PBL Uke 9Du bør velge dine foreldre med omhu

Dagens tema

•Organellene•Proteiners skjebne etter translasjonen•Intracellulære transportveier•Ukens PBL-oppgave

Organellene • CYTOSOL: en rekke metabolske reaksjoner

foregår her. Proteinsyntesen• KJERNEN: inneholder genomet. DNA og RNA

syntese• ER: syntese av lipider. Syntese av proteiner• GOLGI-APPARATET: modifikasjon, sortering og

pakking av proteiner og lipider• LYSOSOMER: intracellulær degradering• ENDOSOMER: sortering av endocytert materiale• MITOKONDIA: ATP syntese ved oksidativ

fosforylering• KLOROPLAST: Fotosyntesen og ATP syntese ved

karbon fiksering• PEROKSISOMER: oksidasjon av toksiske

molekyler

Proteiners skjebne etter translasjonen

FOLDING

•Proteiner foldes i en bestemt 3D struktur•Bestemt av aminosyre rekkefølge•Chapperoner hjelper assisterer foldingen

Posttranslasjonelle modifikasjoner

• Mange proteiner modifiseres i ER

• 1. Disulfidbindinger: Oksidasjon av cystein sidekjeder▫ Intrakjeder▫ Interkjeder

▫ Stabiliserende effekt på proteinet

…• Glycosylering: Påhektelse av korte oligosakkarider▫ N-glycosylering▫ O-glycosylering

▫ Beskytter mot degradering og lysosomets lumen

Signalfrekvenser• Proteinene

modifiseres videre i Golgi

• Signal sekvensene er typisk 15-60 aminosyrer lange.▫ Gult=Hydrofobe▫ Rødt=Positivt ladet▫ Blått=Negativt ladet

Degradering

• Organeller slites ut, proteiner kveiles feil-> må degraderes og byttes ut

• Skjer vdh Proteasomer og Lysosomer

• Proteasomer:

▫ Ubiquitin(UB) bindes til proteinet-> Polyubiquitin er en destruksjonsmerkelapp

http://www.youtube.com/watch?v=w2Qd6v-4IIc

• Lysosomer:▫ Inneholder sure

hydrolaser, pH omkring 5▫ Usedvanelig glycosylerte

membranproteiner▫ Transport til lysosomet

via: Endocytose Fagocytose Autofagi

- Autofagi: ”selvspising”; tar deler av seg selv, sender med autofagocyttiske blærer.

Sure hydrolaser

•Syntetiseres i ER, transporteres via Golgi. I ER og cis Golgi merkes de med Mannose-6-fosfat (M6P)

•I trans Golgi blir M6P av Mannose-6-fosfat reseptoren (MPR). Dette transporteres i vesikler til lysosomet via endosomer.

Intracellulære transportveier

Transport gjennom kjerneporer• Små vannløselige stoffer kan passere porene • Store molekyler kan bare passere porene hvis de har

et bestemt sorteringssignal (nuclear localization signal) som binder seg til nuclear transport receptors.

Transport gjennom protein- translokatører

• Disse proteinene har en signalsekvens på N-terminal som fungerer som en merkelapp.

• Proteinet blir først foldet ut før det transporteres inn i organellen. Der vil chaperonene hjelpe til med å folde dem tilbake.

Vesikkeltransport1) Mekanismer

• Cytoplasmiske proteiner bidrar til vesikkel-formasjon: Klatrin, COPI og COPII

• Klatrin:▫ Trebenet molekylstruktur▫ Danner spontant mangekantet

burstruktur ved å binde seg til hverandre

▫ Klatrin binder også adaptinmolekyler bundet til transmembranreseptorer (cargo receptors), som igjen binder molekyler som skal transporteres på ikke-cytosolisk side av membranen (cargo molecules)

▫ Vesikkelen snøres av ved hjelp av GTPasen dynamin

• Hvordan fusjonere med riktig målmembran?▫ Komplementære

SNARE-proteiner danner trans-SNARE-komplekser

▫ Rab-proteiner fasiliterer ”docking” av vesikkelen og riktig paring av vSNARES og tSNARES

