OPTIMIZACIJA METODE ZA OCENJEVANJE ...Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. III Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru,

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

Barbara OSWALD

OPTIMIZACIJA METODE ZA OCENJEVANJE

ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI Z UPORABO

BARVILA DCFH-DA NA CELIČNI LINIJI TLT

MAGISTRSKO DELO

Maribor, 2016

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

VARNOST HRANE V PREHRAMBENI VERIGI

Barbara OSWALD

OPTIMIZACIJA METODE ZA OCENJEVANJE

ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI Z UPORABO

BARVILA DCFH-DA NA CELIČNI LINIJI TLT

MAGISTRSKO DELO

Maribor, 2016

POPRAVKI

Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. III

Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016

Komisijo za zagovor in oceno diplomskega dela so sestavljali:

Predsednik: izr. prof. dr. Metka ŠIŠKO

Mentor: izr. prof. dr. Tomaž LANGERHOLC

Član: viš.pred. mag. Maksimiljan BRUS

Lektor: Ana Žagar

Magistrsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Datum zagovora: 05. januar 2017

Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. IV


Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti z uporabo barvila

DCFH-DA na celični liniji TLT

UDK: 577:577.164.2(043)=163.6

Na modelni makrofagni človeški celični liniji TLT smo optimizirali celično metodo z uporabo barvila

DCFH-DA (2´,7´-diklorofluorescin-diacetat) za določevanje pro- in antioksidativne aktivnosti modelnih

substanc vitamina C in troloksa. Ugotavljali smo najprimernejše število celic na vodnjak, optimalen

inkubacijski čas in koncentracijo testnih substanc ter najprimernejši vrstni red nanosa reagentov. Vrednost

fluorescence v testu z DCFH-DA je bila linearno odvisna od števila celic na vodnjak, vendar le v odsotnosti

oksidanta t-BuOOH (tert-butilhidroperoksid). Pri eksperimentih se lahko uporablja širok interval

koncentracije celic, saj so vse vrednosti izmerjene fluorescence še vedno bile v območju detekcije aparata.

Optimalen inkubacijski čas troloksa je od 1 do 2 uri, vitamina C pa 6 ur ali več. Visoke koncentracije tako

troloksa kot vitamina C lahko vplivajo na nastalo fluorescenco, če sta prisotna v fazi merjenja. Optimalna

vrstna reda nanosa reagentov sta bila testna substanca - DCFH-DA - t-BuOOH in t-BuOOH - testna

substanca – DCFH-DA.

Ključne besede: antioksidativna aktivnost / DCFH-DA / celice / vitamin C / troloks

OP: IX, 57 s., 6 sl., 9 pregl., 14 graf., 53 ref.

Method optimization for TLT cell line based antioxidant activity assay using DCFH-

DA fluorescent probe

We have optimized a TLT cell-based method using 2´,7´-dichlorofluorescin-diacetate (DCFH-DA) to assess

the pro- and antioxidative activity of model substances vitamin C and trolox. We tried to determine the most

appropriate number of cells per well, optimal incubation time and concentration of tested substances and the

most appropriate order of reagent application. The fluorescence value in DCFH-DA assay was linearly

dependent on the number of cells per well, but only in absence of the oxidant t-BuOOH. A wide range of cell

concentrations can be used in this assay, that were within limits of instrument sensitivity. Optimal incubation

time for trolox was 1 to 2 hours, while 6 or more hours are required for vitamin C. If those antioxidants are

present while the measurement is conducted, their high concentrations can influence the resulted

fluorescence. The most appropriate orders of reagent application were tested substance - DCFH-DA - t-

BuOOH and t-BuOOH - tested substance - DCFH-DA.

Key words: antioxidant activity / DCFH-DA / cells / vitamin C / trolox

NO: IX, 57 P., 6 Pic., 9 Tab., 14 Graph., 53 Ref.

Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. V


Kazalo vsebine

1 UVOD 1

2 PREGLED OBJAV 3

2.1 Reaktivne kisikove zvrsti ter oksidativni stres 3

2.2 Delovanje antioksidantov 4

2.2.1 Celični antioksidativni sistemi 5

2.3 Antioksidativne lastnosti vitamina C in troloksa 6

2.4 Metode za določevanje antioksidativne aktivnosti 9

2.4.1 Metode in vitro za določevanje antioksidativne aktivnosti 9

2.4.2 Celični testi za določevanje antioksidativne aktivnosti 10

2.4.3 Antioksidativni celični test z uporabo 2´,7´– diklorofluorescein diacetata

(DCFH-DA) 11

3 MATERIALI IN METODE 15

3.1 Kemikalije 15

3.1.1 Priprava raztopine DCFH-DA 15

3.1.2 Priprava tert-butil hidroperoksida (t-BuOOH) 15

3.1.3 Priprava raztopine vitamina C oz. askorbinske kisline 16

3.1.4 Priprava raztopine troloksa 16

3.1.5 Priprava HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) 16

3.2 Celična linija 17

3.2.1 Presajanje celic 17

3.3 Test za merjenje antioksidativne aktivnosti na celicah 18

3.3.2 Določitev stopnje »zadušitve« fluorescence (Fluorescence quenching) 18

3.3.3 Optimizacija gostote / števila celic na posamezen vodnjak 19

3.3.4 Optimizacija inkubacijskega časa inkubacije celic s testnimi substancami 20

3.3.5 Optimizacija koncentracije testnih substanc 22

3.3.6 Optimizacija vrstnega reda nanosa reagentov 23

3.3.7 Obdelava rezultatov 23

4 REZULTATI Z RAZPRAVO 25

Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. VI


4.1 Določitev stopnje »zadušitve« fluorescence (fluorescence quenching

assessment) 25

4.2 Določitev optimalnega števila celic na vodnjak 28

4.3 Določitev optimalnega inkubacijskega časa testnih substanc 30

4.4 Določitev optimalne koncentracije testnih substanc 38

4.5 Določitev optimalnega zaporedja nanosa reagentov 40

5 SKLEPI 49

6 VIRI 51

ZAHVALA 56

Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. VII


Kazalo grafikonov

Grafikon 1: Grafični prikaz intenzitete fluorescence DCF v odvisnosti od

koncentracije troloksa. ............................................................................... 26

Grafikon 2: Grafični prikaz intenzitete fluorescence DCF v odvisnosti od

koncentracije vitamina C.. ......................................................................... 27

Grafikon 3: Grafični prikaz intenzitete fluorescence pri različnih koncentracijah

DCF v odsotnosti testnih substanc. ............................................................ 28

Grafikon 4: Inteziteta fluorescence v odvisnosti od časa in števila celic na

vodnjak (brez dodatka t-BuOOH).. ............................................................ 29

Grafikon 5: Inteziteta fluorescence v odvisnosti od časa in števila celic na

vodnjak (z dodatkom t-BuOOH).. ........................................................... 30

Grafikon 6: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100

%) po 1 uri inkubacije testnih substanc s celicami. ................................... 31


%) po 2 urah inkubacije substratov s celicami. ......................................... 33


%) po 3 urah inkubacije substratov s celicami.. ........................................ 34


%) po 6 urah inkubacije substratov s celicami.. ........................................ 36

Grafikon 10: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo

(100 %).. ................................................................................................... 39


%), pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: t-

BuOOH, testna substanca, DCFH-DA.. ................................................... 41


%), pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: t-

BuOOH, DCFH-DA, testna substanca.. ................................................... 43


%), pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: testna

substanca, DCFH-DA, t-BuOOH.. ........................................................... 45

Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. VIII



%), pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju:

DCFH-DA, testna substanca, t-BuOOH. .................................................. 47

Kazalo slik

Slika 1: Oksidacija askorbinske kisline (AH-) z dvema zaporednima korakoma

eno-elektronske oksidacije do askorbinskega radikala (A•-) in

dehidroaskorbinske kisline (DHA) (Carr in Frei 1999). ....................................... 7

Slika 2: Strukturna formula vitamina E (zgoraj) in troloksa (spodaj) (Wattamwar

in sod. 2010). ......................................................................................................... 8

Slika 3: Znotrajcelična redoks kemija 2′,7′-diklorofluorescin diacetata (DCFH-

DA) (Dikalov in Harrison 2012). ........................................................................ 11

Slika 4: Eksperiment optimizacije števila celic na vodnjak na mikrotitrski plošči

(sivo obarvani vodnjaki so prazni). .................................................................... 20

Slika 5: Prikaz nanosa testnih substanc na mikrotitrske plošče. ...................................... 21

Slika 6: Prikaz redčitev substanc na mikrotitrski plošči z začetno koncentracijo 10

mM in redčitvami v razmerju 1:4. ..................................................................... 22

Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. IX


Kazalo preglednic

Preglednica 1: Statistično značilne razlike v fluorescenci med pozitivno kontrolo in

testnimi substancami v različnih koncentracijah po 1 h inkubacije. .......... 32


testnimi substancami v različnih koncentracijah po 2 h inkubacije. ........ 33






testnimi substancami z začetno koncentracijo 10 mM. ............................ 40


testnimi substancami, pri čemer so reagenti bili dodani v sledečem

zaporedju: t-BuOOH, testna substanca, DCFH-DA. ............................... 42



zaporedju: t-BuOOH, DCFH-DA, testna substanca. ............................... 44



zaporedju: testna substanca, DCFH-DA, t-BuOOH. ............................... 46



zaporedju: DCFH-DA, testna substanca, t-BuOOH. ............................... 48

Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. 1


1 UVOD

Reaktivne kisikove / dušikove zvrsti (reactive oxygen /nitrogen species - ROS / RNS)

igrajo ključno vlogo pri srčnožilnih boleznih, vnetjih, nevrodegenerativnih okvarah,

rakavih obolenjih in staranju (Girard-Lalancette in sod. 2009). Med ROS/RNS spadajo

superoksidni anionski radikal, hidroksil, alkoksilni in peroksilni radikali, dušikov oksid in

peroksinitrit (Pisoschi in Pop 2015). Te spojine lahko reagirajo in uničijo različne celične

komponente, kot so proteini, lipidi in DNK. Kadar se ROS/RNS tvorijo v živih sistemih (in

vivo), nastopijo različni antioksidanti (Halliwell 1996). Celica je razvila več

antioksidativnih encimatskih sistemov, ki jo ščitijo pred ROS/RNS. Glavni antioksidativni

encimi so SOD (superoksidna dizmutaza), katalaza in GPX (glutation preoksidaza) (Matés

in Sánchez-Jiménez 1999). V zdravi celici je poskrbljeno za ravnotežje med tvorbo

ROS/RNS (oksidanti) in uničenje le-teh z antioksidativnimi sistemi, medtem ko nagibanje

k oksidantom, imenovano tudi oksidativni stres, lahko vodi do uničenja celice (Sies 1997).

