Upload
avindakumalasari
View
184
Download
30
Embed Size (px)
DESCRIPTION
biologi sel
Citation preview
Pengenalan Kultur Sel
Mamalia
Puji Astuti
Animal Cell
Nucleus
Nucleolus
Rough Endoplasmic Reticulum
Smooth Endoplasmic Reticulum
Ribosomes
Golgi Bodies
Mitochondria
Cell Membrane
Cytoplasm
Pengenalan Kultur Sel Mamalia
Apakah Kultur Sel?
Kultur sel dapat di definisikan sebagai pemindahan sel dari binatang dan dilanjutkan pertumbuhannya dalam lingkungan artifisial yang mendukung
Sel dapat dipisahkan langsung dari jaringan dan didisintegrasi dengan reaksi enzimatis atau mekanik sebelum dikulturkan, atau dapat diturunkan dari suatu cell line atau strain sel yang sudah ada/establish
Cara memperoleh Cell line
Kita bisa membuat kultur sel primer sendiri atau membeli
dari kultur sel yang sudah establih secara komersial atau non-profit suppliers (i.e., cell banks);
Reputable suppliers mempunyai cell lines dengan kualitas yang tinggi yg telah ditest dengan baik integritasnya untuk menjamin kultur sel bebas dari kontaminan;
Disarankan untuk tidak meminjam kultur dari laboratorium yang lain karena mereka umumnya beresiko kontaminan.
Dari manapun sumbernya, pastikan cell line yang baru di uji keberadaan kontaminasi mycoplasma sebelum digunakan
Kultur Sel/Lines
Primary culture/Kultur Primer dapat didefinisikan sebgai kultur yang
diperoleh setelah sel disolasi dari jaringan dan berproliferasi dalam kondisi
yang sesuai sampai mereka menempati seluruh tempat tumbuh (mencapai
confluence). Pada tahap ini, sel harus disubkultur (i.e., passaged) dengan
cara memindahkannya ke dalam tempat tumbuh yang baru berisi media
baru untuk melanjutkan pertumbuhan;
Setelah subkultur pertama, sel kultur primer disebut suatu cell line atau subclone. Cell lines yang diturunkan dari kultur primer mempunyai waktu
hidup terbatas (i.e., they are finite), dan seiring proses subkultur, sel dengan
kapasitas pertumbuhan tertinggi akan mendominasi, menghasilkan suatu
tingkat keseragaman genotip dan fenotip dalam populasi;
Jika suatu subpopulasi suatu cell line diseleksi dari kultur dengan kloning atau dengan metode lain, cell line ini menjadi suatu cloned cell strain.
Suatu cell strain kadang mengalami penambahan perubahan genetik
setelah pembuatan parent line.
http://www.invitrogen.com/
Morfologi sel Mammalian
Hampir semua sel mamalia dapat dikategorikan menjadi 3 kategori dasar menurut morfologi:
1) Fibroblastic (atau fibroblast-like) cells adalah bipolar atau multipolar, mempunyai bentuk memanjang dan tumbuh melekat
pada suatu substrate/tempat tumbuh;
2) Epithelial-like cells adalah berbentuk polygonal dengan dimensi
yang teratur, dan tumbuh melekat pada substrate dalam pola yang
dapat dibedakan;
3) Lymphoblast-like cells adalah berbentuk spheric dan umumnya
tumbuh seperti suspensi tanpa melekat pada permukaan
http://www.invitrogen.com/
Morfologi sel mamalia
Selain kategori dasar di atas, sel tertentu mempunyai
karakteristik morfologi yang spesifik, tergantung
perannya dalam inangnya.
Neuronal cells nampak dalam bentuk dan ukuran yang berbeda,
tetapi secara garis besar dapat dikategorikan menjadi 2: tipe I
dengan axon panjang digunakan untuk menggeraklan signal dalam
jarak jauh dan tipe II tanpa axons. Suatu neuron khusus nampak
sebagai perpanjangan dengan banyak cabang dari badan sel,
disebut dendritic tree.
http://www.invitrogen.com/
Sel neuron
Morfologi sel mamalia
Human Embryonic Kidney 293 cells, sering disebut HEK 293, 293 cells, atau HEK cells adalah cell line spesifik yang diturunkan dari
human embryonic kidney cellsdan ditumbuhkan dalam kultur
jaringan.
http://www.invitrogen.com/
Gambar phase contrast
memperlihatkan morfologi
293 sel sehat ditumbuhkan
dalam kultur melekat pada
80% confluency (1) dan
kultur suspensi (2)
1
2
Finite vs Continuous Cell Line
Sel normal umumnya membelah dengan jumlah
terbatas sampai kemudian hilang kemampuan berproliferasi, suatu event genetik yang disebut senescence; cell lines ini disebut finite.
