Peralatan laboratorium untuk analisa dengan metoda PCR sekarang berkembang dengan sangat cepat. Berikut kami tuliskan daftar peralatan yang dibutuhkan, semoga bermanfaat. Daftar Peralatan Laboratorium yang dibutuhkan :Rocker, Shakers, Rotators Mini-Rocker Shaker Shaker-Rocker Mini Shaker Shaker Mini Shaker for immunology Orbital Shaker Multi Functional Orbital shaker Mini Rotator for test tube with timer Programmable rotatorThermo-Shakers, Shakers-Incubators Plate Shakers-Thermostats Thermo-Shaker for microtubes and PCR Plates Thermo-Shaker with cooling for microtubes and PCR Plates Enviromental Shaker-IncubatorVortexes Personal vortex for tube Multi vortex for tubes Multi Speed VortexCentrifuge, Combispins, Multispins Mini-Centrifuge / Vortex Centrifuge / Vortex Multispin Laboratory Centrifuge Laboratory Bench-top centrifuge with refrigeration High Speed Mini Centrifuge Thermostats Dry Block thermostats Heating and cooling thermostats Heating / Cooling Dry Block Universal stirred water bath Stirred water bath Dry Block thermostats for spectrocells and strips unstirred water bath Dry block heating systems with interchangeable blovks Stirred thermostatic baths and hearting circulators Refrigerated thermostatic baths and circulators linear Shaking bathsMagnetic Stirrers, Overhead Stirrers High speed magnetic stirrers Magnetic stirrers with hot plate Overhead stirrer multi mixerUV-cabinets for PCR, UV Air Recirculators UV-cabinets for PCR operations UV-air flow cleaner -recirculatorsDensitometers, Fluorometers Densitometers ( suspensions turbidity detector ) 3 Channel fluorometerWashers, Aspirators Inteliwasher Aspirator with trap flaskLife Science products Pipette tips and Filter tips Precison Dispenser Tips Microcentrifuge Tubes PCR Tubes Sample Storage Microplates Cuvettes Laboratorium TerpaduLaboratorium terpadu dilengkapi dengan fasilitas yang menunjang penelitian di bidang bioteknologi, biologi, kimia, dan disiplin ilmu yang terkait lainnya. Fasilitas yang terdapat di laboratorium terpadu antara lain DNA sequencer, PCR (Polymerase Chain Reaction), Eliza Reader, Spektrofotometer UV-VIS, Ultrasonic Cleaners, HPLC (High Performance Liquid Chromatography), GC (Gas Chromatography) dan Regulator. Saat ini laboratorium terpadu memberikan layanan analisa PCR untuk kebutuhan penelitian bioteknologi yang meliputi analisa RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), dan isolasi gen dari bakteri, tanaman, dan hewan.Laboratorium MolekularLaboratorium Molekular Prodia mengembangkan beberapa metode pemeriksaan molekular yang dapat digunakan untuk penelitian, yaitu:1. PCR (Polymerase chain reaction) konvensional dengan deteksi gel elektroforesis2. Allele-Specific PCR3. PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)4. Real Time PCR (Fluoresence dye dan Probes)5. NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)6. Line-Probe AssayAlat-alat yang tersedia: Biosafety Cabinet untuk preparasi sampel dan reagen Cobas AmpliPrep/Cobas Taqman (Ekstraksi Otomatis/Real Time PCR) Thermal Cycler GeneAmp 2400 (PCR Konvensional) Gel Electrophoresis Dokumentasi Gel (GelDoc) Light Cycler 2.0 (Real Time PCR) Nanodrop (Untuk kuantifikasi DNA/RNA/Protein) Nuclisens EasyMag (Ektraksi DNA/RNA Otomatis) dengan metode Boom Nuclisens EasyQ (NASBA) Shaker Waterbath untuk pengerjaan metode Line ProbeAlat yang digunakan meliputi alat-alat gelas yang biasa digunakan dalam laboratorium analisis, vortex, inkubator, freezer, shaker rotator, biological safety cabinet class II, satu set pipet mikro (0,1-10 L, 10-100 L, 20-100 L, 100-1000 L), tip (10, 20, 100, 200 L), tabung mikro 1,5 mL, Thermalcycler PCR (merk Veriti), seperangkat alat elektroforesis, serta UV transilluminator (merk Gel Doc Bio- Rad).Polymerase chain reaction (PCR) adalah sebuah teknologi laboratorium yang utama dalam biologi mokuler. PCR mempunyai derajat spesifisitas dan sensitivitas yang cukup tinggi. Dengan teknik PCR ini, dalam hitungan menit kita bisa menghasilkan jutaan copy DNA.Selain itu, ada juga beberapa peralatan penunjang yang perlu kita ketahui, seperti : pipet, pH meter,microwave, dan lain-lain. Dengan praktikum ini diharapakan mahasiswa mengerti dan mampu menjelaskan mengenai fungsi dan prinsip kerja dari peralatan-peralatan laboratorium yang akan digunakan dalam praktikum biologi mulut. Dengan mengetahui cara-cara penggunaan alat tersebut dengan baik dan benar, kesalahan prosedur pemakaian alat dapat diminimalisir sedikit mungkin. Hal ini penting supaya saat melakukan penelitian, data yang diperoleh akan benar pula. Data-data yang tepat akan meningkatkan kualitas penelitian seseorang.BAHAN DAN CARAAda banyak peralatan laboratorium yang diperkenalakan dalam praktikum ini. Namun dalam paper hanya akan dibahas lima peralatan utama dan lima peralatan penunjang yaitu: mikroskop, PCR, incubator, cenrtifugator, waterbath, pipet, pH meter, stirrer. B. Komponen Komponen PCRAda beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara lain:1. DNA cetakan DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas selama 1 2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar sehingga primer akan menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah ( ).2. Oligonukleotida primerOligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi . Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya.Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 25 30 klai (siklus) sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 30 siklus amplikasi.3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)Shanghai ShineGene Molecular Biotech,Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat waktu dan untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya. 4. DNA PolimerasePada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989). Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5 ? 