PERBEDAAN HITUNG LIMFOSIT PADA MENCIT BALB/C MODEL SEPSIS PAPARAN LIPOPOLISAKARIDA

DENGAN CECAL INOCULUM

SKRIPSI

Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran

Agri Vina Brahmantiani Suryono G 0005041

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET

Surakarta 2009

PERNYATAAN

Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah

diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan

sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah

ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam

naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, Mei 2009

AGRI VINA BRAHMANTIANI SURYONO

NIM. G0005041

ABSTRAK

Agri Vina B. S., G0005041, 2009. Perbedaan Hitung Limfosit pada Mencit Balb/C Model Sepsis Paparan Lipopolisakarida dengan Cecal Inoculum, Fakultas Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Sepsis adalah keadaan patologis yang dapat menyebabkan kematian, hal tersebut terjadi karena pada sepsis fase lanjut terjadi penurunan imunitas terutama disebabkan oleh karena apoptosis limfosit. Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendapatkan patofisiologi sepsis yang menyerupai sepsis yang sebenarnya pada manusia dan lebih terjangkau, salah satunya adalah bacterial peritonitis.

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan post test only control group design. Hewan uji mencit Balb/C jantan yang dibagi kelompok K sebagai kontrol, kelompok L diberikan paparan LPS intraperitonial, kelompok C diberi cecal inoculum intraperitonial. Hitung limfosit darah tepi menggunakan metode hitung jenis tiap 100 sel darah. Data yang diperoleh dianalisis dengan One Way ANOVA dilanjutkan Post Hoc Test dengan Least Significant Difference (LSD), menggunakan program SPSS for Windows Release 15.0

Hasil penelitian menunjukkan limfosit tiap seratus sel pada kelompok K 89,7±4,6, kelompok L 88,2±2,6, dan kelompok C 68,7±10,6. Dengan Post Hoc Test didapatkan perbedaan yang bermakna antara hitung limfosit kelompok K dengan kelompok C (p=0,000) dan kelompok L dengan C (p=0,003). Sedangkan hitung limfosit kelompok K dengan L perbedaannya tidak bermakna (p=0,114).

Dari hasil penelitian ini disimpulkan bahwa terdapat perbedaan hitung limfosit pada mencit balb/c antara paparan LPS dengan cecal inoculum. Kata kunci : sepsis, LPS, cecal inoculum, limfosit

ABSTRACT

Agri Vina B. S., G0005041, 2009. The difference of lymphocyte count in Balb/C Mice Sepsis Models Inducted by Lipopolysaccharide with Cecal Inoculum, Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta.

Sepsis is a pathological condition that can cause death, that’s can happen because in further phase occur immunity reduction in main cause of lymphocyte apoptosis. A variety of experimental has been done to get the sepsis pathophysiology that closely the true sepsis in human and more achievable, one of them is bacterial peritonitis.

This was a laboratory experimental with post test only control group design. We used Balb/C mice, they were divided in K group as control group, L group inducted by LPS intaperitonial, C group inducted by cecal inoculum intaperitonial. Lymphocyte counting with blood kind method every one hundred blood cells. The data was analyzed with One Way ANOVA method continued by Post Hoc Test with Least Significant Difference (LSD), used SPSS for Windows Release 15.0 program.

The data showed that rate every one hundred blood cells of K group was 89,7±4,6, L group was 88,2±2,6, and C group was 68,7±10,6. With Post Hoc Test we got result there were significant difference of lymphocyte count between K group and C group (p=0,000), and L group and C group (p=0,003). The difference of lymphocyte count between K group and L group was not significant (p=0,114).

From this experiment we conclude that there were a difference lymphocyte count in balb/c mice inducted by lipopolysaccharide with cecal inoculum. Key words : sepsis, LPS, cecal inoculum, lymphocyte

PRAKATA

Dengan mengucap Alhamdulillahirobbil’alamin kehadirat Alloh SWT, atas izin dan ridho-Nya skripsi dengan judul “Perbedaan Hitung Limfosit pada Mencit Balb/C Model Sepsis Paparan LPS (Lipopolisakarida) dengan Cecal Inoculum” telah terselesai.

Dalam pelaksanaan menyusun skripsi ini penulis tidak terlepas dari berbagai hambatan dan kesulitan. Namun berkat bimbingan dan bantuan berbagai pihak, penulis dapat menyelesaikannya. Untuk itu penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:. 1. Prof. Dr. A.A. Subijanto, dr., MS, selaku Dekan Fakultas Kedokteran

Universitas Sebelas Maret, Surakarta. 2. Sri Wahjono, dr., MKes, selaku Ketua Tim Skripsi FK UNS. 3. Sri Sutati, Dra., Apt., SU. Pembimbing Utama yang dengan penuh kesabaran

meluangkan waktunya, bimbingan, saran, koreksi dan nasehat kepada penulis. 4. Sarsono, Drs., M Si selaku Pembimbing Pendamping yang telah memberikan

saran, bimbingan, dan koreksi kepada penulis. 5. Diding Heri Prasetyo dr., MSi selaku Penguji Utama yang telah berkenan

menguji sekaligus memberikan saran dan juga koreksi bagi penulis. 6. Ipop Syarifah, Dra., MSi selaku Penguji Pendamping yang telah berkenan

menguji dan memberikan saran yang berarti bagi penulisan skripsi ini. 7. Semua pihak yang tidak dapat penulis tulis satu persatu, atas doa, saran, dan

dukungan yang telah diberikan.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu kedokteran pada khususnya dan masyarakat pada umumnya.

Surakarta, Mei 2009

Penulis

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .........................................................................................vi

DAFTAR ISI .......................................................................................................vii

DAFTAR TABEL ............................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xi

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................1

A. Latar Belakang Masalah ....................................................................1

B. Perumusan Masalah .......................................................................... 3

C. Tujuan Penelitian .............................................................................. 3

D. Manfaat Penelitian ............................................................................ 3

BAB II LANDASAN TEORI ............................................................................. 4

A. Tinjauan Pustaka ............................................................................... 4

B. Kerangka Pemikiran ..........................................................................12

C. Hipotesis ............................................................................................14

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ............................................................15

A. Jenis Penelitian ..................................................................................15

B. Lokasi Penelitian ............................................................................... 15

C. Subjek Penelitian ...............................................................................15

D. Teknik Sampling ............................................................................... 15

E. Variabel Penelitian ............................................................................ 15

F. Skala Variabel ................................................................................... 16

G. Definisi Operasional ..........................................................................16

H. Rancangan Penelitian ........................................................................ 18

I. Instrumentasi Penelitian .................................................................... 18

J. Cara Kerja ......................................................................................... 19

K. Alur Penelitian .................................................................................. 20

L. Analisis Data...................................................................................... 20

BAB IV HASIL PENELITIAN .......................................................................... 21

A. Data Hasil Penelitian .......................................................................... 21

B. Analisis Data ...................................................................................... 24

BAB V PEMBAHASAN .................................................................................... 26

BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 29

A. Simpulan ........................................................................................ 29

B. Saran ................................................................................................... 29

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 30

LAMPIRAN

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Rata–rata hitung limfosit darah tepi mencit setelah perlakuan