Namun, beberapa cell lines menjadi immortal melalui proses yang disebut transformasi, dapat terjadi secara spontan atau dapat diinduksi secara kimia atau diperantarai virus. Ketika suatu finite cell line mengalami transformasi dan memiliki kemampuan membelah tidak terbatas, maka sel tersebut menjadi suatu continuous cell line.
http://www.invitrogen.com/
Stem Cells
Embryonic Stem Cells: pluripotent stem cells yang diturunkan dari masa sel bagian dalam dari suatu blastocyst, suatu early-stage preimplantation embryo
Stem Cells Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs):
Suatu jenis pluripotent stem cell yang dapat dihasilkan langsung dari sel dewasa.
(1) Isolasi dan kultur sel donor (2) Transfect stem cell-associated
genes dalam sel dengan perantara viral vectors. Sel berwarna merah menandakan sel yang mengekspresikan exogenous genes.
(3) Panen dan kultur sel dengan mitotically inactivated feeder cells (lightgray).
(4) Kelompok kecil sel yang telah tertransfesi menjadi sel iPS dan menghasilkan ES-like colonies.
Stem Cells
Hematopoietic Stem Cells (HSCs): adalah sel darah yang menghasilkan semua jenis sel darah dan diturunkan dari mesoderm. Sel tersebut berada di red bone marrow, yang menjadi pusat hampir semua tulang.
Stem Cells
Mesenchymal Stem Cells: MSCs, adalah multipotent stromal cells yang dapat berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel, termasuk osteoblasts (bone cells), chondrocytes (cartilage cells), dan adipocytes (fat cells).
Stem Cells
Neural Stem Cells & Glial Precursor Cells
Neural stem cells (NSCs) adalah self-renewing, multipotent cells yang menghasilkan fenotip
utama sistem syaraf.
Glial precursor cells (GPCs), disebut juga glial restricted progenitors (GRP) atau
oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), adalah
sel yang berpotensi untuk berdiferensiasi
membentuk oligodendrocytes atau astrocytes.
Diturunkan dari jaringan atau dari sel pluripotent
yang diinduksi faktor eksternal.
Isolat astrocyte dilihat confocal
microscopy, dicat GFAP (merah), focal
adhesion kinase (hijau), dan nuclear
stain To-Pro (biru)
Pemilihan Cell Line yang Cocok
Kriteria pemilihan cell line untuk penelitian:
Spesies: Non-human dan non-primate cell lines biasanya punya batasan biosafety yang lebih sedikit, tetapi pada dasarnya jenis penelitian menentukan apakah menggunakan kultur spesies spesifik atau tidak;
Karakteristik Fungsional: Apa tujuan penelitian? Contoh: cell line yang diturunkan dari hati dan ginjal lebih cocok untuk testing toksisitas;
Finite atau continuous: finite cell lines pilihan untuk penelitian yang mengarah pada fungsi ekspresi yang lebih tepat, continuous cell lines lebih mudah digunakan untuk kloning dan maintanance;
http://www.invitrogen.com/
Pemilihan Cell Line yang Cocok Kondisi dan Karakteristik Pertumbuhan : Apakah persyaratan
untuk kecepatan pertumbuhan, kerapatan jenuh dan kemampuan tumbuh dalam suspensi? Contoh untuk mengekspresikan proterin dalam jumlah tinggi diperlukan cell line dengan kecepatan pertumbuhan tinggi dan kemampuan tumbuh dalam suspensi.
Normal atau transformed: Transformed cell lines umumnya mempunyai kecepatan pertumbuhan tinggi, plating efficiency lebih tinggi, continuous, dan membutuhkan serum lebih sedikit dalam media, tetapi sel tersebut mengalami perubahan permanen pada fenotipnya karena transformasi genetik;
Kriteria lain: Kalau menggunakan finite cell line, apakah stoknya cukup? Apakah cell line sudah terkarakterisasi baik atau perlu proses validasi? Jika menggunakan abnormal cell line, apakah punya normal cell line yang ekuivalen yang digunakan sbg kontrol? Apakah cell linenya stabil? Jika tidak seberapa mudah diklon dan dibuat untuk stock frozen yang cukup untuk penelitian?
http://www.invitrogen.com/
Cell
Line Tipe sel
Faktor
pertumbuhan
dan perlekatan
Konsentrasi
yg
disarankan
(ng/ml)
Mediu
m
Serum
Suppl.
