Upload
lamtuong
View
231
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
Prof. dr Tanja Berić
EKOLOGIJA MIKROORGANIZAMA
Metode za procenu diverziteta
mikroorganizama u ekosistemu
Principi ekologije mikroorganizama
Tipovi staništa koje naseljavaju MO
Biofilm
• Odgajivačke i neodgajivačke metode
Metode za procenu diverziteta
mikroorganizama u ekosistemu
Obogaćivanje i izolovanje
• Izolovanje podrazumeva izdvajanje mikroorganizma iz zajednice u kojoj se
nalazi, uglavnom kroz proces obogaćivanja, i dobijanje organizma u vidu
čiste kulture
• Obezbeđivanje uslova (medijum, uslovi inkubiranja...) koji su selektivni za
željeni mikroorganizam i kontraselektivni za neželjene mikroorganizme
• Ceo proces započinje uzorkovanjem iz odgovarajuće sredine (inokulum)
• Odgajivačke i neodgajivačke metode
• Konceptualni tvorac metode obogaćivanja Martinus Beijerinck
• Prvi izolovao azotofiksirajuće bakterije Azotobacter ovom metodom
Izolovanje bakterija Azotobacter sp.
Kolona Vinogradskog
• Veštački mikrobijalni ekosistem.
• Dugoročni izvor bakterija za izolovanje i/ili testiranje mogućnosti razgradnje različitih supstrata.
Pristrasnost metode obogaćivanja
• Vrlo izražena kod obogaćivanja u tečnom medijumu.
• Izrašće mikroorganizmi koji najbrže rastu pod datim uslovima, u laboratoriji.
•Realno, takvi organizmi u prirodnim uslovima su najčešće samo minorne komponente
ekosistema dok će se MO čiji procesi značajni za sam ekosistem ostati „ispod radara”
•Veliki problem u mikrobijalnoj ekologiji.
• Donekle se prevazilazi razblaživanjem inokuluma pre obogaćivanja.
Čista kultura
• Išarana ploča
• Razređenje u agaru
• MPN
Provera čiste kulture:
- mikroskopija
- karakteristike kolonija na/u agaru
- rast u drugim medijumima
Analize sastava zajednica bez gajenja
Bojenja:
Bojenje fluorescentnim bojama (DAPI (slika a), akridin narandžasto, SYBR Green I;
boje koje se vezuju za DNK)
Vijabilno bojenje (zelena boja koja ulazi u sve ćelije, i žive i mrtve; crvena boja koja
ulazi samo u ćelije sa narušenom membranom) (slika b)
najveće ograničenje mikroskopskih metoda: ne otkrivaju filogenetski diverzitet
može se prevazići korišćenjem filogenetskih boja (FISH)
a b
Analize sastava zajednica bez gajenja
Filogenetsko bojenje upotrebom FISH (Fluorescentna In
Situ Hibridizacija)
• fluorescentni oligonukleotidi koji odgovaraju delu
sekvence za 16S rRNK (npr.)
• ulaze u ćelije ne izazivajući lizu, hibridizuju sa targetom i
daju fluorescenciju kad se uzorci posmatraju na
fluorescentnom mikroskopu
• vrlo specifične ili nespecifične probe
• kombinacijom FISH i DAPI bojenja može se odrediti
zastuplenost neke filogenetske grupe u uzorku
• specifični geni kao mera biodiverziteta
• filotip
• tehnike u upotrebi:
- analiza DNK fragmenata elektroforezom (DGGE, T-RFLP,
ARISA)
– molekularno kloniranje
- sekvenciranje DNK i analiza
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
• u agarozni gel se dodaje gradijent denaturišućeg agensa
• razdvaja uzorke iste veličine a različite sekvence
• zavisno od primarne sekvence, fragmenti DNK će
denaturisati (i zaustavljati se) u gelu na različitim pozicijama
• razdvojeni fragmenti se mogu sekvencirati
Metode analiza zajednica bazirane na PCR
• jedan gen vs svi geni
• analiza totalnih DNK sekvenci u zajednici
• opisuje funkcionalni kapacitet zajednice
• zavisi od uspona tehnologije sekvenciranja
• metatranskriptomika – analiza totalnih
RNK u zajednici
• daje informacije o ekspresiji gena
• metaproteomika – mera diverziteta i
zastupljenosti različitih proteina u zajednici
Metagenomika
Šta smo naučili?