Tabel 2 Analisis Statistik Antar Kelompok Perlakuan

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Skema kerangka pemikiran konseptual

Gambar 2 Skema rancangan penelitian

Gambar 3 Skema alur penelitian

Gambar 4 Histogram rata-rata hitung limfosit dengan kelompok perlakuan

Gambar 5 Pengamatan mikroskopis limfosit masing-masing kelompok

perlakuan

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran A Jadwal penelitian

Lampiran B Foto alat dan bahan penelitian

Lampiran C Foto kegiatan penelitian

Lampiran D Hasil Uji Analisis One Way Anova dan Post Hoc Test dengan

Program SPSS For Windows Release 15.0

Lampiran E Hasil Laboratorium Hitung Limfosit

Lampiran F Hasil Penghitungan Jumlah Limfosit Tiap Seratus Sel

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Sepsis adalah suatu sindroma klinik yang terjadi oleh karena adanya

respon tubuh yang berlebihan terhadap rangsangan produk mikroorganisme

(Guntur, 2007). Sepsis merupakan penyebab utama kematian di dunia, dan

sebagai penyebab kematian di intensive care unit (ICU). Diperkirakan sekitar

1.400 pasian meninggal di ICU karena sepsis (Poeze et al, 2004). Di Amerika,

menunjukkan angka kejadian sepsis berat sekitar 0,3 % atau mendekati

750.000 kasus setiap tahunnya, dengan angka kematian sampai 26% (Balk,

2000; Angus et al., 2001). Sedangkan di Indonesia melalui sebuah penelitian

yang dilakukan Rumah Sakit Umum Daerah (RSUD) Dr.Moewardi Surakarta,

ditemukan bahwa 130 (97%) dari 135 pasien sepsis dengan syok sepsis

meninggal (Guntur, 2006a).

Produk yang berperan penting terhadap sepsis adalah lipopolisakarida

(LPS). LPS atau endotoksin glikoprotein kompleks merupakan komponen

utama membran luar dari bakteri gram negatif (Guntur, 2008). Bakteri gram

negatif (terutama Escherichia coli, Klebsiella species, Pseudomonas

aeruginosa) dan kokus gram positif (terutama staphylococcus dan

streptococcus) adalah mikroba yang paling banyak terisolasi dari pasien sepsis

dan syok sepsis. Fungi, paling banyak Candida, hanya 5% dari seluruh kasus

sepsis (Bochud dan Calandra, 2003).

Secara alami tubuh memiliki sistem imun yang mempunyai kemampuan

untuk menetralisir dan menginaktivasi molekul asing (molekul yang

dipresentasikan oleh virus, bakteri, dan parasit) dan untuk menghancurkan

mikroorganisme atau sel asing (sel yang diinfeksi virus, sel pada transplantasi

organ, dan sel kanker). Sel imun diedarkan di tubuh pada darah, limpa, epitel,

dan jaringan pengikat. Sel yang ikut dalam respon imun adalah limfosit, sel

plasma, sel mast, neutrofil, eosinofil, dan sel yang berperan pada fagositosis

(Luiz dan Jose, 2005). Limfosit yang merupakan 20% dari semua leukosit

dalam sirkulasi darah orang dewasa terdiri limfosit T dan limfosit B,

merupakan pengontrol sistem imun (Guntur, 2008). Proses patologik yang

utama pada sepsis adalah apoptosis dari sel-sel efektor imunologi, termasuk

limfosit (Chang et al., 2007).

Berbagai model penelitian sepsis telah dikembangkan untuk meneliti dan

mencari patofisiologi sepsis serta mencari penanganan dan pengobatan yang

sesuai. Model-model penelitian sepsis pada hewan coba ada beberapa macam

diantaranya endotoxicosis model, infus live bacteria intravaskuler, bacterial

peritonitis, peritonitis models, cecal ligation and perforation, soft tissue

infection, pneumonia model, dan meningitis model. Model penelitian sepsis

biasanya menggunakan LPS yang dapat menstimulasi berbagai macam

mediator inflamasi, dan bertanggungjawab terhadap awal mula terjadinya

proses sepsis (Alejandra el al., 2004). Namun demikian, penelitian ini

membutuhkan biaya yang relatif mahal (sekitar Rp 2.000.000,00) selain itu

paparan ini hanya menunjukkan reaksi terhadap monomikrobial saja.

Model sepsis yang lain menggunakan bahan fecal atau kultur yang

dimasukkan ke dalam kavitas peritonial (Alejandra el al., 2004). Dari

inoculum ini didapat strain Eschericia coli (E. coli) yang bercampur dengan

material cecal yang lain untuk meniru peritonitis pada manusia (Edwin, 2005).

Cecal inoculum yaitu dengan injeksi material cecal secara intraperitoneal

(Chopra dan Sharma, 2007) yang diperoleh dari isi cecal mencit donor (Ren et

al., 2001). Cecal inoculum ini termasuk peritonitis models. Model ini jauh

lebih murah dibandingkan dengan model LPS, selain itu lebih mendekati

terjadinya sepsis yang sebenarnya pada manusia yang tidak hanya diakibatkan

oleh monomikrobia saja tetepi oleh polimikrobia.

B. Perumusan Masalah

Adakah perbedaan hitung limfosit pada mencit Balb/C model sepsis

paparan LPS dengan Cecal Inoculum?

C. Tujuan penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan hitung limfosit

pada mencit Balb/C model sepsis paparan LPS dengan Cecal Inoculum.

D. Manfaat Penelitian

1. Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai bahan

pertimbangan model-model sepsis dalam hewan coba.

2. Praktis

Penelitian ini dapat digunakan sebagai bahan rujukan untuk

penelitian sepsis lebih lanjut.

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Sepsis

Sepsis adalah suatu sindroma klinik sebagai manifestasi proses

inflamasi imunologik yang terjadi karena adanya respon tubuh (imunitas)

yang berlebihan terhadap rangsangan produk mikroorganisme. Manifestasi

klinis yang berupa inflamasi sistemik disebut sistemic inflammation

response syndrome (SIRS). Sesuai dengan pendapat Thijs (1998)

menyatakan bahwa sepsis adalah SIRS dengan dugaan infeksi tersebut

ditandai dengan takipneu (frekuensi respirasi lebih dari 20 kali/menit),

takikardi (frekuensi jantung lebih dari 100 kali/menit), hiperthermia atau

hipothermia (temperature axilar tubuh lebih dari 101 derajat F/38.3 derajat

C atau 96.1 derajat F/35.6 derajat C), leukositosis (>12.000/mm),

leukopenia (<4000/mm) dengan atau tanpa ditemukannya bakteri dalam

darah (Guntur, 2007).