MCF
7
Human
mammary
carcinoma
EGF(a) 100 DMEM 2%
FBS
HF
Human foreskin
fibroblast EGF(a) 2 DMEM
10%
FBS
--
Primary
hepatocyte EGF(a) 10 DMEM
10%
FBS
WB
Rat hepatic
epthelium EGF(a) 10
Richter'
s MEM
10%
FBS
HeLa
Human cervical
carcinoma EGF(a) 2.5 x104 DMEM
10%
FBS
A431 Epidermal
carcinoma EGF(a) 2.5 x 104 DMEM
10%
FBS
--
Primary human
fibroblast EGF(a) 1x103
MEM
Earle's
10%
FBS
Cell
Line
Tipe sel
Faktor
pertumbuhan
dan perlekatan
Konsentrasi
yg
disarankan
(ng/ml)
Mediu
m
Serum
Suppl.
MKN-
7
Human
adenocarcinom
a
EGF(a) 50 DMEM 8%
FBS
BALB
/c
3T3
Mouse
fibroblast EGF(a) 50
DMEM/
F-12 --
TM-4 Mouse testes
epithelium EGF(a) 3
DMEM/
F-12 --
NRK-
49F Rat fibroblast EGF(a) 50
DMEM/
F-12 --
GH3
Rat
neuroblastoma bFGF 1 F-12 --
BHK-
21
Baby hamster
kidney bFGF 3
DMEM/
F-12
5%
Calf
MKN-
7
Human
adenocarcinom
a
EGF(a) 50 DMEM 8%
FBS
Kondisi kultur
Kondisi kultur sangat berbeda untuk tiap jenis sel, tetapi lingkungan
artificial dimana sel ditumbuhkan tidak beragam yang umumnya terdiri dari:
substrate atau medium yg mensuplai essential nutrients (asam amino, karbohidrat, vitamin, mineral)
Faktor pertumbuhan (FBS; defined media supplements) Hormones (extra) gases (O2, CO2) Lingkungan fisiko-kimia yang diatur (pH, tekanan osmosis,
temperature)
hampir semua sel anchorage-dependentdan harus dikulturkan dengan melekatkan pada solid atau semi-solid substrate (adherent atau monolayer culture), yang lain dapat ditumbuhkan mengapung dalam medium kultur (suspension culture).
http://www.invitrogen.com/
Menghitung sel dengan Hemacytometer
Bersihkan chamber dan cover slip dgn alkohol. Keringkan dan tempatkan coverslip dlm posisi yg tepat.
Panen sel. Tambahkan 10 L sel dlm hemacytometer. Jgn berlebihan.
Tempatkan chamber dlm inverted microscope, 10X objective. gunakan phase contrast untuk membedakan sel.
Hitung sel pd bagian kotak yg besar tengah bergaris (1 mm2). Kotak bergaris ada dlm lingkaran. Kalikan 104 untuk memperkirakan jml sel per mL. Lakukan 2 X dan hitung rata-rata.
http://www.invitrogen.com/
Avi: 7
HepatoPac
HepatoPac Platform Hepregen diekmbangkan sebagai suatu bioengineered microliver platform yang unik sebagai model fungsional liver in vivo.
Teknologi rekayasa jaringan Microfabrikasi dikombinasi untuk menghasilkan model miniatur hati manusia yg terorganisasi
Multiwell plate yg terstandarmicropattern level industri mengandung koloni sel hati dikelilingi penyokong stroma
http://www.hepregen.com/technology.html
Sel manusia untuk skrining
hES-CMC2D adalah sel hES yg diturunkan dari klaster cardiomyocyte, dibuat sebagai monolayers dalam format 96-well plate.
Keuntungan:
Sel manusia
Sumber homogen
Lingkungan asli dari multiple ion channels
High toxicological relevance
Secara genetik unmodified
Suplai tidak terbatas
Fresh dan ready to use
Figure 1: Schematic illustration of an in vitro testing platform for hES-CMC2D (adapted from Mandenius et al, 2011)
http://www.cellartis.com/
Penggunaan stimulus elektrik atau kimia dapat
menghasilkan awal proses parthenogenesis
hpSC (human pluripotent stem cell)
Ketika digunakan untuk transplant-based stem cell therapies, stem cells kemungkinan besar menghadapi problem Human leukocyte antigen (HLA) matching issues yang sama yang membatasi solid organ allogeneic transplants dan menyebabkan immune rejection. Resiko penolakan proporsional dgn tingkat perbedaan cell-surface antigen-presenting proteins donor dan recipient.