▫Selve fusjonen er energikrevende og krever bistand fra et fusjonsmaskineri

▫vSNARES og tSNARES bidrar til membranfusjon ved å tvinge membranene sammen

2) Sekretoriske transportveier

• Korrekt foldete proteiner transporteres fra ER til Golgiapparatet▫ COPII-kledte vesikler

fusjonerer med Golgiapparatet

▫ Proteiner returneres til ER i COPI-kledte vesikler

• Golgiapparatet: To hovedfunksjoner1) Enzymatisk modifikasjon av proteiner fra ER2) Sortering av proteiner for videre transport

• Sekretoriske proteiner kan ha ulike skjebner▫ Inkorporeres i ekstracellulær matriks▫ Tilknyttes plasmamembranen perifert▫ Diffundere som næring/signalmolekyler til andre celler

• Sekresjon skjer ved eksocytose: Fusjon med plasmamembranen

• Den konstitutive sekretoriske veien:▫ Ikke-selektiv eksocytose▫ Kontinuerlig i alle eukaryote celler▫ ”Default pathway”: Forsyner

plasmamembranen og ekstracellulær matriks med nye komponenter

• Den regulerte sekretoriske veien:▫ Selektiv eksocytose▫ Kun i sekretoriske celler▫ Seleksjon i trans-Golgi▫ Fusjonerer med plasmamembranen

på signal utenfra

3) Endocytiske transportveier

• Endocytose: Prosessen hvor celler tar opp makromolekyler, bestemte substanser og andre celler utenfra ved invaginering av plasmamembranen

• Kategorisering etter:▫ Størrelse: Fagocytose versus pinocytose▫ Spesifisitet: Reseptormediert eller uselektiv

• Fagocytose: Når cellen tar inn store partikler som mikroorganismer og døde celler▫ Store vesikler (fagosomer) som

fusjonerer med lysosomer▫ Hos animalske arter: Spesialiserte

fagocytter beskytter mot patogener og fjerner ødelagte/døde celler

▫ Selektiv• Pinocytose: Kontinuerlig internalisering

av plasmamembran og intracellulærvæske▫ Klatrin- eller kaveolinmediert▫ Uselektiv

• Reseptormediert endocytose: Selektiv pinocytose via klatrinkledte vesikler▫ Molekyler i ekstracellulærvæske

binder reseptorer i plasmamembranen

▫ Opptak av for eksempel vitamin B12, jern og kolesterol

▫ Danner reseptor-makromolekylkomplekser som entrer cellen

▫ Fusjonerer med tidlige endosomer

▫ Proteiner som ikke returneres til plasmamembranen ender opp i lysosomer

Ukens PBL-oppgave

•Kolesterol og LDL-reseptoren

•Mutasjon i LDL-reseptoren og familiær hyperkolesterolemi

Lipoproteiner:

•Lipoprotein

•ApolipoproteinFlere forskj. typer, fungerersom ligand.

•Kolesterol

Lipoproteiner og kolesterol:• Kolymikron:

Tarm plasma vev

• VLDL:Lever plasma vev

• LDL:VLDL LDL vev

• HDL:Lever plasma lever

fett

fett

kolesterol

kolesterol

Godt og dårlig kolesterol:

•Vanlige verdier i plasma:Kolesterol < 5 mmol/LLDL-kolesterol < 3 mmol/L

LDL-reseptorens oppbygning:

Kolesterolopptakets virkning på genregulering:

Familiær hyperkolesterolemi • Tilhører gruppe metabolske sykdommer: hyperlipedemier • Karakteriseres ved:

▫ autosomal dominant nedarvet hyperkolesterolemi ▫ xantomknuter

▫ tidlig debut av hjerte- og karsykdommer. • skyldes defekte (LDL)-reseptorer på cellenes overflate. • Gir akkumulering av kolesterol i blodet• Rammer 1 av 300 i Norge, 1 av 500 i Storbritannia*

• Kilde: www.pasienthandboka.no

Arvemekanismene Autosomal dominant Heterozygot + frisk --> 50% Homozygot + frisk --> 100% (heterozygot) Heterozygot + heterozygot --> 75% Homozygot + Homozygot --> 100% (homozygot)

Kilde: www.pasienthandboka.no

Heterozygote pasienter har 2 til 3 ganger høyere kolesterolinnhold i serum enn normalt.

Homozygote pasienter har 4 til 8 ganger høyere kolesterolinnhold i serum enn normalt.