Berdasarkan sindroma klinis tersebut sepsis dibedakan menjadi 5

derajat, yaitu:

a. Systemic Inflammatory Responds Syndrome (SIRS), ditandai dengan

≥2 gejala sbb:

1) Hiperthermia/Hipothermia (>38,3° C/< 35,6° C)

2) Takipneu ( frekuensi respirasi >20 menit)

3) Takikardi ( frekuensi jantung >100/menit)

4) Leukositosis > 12.000/mm atau Leukopenia <4000/mm

5) Leukosit lebih dari 10% imatur

b. Sepsis

Gejala SIRS disertai infeksi

c. Sepsis berat

Sepsis disertai disfungsi organ multipel (MODS)/gagal organ multipel

(MOF), hipotensi, oligouri bahkan anuria

d. Sepsis dengan hipotensi

Sepsis dengan hipotensi (tekanan sistolik < 90 mmHg atau penurunan

tekanan tekanan sistolik > 40 mmHg)

e. Syok sepsis

Syok sepsis adalah subset dari sepsis berat, yang didefinisikan sebagai

hipotensi yang diinduksi sepsis dan menetap kendati telah mendapat

resusitasi cairan disertai hipoperfusi jaringan

(Guntur, 2008).

Reaksi tubuh sebagai tanggapan terhadap mikroorganisme

penginfeksi melibatkan bermacam-macam komponen sistem imun baik

yang bersifat proinflamasi maupun antiinflamasi (Guntur, 2006a).

Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) adalah protein yang

berperan pada system imun nonspesifik, yang akan membawa LPS ke

reseptor CD14 pada sel monosit-makrofag (Shahin, et al., 2006). Ikatan

LPS-LBP kompleks kemudian menuju CD14 reseptor di permukaan

seluler dan berinteraksi dengan toll-like receptor 4 (TLR4) untuk

menginduksi nuclear factor κ-B (NFκ-B) sebagai sinyal dan transkripsi

sitokin proinflamasi (Hongwei et al., 2005; Kristine et al., 2007).

Termasuk sitokin proinflamasi antara lain TNF, IL-1, IL-6 dan Interferon,

yang bekerja membantu sel untuk menghancurkan mikroorganisme yang

menginfeksi. Sedang sitokin antiinflamasi adalah interleukin 1 reseptor

antagonis, IL-4, IL-10 yang bertugas memodulasi koordinasi atau represi

terhadap respon yang berlebihan (Guntur, 2006b). Produksi yang

berlebihan sitokin inflamasi menyebabkan aktivasi respon sistemik berupa

Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS) terutama pada paru-

paru, hati, ginjal, usus dan organ lainnya (Arul, 2001) yang mempengaruhi

permeabilitas vaskuler, fungsi jantung dan menginduksi perubahan

metabolik menyebabkan nekrosis jaringan, multiple organ failure (MOF)

serta kematian (Elena et al., 2006; Javier et al., 2005; Arul, 2001).

2. Lipopolisakarida

Lipopolisakarida adalah penyusun utama membran terluar dari

bakteri gram negatif. LPS merupakan komponen penting pada dinding sel

dan digunakan untuk viabilitas bakteri. LPS tidak bersifat toksik jika

masih sebagai bagian dari membran terluar dari bakteri, tetapi setelah

lepas dari dinding sel menjadi bersifat toksik, lipid A yang dikenali oleh

sistem imun yang menyebabkan timbulnya respon inflamasi (Edwin et al.,

2003). Produk yang berperan penting terhadap sepsis terutama kandungan

lipid A dalam LPS tersebut. LPS atau endotoksin glikoprotein kompleks

merupakan komponen utama membran terluar dari bakteri gram negatif

(Guntur, 2006a). LPS bersifat stabil terhadap panas, mempunyai berat

molekul antara 3000 dan 5000 (lipooligosakarida) sampai beberapa juta

(lipopolisakarida). Dalam aliran darah LPS akan terikat pada protein yang

bersirkulasi kemudian berinteraksi dengan reseptor makrofag, limfosit dan

monosit serta sel lain pada sistem retikuloendotelial. Hal ini akan

mengakibatkan pelepasan sitokin dan pengaktifan jalur komplemen dan

koagulasi. Runtutan peristiwa tersebut dapat diamati secara klinis sebagai

demam, leukopenia, hipoglikemia, hipotensi, syok, koagulasi

interavaskuler hingga kematian karena disfungsi organ (Brooks et al.,

2003).

3. Cecal Inoculum

Inoculum merupakan bahan yang dipakai dalam inokulasi. Inokulasi

(inoculation) adalah pemasukan mikroorganisme, bahan infektif, serum,

dan substansi lain ke dalam jaringan organisme hidup atau media biakan;

pemasukan agen penyakit ke dalam individu sehat untuk menimbulkan

bentuk ringan penyakit tersebut yang menimbulkan imunitas. Cecum

adalah bagian pertama dari usus besar, membentuk kantong yang secara

distal melebar ke ileum dan proksimal ke arah kolon, serta melepaskan

apendiks vermiformis (Dorland, 2002). Model sepsis ini dibuat dari cecal

inoculum diperoleh dari isi cecal mencit donor (Ren et al., 2001) yang

dimasukkan ke dalam kavitas peritonial (Alejandra et al., 2004). Dari

model inoculum ini didapat strain Eschericia coli (E. coli) yang bercampur

dengan material cecal yang lain untuk meniru peritonitis pada manusia

(Edwin, 2005).

4. Limfosit

Limfosit merupakan 20% sampai 25% dari leukosit total yang

bersirkulasi. Pada darah tepi bentuknya bulat, tapi saat bermigrasi ke

jaringan bentuknya pleomorfik. Limfosit mempunyai ukuran yang lebih

besar dibandingkan eritrosit dan memiliki sedikit lekukan, inti sel bulat

yang hampir memenuhi sel. Sitoplasma berwarna biru terang dan

mengandung beberapa granula azurofilik (Leslie dan James, 2007). Umur

limfosit bervariasi ada yang hanya berumur beberapa hari tetapi ada juga

yang hidup dalam sirkulasi darah sampai berumur beberapa tahun (Luiz

dan Jose, 2005).

Limfosit berkembang pada jaringan limfoid di dalam tubuh yaitu

pada limfonodus, limpa, dan folikel limfatik pada sumsum tulang.

Maturasi limfosit dibagi dalam 3 tahapan yaitu :

a. Limfoblas mempunyai diameter bervariasi dari 10-20µm,

mempunyai intisel yang bulat dengan besar ±80% dari selnya.