• iznenađujući rezultati
• otkriveno je mnogo sekvenci 16S rRNK koje se razlikuju od svih laboratorijskih uzoraka
• obično su najzastupljeniji MO u zajednicama oni koji „odbijaju da se odgaje u
laboratoriji”
• odgajivačke metode su nam otkrije jedva 0,1% diverziteta MO u prirodi
• Ekologija - nauka koja proučava međusobne odnose organizama i njihove životne sredine
• Ekosistem – dinamični kompleks biotičkih (zajednice biljaka, životinja i mikroorganizama) i abiotičkih (uslovi nežive prirode) faktora
• čini ga mnogo različitih staništa
• stanište je deo ekositema koji je najpogodniji za jednu (ili nekoliko) populacija
• mikroorganizmi su prisutni u SVIM staništima a neka staništa su naseljena EKSKLUZIVNO mikroorganizmima
• Populacija – grupa MO iste vrste na istom mestu u isto vreme
• Zajednica – asocijacija više populacija različitih vrsta MO, na jednom staništu, koji stupaju u složene međusobne odnose
Ekologija mikroorganizama
• Diverzitet vrsta MO u zajednici definiše se kao:
- bogatstvo vrsta (totalni broj vrsta u zajednici)
- proporcionalna zastupljenost vrste (abundanca)
• vrlo promeljiva kategorija
• u funkciji uslova sredine, ponajviše količine nutrijenata
• metabolički slične populacije MO koje koriste isti resurs
na sličan način čine ESNAF
• stanište koje dele članovi esnafa a koje obezbeđuje
nutrijente i druge uslove je NIŠA
• grupe esnafa formiraju zajednice
Ekologija mikroorganizama
Energija u mikroekosistemu
• energija protiče kroz ekosistem
• ulazi kao sunčeva svetlost, redukovana neorganska jedinjenja i organska jedinjenja
• fotoautotrofi transformišu svetlosnu energiju u hemijsku u sintetisanim organskim jedinjenjima
• hemolitotrofi fiksiraju CO2 i doprinose pulu org. mat.
• ta autohtona org. jedinjenja zajedno sa alohtonim (ona koja ulaze u ekosistem spolja) pokreću kataboličku aktivnost heterotrofa
• heterotrofi oksiduju org. materiju do CO2 procesom disanja i fermentacije
• materija kruži u ekosistemu
• biogeohemijski ciklusi kruženja elemenata
Populacije, esnafi i zajednice
jezerskog ekosistema
Energija u mikroekosistemu
• biogeohemijski ciklus definiše transformaciju elemenata koja je katalizovana bilo hemijskim bilo biološkim (ili oba) agensima
• u mnogim slučajevima MO su jedini biološki agensi koji mogu regenerisati neke forme elemenata
• biogeohemijski ciklus = kruženje nutrijenata
• oksido-redukcione reakcije
• često su ciklusi različitih elemenata povezani
• S i C, npr.
Populacije, esnafi i zajednice
jezerskog ekosistema
Sredina i mikrosredina
• Mikroorganizami - veoma intiman kontakt sa spoljašnjom sredinom (velika površina ćelija prema zapremini), otuda i posebna osetljivost na promene činilaca spoljašnje sredine (t , pH, svetlost, koncetracije organskih i neorganskih jedinjenja, voda, itd.)
