Organización genética y regulación

Regulación

Proteínas

ARN-Polimerasa

ADNGen

Ausencia de sustrato

ADNGen

Presencia de sustrato

Regulador

ARN-Polimerasa

ARNRegulador

+

GenesADN

Gen

Ribosomas

ARN

Proteínas

ARN-Polimerasa

Reguladores

Operón

Proteínas

K

F

B

T

O

Tn4653

IN

X K

Tn4651

B H

FVD

xylR

xylS

D

A

E

E

JC

P

meta

A

D

GQ

F upper

I

E

H

A

G

S

G

CJ

C

MR

JL B

H

pWW0

XhoI

EcoRI

HindIII

Tra/Rep

tnpT

res

tnpS

tnpA

tnpA(Tn4653 )

117 kb

Operón

Operón(Tn4561 )

pWW0

P. putida mt-2

• Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca)

• Mutagénesis al azar• Mapeo y localización de los mutantes

(secuenciación)• Análisis bioquímico: identificación de gen-función

CH3 COOH

Krebs

tolueno benzoato

U W C M A B Nxyl

Operón upper

X Y Z L T E FG J Q K HI S R

Operón meta

Organización genética

Regulación de la expresión

Determinar actividades en células creciendo en distintos medios:No-sustrato de la ruta (acetato)Sustratos de la ruta upperSustratos de la ruta meta

Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD

Acetato - - - -Tolueno + + + +Bencilalcohol + + + +Benzoato - - + +3-metilbenzoato - - + + Acetato + Tolueno + + + +

TODAS las actividades son inducibles

Sustratos de la ruta meta sólo inducen a la ruta metaSustratos de la ruta upper inducen tanto a la ruta upper

como a la ruta meta

Mutante PaW210:

Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD

Acetato - - - -Tolueno - - - -Bencilalcohol - - - -Benzoato - - + +3-metilbenzoato - - + +

Ruta upper NO es inducibleRuta meta SÓLO es inducible por sustratos de meta

xylRxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu Pm

upper meta

tolueno

+Reguladores

XylR

+

benzoatos

xylS

XylSEsquema de regulación

?

CH3 COOH

Krebs

tolueno benzoato

Fusiones transcripcionalesHuésped heterólogo (Escherichia coli)

Examinar regulación en AUSENCIA de las rutas

Promotor Gen marcador desprovisto de promotor propio

xylS xylR Pm:: ‘lacZ

E. coli

E. coli (pKT570, pJLR107)

Inductor Actividad -galactosidasa

Ninguno -3-metilbenzoato + Xyleno +

• Xyleno NO tiene que ser metabolizado para activar la ruta meta

Expresión de XylS en P. putida mt-2

Xyleno (XylR) activa la síntesis de XylS

Altas concentraciones de XylS en la células activan la ruta meta en ausencia de inductor

P. putida (pWW0)

Inductor niveles de mRNA de xylS

Ninguno 103-metilbenzoato 10Xyleno 100

xile

no

xylS

3-m

etilb

enxz

oato

ning

uno

+Pr1Pr2 xylRPs1xylSxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu

+

tolueno

+

benzoatos

Ps2Pm

upper meta Reguladores

XylR

XylS

CH3 COOH

Krebs

tolueno benzoato

BenR

32/38

+Pr1Pr2 xylRxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu

+

- -

-

tolueno

+

54

IHF

Ps2

benzoatos

Pm

upper meta Reguladores

54

+

70

+

IHF

-

XylS

XylR

Ps1xylS

Reguladores

• Activa a los promotores Pu y Ps

• Es dependiente de 54 (familia NtrC)

• Reprime su propia expresión

• IHF activa en Pu y reprime en Ps

• En Ps HU es necesaria

• Requiere activación por un efector

• Represión dependiente de la presencia

de otras fuentes de C

XylR

A

C

A B C D

85Pro Ser

135Asp Asn

172Glu Lys

Perfil de efectores

Mutagénesis química

Regulador - 3-MBA 2NT 3-NT

XylR 180XylR6 1150XylR49 1500XylR7 150XylR49-7 70

105019002600900150

1000290035501050950

90450

30001000450

CH3

NO2

CH3

NO2

CH2OH

CH3

Reprimido

C

Regulador XylR

Deleción

ConstitutivoActivado por el efector

(desreprimido)

