculas entre la fase móvil y la fase estacionaria de porosidad definida.

Las fracciones con actividad enzimática resultantes de la anterior etapa, se

concentraron tres veces y fueron inyectadas en columna de tamizaje molecular, obteniendo tres picos de proteína (Figura 23) determinada a 280 nm, siendo únicamente el primero el que presentó actividad enzimática.

0

0,2

0,4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Volumen de elución (ml)

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a

(U

E/m

l)

0

0,025

0,05

Abs

. (28

0 nm

)

Figura 23. Perfil de actividad enzimática (•), proteína (-) a 280 nm. La elución se llevo a cabo aplicando un flujo isocrático de solución amortiguadora de acetatos 0.1 M, pH5.5.

Dado que la actividad enzimática se encontró en un único pico simétrico, nos

sugería la posible pureza de la enzima. Por otro lado su tiempo de elución, 35 minutos a un flujo de 1 ml/min, puede constituir un indicio de que el peso molecular de la tanasa es


59

superior a 70 kD, debido a que la columna separa proteínas en rango de peso molecular entre 3 y 70 kD. Es lógico pensar que las proteínas de peso superior a 70 kD saldrán antes del primer volumen de la columna que son 60 ml a un flujo de 1ml/min, de esta forma las proteínas de 70 kD deberían eluir a los 60 minutos, mientras que las de menor tamaño tardaran mas de este tiempo en salir, ya que quedan retenidas en los poros de la columna. Este hecho solamente implica que el tamaño de la proteína es superior a 70 kD, sin embargo no permite saber el eso molecular exacto de la tanasa.

En la Figura 24, se presenta un gel de electroforesis con poliacrilamida, donde se colocaron las mezclas que mostraron actividad enzimática después de cada una de las etapas de purificación, manteniendo constantes la concentración de proteína y el volumen en cada una de las fracciones.

En el primer carril se tiene el patrón de proteínas; en el tercero el extracto enzimático dializado, donde se observa una gran variedad de proteínas; el siguiente carril corresponde a la fracción proteíca obtenida después del primer electroenfoque, con aproximadamente 9 bandas de proteína. La mezcla con actividad enzimática resultante de la cromatografia de intercambio aniónico se coloco en el carril 4, después de esta etapa se pueden ver solamente 4 bandas de tamaños muy distintos, 2 bandas de peso molecular superior a 66 kD, una de un peso entre 45 y 66 kD y una banda muy sobresaliente de menor tamaño, esta gran diferencia de tamaño entre las proteínas presentes permitió el uso de la filtración en gel como última etapa de purificación. En el ultimo carril se tiene la muestra purificada después de cuatro etapas, se detectaron dos bandas, acerca de esto se discutirá posteriormente.

Figura 24. Gel de electroforesis con poliacrilamida 12.5%, revelado con nitrato de plata: en cada carril se tiene lo siguiente: 1 patrón de proteínas, 2 extracto enzimático crudo, 3 mezcla después de primer electroenfoque, 4 mezcla después de cromatografía de intercambio aniónico, 5 proteína purificada, después de filtración en gel.

1 2 3 4 5


60

La Tabla 13, resumen los resultados durante las etapas del protocolo de purificación modificado (Protocolo II). La purificación se inició con una concentración de proteína de 0.76 mg/ml. Durante el primer electroenfoque la pérdida de proteína no fue tan grande como la que se tuvo durante el segundo electroenfoque, donde se perdió casi el 50% de proteína presente en el extracto, sin embargo la actividad enzimática específica se duplico obteniendo un factor de purificación de 4.8. Tabla 13. Etapas de purificación de la tanasa producida por Aspergillus niger en FMS. Etapa de purificación

Volumen (ml)

Proteína (mg/ml)

Actividad (U/ml)

Actividad total

Recuperación (%)

Actividad esp. (U/mg p.)

Factor de purifica-ción.

E.E. crudo 50 0.76 0.62 31.0 100 0.81 EE.dializado 51 0.74 0.82 41.81 100 1.1 M1 Electro-enfoque

10 0.69 1.25 12.50 40.32 1.84 2.2

M2 Electro-enfoque

10 0.37 1.27 12.70 40.96 3.43 4.3

M3 Intercam- bio aniónico.