Širša definicija antioksidantov se glasi: antioksidant je vsaka snov, ki že v majhnih

koncentracijah v primerjavi s tistimi, ki substrat oksidirajo, preprečijo, ali zakasnijo

oksidacijo tega substrata (Halliwell 1996). Hrana, bogata z antioksidanti, kot sta sadje in

zelenjava, lahko pomaga preprečiti tovrstna obolenja (Girard-Lalancette in sod. 2009).

Zaradi tega je začelo naraščati zanimanje za raziskave o vlogi rastlinskih antioksidantov v

hrani in pri človekovem zdravju. Danes obstaja že več metod in vitro za določevanje

oziroma ocenjevanje antioksidativne aktivnosti sestavin hrane, ki temeljijo na spremembi

absorpcijskega koeficienta v vidnem delu spektra po kemijski redukciji

radikala/molekule/iona, ki jo antioksidant reducira. Najpogosteje uporabljene med njimi so

metoda ABTS (2,20-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina), metoda DPPH (2,2-

difenil-1-pikril-hidrazil), Fe3+ - Fe2+ transformacijski test, metoda FRAP (ferric reducing

antioxidant power – sposobnost aktioksidantov, da zreducirajo železo) in Folin - Ciocalteu

metoda (določanje skupnih fenolnih spojin s Folin - Ciocalteu reagentom (Gülçin 2012).

Vendar so vse naštete metode pogosto zelo specifične za en mehanizem delovanja (Girard-

Lalancette in sod. 2009) in ne upoštevajo fiziološkega stanja celice, biodostopnosti

molekule antioksidanta ter celotnega metabolizma celice (Liu in Finely 2005). Poleg tega

so antioksidanti v hrani heterogeni in multifunkcionalni (Frankel in Meyer 2000). Prav



zaradi teh razlogov je narastlo zanimanje za razvoj novih metod, ki temeljijo na merjenju

antioksidativne aktivnosti v živih celicah. Pri pregledu strokovne literature smo zasledili

nekaj podobnih raziskav, kjer so za določevanje antioksidativne aktivnosti uporabljali

DCFH-DA. Žal je število raziskovalcev, ki uporabljajo modele za ocenjevanje

antioksidativne aktivnosti v živih sesalčjih celicah, še vedno zelo nizko. Posledično je na

voljo zelo malo podatkov o protokolih in pristopih.

Namen magistrske naloge je bil optimizacija celične metode z uporabo barvila 2´,7´-

diklorofluorescin-diacetata (DCFH-DA) za določevanje pro- in antioksidativne aktivnosti

različnih spojin. Na modelni makrofagni človeški celični liniji TLT smo poskušali

optimizirati koncentracijo in čas inkubacije substratov (kot testni substanci smo uporabili

antioksidanta vitamin C in troloks) ter določiti najprimernejše število celic v

eksperimentalnem sistemu. Poleg tega smo poskušali določiti tudi najprimernejši vrstni red

nanosa reagentov, saj v literaturi glede tega še vedno vlada zmeda. Skratka, namen je bil

določiti sistem, ki bi podal najrelevantnejše rezultate in podal smernice za merjenje

antioksidativne aktivnosti naravnih ekstraktov.

Postavili smo tri hipoteze:

Hipoteza 1: Vrednost fluorescence v testu z DCFH-DA je linearno odvisna od števila celic

na vodnjak.

Hipoteza 2: Previsoka koncentracija antioksidantov vpliva na vrednost izmerjene

fluorescence (učinek »zadušitve« fluorescence).

Hipoteza 3: Prekratka ali predolga inkubacija antioksidantov zmanjša antioksidativni

učinek.

Hipoteza 4: Za meritve fluorescence je pomemben vrstni red nanosa reagentov peroksida,

testne substance (antioksidanta) in DCFH-DA.



2 PREGLED OBJAV

2.1 Reaktivne kisikove zvrsti ter oksidativni stres

Reaktivne kisikove spojine (ROS) povezujemo s patologijami, kot so kardiovaskularne

bolezni, inflamatorne bolezni, nevrodegenerativne bolezni, rak in staranje (Stohs 1995).

Glavne reaktivne kisikove spojine, ki se oblikujejo v bioloških sistemih, so superoksidni

anioni, vodikov peroksid, peroksidni radikali in hidroksidni radikali (Bergendi in sod.

1999). Vse te oblike kisika so lahko rezultat normalne celične presnove ali posledica

dejavnikov okolja, kot so UV- in gama- žarčenje, toplotno sevanje, kajenje, onesnaževala v

okolju itd. Prosti radikal je vsak atom ali molekula, ki ima prost, nevezan elektron v eni ali

več orbitalah. Prosti radikali so po navadi rezultat homolitične cepitve molekul pod

vplivom svetlobe, toplote ali nastajajo v redoks reakcijah (Korošec 2000).

Znano je, da so ROS v bioloških sistemih glede na okolje lahko tako škodljive kot tudi

koristne (Glade 2003). Blagodejni učinki ROS so na primer fiziološka vloga v celičnih

odzivih kot obramba proti okužbam ter v funkciji številnih celičnih signalnih sistemov.

Nasprotno v visokih koncentracijah so ROS lahko posredniki poškodb celičnih struktur,

vključno z lipidi in membranami, proteini ter nukleinskimi kislinami (Poli in sod. 2004).

V normalni zdravi celici se vzpostavi ravnotežje med tvorbo ROS in odstranjevanjem le-

teh z antioksidativnim sistemom. Kadar je tvorba ROS večja od antioksidativne obrambne

zmožnosti celice ali če je antioksidativna obramba celice inhibirana, se pojavi

neravnotežje. Ta pojav imenujemo oksidativni stres, ki lahko vodi celični sistem do

patološkega stanja (Sies 1997).

Kljub prisotnosti celičnega antioksidativnega obrambnega sistema, ki preprečuje

oksidativne poškodbe s strani ROS, se oksidativne poškodbe nalagajo skozi ves življenjski

cikel in so odgovorne za staranje ter obolenja povezana s staranjem, kot so srčno-žilne

bolezni, rak, nevrodegenerativna obolenja ter druge kronične bolezni (Rahman 2003).



2.2 Delovanje antioksidantov

Preprosta definicija pravi: »Antioksidant je snov, ki ščiti druge snovi pred oksidacijo«.

Oksidacija je verižna reakcija, ki jo povzročajo oksidanti in prosti radikali. Kako

antioksidanti preprečujejo oksidacijo, je odvisno od vrste antioksidanta. Pri oksidaciji

lahko odigrajo preventivno vlogo na dva načina (Abram 2000):

1. Najpogosteje antioksidant poseže v reakcijo avtooksidacije s tem, da hitro odda

vodikov atom radikalu, ki bi sicer povzročil tvorbo peroksidnih radikalov (reakcija

1). Nastali radikalski produkt mora biti bolj stabilen kot sam radikal (Raspor in sod.

2000).

R• + ArOH RH + ArO• ... (1)

2. Antioksidant lahko stabilizira prosti radikal s prenosom posameznega elektrona

(reakcija 2).

R• + ArOH R- + ArOH•+ ... (2)

Prenos vodikovega atoma in prenos posameznega elektrona potekata z različno hitrostjo

(Wright in sod., 2001).

Antioksidanti so del obrambnega mehanizma organizma, ki ščiti biološke molekule pred

poškodbami s prostimi radikali. Drugače povedano, to so spojine, ki imajo sposobnost

pretvorbe prostih radikalov v manj škodljive ali popolnoma neškodljive produkte s

sprejemanjem ali oddajanjem elektronov. V tem procesu antioksidanti postanejo radikali,

ki so običajno manj reaktivni. Nekatere organizem obnavlja, drugi pa se po nadaljnjih

pretvorbah izločijo iz telesa (Cornelli 2009).



2.2.1 Celični antioksidativni sistemi

Škodljivi učinki ROS so uravnavani z delovanjem antioksidantov (Halliwell 1996). Idealen

antioksidant bi se moral takoj absorbirati in uničiti proste radikale ter kelirati redoks

kovine na ustrezen fiziološki nivo. Prav tako bi mogel delovati tako v vodnih kot

membranskih domenah ter vplivati na gensko izražanje na pozitiven način (Rahman 2007).

Skozi evolucijo človeka se je endogena obramba postopoma izboljšala tako, da je ohranila

ravnotežje med prostimi radikali in oksidativnim stresom. Antioksidativna aktivnost je

lahko učinkovita na različne načine: kot inhibitorji oksidacijskih reakcij prostih radikalov

(preventive oxidants - preventivni oksidanti) s preprečevanjem tvorbe prostih lipidnih

radikalov; s prekinitvijo propagacije avtooksidacijske verižne reakcije (chain breaking

antioxidants - antioksidanti, ki prekinjajo verige); kot singletni kisikovi dušilci (singlet

oxygen quenchers); skozi sinergizem z ostalimi antioksidanti; kot reducenti, ki pretvarjajo

hidroperokside v stabilne spojine; kot kovinski kelatorji, ki pretvarjajo kovinske

prooksidante (železove in bakrove derivate) v stabilne produkte ter kot inhibitorji

prooksidativnih encimov (lipooksigenaze) (Carocho in Ferreira 2013).

Antioksidativni sistem človeka delimo v dve glavni skupini, encimatski in neencimatski

antioksidanti. Encimatski antioksidanti se naprej razdelijo na primarne in sekundarne

encimske obrambne mehanizme. Primarni obrambni mehanizem je sestavljen iz treh

pomembnih encimov, ki preprečujejo tvorbo prostih radikalov ali jih nevtralizirajo:

glutation peroksidaza, ki odda dva elektrona in tako zreducira perokside s tvorbo selenolov

ter izloči perokside kot potencialne substrate za Fentonovo reakcijo; katalaza, ki pretvarja

vodikov peroksid v vodo in molekularni kisik ter ima eno najvišjih stopenj »prometa« kar

jih pozna človek (samo ena molekula katalaze lahko pretvori 6 bilijonov molekul

vodikovega peroksida v vodo in kisik na minuto); ter superoksidna dizmutaza, ki pretvarja

superoksidne anione v vodikov peroksid kot substrat za katalazo (Rahman 2007).