O‘Neill & al., 1998

ADP + Pi

ATP

A

C

ADP + Pi

ATP

C

A

Activación de un regulador

Represión catabólica

Crecimiento

Exp

resi

ón

de

la r

uta

u

pp

er

Inductor

Medio rico

Tasa de dilución (h-1)

Exp

resi

ón

de

la r

uta

u

pp

er

Cultivo contínuo(limitación de C)

0.05 0. 5 0.75

Limitación

Exp

resi

ón

de

la r

uta

u

pp

er

Cultivo contínuo (0.05 h-1)

C O2N PS

Sistema PTSCRC?Otro?

54-polimerasa

xylS xylR

XylR

IHFIHF

70-polimerasa

XylR Activa ReprimeIHF Facilita Impide54 +

Efector +

¿ Represor?

Elementos que participan en la regulación

Reguladores

XylS

• Activa al promotor Pm

• Pertenece a la familia AraC

• Es dependiente de 32 y 38

Extremo N-terminal

Extremo C-terminal

1 2 3 4 765

• Requiere activación por un efector

Crecimiento

Exp

resi

ón

de

la r

uta

m

eta

Inductor

32 38

- 39 2FBz 343

Bz 6369 3FBz 6801

2MBz 2724 4FBz 2886

3MBz 13452 2ClBz 141

4MBz 3377 3ClBz 9034

2,3DMBz 6491 4ClBz 2991

2,4DMBz 1737 2,6DClBz 397

2,5DMBz 4093 3,5DClBz 381

2,6DMBz 383 2BrBz 547

3,4DMBz 4630 3BrBz 5372

3,5DMBz 385 4BrBz 1726

Pm :: ‘lacZ

XylS

COOH

X

Efector Actividad Efector Actividad

XylS

• Mutagénesis química de XylS (NTG)

• Selección de resitencia a Tetraciclina:

- Constitutiva.

- Inducible por distintos efectores.

• Identificación del residuo mutado

Extremo N-terminal

Extremo C-terminal

Motivo HTH-1 Motivo HTH-2

1 2 3 4 765

Unión del efector

Pm :: tet

0 2 4 6 8

0

4000

8000

Time (h)

-g

alac

tosi

das

e (M

iller

U) wt

rpoS

rpoH

rpoSrpoH

XylS/Pm:lacZ

Proteínas desnaturalizadas

estress

Promotores dependientes de 32

32

+

Respuesta HS

DnaKJ

NO estress -

Proteínas desnaturalizadas

estress

DnaKJ

Promotores dependientes de 32

32

+

Respuesta HS

0

5

10

15

20

3-metilbenzoato

-G

ala

cto

sid

as

e (M

ille

r U

)

PrpoDhs-lacZ

Respuesta a choque térmico

HS

FtsH

32

38Faseestacionaria

54

IHF

70

Limitaciónanabólica

-

XylS

XylR

(XylR)

Pm+

Pu+

COOH

benzoato

CH3

tolueno

• Plásmido

Transferible

Incidencia sobre otras poblaciones

Tol tiene además 2 transposones!

Inestable%

cél

ulas

TO

L+

100

50

0

tiempo

benzoato

o-xyl

tolueno

Retrotransferencia

Consecuencias

• Represión catabólica: MEZCLAS

• Activación del regulador: INDUCIBILIDADLa inacapacidad de una cepa para degradar un determinado compuesto aromático puede tener dos causas:

- Enzima(s) no reconocen el sustrato- El regulador no reconocen al inductor, no se activa la

ruta

CH3 CH3OH

CH3

OH

OH

o-cresoltolueno 3-metilcatecol

H3C

OH

OH

H

H

CH2OH CHO COOH

H

HOOC OHOH

CH3

OH

CH2OH

OH

CHO

OH OH

COOH

CH3

OH

OHOH

COOH

OH

OH

ORTO

(ORTO)

cis-toluenodihidrodiol

m-cresol

META

alcoholbencílico

benzaldehído benzoato cis-benzoatodihidrodiol

catecol

p-cresol alcoholp-hidroxibencílico

p-hidroxi-benzaldehído

p-hidroxi-benzoato

protocatecuato

META

P. putida mt-2

P. putida F1

B. cepacia G4

R. pickettii PK01

P. mendocina KR1

TOL

TOD

TOM

TBU

T4MO

benABC(DKEF)PbenAbenR PbenR

benzoato XylS

+

pcaK pcaF pcaTB(DC)pcaRPpcaR

-cetoadipato

+-PpcaK PpcaF PpcaT pcaIJPpcaI

++ +

Cromosoma (ruta orto)

P. putida mt-2

catBCAPcatBcatR PcatR

+

-

cis,cis-muconato

COOHO

OCOOHCOOH

O

OH

OH

COOHCOOH COOH

OO

-cetoadipato enol lactona -cetoadipatocatecol cis,cis-muconato muconolactona

ABC1X DR* F E IG HC2tod TS

CH3

Krebs

tolueno

cromosoma

todXFC1C2BADEGIH todSTPtodX PtodS

P-

-P

+

tolueno

Tolueno dioxigenasa +

meta

Reguladores

P. putida F1

TOD

tbm A B C D E F

CH3

tolueno

CH3

o-cresol

OHCH3

OH

OH3-metilcatecol

Tolueno 2-monooxigenasa

tbmABCDEFPtbmAtb4m

tolueno

tbmR

54

++

Regulador Tolueno/benceno 2-monooxigenasa

Tolueno4-monooxigenasa

Burkholderia sp. JS150

TOM

plásmido

B

CH3

tolueno

CH3

m-cresol

CH3OH

OH3-metilcatecol

OHKrebs

Operón meta Tolueno3-monooxigenasa

Fenolhidroxilasa

Proteína demembrana

tbuR tbuS tbuA1UVBVA2CTPtbuA1 tbuX PtbuX

70?54 54

JIKGFEW tbu PtbuW tbuD PtbuD

54ANR?54

tolueno

tolueno

+ +++

meta Tolueno 3-monooxigenasa+

regulador

Fenol hidroxilasa Proteína demembrana

Reguladores

tolueno

Ralstonia pickettii PKO1

TBU

tbu A1U VA2 C T XD R SF E WI K GJ H

cromosoma

tmo A BC

DE FpcuCAB pobA

p-cresol metilhidroxilasa+

p-hidroxibenzaldehídodeshidrogenasa

Tolueno4-monooxigenasa

CH3 CH3

OH

COOH

OH

COOH

OHOH

Krebs

tolueno

p-cresol p-hidroxibenzoato

protocatecuato

p-hidroxibenzoatohidroxilasa

P. mendocina KR1

T4MO

cromosoma

A DB C E GF IHbbs

CO SCoA

CH3

HOOCCOOH

COOH

COOH

benzoilCoA

tolueno

bencilsuccinato

fumarato

acetilCoA + CO2

COOH

CSCoAO

HO

3-hidroxipimelilCoA

fdx

hadoah

dch

bcr

B A DC

benzoilCoA reductasa

Thauera aromatica K172

D C A BS Rtdi bss

reguladores bencilsuccinato sintetasa

?

E C D ?tuttutB

tdiSRPtdiS

P-

-P

bssDCABPbssD

+

tolueno

Bencilsuccinato sintetasaReguladores

Thauera aromatica K172

Características de la regulación

En todos los casos estudiados, las enzimas sólo están presentes cuando las células se cultivan en presencia de tolueno:INDUCIBLES

Sometidos a represión catabólica

Reguladores del tipo de 2 componentes

Expresión reprimida en presencia de O2

AadR (FNR) Activación en respuesta a anaerobiosis

Cuando la cepa puede degradar tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, las rutas y su regulación son distintas.

Anaerobias facultativas