Kromatin jelas dan terdiri dari 2 anak inti. Sitoplasma basofilik

dan agranular.

b. Prolimfosit mempunyai diameter bervariasi dari 10-18µm, intisel

bulat, lebih terang, dan sitoplasma lebih banyak dibandingkan

limfoblas

c. Limfosit (Gillian, 1996)

Secara fungsional limfosit dibedakan menjadi tiga jenis yaitu:

a. Limfosit B

b. Limfosit T

c. Sel null

Meskipun secara morfologi tidak dapat dibedakan satu dengan yang

lainnya, jenis sel limfosit tersebut dapat dikenali secara

immunocytochemically dengan membedakannya menurut petanda pada

permukaannya. Kira-kira 80% yang bersirkulasi adalah sel T, 15% adalah

sel B, dan sisanya adalah sel null. Umur limfosit T bisa hidup selama

beberapa tahun, sedangkan sel B dapat mati dalam beberapa bulan (Leslie

dan James, 2007). Pada manusia limfosit B dimatangkan di sumsum

tulang, sedangkan limfosit T pada timus. Secara umum sel B befungsi

untuk sistem imun humoral, sedangkan sel T bertanggungjawab untuk

sistem imun seluler (Stuart, 2002).

Limfosit T mempunyai 3 kelompok :

a. Sel T Pembantu (Th)

Berperan sebagai pengatur utama bagi seluruh fungsi imun,

melalui serangkain mediator protein yang disebut limfokin. Limfokin

penting yang disekresikan oleh sel-sel T pembantu antara lain IL-2, IL-

3, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-γ dan GM-CSFfaktor perangsang koloni

monosit-granulosit (Guyton and Hall, 1997).Mengeliminasi agen asing

melalui aktivasi sel-sel fagositer seperti makrofag dan menyekresikan

mediator inflamasi (Abbas and Litchman, 2005).

b. Sel T Sitotoksik (Tc)

Merupakan sel penyerang langsung yang mampu membunuh

mikroorganisme dan, pada suatu saat, bahkan membunuh sel-sel tubuh

sendiri melalui sebuah mekanisme sekresi protein pembentuk lubang

pada membran sel yang diserang yang disebut perforin. Hal ini

menyebabkan gangguan keseimbangan sel disertai pula oleh substansi

sitotoksik dari sel T tersebut, sehingga dengan segera sel yang diserang

membengkak dan larut (Guyton and Hall, 1997; Abbas and Litchman,

2005).

c. Sel T Supresor (Ts)

Merupakan sel T yang mempunyai kemampuan menekan fungsi

sel T sitotoksik dan sel T pembantu. Fungsi supresor ini menyebabkan

pengaturan aktivitas sel-sel lain dan menjaganya agar tidak berlebihan

dan menimbulkan kerusakan jaringan tubuh, yang disebut toleransi

imun (Guyton dan Hall, 1997).

Limfosit B bertanggung jawab dalam sintesis antibodi yang

bersirkulasi dan dikenal juga dengan nama imunoglobulin. Imunoglobulin

plasma terutama disintesis di dalam sel plasma. Sel plasma merupakan sel

khusus turunan sel B yang mensintesis dan mensekresikan imunoglobulin

ke dalam plasma sebagai respon terhadap pajanan berbagai macam antigen

(Robert dkk, 2003;Guyton dan Hall, 1997).

Terdapat lima golongan umum imunoglobulin yaitu IgA, IgG, IgM,

IgD, IgE. Dua golongan imunoglobulin terpenting adalah IgG yang

merupakan antibodi bivalen dan kira-kira 75% dari seluruh antibodi pada

orang normal, dan IgE yang merupakan antibodi dalam jumlah kecil,

khususnya terlibat dalam peristiwa alergi (Robert dkk, 2003).

Sedang imunoglobulin yang berperan penting dalam imunitas

mukosa adalah IgA (Abbas dan Litchman, 2005). IgA merupakan

pertahanan garis depan terhadap bakteri dan virus (Stryer, 2000). IgA

diproduksi di jaringan limfoid mukosa dan disekresikan melalui epitel

mukosa ke dalam lumen. IgA akan mengikat mikroba dan toksin yang

terdapat dilumen dan menetralisasinya melalui hambatan jalur masuk ke

host (Abbas dan Litchman, 2005).

Keterangan :

: Merangsang

↑↑ : Jumlah meningkat

↓↓ : Jumlah menurun

B. Kerangka Pemikiran

1. Kerangka Berpikir Konseptual

Gambar 1. Skema Kerangka Pemikiran Konseptual

Hiperinflamasi

Limfosit

Lipopolisakarida

Antigen Presenting

Cell

Respon

Proinflamasi ↑↑

Respon

Anti-inflamasi

Systemic Inflamatory Response Sindrome (SIRS)

Sepsis

Apoptosis

Limfosit ↓↓

Cecal Inoculum

Sitokin

2. Kerangka Berpikir Teoritis

Masuknya mikroorganisme penginfeksi ke dalam tubuh akan

difagosit oleh makrofag kemudian akan ditampilkan sebagai Antigen

Presenting Cell (APC). Eksotoksin, virus, dan parasit berperan sebagai

superantigen (Guntur, 2006b), superantigen adalah molekul yang sangat

poten terhadap mitogen sel T (Diding, 2005), akan difagosit oleh monosit

atau makrofag yang berperan sebagai Antigen Processing Cell dan

kemudian ditampilkan dalam APC. APC tersebut memproduksi dan

melepas sitokin yang merangsang limfosit T untuk berproliferasi dan

berdeferensiasi. Antigen ini membawa muatan polipeptida spesifik yang

berasal dari Major Histocompatibility Complex (MHC). Antigen yang

bermuatan peptida MHC kelas II akan berikatan dengan CD4+ (limfosit

Th1 dan Th2) dengan perantaraan TCR (T Cell Receptor), kemudian akan

berfungsi sebagai imunomodulator dan berfungsi untuk mengekpresikan

sitokin proinflamatori yang akan menyebabkan inflamasi sebagai

tanggapan imunitas tubuh terhadap berbagai macam stimulasi imunogen

dari luar dan sitokin anti inflamasi. Apabila terjadi ketidakseimbangan

antara kedua jenis sitokin tersebut dimana sitokin proinflamasi lebih

dominan maka akan terjadi hiperinflamasi. Manifestasi klinis yang berupa

inflamasi sistemik disebut SIRS dan sesuai dengan pendapat bahwa sepsis

adalah SIRS dengan dugaan infeksi.

Pada sepsis limfosit merupakan inti dari sei imun spesifik dan secara

cepat akan bereaksi terhadap rangsangan sitokin dan stimulasi antigen

spesifik. Secara normal apoptosis limfosit adalah sebuah proses untuk

menghilangkan autoreaktif limfosit atau menekan aktivasinya. Apoptosis

merupakan proses penting dimana sel-sel akan dimusnahkan dalam rangka

mengontrol untuk meminimalisir kerusakan jaringan yang diakibatkan

reaksi yang berlebihan (Wesche et al., 2005) sehingga pada sepsis akan

terjadi penurunan limfosit.