10 0.33 1.30 13.00 41.93 3.92 4.8

Tamizaje molecular

5 0.02 0.97 4.80 15.50 48.50 59.9

EE=Extracto enzimático M=Mezcla de fracciones con actividad enzimática después de cada etapa de purificación.

Los porcentajes de recuperación durante estas etapas de electroenfoque (40.3% y 40.9%) fueron mayores a los reportados (Yamada et al, 1968; Rajakumar y Nandy, 1983 y Barthomeuf et al, 1994) y a lo obtenido en experimentos anteriores, sección 5.5.1. Los extractos obtenidos después del electroenfoque fueron dializados en solución amortiguadora de acetatos 0.1M pH 5.5, con el fin de eliminar las anfolitas, debido a que se demostró que estas causaban interferencia en la determinación de la actividad enzimática. Por otra parte con la diálisis también se logró llevar el extracto al pH adecuado para cuantificar la actividad enzimática, ya que este se encontraba en un rango de pH entre 2.8 y 4.

Después de la tercer etapa de purificación, se incrementó la actividad específica en menor proporción, obteniendo un valor de 3.92 UE/mg proteína. El incremento más importante de la actividad enzimática específica se obtuvo después de la última etapa de purificación, ya que esta alcanzo un incremento de 12 veces, con un factor de purificación de 59.9 y un porcentaje de recuperación de 15.5. Tanto el porcentaje de recuperación como el factor de recuperación son buenos comparados con los que se encontró en la literatura (Yamada et al, 1968; Rajakumar y Nandy, 1983 y Barthomeuf et al, 1994b).

Con las etapas de purificación aplicadas se logró purificar la enzima, sin embargo,

se obtuvo una concentración final de proteína baja, insuficiente para todos los experimentos


61

de caracterización. Para evitar este problema se debe iniciar la purificación con un volumen mayor de extracto enzimático y por tanto con una concentración mayor de proteína. Los resultados indican que se podría eliminar un de las etapas de purificación, debido a que el incremento de actividad enzimática que se obtuvo entre el segundo electroenfoque y la cromatografía de intercambio aniónico no fue muy significativo. 5.6. Caracterización. 5.6.1. Determinación del peso molecular.

Para determinar el peso molecular de la enzima se realizó un gel de electroforesis SDS, con 12.5% de poliacrilamida, según la técnica reportada por Lammeli en 1970.

En la Figura 25, se tiene el gel donde se corrió la muestra purificada junto con un

patrón de proteínas. Ya se tenían indicios de que su tamaño era superior a 70 kD. De acuerdo a los resultados obtenidos en el gel de electroforesis, los pesos moleculares de las dos bandas de tanasa correspondieron a 80 y 85 kD.

Figura 25. Gel de poliacrilamida, en el carril 1 se colocó un patrón, que contiene las siguientes proteínas: albumina bovina 66 kD, albumina de huevo 45 kD, pepsina 34.7 kD, tripsinógeno 24 kD, β-lactoglobulina 18.4 kD y lizozima 14.3 kD, en el carril 2 se tiene la muestra purifcada.


62

En el gel se obtuvieron dos bandas protéicas, esto nos llevo a plantear tres hipótesis: que las dos bandas correspondan a dos tanasas lo cual ya fue reportado por Beverini y Metche (1990); que se trate de una proteína dimérica o bien que solo una de las bandas corresponda a tanasa y la otra sea una proteína contaminante. Estos autores, usan una cromatografía de afinidad y logran la purificación de dos fracciones de tanasa - tanasa I y tanasa II. Un electroenfoque, posterior, muestra que ambas contienen aproximadamente siete isoenzimas con puntos isoeléctricos en un rango entre 3.5 y 4. En otro trabajo (Barthomeuf et al, 1994) encuentran resultados que corroboran, tanto lo reportado por Beverini y Metche en 1990, como lo observado en el presente trabajo. Los autores sostienen que aparentemente la enzima esta constituida por dos subunidades de idéntico peso molecular, ya que después de desglicosilar la tanasa realizan una cromatografía de filtración en gel, obteniendo un solo pico de 53 kDa. 5.6.2 Efecto de la temperatura.

Al evaluar la actividad enzimática en un rango de temperatura entre 30 y 80ºC, se encontró la actividad enzimática máxima a 70ºC, utilizando solución de ácido tánico (0.51 g/l) en solución amortiguadora de acetatos 0.1 M pH 5.0, como sustrato. Los resultados se muestran en la Figura 26.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

10 20 30 40 50 60 70 80 90

Temperatura (ºC)

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a(U

E/m

l)

Figura 26. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la tanasa.