Sekundarna encimska obramba vključuje glutation reduktazo in glukoza-6-fosfat

dehidrogenazo. Glutation reduktaza reducira glutation (antioksidant) iz svoje oksidirane



oblike v reducirano, da ga reciklira za nadaljnjo nevtralizacijo še več prostih radikalov.

Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza obnavlja NADPH (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat

– koencim soudeležen pri anabolnih reakcijah), da ustvari reducirajoče okolje (Ratnam in

sod. 2006). Ta dva encima ne nevtralizirata prostih radikalov neposredno, ampak imata

podporno vlogo ostalim endogenim antioksidantom.

Obstaja veliko število ne-encimatskih endogenih antioksidantov, mednje sodijo vitamini

(A), encimski kofaktorji (Q10), dušikove spojine (sečna kislina) in peptidi (glutation)

(Carocho in Ferreira 2013). V isto skupino antioksidantov uvrščamo še druge naravne

spojine, kot so fenoli, galna kislina in njeni derivati ter flavonoidi (kvercetin, ramnetin,

kamferol, rutin, kavna kislina, rožmarinska kislina) (Korošec 2000).

Kljub njegovi izjemni učinkovitosti endogeni antioksidativni sistem sam po sebi ne

zadostuje, zato smo ljudje, da ohranimo koncentracijo prostih radikalov na nizkem nivoju,

odvisni od različnih vrst antioksidantov, ki se nahajajo v prehrani (Pietta 2000).

2.3 Antioksidativne lastnosti vitamina C in troloksa

Askorbinska kislina oziroma vitamin C je pomemben in močan vodotopen antioksidant,

zato tudi deluje v vodnih okoljih v telesu (Rahman 2007). Vitamin C vsebuje dve spojini:

L-askorbinsko kislino in L-dehidroaskorbinsko kislino, pri čemer se obe absorbirata skozi

gastrointestinalni trakt in se lahko in vivo encimatsko med seboj zamenjata. Askorbinska

kislina je učinkovita v lovljenju superoksidnih radikalnih anionov, vodikovega peroksida,

hidroksilnih radikalov, singletnega kisika in reaktivnega dušikovega kisika (Barros in sod.

2011). Primaren antioksidativni partner vitaminu C so tako encimatski antioksidanti kot

tudi karotenoidi in vitamin E. Vitamin C sodeluje z vitaminom E tako, da tvori α-tokoferol

iz α-tokoferolnih radikalov v membranah in lipoproteinih (Carr in Frei 1999). Poleg tega

zvišuje nivo znotrajceličnega glutationa, zato igra pomembno vlogo pri zaščiti tiolnih

skupin proteinov pred oksidacijo (Nazirog 2005).



Slika 1: Oksidacija askorbinske kisline (AH-) z dvema zaporednima korakoma eno-

elektronske oksidacije do askorbinskega radikala (A•-) in dehidroaskorbinske

kisline (DHA) (Carr in Frei 1999, str. 1008).

Vitamin E je sestavljen iz osmih izoform, s štirimi tokoferoli (α-, β-, γ- in δ-tokoferol) in

štirimi tokotrienoli (α-, β-, γ- in δ tokotrienol), pri čemer je α-tokoferol najmočnejša

izoforma v bioloških sistemih. Kromanska skupina prispeva k antioksidativni aktivnosti

tokoferolov, medtem ko fitilni rep nima vpliva. Ker sta aktivni strani α-tokoferola in

troloksa enaki, je sposobnost troloksa, da odda vodik podobna tisti od α-tokoferola (Hall in

sod. 2010). Vitamin E zaustavi lipidno peroksidacijo z oddajo svojega fenolnega vodika k

peroksidnim radikalom, tvorijo se tokoferolni radikali, vendar slednji, kljub temu da so

radikali, so nereaktivni ter nesposobni nadaljevati oksidativno verižno reakcijo. Vitamin E

je glavna maščobotopna molekula, ki je sposobna trganja radikalskih verig. Ta

antioksidant, najden v plazmi, rdečih krvničkah in tkivih, ščiti celovitost lipidnih struktur,

predvsem membran (Burton in Traber 1990).

Troloks je derivat α-tokoferola, pri katerem je hidrofobna fitilna skupina zamenjana s

hidrofilno karboksilno skupino, ki je topna v vodi (Priyadarsini in sod. 2001).



Slika 2: Strukturna formula vitamina E (zgoraj) in troloksa (spodaj) (Wattamwar in sod.

2010, str. 148).

Hall in sod. (2010) so preučevali antioksidativno aktivnost askorbinske kisline in troloksa

na oksidacijo riboflavina v mleku v prisotnosti svetlobe in ugotovili, da se je s

povečevanjem koncentracije obeh vitaminov znižala razgradnja riboflavina. Riboflavin,

troloks in askorbinska kislina so namreč med seboj tekmovali za reakcijo s singletnim

kisikom, ki se tvori v prisotnosti riboflavina na svetlobi. Podobno sta v svoji raziskavi

dokazala tudi Yettella in Min (2010) – tako askorbinska kislina, kot troloks sta zmanjšala

razgradnjo aromatičnih aminokislin fenilalanina, triptofana in tirozina, pri čemer je troloks

odigral boljšo vlogo antioksidanta kot askorbinska kislina.

Carr in sod. (1999) navajajo, da večina in vivo ter in vitro pregledanih študij kaže odvisnost

znižanja oksidativnih poškodb v DNK z vitaminom C, medtem ko nekatere raziskave niso

opazile nikakršnih sprememb ali povečane stopnje izbranih lezij DNK. V prisotnosti ali ob

dodatku kovinskih ionov vitamin C inhibira oksidativne poškodbe DNK v celicah (Fiala in

sod. 1996; Wei in sod. 1996; Noroozi in sod. 1998; Fischer-Nielsen in sod. 1993; Pflau in

sod. 1998). Od dveh in vivo študij, v katerih so živalim dodajali vitamin C, je ena pokazala

zaščito s strani vitamina C proti UV sproženi poškodbi DNK v očesu (Reddy in sod. 1998),

medtem ko druga ni pokazala sprememb v nivoju oksidativnih poškodb DNK v jetrih

(Cadenas in sod. 1997).



2.4 Metode za določevanje antioksidativne aktivnosti

2.4.1 Metode in vitro za določevanje antioksidativne aktivnosti

Metode, ki se najpogosteje uporabljajo za določanje antioksidativnega potenciala, se

razlikujejo glede na delovanje in pogoje (Lucas-Abellán in sod. 2010). Glede na potek

reakcije v grobem delimo metode in vitro v dve skupini: metode, ki temeljijo na prenosu

vodikovega atoma (HAT - hydrogen atom transfer) in metode, ki temeljijo na prenosu

elektrona (ET - electron transfer). Večina metod, ki jih uvrščamo v prvo skupino, temelji

na tekmovanju antioksidanta in substrata (katerega oksidacijo antioksidant preprečuje) za

radikale. Te metode vključujejo zaviranje avtooksidacije lipoproteinov z nizko gostoto v

prisotnosti antioksidantov, preprečevanje oksidacije molekul, kot je fluorescein z metodo

ORAC (oxygen radical absorbance capacity) ali preprečevanje razbarvanja beta-karotena.

V drugo skupino uvrščamo metode, ki temeljijo na merjenju kapacitete antioksidanta, da

reducira oksidant/radikal, kateremu se spremeni barva v vidnem delu spektra. Sprememba

absorbance je v neposredni povezavi s koncentracijo antioksidantov v vzorcu. V to skupino

uvrščamo metode, kot so določitev skupnih fenolov s Folin-Ciocalteu reagentom, DPPH,

ABTS in FRAP (Huang in sod. 2005).

V praksi se za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti preiskovanih vzorcev izvajajo

različni protokoli omenjenih testov in vitro. Vendar antioksidativna aktivnost ne bi smela

biti podana na podlagi enega samega antioksidativnega testnega modela, saj se

antioksidativni testni modeli razlikujejo v različnih ozirih. Zaradi tega je težko v celoti

primerjati eno metodo z drugo. Raziskovalci morajo kritično overiti metode analiz, preden

prevzamejo tisto, ki jo potrebujejo za namen raziskave. Na splošno so antioksidativni testi

in vitro, ki uporabljajo t. i. pasti za proste radikale, relativno enostavni za izvedbo. V to

skupino testov uvrščamo metodo DPPH, ki je hitra, enostavna (ne vsebuje veliko korakov

in reagentov) ter poceni v primerjavi z ostalimi testnimi modeli. Po drugi strani je metoda

ABTS razbarvanja primerna tako za hidrofilne kot lipofilne antioksidante (Alam in sod.

2013).



V zadnjem času so naravni antioksidanti v hrani, sadju, pijačah, začimbah in dodatkih

dobili pozornost prehranskih in kozmetičnih interesentov, čeprav so številni sintetični

antioksidanti bili pripravljeni s farmacevtskega stališča. Kapaciteta teh antioksidantov je

bila ocenjena v številnih raziskavah z različnimi metodami pod različnimi pogoji. Razvitih

in uporabljenih je bilo veliko število metod ter načinov za merjenje antioksidativne

kapacitete oziroma učinkovitosti, vendar zelo pogosto ni bilo korelacije med aktivnostmi,

izmerjenimi v enakem materialu z različnimi metodami in med aktivnostmi, izmerjenimi z

istimi metodami v različnih laboratorijih (Niki 2010).

2.4.2 Celični testi za določevanje antioksidativne aktivnosti

Eksperimenti na živalih so zaradi časovne dolžine izvedbe in visokih stroškov neprimerni

za ocenjevanje oz. vrednotenje antioksidantov v začetni stopnji raziskovanja antioksidanta

(Wan in sod. 2015). Poleg tega so sočasna nihanja hranil, hormonov ter kompleksnost tkiv

in organizacija organov med poskusom na modelih živih živali zelo otežila demonstracijo

molekularnih mehanizmov specifičnih uravnavanj (Goya in sod. 2009).