Heterozygote• totalkolesterol ofte ligge mellom 8 og 12 mmol/L (normal under

5)• Hjerteinfarkt fra 30år• Står for 5% av hjerteinfarkt hos folk under 60

• Behandling:Kolesterolsenkende midler (statiner) kan føre til syntese av LDL reseptorer fra

det normale allelet til de heterozygote pasientene. Dermed kan det delvis kompensere.* statiner blokkerer produksjonen av kolesterol i leveren ved at de hemmer virkningen av enzymet hydroksymetyl-glutaryl-koenzym A-reduktase som er det hastighetsbestemmende enzym i kolesterolsyntesen. Da vil cellen kompenserer ved å lage flere reseptorer for å få inn kolesterol fra blodet.

Det finnes også folk som er heterozygote for 2 forskjellige mutasjoner, 1 mutant gen fra hver forelder.

* Kilde: Leren,T,1993, TDNLF, 113,3251-4

Homozygote• Arver 1 mutant gen fra hver forelder. • Alvorlig tilstand• Hjerteinfarkt fra tidlige barneår

• Behandling:▫ Aktuelle behandlingsprinsipper for de homozygote innebærer

plasmautskiftninger hver annen til fjerde uke eller levertransplantasjon.

▫ I USA er det gjort lovende forsøkt med genterapi hos disse pasientene. (etablert cellekulturer av hepatocytter, hvor det introduseres et normalt LDL-reseptorgen. Hepatocyttene tranfunderes via vena portae, og slår seg ned i lever) usikker på klinisk anvendelse.

Kilde: Leren,T,1993, TDNLF, 113,3251-4

Mutasjon i LDL-reseptoren• Per jan 2009: 1100 mutasjoner identifisert• Diagnostikk:

- Trengs i prinsippet test for hver av mutasjonene- I familier med påvist FH i minst 2 generasjoner, kan det sjekkes om familiemedlemmet har arvet den samme DNA strengen som den syke i familien, uten å kjenne mutasjonen i genet.

• 5 Hovedgrupper:1. Manglende syntese av reseptorprotein.2. Manglende intracellulær transport og modifisering av

reseptorproteinet3. Manglende binding av lipoproteiner4. Manglende internalisering av reseptor-ligand-

komplekset5. Manglende resyklering av reseptor

Kilde: Leren,T,1993, TDNLF, 113,3251-4

1.Manglende syntese av reseptorprotein

Det syntetiseres ikke noe påvisbart reseptorprotein

Vanligste typer: Nonsense mutasjon Endring av leserammen (mindre delesjoner,

duplikasjoner, insersjoner

2. Manglende intracellulær transport og modifisering av reseptorproteinet

den vanligste typen, utgjør 50% av alle kjente mutasjoner

den intracellulære transporten mellom ER og Golgi-apparatet er helt eller delvis blokkert

proteinet får ikke de nødvendige modifikasjonene Lokalisering:

2/3 i det ligandbindende domenet 1/3 i domenet som har homologi

med forløperen for EGF

3. Manglende binding av lipoproteiner

Fører til at reseptoren ikke binder LDL Lokalisering:

i det ligandbindende domenet i domenet som har homologi med forløperen for

EGF

4. Manglende internalisering av reseptor-ligand komplekset

Resptorene konsentreres ikke i coated pits dermed kan heller ikke LDL internaliseres ved

reseptormediert endocytose Hovedsaklig lokalisert:

i det cytoplasmatiske domenet i det membranspennende domenet Av de 22 hydrofobe aminosyrene er det spesielt aminosyre

807 som er spesielt viktig.

5. Manglende resirkulering av reseptor•reseptoren dissosieres ikke fra LDL i

endosomet.•reseptoren ikke kan resirkulering, og vil

derfor degraderes i lysosomene sammen med LDL.

•Type mutasjoner: missensmutasjoner eller delesjoner

•Lokalisasjon: domenet som har homologi med forløperen for EGF

Elverum- variantenFH-Elverum mutasjonen er lokalisert til det ligandbindende

domenet.• Punktmutasjon: en G er byttet ut med en A på posisjon 1 av

intron 3. • Dette er en del av spleise setet sekvensen og fører mest

sannsynlig til at intron 3 ikke spleises ut av mRNA. • Resultat: null allel, et protein som forventes å være non-

funksjonelt. • Homozygoter for FH Elverum er reseptornegative.

• Denne mutasjonen ble funnet ved hjelp av PCR-metoden, sammen med FH Svartor (utskiftning av cytosin til guanin i exon 3)

Kilde: Leren T, m.fl, 1994 Atherosclerosis,Dec;111(2):175-82.