La temperatura óptima para la enzima obtenida en este trabajo, fue diferente a la que reportan Lenkha y Lonsane en 1994, para tanasa producida por A. niger en fermentación en medio sólido (FMS). Ellos encontraron una temperatura óptima de 60ºC y a temperaturas superiores a esta, la actividad enzimática empezaba a decrecer rápidamente, contrariamente


63

a lo observado en el presente estudio, ya que la actividad decrece después de los 70ºC.

En cuanto a la tanasa producida en fermentación en medio líquido (FML), las temperaturas optimas para la acción de la enzima, reportadas por distintos autores muestran grandes diferencias. Para la tanasa de A. flavus obtuvieron la actividad enzimática máxima entre los 50 y 60 ºC, después de los 60 ºC la actividad enzimática decrecía rápidamente (Yamada et al, 1994). Barthomeuf et al, 1994 b, determinaron una temperatura optima de acción de la tanasa producida por A. níger de 35ºC, lo cual difiere ampliamente con el primer trabajo mencionado. Por otro lado, para la tanasa producida por otro tipo de microorganismos, Candida sp K-1, mostró tener una temperatura optima de actividad de 50ºC.

En lo que se refiere a la estabilidad de la enzima para la tanasa producida en FML,

la mayoría de los autores reportan que la enzima es estable en un rango de temperatura entre 20 y 45ºC, mientras que la enzima producida en FMS mostró ser mas estable en un rango entre 20 y 60 ºC (Lenkha y Lonsane, 1994). La diferencia en la estabilidad de la tanasa obtenida en FMS comparada con la producida en FML, podría deberse a que la enzima producida en FMS es completamente extracelular, ya que se ha reportado que la adición de carbohidratos a la molécula de proteína, durante el proceso de excreción de enzimas extracelulares a través de la pared celular, le confiere estabilidad a la estructura proteica y pos tanto a su sitio catalítico (Bull, 1972). Además las modificaciones estructurales durante la excreción han mostrado promover una barrera protectora contra la acción de varios agentes desnaturalizantes (Strumeyer y Malin, 1970). 5.6.3. Efecto del pH.

El efecto del pH sobre la actividad se observa en la Figura 27. La enzima mostró tener un pH óptimo de acción de 6.0. Este resultado coincide con el trabajo realizado por Lenkha y Lonsane (1994), ya que ellos reportan un pH óptimo de acción de la enzima de 5.5 para tanasa producida en FMS.

Tabla 14. Efecto de la soluciòn amortiguadora sobre la actividad enzimática. Valor de pH

Solución amortiguadora de citrato

Solución amortiguadora de acetatos

2 0.08 3 0.12 4 0.15 5 0.25 0.2 6 0.34 0.287 7 0.29 0.043

También se encontró que existe un efecto de la solución amortiguadora que se use para desarrollar la actividad enzimática, ya que al usar un amortiguador de citrato y un


64

amortiguador de acetatos, en los mismos valores de pH, se obtuvo mayor actividad con el primero. Debido probablemente a que establece condiciones más favorables para la actividad de la enzima, este efecto se puede observar en la Tabla 14.

0

0,2

0,4

0,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a(U

E/m

l)

Figura 27. Efecto del pH sobre la actividad enzimática de la tanasa.

El pH optimo de la actividad para la tanasa obtenida en FML con A. flavus fue reportado en un rango de pH entre 5.0 y 5.5 (Yamada et al, 1968). Barthomeuf et al, 1994b, obtienen un pH optimo de acción enzimática de 5.0 cuando se usa como sustrato metil galato y un pH de 6.0 cuando desarrollaron la reacción enzimática con ácido tanico. El pH optimo reportado para la tanasa de Candida sp K-1 fue de 6.0 (Auki et al, 1976)