C. Hipotesis

Terdapat perbedaan hitung limfosit pada mencit Balb/C model sepsis

paparan LPS dengan cecal inoculum.

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorik dengan post test only

control group design.

B. Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran

Universitas Sebelas Maret Surakarta.

C. Subjek Penelitian

Subjek penelitian berupa 18 ekor mencit Balb/C jantan dengan berat

badan + 20-32 gram, dan berumur 4-6 minggu. Mencit Balb/C diperoleh dari

Universitas Setia Budi, Mojosongo, Surakarta. Bahan makanan mencit

digunakan pakan mencit BR I.

D. Teknik Sampling

Untuk pengambilan sampel digunakan teknik incidental sampling.

E. Variabel Penelitian

1. Variabel Bebas : LPS dan cecal inoculum

2. Variabel Terikat : Hitung limfosit

3. Variabel luar

a. Dapat dikendalikan : Genetik, berat badan, makanan, umur

b. Tidak dapat dikendalikan : Variasi kepekaan mencit terhadap suatu

zat

F. Skala Variabel

Hitung limfosit : skala rasio

Sepsis paparan LPS : skala nominal

Sepsis paparan Cecal inoculum : skala nominal

G. Definisi Operasional

1. Model sepsis

Mencit model sepsis dibuat dengan metode injeksi LPS dan cecal

inoculum secara peritonial.

a. LPS yang digunakan : LPS diperoleh dari Sigma Aldrich

(Deisenhofen, Germany) dengan dosis 0,1 mg/mencit secara

intraperitonial (Wang et al., 2006; Krutzel et al., 2002).

b. Cecal inoculum yang digunakan : Cecal inoculum dibuat setiap hari

dari mencit donor dengan mensuspensikan 200 mg material cecal pada

5 mL dekstrose water 5% (Ren et al., 2002) kemudian diinjeksikan

masing-masing 4 mg/mencit secara intraperitonial (Brahmbhatt et al.,

2005; Chopra dan Sharma., 2007).

2. Hitung Jumlah Sel Limfosit

Darah mencit diambil dari ekor mencit, dibuat apusan darah pada

obyek glass, kemudian diberi pulasan Giemsa yang sebelumnya sudah

difiksasi terlebih dahulu dengan metilalkohol. Leukosit terdiri dari basofil,

eosinofil, netrofil, limfosit, dan monosit. Menghitung jumlah sel limfosit

menggunakan pengelompokan tiap 10 sel yang dihitung sampai terdapat

100 sel. Hasil hitung jenis berdasarkan 100 sel sebenarnya hanya

bermakna pada keadaan normal, jika terdapat leukositosis harus dihitung

lebih banyak; untuk leukositosis antara 10.000-20.000 hitung jenis atas

200 sel; leukositosis antara 20.000-50.000 hitung jenis atas 300 sel;

leukositosis diatas 50.000 hitung jenis atas 400 sel (Gandasoebrata, 2001).

Limfosit merupakan sel yang sferis, garis tengah 6-8um. Limfosit

yang normal memiliki inti relatif besar, berbentuk bulat dengan sedikit

cekungan pada satu sisi, kromatin inti padat, dan anak inti baru terlihat

dengan mikroskop elektron. Sitoplasmanya sangat sedikit, sedikit basofilik

dan mengandung granula-granula azurofilik. Bagian yang berwarna ungu

dengan Romonovsky mengandung ribosom bebas dan poliribisom.

Klasifikasi lainnya dari limfosit ialah dengan ditemuinya tanda-tanda

molekuler khusus pada permukaan membran sel-sel tersebut. Beberapa

diantaranya membawa reseptor seperti imunoglobulin yang mengikat

antigen spesifik pada membrannya. Limfosit dalam sirkulasi darah normal

dapat berukuran 10-12µm. Ukuran yang lebih besar disebabkan

sitoplasmanya yang lebih banyak. Kadang-kadang disebut dengan limfosit

sedang. Sel limfosit besar berada dalam kelenjar getah bening dan akan

tampak dalam darah pada keadaan patologis dengan inti vesikuler dan

anak inti yang jelas (Zukesti, 2003). Pemeriksaan limfosit menggunakan

mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x.

H. Rancangan Penelitian

Keterangan : S : Jumlah mencit yang digunakan K : Kelompok kontrol negatif K1 : Kelompok perlakuan 1 (injeksi intra peritonial LPS) K2 : Kelompok perlakuan 2 (injeksi intra peritonial Cecal Inoculum) K : Kelompok kontrol negatif L : Kelompok LPS C : Kelompok Cecal Inoculum

I. Instrumentasi Penelitian

1. Alat penelitian

a. Kandang hewan percobaan ukuran 30x38x15 cm3

b. Timbangan hewan camry

c. Spuit injeksi 0,1ml

d. Labu takar 1ml

e. Beaker glass 5ml

f. Timbangan analisis metler toledo

g. Pinset

Gambar 2. Skema Rancangan Penelitian

S

Uji ANOVA dilanjutkan dengan Post Hoc Test K1

K2

K K

L

C

h. Sarung tangan

i. Masker

j. Kaca objek

k. Mikroskop cahaya Olympus

2. Bahan penelitian

a. Lipopolisakarida (LPS) Sigma Aldrich (Deisenhofen, Germany)

b. Phosphate Buffered Saline (PBS)

c. Cecal inoculum

d. Hewan uji (18 ekor Mencit Balb/C)

e. Hewan donor (6 ekor Mencit Balb/C)

f. Pakan mencit BR I

g. Alkohol 70%

h. Dekstrose water 5%

i. Zat pulas Giemsa

J. Cara Kerja

1. Sebelum perlakuan

a. Hewan uji diadaptasi dengan kondisi laboratorium tempat penelitian

dilakukan.

b. Hewan uji dikelompokkan menjadi 3 kelompok. Masing masing

kelompok terdiri dari 6 ekor mencit.

2. Pemberian perlakuan

Sejak hari ke-0 sampai dengan hari ke-6.

Kelompok K, K1, dan K2 diberi diet standar.

Masing-masing kelompok diberi perlakuan yang berbeda sesuai alur

penelitian.

K. Alur Penelitian

Gambar 3. Skema Alur Penelitian

L. Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji

ANOVA dan dilanjutkan dengan Post Hoc Test menggunakan program SPSS

for windows release 15.0.