Alternativno se kot model za pojasnjevanje osnovnih mehanizmov oksidativnega stresa in

ocenjevanje zaščitnih učinkov antioksidantov proti različnim oksidativnim stresnim

dejavnikom pogosto uporabljajo kultivirane celice (Piga in sod. 2007). Vendar mora

celični model imeti močne antioksidativne obrambe, da so izmerjene spremembe v

antioksidativnem odzivu, opažene. Poleg tega morajo celice biti sposobne ostati v kulturi

stabilne daljše časovno obdobje, da bi lahko zagotovili konstanten in zanesljiv odgovor na

ponovljene pogoje (Goya in sod. 2009).

Prednost uporabe kultiviranih celic je, da več različnih dejavnikov stresa in tipov celic,

vključno z modelnimi sistemi za nekatera specifična obolenja, omogoča ocenitev

antioksidativnih učinkov (Niki 2010). Učinki antioksidantov se merijo na podlagi

oksidativnega stresa v kultiviranih celicah glede na zaviranje tvorbe ROS, oksidacije

lipidov, proteinov, DNK in celične smrti. Antioksidanti se lahko dodajo k mediju za



kultivacijo celic hkrati s stresnim dejavnikom ali v predinkubaciji predhodno vključenim v

celice (Piga in sod. 2007).

2.4.3 Antioksidativni celični test z uporabo 2´,7´ - diklorofluorescein diacetata (DCFH-

DA)

Celični test z uporabo 2´,7´ - diklorofluorescin diacetata (DCFH-DA) določa

antioksidativno aktivnost z merjenjem aktivnosti lovljenja prostih radikalov testiranega

antioksidativnega vzorca v celicah preko zaznavanja znotrajcelične fluorescence po

inkubaciji s fluorescentnim barvilom DCFH-DA, vzorcem antioksidanta in radikalov s

celicami (Wan in sod. 2015).

Slika 3: Znotrajcelična redoks kemija 2′,7′ - diklorofluorescin diacetata (DCFH-DA)

(Dikalov in Harrison 2012).



S prvim opisom uporabe DCFH-DA, kot fluorometričnega testa za vodikov peroksid, se je

začel uporabljati DCFH-DA, kot barvilo za določevanje tvorbe znotrajceličnega

vodikovega peroksida s pretočno citometrijo (Wang in Joseph 1999). Teorija v ozadju

uporabe DCFH-DA je, da nefluorescentni fluorescinski derivati oddajajo fluorescenco po

oksidaciji s strani vodikovega peroksida. Intenziteta fluorescence je neposredno

proporcionalna koncentraciji vodikovega peroksida. Pri uporabi na nepoškodovanih

celicah, nepolarni DCFH-DA prečka celične membrane, kjer se encimatsko hidrolizira s

strani znotrajceličnih esteraz do nefluorescentnega diklorofluorescina (DCFH). V

prisotnosti ROS se DCFH-DA oksidira v visoko fluorescenten diklorofluorescin (DCF)

(LeBel in sod. 1992). Zaradi tega se lahko znotrajcelična fluorescenca DCF uporablja kot

indeks za kvantifikacijo skupnega oksidativnega stresa v celicah (Wang in Joseph 1999).

Kljub temu se porajajo vprašanja glede uporabe DCFH-DA za določanje znotrajceličnega

vodikovega peroksida in ostalih oksidantov, saj je znotrajcelična redoks kemija barvila

DCFH-DA kompleksna. Obstaja več omejitev in artefaktov, povezanih s testom DCFH-

DA za merjenje oksidativnega stresa. Ena izmed omejitev je, da DCFH-DA ne reagira

neposredno z vodikovim peroksidom do tvorbe fluorescentnega produkta DCF-ja, zaradi

tega se fluorescenca DCF ne more uporabljati za neposredno merjenje vodikovega

peroksida v celici kot enega izmed potencialnih oksidantov. Poleg tega, več eno-

elektronsko oksidirajočih spojin oksidira DCFH do DCF; to vključuje hidroksilne radikale

(•OH), spojine tvorjene iz peroksidaze ali hemske interakcije z vodikovim peroksidom, iz

sistema mieloperoksidaze / vodikovega peroksida / NO2 tvorjenega •NO2, hipoklorovo

kislino, ter razpad reaktivnih spojin, tvorjenih iz peroksinitrita (ONOO−/ONOOH). Razpad

peroksinitrita v prisotnosti bikarbonata tvori •OH ali karbonatne anionske radikale

(CO3•−). Citokrom c (hemski protein, ki se sprosti iz mitohondrija v citosol med

apoptozo), lahko oksidira DCFH do DCF neposredno ali posredno preko peroksidaznega

mehanizma. Povečanje fluorescence, ki se pojavi med apoptozo celic, je pogosto povezano

s povečano tvorbo oksidanta. Poleg tega redoks aktivne kovine (npr. Fe2+) v prisotnosti

kisika ali vodikovega peroksida spodbudijo oksidacijo DCFH (Kalyanaraman in sod.

2012).



Lalancette in sod. (2009) so razvili občutljiv celični test z uporabo DCFH-DA za

določevanje pro- in antioksidativne aktivnosti spojin in zmesi. Poskus je potekal tako, da

so najprej na črne mikrotitrske plošče z ravnim dnom (BD Falcon) nasadili sesalčje celice

(celična linija L-929) z gostoto 10.000 celic / vodnjak in jih 24 ur inkubirali pri 37 °C in 5

% CO2. Nato so jih sprali s 150 μL PBS (raztopina fosfatnega pufra s pH 7,4) ter ponovno

inkubirali s 100 μL 5 μM DCFH-DA v HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) s pH 7,4.

Ponovno je sledilo spiranje s 150 μL PBS in nato 1 h inkubacije z naraščajočimi

koncentracijami čistih spojin ali ekstraktov v prisotnosti ali odsotnosti 200 μM t-BuOOH

(tert-butil hidroperoksid). Fluorescenco (vzbujevalna valovna dolžina: 485 nm, emisijska

valovna dolžina: 530 nm) so prvič izmerili takoj po dodatku t-BuOOH, drugič po 90 min.

Rezultate so interpretirali z izračunom vrednosti IC50 tako, da so uporabili logaritmično

regresijo krivulje odvisne od koncentracije po odštetju obeh vrednosti fluorescence -

slepega ter vzorca čiste spojine oziroma ekstrakta brez DCF.

Wang in sod. (1999) so z uporabo DCFH-DA testa kvantificirali oksidativen stres v celicah

PC12. Celice z gostoto 10.000 celic / vodnjak so 1 dan pred poskusom nanesli na

mikrotitrske plošče, prevlečene s kolagenom. Nato so odstranili gojišče, sprali s pufrom

KRH (Krebs-Ringer bikarbonatni pufer) in celice 30 min inkubirali s 100 μM DCFH-DA v

mediju pri 37 °C ter 5 % CO2 / 95 % zraku. Sledila je odstranitev DCFH-DA, ponovno

spiranje in nato inkubacija z različnimi koncentracijami tvorcev prostih radikalov oziroma

sprožilcev oksidativnega stresa (H2O2, AAPH = 2,2-azobios (2-amidino-propan)

dihidroklorid, SIN-1 = 3-morfolinosidnonimin hidroklorid, SNP = natrijev nitroprusid) v

pufru KRH. Fluorescenco (vzbujevalna v. d.: 485 nm, emisijska v. d.: 530 nm) so merili 30

min v intervalih vsakih 5 min. S kvantifikacijo fluorescence so premo-sorazmerno

kvantificirali oksidativni stres v celicah.

Wan in sod. (2015) so razvili test s celično linijo Caco-2 za kvantitativno ocenjevanje

antioksidativne aktivnosti antioksidantov, pri čemer so optimizirali gostoto celic,

kultivacijski čas celic, inkubacijski čas in koncentracijo DCFH-DA ter detekcijski čas

fluorescence. Pri določanju optimalne gostote celic / vodnjak ter kultivacijskega časa celic



so poskus izvedli tako, da so celice z gostoto od 1×104 do 1×105 / vodnjak nanesli na črne

mikrotitrske plošče ter jih inkubirali 24 in 36 ur pri 37 °C in 5 % CO2. Rezultati so

pokazali, da je optimalna gostota Caco-2 celic pri inkubacijskem času 24 ur 5 × 104 – 6 ×

104 celic / vodnjak, medtem ko je pri inkubacijskem času 36 ur 3 × 104 – 4 × 104 celic /

vodnjak. Nižja gostota celic namreč vodi v nastanek velikih in redkih celic z nizko

konfluenco (20 - 80 %), višja gostota pa kljub 100 % konfluenci do skupkov celic.

Optimalna gostota celic in kultivacijski čas sta bila določena na podlagi pritrditve celic,

konfluence in statusa aktivnosti celic. Na podlagi določenega optimalnega kultivacijskega

časa in gostote celic so nato optimizirali inkubacijski čas DCFH-DA tako, da so celice

inkubirali s 15 μM DCFH-DA različno dolgo (5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 in 90

min), po odstranitvi medija in spiranju v vsak vodnjak dali 100 µL 500 μM AAPH

(oksidant). Fluorescenco (vzbujevalna v. d.: 485 nm, emisijska v. d.: 530 nm) so merili

vsega skupaj 120 min v intervalih vsakih 5 min. Ugotovili so, da se vrednost fluorescence

povečuje s časom, vendar doseže svojo maksimalno vrednost po 20 min. Ker po 20 min

DCFH-DA postane nestabilen, so kot optimalen inkubacijski čas DCFH-DA določili 20

min. Podobno kot optimalen inkubacijski čas so določili tudi optimalno koncentracijo

DCFH-DA, pri čemer so celice 20 min tretirali z različnimi koncentracijami DCFH-DA (1,

3, 5, 15, 29, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μM). Kot najbolj optimalna koncentracija

DCFH-DA se je izkazala 60 μM, saj je pri tej koncentraciji vrednost fluorescence dosegla

svoj maksimum. Ta pojav so pojasnili tako, da pri višjih koncentracijah nastanejo v celici

prosti peroksidni radikali, ki oksidirajo DCFH-DA. Raziskovalci so optimizirali tudi način

inkubacije DCFH-DA (60 μM) in substrata (10 μM kvercetin) s celicami. Preizkusili so tri

načine: 1) substrat se je posebej inkubiral pred inkubacijo DCFH-DA, 2) DCFH-DA se je

inkubiral pred substratom, in 3) DCFH-DA in substrat sta se sočasno inkubirala. Kot

najbolj optimalen način se je izkazala sočasna inkubacija DCFH-DA in substrata. Pri

drugem načinu so rezultati pokazali izgubo oziroma nestabilnost DCFH-DA med daljšo

inkubacijo.