3)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.a. Taq DNA PolimeraseTaq DNA polymerase yang beraasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain yang tidak mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3 ? 5. Enzim ini paling aktif pada pH9 (pada suhu 200 C) dan suhu aktivitas optimumnya sekitar 750C 800C.Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi disbanding dengan fragmen Klenow.Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 75 80 ?C. aktivitas spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul enzim. Waktu paruh (half-time) Taq DNA polymerase pada suhu 95 ?C adalah 40 menit (Gelfand dan White, 1990). Deterjen non-ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin, gliserol, dan ammonium sulfat.Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengan kondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi 30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen -globin (14990 nukleotida). Dengan demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus.Taq DNA polymerase mempunyai keunikan yaitu bahwa enzim ini mampu menambahkan satu nukleotida,terutama dATP, pada ujung -3 fragmen DNA hasil polimerasi meskipun tanpa ada cetakanya. Dengan demikian, ujung fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR pada umumnya tidak pepat (blunt-ended), melainkan ada tambahan satu nukleotida pada kedua ujungnya. Kenyataan semacam ini mempunyai implikasi penting karena fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR dapet diligase dengan suatu plasmid vector tertentu tanpa menggunakan enzim DNA ligase. Hal ini juga perlu diperhatikan jika frag men DNA hasil PCR akan diligasikan dengan suatu plasmid dengan metode ligasi pepat (blunt-ended ligation). Sebelum dilakukan ligasi , fragmen DNA tersebut harus dibuat pepat/tumpul dengan menggunakan aktivitas polymerase 5 ? 3 fragmen Klenow.Aktivitas Taq DNA polymerase dipengaruhi oleh kosentrasi ion magnesium. Aktivitas Taq DNA polymerase mencapai maksimal pada kosentrasi sebesar 2,0 mM jika kosentrasi dNTP yang digunakan adalah 0,7 0,8 mM. kosentrasi lebih tinggi dari 2,0 mM akan menghambat aktivitas Taq DNA polymerase. Di samping itu, aktivitas enzim polymerase ini juga akan menurun 20-30% jika kosenrasi total dNTP yang digunakan mencapai 4-6 mM.b. Tth DNA polimerse Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8. Tth DNA polimerse mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3 ? 5. Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada suhu 25 ) dan suhu sekitar . Selain aktivitas polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien dengan adanya ion mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada Taq DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotida, digoxigenin maupun biotin.Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul akibat adanya struktur skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR (reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat sekaligus diamplifikasi dengan menggunakan Tth DNA polimerse dengan adanya ion . Enzim ini dapat dilakukan untuk melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa.c. Pwo DNA polymeraseEnzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei. Enzim Pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi 5 3 yang tinggi, mempunyai aktivitas eksonuklease , dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease .Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya mempunyai waktu paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonuklease 3 5 (aktivitas proof-reading dalam proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan (fidelity) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp sebanyak satu juta kali maka kurang lebih 56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih kesalahan. Sebalikya, jika enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya 10% produk amplifikasinya yang mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat penting jika DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit.Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung pepat/tumpul (blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam proses ligasi ujung tumpul secara langsung tanpa harus dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Oleh karena sifat ketepatanya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi:1) Cloning produk PCR2) Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual3) Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan4) Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal5) Karakterisasi populasi sel dalam suatu kulturd. Pfu dan Tli DNA polymeraseDNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli DNA polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari Pyrococcus furiosis, mempunyai berat molekul 92 kD, aktif pada suhu dan mempunyai aktivitas eksonuklease . Enzim ini diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil disbanding dengan enzim DNA polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul DNA dengan ujung tumpul.Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis, sangat stabil terhadap panas, aktivitas optimum pada suhu dan dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu . Berat molekul enzim ini dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease .5. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.C. Peralatan Khusus yang Digunakan dalam PCRPCR memerlukan alat khusus dalam prosesnya, alat-alat tersebut antara lain:1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler3. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah peralatan laboratorium yang digunakan untuk analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan DNA tertentu.4. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific). Alat ini memiliki sebuah thermal block dengan lubang-lubang untuk memasukkan tabung campuran PCR.