Kelompok K 6 ekor mencit

Kelompok K1 6 ekor mencit

Kelompok K2 6 ekor mencit

+ diet standar ( BR1& air)

+ diet standar (BR1 & air)

+ diet standar (BR1 & air)

Diinjeksi LPS intraperitonial pada hari ke-0

Diinjeksi Cecal Inoculum

intraperitonial setiap hari

Hari ke 7 mencit diambil darahnya

Mencit 18 ekor

Hitung jumlah sel limfosit darah tepi

BAB IV

HASIL PENELITIAN

A. Data Hasil Penelitian

Setelah dilakukan penelitian mengenai hitung limfosit model sepsis

paparan lipopolisakarida dan cecal inoculum pada mencit Balb/C, didapatkan

pemberian LPS mampu menurunkan jumlah limfosit tiap 100 sel, hal ini

terlihat pada kelompok L (88,2), selain itu pada CI menunjukkan penurunan

jumlah limfosit yaitu 68,7, dari kelompok kontrol 89,7. Secara umum dapat

dilihat pada tabel 1

Tabel 1. Rata – rata hitung limfosit tiap seratus sel darah tepi mencit setelah perlakuan

Kelompok Rata-rata±SD

Kontrol (K) 89,7±4,6

LPS (L) 88,2±2,6

Cecal Inoculum (C) 68,7±10,6

Keterangan: K : Kelompok kontrol negatif L : Kelompok LPS C : Kelompok Cecal Inoculum

Dari hasil di atas dapat digambarkan dalam histogram di bawah ini :

Gambar 4. Histogram Rata-Rata Hitung Limfosit Tiap Seratus Sel pada Tiap

Kelompok Perlakuan

Pengamatan mikroskop limfosit masing-masing kelompok dapat dilihat

sebagai berikut :

a.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Rata-rata hitung limfosit

tiap seratus

sel

1

Jenis Perlakuan

Kontrol LPS CI

b.

c. Gambar 5. Pengamatan Mikroskopis Limfosit Masing-Masing Kelompok

Perlakuan Keterangan: a. Gambaran limfosit kelompok K pengecatan Giemsa, perbesaran 400x

dengan 3x optical zoom Mpix digital camera. Panah hitam menunjukkan limfosit

b. Gambaran limfosit kelompok L pengecatan Giemsa, perbesaran 400x dengan 3x optical zoom Mpix digital camera. Panah hitam menunjukkan limfosit

c. Gambaran limfosit kelompok C pengecatan Giemsa, perbesaran 400x dengan 3x optical zoom Mpix digital camera. Panah hitam menunjukkan limfosit

B. Analisis Data

Hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa rata-rata hitung limfosit tiap

seratus sel dari kontrol (K) 89,67 tiap seratus sel, LPS (L) 88,17 tiap seratus

sel, dan cecal inoculum (C) 68,67 tiap seratus sel. Analisis statistik terhadap

data hasil penelitian di atas dilakukan dengan One Way ANOVA, didaptkan

hasil p = 0.000

Hasil analisis variansi satu jalan terhadap rata-rata hitung limfosit mencit

antar kelompok perlakuan menunjukkan perbedaan yang bermakna dengan

p<0,05. Ini berarti, tiap satu pasang kelompok secara statistik menunjukkan

perbedaan bermakna. Sehingga, dilanjutkan dengan Post Hoc Test (LSD).

Hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa rata-rata hitung limfosit

tiap seratus sel dari kontrol (K) adalah 89,67 tiap seratus sel. Setelah

dilakukan pemaparan LPS (L) terjadi penurunan rata-rata hitung limfosit tiap

seratus sel kontrol menjadi 88,17 tiap seratus sel (p=0,114), dan terhadap

kelompok cecal inoculum (C) juga didapatkan penurunan rata-rata hitung

limfosit terhadap seratus sel yaitu 68,67 tiap seratus sel (p=0,000). Hasil

analisis terhadap kelompok L dan C didapatkan hasil p=0,003.

Hasil analisis statistik antar kelompok dapat diringkas dalam tabel

sebagai berikut:

Tabel 2. Analisis Statistik Antar Kelompok Perlakuan Kelompok P value Kemaknaan

K – L 0,114 Tidak Signifikan

K – C 0,000 Signifikan

L – C 0,003 Signifikan

BAB V

PEMBAHASAN

Dari penelitian didapatkan hasil bahwa rata-rata hitung limfosit dari seratus

sel darah kelompok sepsis paparan LPS menunjukkan nilai lebih rendah

dibandingkan dengan kelompok kontrol meskipun secara statistik menunjukkan

nilai yang tidak bermakna (p=0,114). Hal ini sesuai bahwa LPS merupakan

komponen penting penyusun membran luar bakteri gram negatip dan mempunyai

peranan yang sangat penting dalam induksi sepsis (Alexander, 2001), dimana

dalam sepsis akan terjadi disfungsi seluler yang dalam penelitian-penelitian sepsis

menunjukkan adanya apoptosis limfosit (Remick, 2007). Namun pada penelitian

oleh Hotchkiss et al bahwa pada pasien dengan sepsis akan terjadi apoptosis

limfosit yang signifikan (Hotchkiss et al, 2001), dan juga akan menginduksi

secara masif, pelepasan secara cepat beberapa molekul proinflamatori pada hewan

percobaan dan manusia (Copeland et al, 2005) hal ini dimungkinkan terjadi

karena pada penggunaan model endotoksin, dalam hal ini LPS, berdasarkan

peristiwa syok septik dan MODS (Deitch, 2005).

Pada paparan CI hitung limfosit menunjukkan nilai lebih yang rendah

daripada kelompok kontrol dan secara statistik bermakna (p=0,000). Hal ini sesuai

bahwa pada hari ke-3 dan hari ke-7 terjadi kenaikan caspase-3, procaspase-3, dan

Bax tetapi terjadi penurunan BCl2 yang akan menginduksi apoptosis (Chopra dan

Sharma, 2007).

Kematian sel secara apoptosis terjadi melalui 3 jalur utama yaitu: jalur

ekstrinsik (tipe I), jalur intrinsik (mitokondrial) (type II), dan jalur retikulum

endoplasmik (RE) atau stress-induced pathway. Antigen Fas [cell differentiation

antigen 95 (CD95)] adalah protein permukaan sel pada membran reseptor TNF,

yang bertanggungjawab sebagai sinyal apoptosis jalur ekstrinsik pada tipe I. Fas

diekspresisksn oleh berbagai macam tipe sel, termasuk timosit, sel B teraktivasi,

sel T, monosit, makrofag, neutrofil, sebagaimana pula pada berbagai macam non

imun sel pada hati, paru-paru, dan jantung. Ketika Fas berikatan dengan ligannya

yaitu FasL akan menyebabkan trimerisasi dan kemudian membentuk formasi

death-induced signaling complex (DISC), dimana akan terjadi pengerahan

pembentukan molekul adaptor kematian sel, yang akan berikatan dengan

procaspase 8. kemudian jalur ini akan melalui jalur caspase cascade. Ketika

procaspase 8 is membelah dan menjadi caspase 8 aktif, kemudian mengaktivasi

caspase 3, yang akan menjadi inhibitor caspase-aktivasi DNase dan pembelahan

DNA pada nukleus (Aneway, 2001) menyebabkan apoptosis. Alternatif yang lain

adalah tipe II diperankan oleh mitokondria yang akan melepaskan molekul

destruktif, dan sedikit membentuk DISC. Jalur tersebut teraktivasi saat kehilangan