3 MATERIALI IN METODE

3.1 Kemikalije

Uporabljeni so bili reagenti 2’,7’ - diklorofluorescin-diacetat (DCFH-DA), 2’,7’-

diklorofluorescin (DCF), tert-butil hidroperoksid (t-BuOOH), 6-hidroksi - 2,5,7,8-

tetrametil-2-karboksilna kislina (troloks), askorbinska kislina (vitamin C), dimetil sulfoksid

(DMSO). Vsi omenjeni reagenti so bili od proizvajalca Sigma Aldrich. Celice smo gojili v

gojišču DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco, Paisley, Velika Britanija) in

FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco, Paisley, Velika Britanija), reagente pa topili ter izvajali

poskuse v gojišču HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), katerega smo ga pripravili sami

(postopek opisan v poglavju 3.1.1). Kemikalije, ki niso vodotopne (DCFH-DA, DCF,

troloks) smo najprej raztopili v DMSO, nato jih razredčili s HBSS do želene koncentracije,

tako da je bil delež DMSO v vseh raztopinah manj kot 2 %.

3.1.1 Priprava raztopine DCFH-DA

Najprej smo pripravili 41 mM DCFH-DA založne raztopine v DMSO, naredili alikvote ter

jih shranili pri temperaturi -20 °C. Za vsak poskus posebej smo iz 41 mM DCFH-DA

založne raztopine pripravili 20 µM DCFH-DA delovne raztopine v HBSS.

3.1.2 Priprava tert-butil hidroperoksida (t-BuOOH)

Za celične poskuse smo uporabljali t-BuOOH v HBSS v končni koncentraciji 500 µM.

Delovno raztopino smo pripravili tako, da smo najprej 5 μL 80 % t-BuOOH dodali k 500

µL HBSS in dobili 80 mM raztopino t-BuOOH v HBSS, katero smo potem redčili s HBSS

do končne koncentracije 500 µM. Delovno raztopino smo pripravljali pred vsakim

poskusom posebej.



3.1.3 Priprava raztopine vitamina C oz. askorbinske kisline

Delovno raztopino čistega vitamina C oziroma askorbinske kisline smo vedno za vsak

poskus posebej pripravili tik pred nanosom na celice, saj je znano, da askorbinska kislina v

vodnem mediju zaradi oksidacije hitro razpade. Delovno raztopino askorbinske kisline smo

pripravili tako, da smo natehtali 5 mg čiste askorbinske kisline in jo raztopili v 1 ml HBSS,

pri čemer smo dobili 28 mM raztopino askorbinske kisline v HBSS. Pridobljeno raztopino

smo nato redčili s HBSS do želene končne koncentracije in potrebnega volumna.

3.1.4 Priprava raztopine troloksa

Delovno raztopino analoga vitamina E oziroma troloksa smo prav tako vedno pripravili za

vsak poskus posebej. Zaradi netopnosti troloksa v vodnih medijih, smo najprej 10 mg

čistega troloksa raztopili v 100 µL DMSO, nato dodali 900 μL HBSS in tako dobili 40 mM

raztopino troloksa v HBSS z 10 % DMSO. Pridobljeno raztopino smo redčili s HBSS do

želene končne koncentracije in potrebnega volumna. Končna vsebnost DMSO v delovni

raztopini je bila vedno manjša od 2 %.

3.1.5 Priprava HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)

Čašo volumna 2000 ml smo dopolnili s 1600 ml destilirane vode (dH2O), nato vanjo

natehtali naslednje substance:

16,0 g NaCl

0,80 g KCl

2,0 g glukoze

0,212 g Na2HPO4×12H2O

0,108 g KH2PO4



0,704 g NaHCO3

Po dodatku vseh navedenih substanc smo vse dobro premešali, da smo dobili čisto

raztopino. Nato smo dodali še naslednji dve substanci:

0,508 g CaCl2×2H2O

0,948 g MgCl2×6H2O

Zopet smo vse dobro premešali in čašo dopolnili z dH2O do končnega volumna 2000 ml.

Sledilo je uravnavanje pH na 7,1 in nazadnje še sterilizacija s filtrom velikosti por 0,22

m. Pripravljeno raztopino HBSS smo hranili na temperaturi 4 °C, pred vsako uporabo za

celični poskus smo jo v inkubatorju ogreli na temperaturo celic - tj. 37 °C.

3.2 Celična linija

Za eksperiment smo uporabili celično linijo TLT (humani makrofagi), ki je bila vzgojena v

laboratoriju Katedre za mikrobiologijo, biokemijo, molekularno biologijo in

biotehnologijo, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, Univerza v Mariboru. Celice

smo gojili in izvajali eksperimente v visokoglukoznem gojišču DMEMAdv (Dulbecco's

Modified Eagle Medium Advanced, Gibco, Paisley, Velika Britanija) z dodatkom

neesencialnih aminokislin (glutamin), natrijevega piruvata, fenol rdečega ter 5 % FBS

(fetalni goveji serum - Fetal Bovine Serum, Gibco, Paisley, Velika Britanija). Gojišču sta

bila v standardni količini dodana tudi antibiotika penicilin in streptomicin. Celice smo

gojili v plastičnih T-flaškah T25 (Thermofisher, Nunclon) namenjenih za gojenje celic.

Celice smo inkubirali v vlažni atmosferi pri konstantni temperaturi 37 °C in 5 % CO2.

3.2.1 Presajanje celic

Ko so celice tvorile enakomeren monosloj, smo jih pripravili na tripsinizacijo. Ves

potreben material smo predhodno ogreli na 37 oC. S celic smo najprej odstranili staro

gojišče in jih sprali z 1 ml raztopine tripsina. Nato smo jim znova dodali 2 ml raztopine



tripsina ter jih inkubirali približno 15 minut. Ko so se celice povsem odlepile od podlage,

smo jih s pipeto dobro premešali in dodali 8 ml svežega gojišča DMEMAdv ter celotno

suspenzijo odpipetirali v centrifugirko. Centrifugirali smo 5 min na 100 g (Centrikon,

Tehtnica, Slovenija), da so se celice posedle na dno centrifugirke. Nato smo previdno

odstranili supernatant, dodali 10 ml svežega gojišča DMEMAdv in v njem ponovno

suspendirali celice. 2 ml raztopine celic smo vrnili v flaško T25, dodali 0,5 mL FBS in 7,5

ml svežega gojišča DMEMAdv ter celice naprej inkubirali. Ko so se celice razrasle in

tvorile monosloj, smo jih nasadili na mikrotitrske plošče s 96 vodnjaki (Thermo Fischer

Scientific-Nunclon 96 Flat Bottom Black Polystyrol).

3.3 Test za merjenje antioksidativne aktivnosti na celicah

3.3.1 Nanos celic na mikrotitrske plošče

Število celic smo določili tako, da smo 20 µL suspenzije celic prenesli na hemacitometer

znamke Neubauer in pod mikroskopom v 16 -ih kvadratkih prešteli celice. Koncentracijo

celic smo izračunali po naslednji formuli:

c (celic/mL) = število preštetih celic × 10.000

Po izračunanem številu celic v 1 ml suspenzije smo odpipetirali ustrezen volumen

suspenzije celic in dodali sveže gojišče DMEMAdv z dodatkom 5 % FBS. Na ta način smo

dobili celično suspenzijo v koncentraciji 5 × 104 celic/ml. V vsak vodnjak na mikrotitrski

plošči smo nanesli po 100 μl pripravljene suspenzije ter inkubirali preko noči, da so se

pritrdile.

3.3.2 Določitev stopnje »zadušitve« fluorescence (Fluorescence quenching)

Občutljivost čitalca za merjenje fluorescence (Tecan i-control, vzbujevalna v. d.: 485 nm,

emisijska v. d.: 529 nm) smo določili z naraščajočimi koncentracijami DCF ter testnih



antioksidantov v HBSS. Območje koncentracij DCF je segalo od 3,9 pM do 4 μM, testnih

antioksidantov od 0,5 μM do 10 mM. Za vsak substrat smo izvedli dve ponovitvi, rezultate

pa podali kot srednjo vrednost obeh ponovitev.

3.3.3 Optimizacija gostote / števila celic na posamezen vodnjak

Za določitev optimalnega števila celic na vodnjak smo na mikrotitrsko ploščo nanesli 6

različnih koncentracij celic (določitev koncentracije celic je opisana v poglavju 3.3.1).

Začetna koncentracija je znašala 60.000 celic na vodnjak, sledilo je 5 serijskih dilucij v

razmerju 2:3, tako je zadnja koncentracija bila 4665,6 celic na vodnjak (Slika 4). Vsaka

dilucija je bila nanesena v 10 ponovitvah. Po nanosu celic na mikrotitrsko ploščo je sledila

4 urna inkubacija, da so se celice pritrdile. Nato smo s celic odlili gojišče in jih sprali z 200

μL HBSS. Sledil je nanos 20 μM DCFH-DA in 30 minutna inkubacija. Po inkubaciji smo

celice zopet sprali in s tem odstranili nevezan DCFH-DA. 5 ponovitev vsake koncentracije

celic smo tretirali s 500 μM t-BuOOH v HBSS, drugih 5 ponovitev pa s HBSS kot

kontrolo. Na večnamenskem čitalcu Tecan smo merili intenziteto fluorescence 360 min v

15 minutnih intervalih, pri čemer je vzbujevalna valovna dolžina znašala 495 nm,

emisijska pa 529 nm.



Slika 4: Eksperiment optimizacije števila celic na vodnjak na mikrotitrski plošči (sivo

obarvani vodnjaki so prazni).