Finalmente en cuanto a las aportaciones del presente trabajo, se debe tener en cuenta

que en la literatura, existen varios reportes a cerca de el aislamiento, purificación y propiedades de la tanasa producida por cepas de Aspergillus (Madhavakrishna y Bose, 1961; Haslam et al, 1961; Adachi et al, 1968, Iibuchi et al, 1968; Yamada et al, 1968; Barthomeuf et al, 1994), levaduras (Aoki et al, 1976) y plantas (Weber, 1969), en fermentación en medio líquido. Especialmente las tanasas fungicas de Aspergillus y Penicillium (Rajakumar y Nandy, 1983) han sido ampliamente investigadas en medio líquido (FML). Sin embargo, existe solamente un trabajo realizado por Lenkha y Lonsane en 1994, donde se reporta la producción, purificación parcial y caracterización de tanasa producida por A. niger en fermentación en medio sólido (FMS). El presente trabajo constituye un amplio estudio de la tanasa producida por A. niger en FMS, en el que se logro incrementar la actividad enzimática aumentando el nivel de inductor, se purifico la enzima 59.9 veces y se determinaron algunas características de la misma.


65

La tanasa es una enzima de extensivo uso en la manufactura de te instantáneo y en la obtención de ácido galico, este ultimo representa un importante sustrato para la síntesis química o enzimática del propil galato en la industria alimenticia y del trimetropin en la industria farmacéutica. Asimismo esta enzima tiene una gran cantidad de usos potenciales que no han sido comercialmente explotados debido al alto costo de la misma. Hasta el momento la enzima es producida exclusivamente por fermentación en medio líquido (Okamura y Yuasa, 1996; Okamura et al, 1987). La principal desventaja de este sistema de producción es que la enzima se encuentra fuertemente asociada al micelio, lo cual obliga a desarrollar técnicas sofisticadas y costosas para su aislamiento.

La fermentación en medio sólido es un proceso que ha sido ampliamente explotado

para la producción de numerosos enzimas fúngicas, con un gran número de ventajas sobre los procesos convencionales de fermentación en medio líquido (Nishio et al, 1974; Rao et al, 1983). A lo largo de este estudio se produjo tanasa en FMS con la ventaja de que la enzima mostró ser completamente extracelular, obteniendo un extracto enzimático muy concentrado usando como única etapa de aislamiento un proceso de prensado del bagazo de caña fermentado con el microorganismo. Con este estudio se corrobora lo previamente obtenido por Lenkha y Lonsane en 1994, en cuanto a que la enzima tanasa producida en FMS es completamente extracelular. El hecho de ser extracelular le confiere una serie de características ventajosas, tales como su gran estabilidad y termoresistencia, debidas probablemente a que durante el proceso de excreción la molécula proteica sufre ciertas modificaciones estructurales que constituyen una proteccion contra agentes desnaturalizantes, además de glicosilarse, lo cual le imparte estabilidad tanto a la estructura general de la proteína como a su sitio catalítico.

En lo que se refiere a las condiciones de producción de la enzima en FMS, se

demostró que la cepa N888 de A. níger, es capaz de crecer y tener actividad enzimática usando 10% de ácido tánico como inductor. En trabajos anteriores en FML, se había demostrado que la enzima es inducible (Doi et al, 1973; Beverini y Metche, 1990), sin embargo la máxima concentración de ácido tánico que había podido utilizarse para incrementar la actividad enzimática fue de 3%. En este trabajo, en FMS se pudieron usar concentraciones de hasta 20% de ácido tánico, debido probablemente a que las condiciones de este sistema de cultivo reducen la represión catabólica. Con 10% de ácido tánico como inductor se incremento cinco veces la actividad enzimática máxima comparada con la obtenida con 1% de ácido tánico. Estos resultados deben ser evaluados cuidadosamente debido a que Chatterjee et al, 1996, reportan un estudio de la optimización de la producción de tanasa en FMS usando una cepa de Rhizopus oryzae, donde al evaluar varios niveles de ácido tánico como inductor, 1.5, 2, 2.5, 4 y 6%, observan que se obtiene el máximo de actividad usando 2.5% de ácido tánico y con concentraciones superiores del ácido la actividad enzimática comienza a decrecer. La diferencia en los resultados obtenidos por estos autores y el presente trabajo, puede deberse a que las cepas de Aspergillus son mas resistentes el efecto toxico de los taninos o bien a que se usaron distintas condiciones de cultivo.


66

En la Tabla 15, se comparan las características reportadas por distintos autores para la tanasa con las características de esta enzima producida por A. níger, N888, en FMS, con 10% de ácido tánico como inductor, purificada y caracterizada a lo largo del presente trabajo.