faktor pertumbuhan seperti IL-2, IL-4, atau or granulocyte macrophage-colony

stimulating factor, peningkatan sitokin seperti IL-1 dan IL-6, atau eksogen stresor

seperti steroid, reactive oxygen intermediates (ROIs), peroxynitrite, or NO, yang

akan mengaktivasi pro atau antiapoptosis anggota kelompok Bcl-2. Proapoptotik

Bcl-2 seperti t-Bid atau Bax diperkirakan berlokasi pada sitosol, dimana secara

normal dalam batas tertentu, dalam membran mitokondrial digunakan untuk

mengurangi m. Mitochondrion kemudian melepas sitokrome c, Smac/Diablo,

dan apaf-1, lewat formasi apoptosome, mengaktivasi downstream caspases seperti

caspase 9. Downstream caspase ini menyebabkan kematian sel. Bergantung pada

keseimbangan anggota kelompok Bcl-2, dalam keadaan dominan pada kelompok

antiapoptosis seperti bisa mempertahankan kehidupan sel (Krammer, 2000) RE

mengaktivasi caspese 12 by Ca2+ dan stess oksidan (Oyadomari dan Mori, 2004).

BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Dalam penelitian ini didapatkan CI secara bermakna mampu

menurunkan hitung limfosit dibandingkan LPS.

B. Saran

Untuk penelitian lebih lanjut dapat dilakukan:

1. Perhitungan limfosit secara lebih spesifik misalnya limfosit CD4+

2. Pemeriksaan sitokin-sitokin yang berkaitan dengan patogenesis sepsis

3. Penggunaan cecal inoculum sebagai pertimbangan salah satu model

penelitian sepsis

DAFTAR PUSTAKA

1Abbas A. K. and Lichtman A. H., 2005. Cellular and Molecular Immunology. 5th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders, pp : 295-343.

Alexander C., Rietschel E.T. 2001. Bacterial lipopolysaccharides and innate

immunity. J Endotoxin Res. 7:167­202. Amersfoort E. S. V., Berkel T. J. C. V., Kuiper J. 2003. Receptors, mediators,

and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin Microbiol Rev. 16(3): 379–414.

Angus D. C., Linde Z. W. T., Lidicker J., Clermont G., Carcillo J., Pinsky M.

R. 2001. Epidemiology of severe sepsis in the united state: analysis of incidence and associated costs of care. Crit Care Med. 29: 1303-9.

Aneway C. W., Jr. 2001. How the immune system works to protect the host

from infection: a personal view. Proc Natl Acad Sci. 98: 7461-8. Arul M. C., Markus H. L., Chandan K. S., Terrence R. B., Sunita S. S., Vidya

J. S., Vaishalee A. P., and Peter A.W. 2001. Molecular signatures of sepsis multiorgan gene expression profiles of systemic inflammation. Am J Pathol. 159(4): 1199–1209.

Balk R. A. 2000. Severe sepsis and septic shock: definition, epidemiologi, and

clinical manifestation. Crit Care Clin. 16(2): 179-92. Bochud P. Y., Calandra T. 2003. Science, medicine, and the future,

Pathogenesis of sepsis: new concepts and implications for future treatment. BMJ. 326:262–6.

Brahmbhatt S., Gupta A., Sharma A.C. 2005. Bigendothelin-1 (1-21) fragment

during early sepsis modulates tau, p38-MAPK phosphorylation and nitric oxide synthase activation. molecular and cellular biochemistry. Experimental Cell Research. 271:225–37.

Brooks G. F., Butel J., Morse A.S. 2003. Medical Microbiology. 22th ed.

Singapore: Mc Graw Hill Co, p: 217. Chang K. C., Unsinger J., Davis C. G., Schwulst S. J., Muenzer J. T., Strasser

A., Hotchkiss R. S. 2007. Multiple triggers of cell death in sepsis: death receptor and mitochondrialmediated apoptosis. FASEB J. 21: 708-19.

Chopra M. and Sharma A. C. 2007. Distinct cardiodynamic and molecular characteristics during early and late stages of sepsis-induced myocardial dysfunction. Life Sci. 81(4): 306–16.

Copeland S., Warren H. S., Lowry S. F., Calvano S. E., Remick D. 2005.

Acute inflammatory response to endotoxin in mice and humans. Clin Diagn Lab Immunol. 12: 60–7

Deitch E. A. 2005. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24,

Suppl.1: 19-23. Diding H. P. 2005. Imunokimia. Dalam: Kimia Kedokteran. Surakata: Sebelas

Maret University Press, p: 148. Dorland, W.A. 1998. Kamus Saku Kedokteran Dorland. Jakarta: EGC, pp:

199, 559. Fox, S. I. 2002. Human Physiologi. 7th ed. Boston: McGraw Hill Co, p: 452. Gaïni S., Koldkjær O.G., Pedersen C., Pedersen S. S. 2006. Procalcitonin,

lipopolysaccharide-binding protein, interleukin-6 and C-reactive protein in community-acquired infections and sepsis: a prospective study. Critical Care. 10: 1-10. cce

Gandasoebrata, R. 2001. Penuntun Laboratorium Klinik. Jakarta: Dian

Rakyat, p: 33. Garrido A. G., Poli F. F., Silva M. R. 2004. Experimental models of sepsis

and septic shock: an overview. Acta Cir Bras. 19(2): 82-8. Gartner L. P., Hiatt J. L. 2007. Color Textbook of Histology. 3th ed,

International Edition. Philadelphia: Elsevier, pp: 231. Guntur A. H. 2006a. Penyakit tropik dan infeksi, sepsis. Dalam: Buku Ajar

Ilmu Penyakit Dalam. Jilid III Edisi IV. Jakarta: Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam FKUI, pp:1840-3.

Guntur A. H. 2006b. Sirs & Sepsis: Imunologi, Diagnosis, Penatalaksanaan.

Surakarta: Sebelas Maret University Press, pp: 1-14. Guntur A. H. 2007. Imunopatobiologik sepsis dan penatalaksanaanya.

Simposium Nasional SEPSIS dan Antimikrobial Terkini. Surakarta: PETRI, pp: 31-6.

Guntur A. H. 2008. Clinical observation of IVIG in management of sepsis. Proseding of National Symposium : The Second Indonesia SEPSIS Forum. Surakarta: PETRI, pp:106-13.

Guyton and Hall, 1997. Resistensi tubuh terhadap infeksi: leukosit, granulosit,

sistem makrofag-monosit, dan inflamasi. Dalam : Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. 9th ed. Jakarta: EGC, pp: 556-66.