3.3.4 Optimizacija inkubacijskega časa inkubacije celic s testnimi substancami

Po določitvi optimalnega števila celic na vodnjak smo določili tudi optimalen inkubacijski

čas testnih substanc (vitamina C in troloksa). Po nanosu optimalnega števila celic na

vodnjak smo celice inkubirali preko noči na 37 °C in 5 % CO2. Naslednji dan smo celice

sprali z 200 μM HBSS in nato pripravili začetni koncentraciji substratov, tj. 900 μM v

HBSS s 5 % FBS. Naredili smo redčitveno vrsto 900 μM, 300 μM, 100 μM, 33,3 μM, 11,1

μM, 3,7 μM. Vsaka redčitev je bila nanesena v treh ponovitvah. V mikrotitrski ploščici so

stolpci 2, 3 in 4 predstavljali redčitve vitamina C, stolpci 9, 10, 11 pa redčitve troloksa.

Stolpci 5, 6, 7 in 8 so bili brez testnih substanc, imenovani tudi kontrole (Slika 5). Sledila

je različno dolga inkubacija, in sicer 1 h, 2 h, 3 h ter 6 h. Po inkubaciji celic s substratom je

ponovno sledilo spiranje z 200 μM HBSS in nato nanos 20 μM DCFH-DA v HBSS v vsak

vodnjak ter 30 min inkubacija. Nato smo celice zopet sprali z 200 μM HBSS in dodali 500

μM t-BuOOH v HBSS v vse vodnjake, razen v stolpca 6 in 8, ki sta predstavljala negativno



kontrolo. Stolpca 5 in 7 sta predstavljala pozitivno kontrolo. Po 30 minutah smo izmerili

vrednost fluorescence (vzbujevalna v. d.: 495 nm, emisijska v. d.: 529 nm).

Slika 5: Prikaz nanosa testnih substanc na mikrotitrske plošče (PK 1, PK 2 - pozitivni

kontroli; NK 1, NK 2 – negativni kontroli; sivo obarvani vodnjaki so prazni).

Vse dobljene vrednosti fluorescence smo preračunali glede na pozitivno kontrolo po

naslednji formuli:

Relativna fluorescenca = (dejanska vrednost fluorescence*/ dejanska vrednost fluorescence

pozitivne kontrole**) × 100

*Povprečna vrednost treh ponovitev s testno substanco oziroma povprečna vrednost

dvanajstih ponovitev negativnih kontrol

**Povprečna vrednost dvanajstih ponovitev pozitivnih kontrol



3.3.5 Optimizacija koncentracije testnih substanc

Ko smo določili optimalen inkubacijski čas testnih substanc, smo poskušali določiti še

njihovo optimalno koncentracijo, to je tisto, pri kateri imajo substance največji

antioksidativni učinek. Pripravili smo 10 mM začetno koncentracijo vsake testne

substance. Po standardnem postopku nanosa celic in spiranja, smo naredili 5 serijskih

dilucij v razmerju 1:4. Vsaka redčitev je bila nanesena v treh ponovitvah. V mikrotitrski

ploščici so stolpci 2, 3 in 4 predstavljali redčitve vitamina C, stolpci 9, 10, 11 pa redčitve

troloksa. Stoplci 5, 6, 7 in 8 niso vsebovali testnih substanc, imenovani tudi kontrole (Slika

6). Celice s testnimi substancami smo inkubirali 2 uri, sledilo je spiranje s HBSS ter nanos

20 μM DCFH-DA. Po 30 min inkubaciji z DCFH-DA smo celice sprali in v vse vodnjake

razen v stolpcih 6 in 8 (negativna kontrola) dodali 500 μM t-BuOOH. Vodnjaki v stolpcih

5 in 7 so bili pozitivne kontrole. Po 30 minutah smo izmerili vrednost fluorescence

(vzbujevalna v. d.: 495 nm, emisijska v. d.: 529 nm).

Slika 6: Prikaz redčitev substanc na mikrotitrski plošči z začetno koncentracijo 10 mM in

redčitvami v razmerju 1:4 (PK 1, PK2 - pozitivni kontroli; NK 1, NK 2 –

negativni kontroli; sivo obarvani vodnjaki so prazni).



3.3.6 Optimizacija vrstnega reda nanosa reagentov

Izvedli smo štiri poskuse, pri čemer smo testirali štiri različne načine nanosa testnih

substanc (začetna koncentracija je znašala 10 mM in pet redčitev v razmerju 1:4), t-

BuOOH (500 μM) in DCFH-DA (20 μM). Pri vseh štirih poskusih je bil standardni

postopek nanosa in spiranja celic enak. V prvem poskusu smo celice najprej inkubirali z

DCFH-DA, nato dodali substance in inkubirali 2 uri, v zadnji fazi pa dodali t-BuOOH v

HBSS ter po 30 min pomerili fluorescenco. V drugem poskusu smo celice najprej 30 min

inkubirali s t-BuOOH, nato dodali substance in 2 uri inkubirali. Sledil je dodatek DCFH-

DA in 30 min inkubacija, nato spiranje celic in merjenje fluorescence v HBSS po 30

minutah. Tretji poskus je vseboval postopek, ki smo ga uporabljali tudi za optimizacijo

časa in koncentracije substratov, in sicer najprej nanos substrata in inkubacija 2 uri, nato

dodatek DCFH-DA, v zadnjem koraku pa dodatek t-BuOOH v HBSS ter merjenje

fluorescence po 30 min. V četrtem poskusu smo v celicah najprej s 30 minutno inkubacijo

v t-BuOOH sprožili oksidativen stres, nato dodali DCFH-DA in šele v zadnji fazi dodali

testne substance ter takoj pričeli z merjenjem fluorescence, ki je trajala 105 minut. V tem

primeru substanc iz vodnjakov nismo odstranili. V vseh poskusih so negativne kontrole

namesto t-BuOOH vsebovale samo HBSS.

3.3.7 Obdelava rezultatov

Za določanje relativne fluorescence smo podatke iz čitalca za merjenje fluorescence

statistično obdelali. Pri tem smo uporabili programa Excel (Microsoft, verzija 2010, ZDA)

in SPSS Statistics (IBM, verzija 24, ZDA). V programu SPSS Statistics smo zaradi

nehomogenosti varianc med paralelnimi meritvami uporabili neparametrični statistični test

primerjave neodvisnih vzorcev (Kruskal-Wallisov test). Dobljene vrednosti smo pri

določeni koncentraciji testnih substanc parno primerjali samo s pozitivno kontrolo.

Statistične značilne razlike smo v post-hoc testu z Bonferronijem popravkom parno

primerjali s prilagojeno stopnjo značilnosti, ki je v našem primeru znašala p = 0,05/6 =

0,0083. Vse vrednosti, ki so bile manjše ali enake od prilagojene stopnje značilnosti



oziroma 0,0083, smo označili za značilno različne od pozitivne kontrole. V eksperimentu,

kjer smo določali stopnjo »zadušitve« fluorescence, je prilagojena stopnja značilnosti

zaradi večjega števila koncentracij testnih substanc bila manjša, in sicer p = 0,05/9 =

0,0055.



4 REZULTATI Z RAZPRAVO

4.1 Določitev stopnje »zadušitve« fluorescence (fluorescence quenching

assessment)

»Zadušitev« fluorescence (fluorescence quenching) se nanaša na vsak proces, ki vzorcu

zniža intenziteto fluorescence. Različne molekularne interakcije lahko vodijo do t. i.

»zadušitve«. To vključuje reakcije v vzbujenem stanju, molekularne preureditve, prenos

energije, kompleksne formacije v nevzbujenem stanju ter »zadušitev« trka (collisional

quenching) (Lakowicz 2006).

Občutljivost čitalca za merjenje fluorescence oziroma stopnjo »zadušitve« fluorescence

smo določili z naraščajočimi koncentracijami DCF ter testnih substanc v HBSS. Rezultati

so pokazali, da so vrednosti fluorescence naraščale s koncentracijo DCF (Grafikon 1 in 2).

Poskus je bil izveden v dveh ponovitvah, na grafikonih so prikazane srednje vrednosti obeh

meritev. Vrednost fluorescence pri najvišji koncentraciji DCF (tj. 4 μM) je bila pri obeh

testnih substancah previsoka, da bi jo čitalec lahko izmeril, zato vrednosti na grafikonih

niso prikazane. Pri 1 μM DCF in najvišji koncentraciji obeh testnih substanc (še posebej

pri vitaminu C – Grafikon 2) je bila vrednost fluorescence v primerjavi s kontrolo precej

nižja. Pri nižjih koncentracijah DCF (od 0,0625 mM navzdol) in višjih koncentracijah

troloksa se je pokazal celo trend zvišanja fluorescence v primerjavi s kontrolo. Pri

koncentraciji vitamina C manjši od 3,3 mM, so vrednosti pri posamezni koncentraciji DCF

bile zelo podobne, kar pomeni, da v območju teh koncentracij testne substance ne pride do

motenja signala in posledično do lažnega znižanja ali zvišanja fluorescence. Rezultati

statističnega testa Kruskal Wallis so kljub temu pokazali, da vrednosti pri vseh

koncentracijah obeh testnih substanc (tudi najvišje, tj. 10 mM) niso bile značilno različne

od kontrole (brez testne substance). Glede na rezultate zaključimo, da so optimalni pogoji

za meritve pri koncentracijah testnih substanc pod 3,3 mM in odčitkih fluorimetra nad

1000 enot. Ti pogoji so predvsem pomembni v primeru vrstnega reda nanosa reagentov,

kjer pride kot zadnja dodana testna substanca in se fluorescenca meri v njeni prisotnosti.



Grafikon 1: Grafični prikaz intenzitete fluorescence DCF v odvisnosti od koncentracije

troloksa. Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in napaka.

80

800

8000

80000

Inte

nzi

teta

flu

ore

scen

ce (

log

)

Koncentracija troloksa (mM)

DCF (1 µM)

DCF (0,25 µM)

DCF (0,0625 µM)

DCF (0,0156 µM)

DCF (0,0039 µM)



Grafikon 2: Grafični prikaz intenzitete fluorescence DCF v odvisnosti od koncentracije

vitamina C. Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in napaka.

Ločeno smo naredili še graf fluorescence barvila DCF brez prisotnosti testnih substanc

(Grafikon 3). Rezultati testa so pokazali, da intenziteta fluorescence linearno narašča s

koncentracijo DCF, pri čemer je regresijski koeficient znašal 1.