• uslovi mikrosredine (sredine koja neposredno okružuje ćelije mikroorganizama) su vrlo značajni
• podložni brzim i čestim promenama uslova
• na ograničenom prostoru veliki broj mikrostaništa
• za bakteriju koja raste i razmnožava se u grumenu zemlje mikrosredina je mnogo važnija od makrosredine (odnosno šume ili polja) u kojoj se grumen nalazi
Distribucija kiseonika u čestici zemljišta
• primarna niša – sredina u kojoj je MO najuspešniji
• može da opstane i izvan primarne niše gde je manje ekološki uspešan
• fundamentalna niša – pun raspon sredinskih uslova pod kojima neki MO može da raste
• niša ≠ mikrosredina
• mikrosredina je specifična lokacija unutar niše
Sredina i mikrosredina
Količina nutrijenata i brzina rasta mikroorganizama izvan
laboratorije
• eksponencijalan rast izuzetno redak
• u ekosistemu (mikrosredini) MO rastu na mahove
• količina i distribucija nutrijenata predstavlja ograničavajući faktor
• vreme generacije E. coli u crevima 12h u labu 20min
• mešovite populacije naspram čiste kulture
• kompeticija i kooperacija
Smena generacija u mikroekositemu
• promena uslova sredine utiče na promenu broja i vrste MO u mikroekosistemu - sukcesija
• dominantna vrsta može biti zamenjena vrstom koja je bila u manjini ako se sredina promenila u korist malobrojne
• sirovo mleko
• Rhodobacter (u uslovima odsustva svetlosti populaciju koja proizvodi fotosintetičke pigmente će veoma brzo zameniti mutantni soj koji ih ne proizvodi)
• bakterije rezistentne na antibiotike
Smena generacija u sirovom mleku
Promene u populaciji Rhodobacter
izazvane promenom svetlosnog režima
• zajednica ćelija MO prilepljenih za neku površinu i obuhvaćenih adhezivnim matriksom koje same produkuju
• funkcionalna zajednica koja raste, ne prosta nakupina ćelija
• matriks – smeša polisaharida koji sadrži i proteine i nukleinske kiseline
• funkcioniše kao lepak i zamka za nutrijente
• biofilm obično gradi nekoliko poroznih slojeva
• zajednica 1, 2 ili više vrsta MO
• biofilm na zubima (plak) gradi nekoliko stotina vrsta bakterija i arhea
• inherentna osobina biofilma – tolerancija na antibiotike i toksine (posledica sporijeg rasta i fizičke nedostupnosti)
Biofilm
• započinje prilepljivanjem nekoliko prethodno pokretnih ćelija za neku površinu (pilima, bičem, specijalnim proteinima...)
• lepljenje za površinu je signal za ekspresiju gena specifičnih za biofilm (intracelularni signalni molekuli koji pokreću formiranje matriksa)
• ćelije gube bič, dele se i komuniciraju sa drugim ćelijama
• prelazak sa planktonskog na sesilni način života (u biofilmu) okida c-di GMP kao sekundarni mesendžer
• prenosi signale iz sredine do ćelijske mašinerije koja generiše odgovor na sredinske uslove (pokretljivost, virulenciju, formiranje biofilma)
• vezuje se za proteine koji moduliraju aktivnost motora flageluma i enzime koji učestvuju u nastanku matriksa
• osim interćelijske potrebna je i intraćelijska komunikacija za razvoj i održavanje biofilma
• quorum sensing
Formiranje biofilma
Formiranje biofilma u čeličnoj cevi za vodu
Zašto biofilm?
1. Vid mikrobijalne samoodbrane koja poboljašava preživljavanje
- biofilm se opire fizičkim silama koje bi inače mogle otkloniti slabo pričvršćene ćelije na nekoj površini
- biofilm odoleva fagocitozi (ćelija imunskog sistema)
- sprečava/smanjuje penetraciju antibiotika i toksina
2. Omogućava ostanak u najpovoljijoj ekološkoj niši
3. Bolja ćelijska komunikacija povećava preživljavanje
4. Tipičan način rasta MO u prirodi („default mode“ za rast prokariota)
Kontrola formiranja biofilma
• izuzetno teška a neophodna
• u medicini i industriji štete od formiranja biofilma mogu biti velike i opasne
• radi se na antimikrobnim agensima koji mogu da prodru u strukturu biofilma ili da spreče samo formiranje biofilma sprečavajući interćelijsku komunikaciju
• furanoni obećavaju kao preventiva za formiranje biofilma na površinama
Mikrobijalni tepih (mat)
• ekstremno debeli biofilm
• grade ga ili cijanobakterije ili hemolitotrofi kao primarni producenti
• ekosistem za sebe
• cijanobakterijski tepih danas ograničen uglavnom na tople izvore i hiperslana staništa