Hongwei Q., Cynthia A.W., Sun J.L., Xueyan Z., and Etty N. B. 2005. LPS

induces CD40 gene expression through the activation of NF-κB and STAT-1α in macrophages and microglia. Blood.106(9): 3114–22.

Hotchkiss R. S., Dunne W. M., Swanson P. E., Davis C. G., Tinsley K. W.,

Chang K. C., Buchman T. G., Karl I. E. 2001. Role of apoptosis in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Science. 294:1783.

Junqueira L.C., Carneiro J. 2005. Basic Histology. 11th ed. Boston: McGraw

Hill Co, p: 233. Krammer, P. H. 2000. CD95’s deadly mission in the immune system. Nature.

407: 789-95. Kristine M. J., Sarah B. L., Anncatrine L. P., Jesper E. O., and Thomas B.

2007. Common TNF-α, IL-1β, PAI-1, uPA, CD14 and TLR4 polymorphisms are not associated with disease severity or outcome from Gram negative sepsis. BMC Infect Dis. 7: 108.

Krutzel M. L., Harari Y., Chen C. Y., Castro G. A. 2000. Lactoferin protecs

gut mucosal integrity during endotoxemia induce by lipopolysaccharide in mice. Inflammation. 24: 33-44.

Murray K.R., Granner K. D., Mayes A. P., Rodwell W. V. 2003. Biokimia

Harper. 23th ed. Jakarta: EGC, p :711.

Oyadomari, S., Mori, M. 2004. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 11: 381-9

Poeze M., Ramsay G., Gerlach H., Rubulotta F., Levy M. 2004. An

international sepsis survey: a study of doctors' knowledge and perception about sepsis. Critical Care. 8(6): 409-13.

Remick D. G. 2007. Biological perspectives pathophysiology of sepsis. Am J

Pathol. 170(5). 1435-44.

Ren J., Ren B. H., Sharma, A. C. 2002. Sepsis-induced depressed contractile function of isolated ventricular myocytes is due to altered calcium transient properties [basic science aspects]. Shock. 18(3): pp 285-8.

Rey E. G., Chorny A., Robledo G., Delgado M. 2006. Cortistatin, a new

antiinflammatory peptide with therapeutic effect on lethal endotoxemia. J Exp Med. 203(3): 563–71.

Rozenberg G. 1996. Microscopic Haematology: a Practical Guide for

Laboratory. Amsterdam: Harwood Academica Publisher GmbH, p: 90.

Wang X. L., Li Y., Kuang J. S., Zhao Y., Liu P. 2006. Increase heat shock

protein 70 expression in the pancreas of rats with endotoxic shock. World J Gastroenterol. 12(5): 780-3

Wesche D. E., Lomas-Neira J. L., Perl M., Chung C. S., Ayala A. 2005.

Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock. Journal of Leukocyte Biology. 78:325-37.

Zukesti, E. 2003. Peranan Leukosit Sebagai Anti Inflamasi Alergik Dalam

Tubuh. USU Digital Library.

Lampiran A. Jadwal Penelitian

Hari ke- Kelompok

0 1 2 3 4 5

Kontrol

LPS 0,1 mg LPS/ mencit/ i.p

Cecal inoculum

4 mg CI/ mencit/ i.p

4 mg CI/ mencit/ i.p

4 mg CI/ mencit/ i.p

4 mg CI/ mencit/ i.p

4 mg CI/ mencit/ i.p

4 mg CI/ mencit/

Lampiran B. Foto Alat dan Bahan Penelitian

Gambar 1. Mencit Kelompok Kontrol Gambar 2. Mencit Kelompok LPS

Gambar 3. Mencit Kelompok Cecal Inoculum

Gambar 4. Timbangan Camry Gambar 5. Spuit Injeksi

Gambar 6. Gelas Ukur

Lampiran C. Foto Kegiatan Penelitian

Gambar 1. Adaptasi Mencit Gambar 2. Menimbang Mencit Gambar 3. Mengambil Caecum Mencit

Gambar 4. Membuat Caecal Inoculum Gambar 5. Injeksi Intra Peritoneal Gambar 6. Membuat Apusan Darah

Lampiran D. Hasil Uji Analisis One Way Anova dan Post Hoc Test dengan Program SPSS For Windows Release 15.0

Descriptives Hitung Limfosit

N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for

Mean Minimum Lower Bound Upper Bound Kontrol 6 89.67 4.590 1.874 84.85 94.48 LPS 6 88.17 2.563 1.046 85.48 90.86 Cecal Inoculum 6 68.67 10.633 4.341 57.51 79.83 Total 18 82.17 11.759 2.772 76.32 88.01

Test of Homogeneity of Variances Hitung Limfosit

Levene Statistic df1 df2 Sig.

1.882 2 15 .187

Oneway ANOVA Hitung Limfosit

Sum of

Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 1647.000 2 823.500 17.559 .000 Within Groups 703.500 15 46.900 Total 2350.500 17

Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: jumlah limfosit LSD

(I) perlakuan (J) perlakuan

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound kontrol Lps 6.667 3.974 .114 -1.80 15.14 Ci 21.000(*) 3.974 .000 12.53 29.47 lps Control -6.667 3.974 .114 -15.14 1.80 Ci 14.333(*) 3.974 .003 5.86 22.80 ci Control -21.000(*) 3.974 .000 -29.47 -12.53 Lps -14.333(*) 3.974 .003 -22.80 -5.86

* The mean difference is significant at the .05 level.

Lampiran E Hasil Laboratorium Hitung Limfosit

Jenis Sampel Persentase Limfosit Kontrol-1 86% Kontrol-2 92% Kontrol-3 87% Kontrol-4 94% Kontrol-5 84% Kontrol-6 95%

Rata-rata 90%

Jenis Sampel Persentase Limfosit LPS 0,1-1 90% LPS 0,1-2 85% LPS 0,1-3 86% LPS 0,1-4 92% LPS 0,1-5 88% LPS 0,1-6 88%

Rata-rata 88%

Jenis Sampel Persentase Limfosit CI-1 88% CI-2 58% CI-3 60% CI-4 68% CI-5 70% CI-6 68%

Rata-rata 69%

Lampiran F. Hasil Penghitungan Jumlah Limfosit Tiap Seratus Sel

Keterangan: K : Kelompok kontrol negatif L : Kelompok LPS C : Kelompok Cecal Inoculum

No

Kelompok Perlakuan

Jumlah Limfosit

Kelompok Perlakuan

Jumlah Limfosit

Kelompok Perlakuan

Jumlah Limfosit

1 K-1 86 L-1 90 C-1 88

2 K-2 92 L-2 85 C-2 58

3 K-3 87 L-3 86 C-3 60

4 K-4 94 L-4 92 C-4 68

5 K-5 84 L-5 88 C-5 70

6 K-6 95 L-6 88 C-6 68

Jumlah 538 529 412 Rata-rata 89,7 88,2 68,7