10

100

1000

10000

100000

Inte

nzi

teta

flu

ore

scen

ce (

log

)

Koncentracija vitamina C (mM)

DCF (1 µM)

DCF (0,25 µM)

DCF (0,0625 µM)

DCF (0,0156 µM)

DCF (0,0039 µM)



Grafikon 3: Grafični prikaz intenzitete fluorescence pri različnih koncentracijah DCF v

odsotnosti testnih substanc. Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in

napaka.

4.2 Določitev optimalnega števila celic na vodnjak

Na mikrotitrsko ploščo je bilo nanesenih 6 različnih koncentracij celic. Začetna

koncentracija je znašala 60.000 celic na vodnjak, sledilo je 5 serijskih dilucij v razmerju

2:3, tako je zadnja koncentracija bila 4665,6 celic na vodnjak. Vsaka dilucija je bila

nanesena v 10 ponovitvah. Vzporedno smo naredili poskus z različnimi koncentracijami

celic še ob prisotnosti t-BuOOH (postopek opisan v poglavju 3.3.3).

Rezultati so pokazali, da fluorescenca pri različnih koncentracijah celic brez prisotnosti

peroksida linearno narašča s časom (Grafikon 4).

R² = 1

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Inte

nzi

teta

flu

ore

scen

ce

Koncentracija DCF (µM)



Grafikon 4: Inteziteta fluorescence v odvisnosti od časa in števila celic na vodnjak (brez

dodatka t-BuOOH). Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in napaka.

Med točkami pri isti koncentraciji celic je narisana linearna trendna črta.

Ob prisotnosti peroksida naraščanje ni bilo več linearno s časom, ampak smo točke

najbolje povezali s polinomsko krivuljo drugega reda (Grafikon 5). Razlogov za nelinearno

naraščanje je lahko več, od časovno odvisne deaktivacije peroksida do progresivnega

naraščanja antioksidativnega odgovora v celicah. Pri enakem številu celic je bilo ob

prisotnosti peroksida naraščanje fluorescence veliko hitrejše kot ob njegovi odsotnosti. To

je bilo pričakovano, saj naj bi peroksid sprožil nastanek prostih radikalov v celici.

R² = 0,9996

R² = 1

R² = 0,9998

R² = 0,9998

R² = 0,9988R² = 0,9989

10

210

410

610

810

1010

1210

1410

1610

0 50 100 150 200 250 300 350

Inte

nzi

teta

flu

ore

scen

ce

Čas (min)

60000

celic/vodnjak

36000

celic/vodnjak

21600

celic/vodnjak

12960

celic/vodnjak

7776

celic/vodnjak

4665,6

celic/vodnjak



Grafikon 5: Inteziteta fluorescence v odvisnosti od časa in števila celic na vodnjak (z

dodatkom t-BuOOH). Prikazana je srednja vrednost dveh meritev in napaka.

Med točkami pri isti koncentraciji celic je narisana polinomska trendna črta 2.

reda.

Določili smo, da se pri nadaljnjih eksperimentih lahko uporablja širok interval

koncentracije celic, saj so vse vrednosti izmerjene fluorescence še vedno bile v območju

detekcije instrumenta. Zaradi nelinearnosti krivulj fluorescence ob prisotnosti peroksida,

smo se odločili uporabljati kot reprezentativne le meritve pri krajših časih (30 min) od

dodatka peroksida.

4.3 Določitev optimalnega inkubacijskega časa testnih substanc

Za določitev optimalnega inkubacijskega časa testnih substanc smo izvedli 4 eksperimente

po standardnem protokolu, ki je opisan v poglavju 3.6. Eksperimenti so se med seboj

razlikovali le glede na inkubacijski čas celic s testnimi substancami. Vse dobljene

vrednosti fluorescence smo preračunali glede na pozitivno kontrolo.

R² = 0,9989

R² = 0,9941

R² = 0,9998

R² = 0,9995

R² = 0,9996R² = 0,9997

10

100

1000

10000

0 30 135 345

Inte

nzi

teta

flu

ore

scen

ce (

log

)

čas (min)

60000

celic/vodnj

ak

36000

celic/vodnj

ak

21600

celic/vodnj

ak

12960

celic/vodnj

ak

7776

celic/vodnj

ak

4665,6

celic/vodnj

ak



Rezultati se med seboj razlikujejo glede na dodano testno substanco oziroma antioksidant.

Po enourni inkubaciji celic z vitaminom C pri nobeni koncentraciji ni prišlo do znižanja

fluorescence, pač pa celo do nekaj odstotnega zvišanja le-te. Medtem ko so se vrednosti po

eni uri inkubacije s troloksom pri vseh koncentracijah znižale, pri čemer je do največjega

znižanja (za 66,14 % glede na pozitivno kontrolo) prišlo pri najvišji koncentraciji troloksa

t. j. 900 M (Grafikon 6, Preglednica 1).

Grafikon 6: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %) po 1 uri

inkubacije testnih substanc s celicami. Na stolpcih je prikazana standardna

deviacija (PK – pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so

značilno različne od pozitivne kontrole.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

90

0 μ

M

30

0 μ

M

10

0 μ

M

33

,3 μ

M

11

,1 μ

M

3,7

μM

90

0 μ

M

30

0 μ

M

10

0 μ

M

33

,3 μ

M

11

,1 μ

M

3,7

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

a i

nte

zite

ta f

luo

resc

en

ce

(%)

*

*




testnimi substancami v različnih koncentracijah po 1 h inkubacije.

Koncentracija testne substance

(µM)

P-vrednost*

vitamin C troloks

900

Ni statistično pomembnih razlik

0,000*

300 0,002*

100 0,108

33,3 0,268

11,1 0,085

3,7 0,108

(*P-vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično

pomembnih razlik se je uporabila prilagojena stopnja p-vrednosti z Bonferronijevim

popravkom).

Tudi po 2 urah inkubacije so se vrednosti fluorescence pri vseh koncentracijah troloksa

znižale, pri najvišji koncentraciji 900 M za 66,39 % glede na pozitivno kontrolo in celo

več kot je bila vrednost negativne kontrole. Pri vitaminu C je do znižanja fluorescence

glede na pozitivno kontrolo prišlo le pri najvišji koncentraciji, in sicer za 19,06 %, glede na

pozitivno kontrolo (Grafikon 7).



Grafikon 7: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %) po 2 urah

inkubacije substratov s celicami. Na stolpcih je prikazana standardna deviacija

(PK – pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so značilno

različne od pozitivne kontrole.




(µM)

P-vrednost*

Vitamin C troloks

900

Ni statistično pomembnih razlik

0,000*

300 0,002*

100 0,108

33,3 0,268

11,1 0,085

3,7 0,108

(*P vrednost izračunana po Kruskal Wallisovem testu. Za ugotavljanje statistično


popravkom).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

90

0 μ

M

30

0 μ

M

10

0 μ

M

33

,3 μ

M

11

,1 μ

M

3,7

μM

90

0 μ

M

30

0 μ

M

10

0 μ

M

33

,3 μ

M

11

,1 μ

M

3,7

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

a i

nte

zite

ta f

luo

resc

en

ce

(%)

*

*



Po 3 urah inkubacije celic z vitaminom C prav tako nobena koncentracija ni privedla do

znižanja fluorescence, kvečjemu do zvišanja. Medtem so vrednosti pri treh najvišjih

koncentracijah troloksa (900, 300 in 100 μM) ostale nižje, pri ostalih koncentracijah pa

približno enake ali celo višje od pozitivne kontrole (Grafikon 8).


inkubacije substratov s celicami. Na stolpcih je prikazana standardna



0

50

100

150

200

250

300

90

0 μ

M

30

0 μ

M

10

0 μ

M

33

,3 μ

M

11

,1 μ

M

3,7

μM

90

0 μ

M

30

0 μ

M

10

0 μ

M

33

,3 μ

M

11

,1 μ

M

3,7

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

a i

nte

nzi

teta

flu

ore

scen

ce

(%)

*

*

*

*





Koncentracija testne substance (µM) P-vrednost*

Vitamin C troloks

900 0,022 0,003*

300 0,016 0,024

100 0,005* 0,049

33,3 0,006* 0,977

11,1 0,005* 0,977

3,7 0,907 0,463



popravkom).

Pri dveh najvišjih koncentracijah (900 in 300 μM) obeh testnih substanc, so se vrednosti

relativne fluorescence glede na pozitivno kontrolo po 6 urah inkubacije, znižale. Največje

znižanje fluorescence glede na pozitivno kontrolo (za 62,63 %) je povzročila najvišja

koncentracija troloksa, sledila je najvišja koncentracija vitamina C (za 37,09 %) (Grafikon

9). Ker je pri vitaminu C prišlo do prvega znižanja fluorescence šele po 6 urah inkubacije,

sklepamo, da ta testna substanca v primerjavi s troloksom za antioksidativen učinek

potrebuje dlje časa.




inkubacije substratov s celicami. Na stolpcih je prikazana standardna



0

20

40

60

80

100

120

90

0 μ

M

30

0 μ

M

10

0 μ

M

33

,3 μ

M

11

,1 μ

M

3,7

μM

90

0 μ

M

30

0 μ

M

10

0 μ

M

33

,3 μ

M

11

,1 μ

M

3,7

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

ain

ten

zite

tafl

uo

resc

en

ca

(%)

*

*

*







popravkom).

Optimalen čas inkubacije smo določili za vsako testno substanco posebej. Učinki (znižanje

fluorescence) pri vseh koncentracijah vitamina C so se pokazali šele po 6 urah inkubacije,

zato je optimalen čas inkubacije minimalno 6 ur. Medtem se je antioksidativna aktivnost

troloksa pokazala že po eni uri inkubacije. Podoben odstotek znižanja fluorescence je bil

tudi še po 2 urah inkubacije, nato se je učinek s časom zmanjševal. Optimalen inkubacijski

čas troloksa je od 1 do 2 ur. Takšno razliko med optimalnim inkubacijskim časom obeh

testnih substanc lahko pripišemo njuni hidrofilni oziroma lipofilni naravi. Lipidotopni

troloks, za svoj učinek potrebuje manj časa kot vodotopni vitamin C, saj do njegovih

antioksidativnih lastnosti po vsej verjetnosti pride že v membrani celice (lipofilni dvosloj),

medtem ko vitamin C za vstop v notranjost celice preko membrane in svoje delovanje

potrebuje nekaj ur več.