• u ostalim vodenim ekosistemima kompeticija je prejaka
• hemolitotrofni tepih – na površini morskih sedimenata
• sulfat-redukujuća Thioploca sa vakuolama ispunjenim nitratom
Mikrobiologija zemljišta
• kopnena staništa koju čine 2 tipa sredine:
- samo zemljište
- voda u zemljištu i stenama
• Zemljište se razvija tokom dugo vremena kroz kompleksne interakcije materijala (stene, pesak, glina...), topografije, klime i živih organizama
• 2 tipa zemljišta:
- mineralna, od stena i drugog neorganskog materijala (dominantan tip)
- organska, od sedimenata u močvarama i barama
• većina zemljišta predstavlja kombinaciju ova dva tipa
Sastav i formiranje zemljišta
• najmanje 4 komponente:
- neorganske mineralne materije ≈ 40%
- organske materije ≈ 5%
- voda i vazduh ≈ 50%
- mikro- i makroorganizmi ≈ 5%
• na osnovu veličine čestica
pesak > mulj > glina
• nastanku doprinose hemijski, fizički i biološki procesi
• formiranje može trajati stotinama do hiljadama godina
Sastav i formiranje zemljišta
• površinu prvobitno kolonizuju alge, lišaji i mahovine
• proizvedene org. materije podstiču razvoj kompleksnih zajednica hemoorganotrofnih bakterija i arhea
• CO2 iz disanja + voda = H2CO3 koja polako rastvara stene + fizički faktori, produbljuje se profil
• biljke i drveće korenima nastavljaju usitnjavanje, umiranjem obogaćuju zemljište i pospešuju razvoj MO
• oko korenova – rizosfera
• zemljišne životinje doprinose aeraciji
Zemljište kao mikrobijalno stanište
• najekstenzivniji rast na česticama zemljišta blisko površini, u obliku mikrokolonija, u rizosferi
• 1 čestica može da sadrži nekoliko različitih mikrosredina i da podržava rast različitih fizioloških grupa MO
• glavni faktor koji utiče na aktivnost MO je voda koja se može naći u obliku:
- vezane vode (adsorbovana na površini čestica)
- slobodne vode (u obliku filma između čestica)
• dobro oceđena zemljišta su dobro aerisana dok zabarena zemljišta nude samo O2 rastvoren u vodi
• drugi faktor po važnosti – količina nutrijenata (često su limitirajući faktori količina fosfora i azota)
Filogenetska raznovrsnost MO u zemljištu
• mera prokariotskog diverziteta – sekvence gena za 16S rRNK
• filotip – vrsta na osnovu razlike veće od 3% na nivou sekvence gena za 16S rRNK
• površinski sloj zemljišta podržava hiljade raličitih vrsta u 1g
• diverzitet varira u odnosu na tip zemljišta i geografski položaj
• proporcionalna zastupljenost tipova (phylum) prokariota u različitim zemljištima je relativno konstantna
• zastupljenost konkretnih vrsta može značajno da varira
• bakterije zastupljene velikim diverzitetom
• diverzitet arhea minimalan
Filogenetska raznovrsnost MO u zemljištu
Podpovršinski sloj zemlje
• podzemne vode – raširena a slabo istražena sredina za razvoj MO
• MO ima do najmanje 3 km u dubinu zemlje
• čak do 40% ukupne globalne biomase
• mikrobiološki sastav plitkih površinskih voda vrlo je sličan sastavu zemljišta u istom profilu (isti uslovi)
• dublje podpovršinske vode imaju značajno različite sredinske uslove (temperatura iznad 50ºC, anaerobija, limitirani nutrijenti)
• akvifer – podzemni sloj poroznog materijala koji sadrži vodu
• period zadržavanja vode – nedelje do milioni godina (zavisi od dubine sloja i „dopunjavanja“ površinskom vodom)
• alopatrična specijacija
Mikrobiologija dubokog podpovršinskog sloja
• hemolitotrofni i autotrofni pripadnici bakterija i arhea
• izvor redukujuće snage H2 koji nastaje radiolizom vode ili tokom oksidacije minerala
• model fiziologije za duboki podpovršinski sloj: auksotrof, termofil koji oksiduje vodonik i redukuje sulfate (hemolitotrof) a poseduje i gene za fiksaciju azota (vrlo niski nutritivni zahtevi)
• MO izolovan iz rudnika zlata u J. Africi sa dubine od 3km
• broj MO varira u redovima magnitude (102-108), zavisno od dubine sloja i raspoloživosti nutrijenata
• rast spor, vreme generacije može da se meri i desetinama godina
• značajnija istraživanja tek predstoje
Mikrobiologija vode
Slatkovodna staništa
• fototrofi koji proizvode O2 – alge i cijanobakterije (planktonske i bentosne) =
primarni producenti