En los primeros trabajos realizados con la tanasa en fermentación en medio liquido

no se reportan datos a cerca del pI, posteriormente Beverini y Metche en 1990, purifican la tanasa de A. orizae, separando dos isoenzimas por cromatografía de afinidad gracias a sus distintas especificidades por metil galato o ácido tánico, al realizar un electroenfoque encuentran que las dos fracciones tienen puntos isoeléctricos en valores de 3.5 y 4.0, no reportan otras características como peso moleculares o temperaturas y pHs óptimos de actividad de las enzimas. Barthomeuf et al, 1994 b, encuentran tambien en FML un pI de 3.8, distinto al observado en este trabajo que fue de 4.3. Por otro lado se determino que el peso molecular de la tanasa obtenida en FMS es de 80 kDa, mientras que en otros trabajos, Adachi et al , 1968 y Barthomeuf et al, 1994 b, reportan pesos moleculares superiores de 194 y 186 kDa, respectivamente.

Tabla 15. Características de la tanasa producida por A. níger en FMS. Fermentación en medio liquido Fermentación en medio

sólido Características Microorganismo

A. flavus (1)

Candida sp K-1 (2)

A. orizae (3)

A. níger (4)

A. níger (5) A. níger (6)

Pto. isoelectrico --- --- 3.5-4.0 4.3 --- 3.8 Peso molecular 194 kDa --- --- 186 kDa --- 80-85 kDa

pH optimo 5.0-5.5 6.0 --- 6.0 5.5 6.0 T optima 50-60ºC 50ºC --- 35ºC 60ºC 70ºC

Nota: (1) Adachi et al, 1968; (2) Aoki et al, 1976; (3) Beverini y Metche, 1990; (4) Barthomeuf et al, 1994 b; (5) Lenkha y Lonsane, 1994; (6) Datos obtenidos durante el presente estudio. Al compara nuestros resultados con los obtenidos por Lenkha y Lonsane, 1994, en FMS. Estos autores no aportan datos específicos de la enzima, debido a que no realizaron la purificación de la misma, solamente llevaron a cabo una serie de precipitaciones sucesivas que les permitieron obtener características de estabilidad de la enzima en cuanto a temperatura y pH para compararla con la tanasa producida en FML. La tanasa obtenida durante el presente trabajo también mostró ser muy termoresistente, con un pH optimo similar al obtenido por estos autores.

Conclusiones

67

6. CONCLUSIONES GENERALES. 1. Se demostró que el método mas sensible y confiable para cuantificar actividad tanasa,

con solamente un 4% de error fue el método cromatográfico comparado con la técnica espectrofotométrica y de descenso de pH. Las condiciones más adecuadas para el análisis de HPLC resultaron ser: Una fase móvil de ácido fórmico (1%) y metanol, en proporción 95:5, respectivamente, flujo isocratico de 2ml/min.

2. Las cepas de Aspergillus niger, evaluadas, fueron capaces de crecer y producir tanasa en

fermentación en medio sólido (FMS). 3. La cepa mas adecuada para el presente trabajo fue la cepa N888 de A. niger, por su

capacidad de crecer en concentraciones de hasta 20% de ácido tánico. 4. La actividad enzimática obtenida con la cepa N888 de A. niger, se incrementó cinco

veces, usando 10% de ácido tánico como inductor y los componentes del medio de cultivo incrementados cinco veces, en comparación con lo obtenido al usar 1% de éste ácido.

5. La actividad enzimática obtenida con A. niger, N888, en FMS, no se encontró asociada

al micelio del hongo. 6. El protocolo de purificación modificado (Protocolo II) mostró ser mas efectivo para la

purificación de la tanasa, ya que se demostró que al aplicarlo se obtienen mayores incrementos en la actividad específica y porcentajes de recuperación superiores a los obtenidos al aplicar el protocolo inicial de purificación (Protocolo I).

7. La tanasa producida por A. niger, N888, en FMS con 10% de ácido tánico como

inductor fue purificada 59.9 veces, con un porcentaje de recuperación de 15.5%, después de cuatro etapas de purificación.

8. El punto isoeléctrico (pI) de la tanasa producida por A. niger, N888, en FMS fue de 3.8. 9. El peso molecular de la enzima fue de 80,000-85,000 Daltons. 10.La temperatura óptima de actividad enzimática fue de 70 ºC y se encontró un pH óptimo

de actividad de 6.0.

Referencias

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“PRODUCCION, PURIFICACION Y CARACTERIZACION