Stem cells
Produk kesehatan berbasis sel
1. Manipulasi bersifat substansi: selama proses proses
produksi sel atau jaringan dimanipulasi sehingga
karakteristik biologi, fungsi fisik atau strukturnya
dimodifikasi untuk mencapai fungsi. Contoh: seleksi
dan ekspansi sel, sel yg dimanupilasi genetik
2. Penggunaan non homologous: sel atau jaringan
tidak ditujukan untuk digunakan untuk fungsi yg
sama antara resipient dan donor. Contoh bone
marrow aspirate digunakan untuk pasien penderita
jantung untuk regenerasi myocardium
Produk kesehatan berbasis sel
c. 15.000 patients
Produk kesehatan berbasis
rekayasa jaringan
In vitro skin
Neurotech
Encapsulated Cell Technology
www.neurotechusa.com/
Neurotech
Age-related macular degeneration (AMD) adalah penyebab utama kebutaan
pada orang tua di negara barat dengan prevalensi 30% pada individu umur
lebih dari 70 tahun. Degenerasi macula (bagian pusat retina) menyebabkan
hilangnya penglihatan pada bagian pusat.
Retinitis Pigmentosa (RP) menyebabkan degenerasi fotoreseptor sel di retina
(rod dan cone), yang dalam waktu lama mengurangi penglihatan malam
dan periferal yang memicu kebutaan
Kultur sel Neurotech
Produk Neurotech, NT-501, terdiri dari
encapsulated human cells genetically
modified to secrete ciliary neurotrophic
factor (CNTF). CNTF adalah faktor
pertumbuhan yg mengatasi
photoreceptors yang melemah dan
melindungi dari degenerasi. NT-501
didesign untuk secara terus menerus
menghasilkan dosis terapi yg rendah dan
aman ke bagian belakang mata.
Cell based medicinal products Cell-based MPs EudraCT Clinical trial applications (3Q 2005 4Q 2009)
3Q / 2005 3Q / 2006 3Q / 2007 3Q / 2008 4Q / 2009
Cancer immunotherapy 3 23 45 70 103
Cardio-vascular therapies 4 17 31 44 49
Skin/liver/eye/diabetes/intestine/bone TE 5 12 28 48 74
Neurological 1 4 5 6 7
Lymphohistiocystosis (HLH) - 1 1 1 1
AIDS - 1 1 1 1
Infertility - 1 1 1 1
_________________________________________________________________________________________
Products (trials) 13 (25) 59 (73) 112 (132) 171 (213) 236 (329)
Data from Dr. E.Flory/Eudra CT 246 (2010)
R&D around CADUCEUS
1. J Cell Mol Med. 2012 Jan 6. Dose-Dependent Functional Benefit of Human Cardiosphere Transplantation in Mice with Acute Myocardial Infarction. Shen D, Cheng K, Marbn E. 2. Circulation. 2012 Jan 3. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Malliaras K, Li TS, Luthringer D, Terrovitis J, Cheng K, Chakravarty T, Galang G, Zhang Y, Schoenhoff F, Van Eyk J, Marbn L, Marbn E. 3. J Am Coll Cardiol. 2011 Jan 25;57(4):455-65. Intramyocardial injection of autologous cardiospheres or cardiosphere-derived cells preserves function and minimizes adverse ventricular remodeling in pigs with heart failure post-myocardial infarction. Lee ST, White AJ, Matsushita S, Malliaras K, Steenbergen C, Zhang Y, Li TS, Terrovitis J, Yee K, Simsir S, Makkar R, Marbn E.
Physiological role of cells in
circulation? J Cell Mol Med. 2011 Aug;15(8):1726-36. Circulating stem cell vary
with NYHA stage in heart failure patients. Fortini C, et al.
We have investigated the blood levels of sub-classes of stem cells (SCs) [mesenchymal stem cells (MSCs), haematopoietic stem cells (HSCs), endothelial progenitor cells/circulating endothelial cells (EPCs/CECs) and tissue-committed stem cells (TCSCs)] in heart failure (HF) patients at different stage of pathology and correlated it with plasmatic levels of proangiogenic cytokines.
PDF: 1
MSC
B Harnessing the Mesenchymal
Stem Cell Secretome
for the Treatment of
Cardiovascular Disease
Cell Stem Cell 10, March 2, 2012
iPS Avi: 2B, 2