• diverzitet i brojnost heterotrofa zavise od produktivnosti primarnih producenata
• ako je produktivnost visoka – heterotrofi troše više kiseonika što dovodi do stvaranja anaerobnih uslova u dubljim slojevima vode
• takvi uslovi pogoduju MO koji vrše anaerobnu fotosintezu (gde je svetlost dostupna), respiraciju i fermentaciju
Mikrobiologija vode
Slatkovodna staništa
• u jezerima stub vode je stratifikovan:
- epilimnion (površinski topli sloj, dobro osvetljena trofogena zona u kojoj se odvijaju procesi primarne produkcije)
- hipolimnion (dublji sloj – niska temperatura vode, trofolitički sloj koji se odlikuje odsustvom svetlosti i u kome dominiraju procesi razgradnje organske materije)
• povezuje ih termoklina (neujednačena temperatura)
• transfer kiseonika (i dr.) između slojeva samo difuzijom (sporo)
• dublji slojevi mogu ostati bez kiseonika
• „prevrtanje vode“ u kasnu jesen
Mikrobiologija vode
Slatkovodna staništa
• efekat upliva veće količine nutrijenata u sistem
• dolazi do deficita O2
• meri se kao BOD (biochemical oxygen demand)
• mera količine org. materija koja može biti oksidovana od strane MO u vodi
• veći BOD = manje kiseonika
• povezanost ciklusa ugljenika i kiseonika
• eutrofikacija („cvetanje vode“)
• vode imaju potencijal samoprečišćavanja (autopurifikacije)
Mikrobiologija vode
Okeani i priobalje
• otvoreno more (pelagijal) – zona sa niskim sadržajem i slabim protokom nutrijenata
• oligotrofi izuzetno malih dimenzija (potrebno manje energije za održavanje ali i više transportnih enzima da bi mogli da pribave nutrijente)
• priobalna zona – više nutrijenata, veća i brojnost MO
• tipični pelagijski primarni producent – Prochlorococcus (Prochlorophytes)
• srodnik cijanobakterija koji čini do ½ fotosintetičke biomase u tropskim i suptropskim morima
• nekoliko različitih ekotipova koji fotosintetišu pri različitim intenzitetima svetlosti – stratifikovani od 0-200m dubine
• cijanobakterije, alge malih dimenzija
• aerobni anoksični fotosintetski MO (ATP iz svetlosti, C iz organskih jedinjenja)
Prochlorococcus
Trichodesmium
Mikrobiologija vode
Okeani i priobalje
• od prokariota, u površinskim vodama pelagijala (do
1000m) dominiraju bakterije
• ispod 1000m ravnomerno zastupljene bakterije i arhee
• pelagijske bakterije i arhee ekološki značajne zato što vraćaju C u lanac ishrane okeana
• jedino prokarioti mogu da iskoriste veliku količinu rastvorenih org. materija u okeanima što vraća C u lanac ishrane kad budu pojedeni
• to je neka vrsta sekundarne produkcije
• sve je uravnoteženo predatorstvom (protista) i virusima
• „near-steady state“
zastupljenost A i B u severnom
pacifiku
Mikrobiologija vode
Okeani i priobalje
• Pelagibacter
• oligotrof (heterotrof koji zahteva niske koncentracije org. materija) malih dimenzija, zastupljen sa 105-106/ml
• najmanji genom slobodnoživeće bakterije (1.3 Mbp) koji kodira neuobičajeno veliki broj transportera
• proteorodopsin (srodan bakteriorodopsinu) – protonska pumpa na čiji račun se sintetiše ATP i tako se suplemetira slaba ishrana
• morski virusi
• do 107/ml
• većina bakteriofagi
• regulatori brojnosti prokariota na nivou na kome ekosistem može da funkcioniše
• pokretači razmene genetskog materijala
Pelagibacter
Mikrobiologija vode
Duboko more i sediment
• ispod 300m dubine, potpuno odsustvo svetlosti
• ispod 1000m – minimum biološke aktivnosti
• 3 ekstrema: niska temperatura, visok pritisak i malo nutrijenata
• pijezotoleranti (trpe pritisak do 500 atm ali bolje rastu pri 1atm)
• pijezofili (bolje rastu pri visokom pritisku)
• ekstremni pijezofili (do 10000m dubine)
• bakterije i arhee – do 1600m u sedimentu
• ispod 1 m dominiraju arhee iz tipa Euriarchaeota
Uzorkovanje sedimenta dubokog
mora
Mikrobiologija vode
Hidrotermalni ventili
• visok pritisak ali toplo i nutrijenata (neorganskih) može biti u izobilju
• hemolitotrofi
• hipertermofili i termofili koji žive u temperaturnom gradijentu
• ogroman bakterijski diverzitet i ograničeni diverzitet arhea (ALI arhee dominiraju u uzorcima sa samih zidova „dimnjaka“)
„crni dimnjaci“
krečnjačke formacije
FISH uzorka crnog
dimnjaka