(µM)

P-vrednost*

Vitamin C troloks

900 0,000* 0,003*

300 0,002* 0,015

100 0,010 0,066

33,3 0,670 0,528

11,1 0,202 0,758

3,7 0,038 0,587



4.4 Določitev optimalne koncentracije testnih substanc

Za določitev optimalne koncentracije vitamina C in troloksa, kjer bi dobili največji

antioksidativni učinek, smo izvedli eksperiment z uporabo še višje začetne koncentracije

testnih substanc do 10 mM (Grafikon 10, Preglednica 5). Pri tem smo uporabili postopek,

opisan v poglavju 3.7. Dobljene vrednosti eksperimenta smo prav tako preračunali glede na

pozitivno kontrolo, tako da smo dobili relativne vrednosti fluorescence. Rezultati so

pokazali, da so vrednosti relativne fluorescence pri višji začetni koncentraciji (10 mM) pri

obeh testnih substancah še nižje. Vendar glede na rezultate poskusa, kjer smo določevali

stopnjo »zadušitve« fluorescence, obstaja možnost, da je vrednost fluorescence pri poskusu

z začetno koncentracijo testnih substanc 10 mM lažno nizka, če imamo prisotne testne

substance med merjenjem (glej poglavje (4.1). Kjer testne substance pred meritvijo

odstranimo, pričakujemo nizke znotrajcelične koncentracije obeh substanc, ki posledično

ne bi mogle vplivati značilno na dušenje fluorescence. Kljub temu je potrebno poudariti, da

so koncentracije višje od 1 mM že zelo visoke, zato je vprašljiva tudi njihova biološka

pomembnost.



Grafikon 10: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %). Na

stolpcih je prikazana standardna deviacija (PK – pozitivna kontrola, NK –

negativna kontrola). *Vrednosti so značilno različne od pozitivne kontrole.

0

20

40

60

80

100

120

140

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

ain

tezi

teta

flu

ore

scen

ce

(%)

*

*

*




testnimi substancami z začetno koncentracijo 10 mM.


(mM)

P-vrednost*

vitamin C troloks

10 0,014 0,000*

2500 0,040 0,001*

625 0,577 0,004*

156,25 0,120 0,019

39,1 0,142 0,113

9,8 0,557 0,159



popravkom).

4.5 Določitev optimalnega zaporedja nanosa reagentov

Testirali smo štiri različna zaporedja nanosa testnih substanc (začetna koncentracija 10

mM in pet redčitev v razmerju 1:4), t-BuOOH (500 μM) in DCFH-DA (20 μM). Iz

medsebojne primerjave grafikonov 11, 12, 13 in 14 je razvidno, da se ti med seboj precej

razlikujejo, kar je dokaz, da je zaporedje nanosa reagentov pomemben dejavnik pri

določanju antioksidativne aktivnosti spojin ali ekstraktov.

Pri eksperimentu, kjer je bil k celicam najprej dodan t-BuOOH, nato testna substanca ter na

koncu DCFH-DA, je pri vseh koncentracijah prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s

pozitivno kontrolo, kar je dokaz antioksidativne aktivnosti oziroma »lovljenja« radikalov v

celicah (Garafikon 11). Poleg tega se je v tem primeru poleg troloksa pokazal

antioksidativni potencial tudi pri vitaminu C, ki je znižal vrednosti celo pod vrednost

negativne kontrole. To zaporedje nanosa reagentov se je pokazalo kot eno

najučinkovitejših.



Grafikon 11: Relativna vrednost fluorescence glede na pozitivno kontrolo (100 %), pri

čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: t-BuOOH, testna

substanca, DCFH-DA. Na stolpcih je prikazana standardna deviacija (PK –

pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so značilno


0

20

40

60

80

100

1201

0 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

ain

ten

zite

tafl

uo

resc

en

ce

(%)

* *





zaporedju: t-BuOOH, testna substanca, DCFH-DA.


(mM)

P-vrednost*

vitamin C troloks

10 0,000* 0,060

2500 0,001* 0,030

625 0,097 0,411

156,25 0,092 0,089

39,1 0,123 0,030

9,8 0,023 0,060



popravkom).

V poskusu, kjer je bilo zaporedje nanosa reagentov sledeče: t-BuOOH, DCFH-DA, testna

substanca (Grafikon 12), je do večjega znižanja fluorescence prišlo le pri najvišji

koncentraciji antioksidantov. Ker je v tem primeru merjenje fluorescence potekalo v

prisotnosti testne substance, je pri višjih koncentracijah prišel do izraza tudi učinek dušenja

fluorescence. Kljub temu smo dobili rezultate, iz katerih bi sklepali na vprašljivo

antioksidativno učinkovitost testnih substanc v celicah. Zaradi težko razložljivih rezultatov

smo to zaporedje označili kot najmanj primerno.




čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: t-BuOOH, DCFH-DA,

testna substanca. Na stolpcih je prikazana standardna deviacija (PK –

pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so značilno


0

50

100

150

200

250

300

350

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

a in

tezi

teta

flu

ore

scen

ce

(%)

*

*





zaporedju: t-BuOOH, DCFH-DA, testna substanca.


(10 mM)

P-vrednost*

vitamin C troloks

10 0,059 0,072

2500 0,572 0,003*

625 0,367 0,015

156,25 0,004* 0,066

39,1 0,041 0,433

9,8 0,122 0,676



popravkom).

Kadar je bil antioksidant celicam dodan na začetku, nato DCFH-DA ter šele na koncu t-

BuOOH (Grafikon 13), se je kot učinkovit antioksidant izkazal troloks, vitamin C pa le pri

najvišjih koncentracijah. Kljub temu je bila ta kombinacija manj učinkovita, kot t-BuOOH-

testna substanca-DCFH-DA. Razlika med kombinacijama je predvsem v času od sprožitve

oksidativnega stresa do meritve prostih radikalov. V primeru dodatka oksidanta na začetku

ima celica več časa za sprožitev lastnih antioksidativnih mehanizmov in videti je, da tako

troloks kot tudi vitamin C pri tem učinkovito pomagata. Po drugi strani pa dodatek

peroksida na koncu in takojšnje meritve nastale fluorescence, bolj odražajo učinkovitost

testnih substanc, da vstopijo v celico in takoj učinkujejo kot lovilci prostih radikalov že

sami po sebi.




čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: testna substanca, DCFH-

DA, t-BuOOH. Na stolpcih je prikazana standardna deviacija (PK – pozitivna

kontrola, NK – negativna kontrola). *Vrednosti so značilno različne od

pozitivne kontrole.

0

20

40

60

80

100

120

140

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

a i

nte

nzi

teta

flu

ore

scen

ce

(%)

*

*

*





zaporedju: testna substanca, DCFH-DA, t-BuOOH.


(10 mM)

P-vrednost*

vitamin C troloks

10 0,014 0,000*

2500 0,040 0,001*

625 0,577 0,004*

156,25 0,120 0,019

39,1 0,142 0,113

9,8 0,557 0,159



popravkom).

Pri eksperimentu, kjer je bil DCFH-DA dodan celicam pred antioksidantom ter šele na

koncu t-BuOOH (Grafikon 14), so bile relativne vrednosti fluorescence blizu ali celo višje

kot vrednosti pozitivne kontrole. Prav tako je bila majhna razlika med pozitivno in

negativno kontrolo. Ena izmed teorij za razlago takšnih rezultatov je ta, da se med daljšo

inkubacijo DCFH-DA iz celic izgubi/metabolizira ali pa postane nestabilen.




čemer so reagenti bili dodani v sledečem zaporedju: DCFH-DA, testna

substanca, t-BuOOH (PK – pozitivna kontrola, NK – negativna kontrola). Na

stolpcih je prikazana standardna deviacija. *Vrednosti so značilno različne od

pozitivne kontrole.

0

50

100

150

200

250

300

350

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM

10 m

M

25

00

μM

62

5 μ

M

15

6,2

5 μ

M

39

,1 μ

M

9,8

μM PK

NK

vitamin C troloks

Rel

ati

vn

a i

nte

zite

ta f

luo

resc

en

ce

(%)

*





zaporedju: DCFH-DA, testna substanca, t-BuOOH.


(10 mM)

P vrednost*

vitamin C troloks

10 0,057 0,021

2500 0,457 0,021

625 0,007* 0,423

156,25 0,707 0,061

39,1 0,457 0,079

9,8 0,260 0,947



popravkom).



5 SKLEPI

Na modelni makrofagni človeški celični liniji TLT smo poskušali optimizirati celično

metodo z uporabo barvila DCFH-DA (2´, 7´-diklorofluorescin-diacetat) za določevanje

pro- in antioksidativne aktivnosti različnih spojin. Ugotavljali smo najprimernejše število

celic na vodnjak, optimalen inkubacijski čas in koncentracijo testnih substanc (kot model

smo uporabili antioksidanta vitamin C in troloks) ter najprimernejši vrstni red nanosa

reagentov.

Ugotovili smo, da je vrednost fluorescence v testu z DCFH-DA linearno odvisna od števila

celic na vodnjak, vendar je linearna povezava bistveno večja, če celicam ne dodamo t-

BuOOH kot, če jim ta oksidant dodamo; ob prisotnosti le-tega je bilo naraščanje bolj

podobno polinomski krivulji 2. reda. Hipotezo 1 lahko torej potrdimo le delno. Določili

smo tudi, da se pri eksperimentih lahko uporablja širok interval koncentracije celic, saj so

vse vrednosti izmerjene fluorescence še vedno bile v območju detekcije instrumenta.

Tudi drugo hipotezo lahko potrdimo le delno, saj previsoka koncentracija vitamina C (v

našem primeru je to bilo 10 mM) sproži učinek »zadušitve« fluorescence in s tem vpliva na

lažno nizke izmerjene vrednosti fluorescence. Vendar to velja samo za poskuse, kjer je

antioksidant prisoten med samo meritvijo. Hkrati to ne velja za troloks, kjer je stopnja

»zadušitve« fluorescence pri najvišji koncentraciji precej nižja, predvsem pa bolj odvisna

od koncentracije DCF.

Pri optimizaciji inkubacijskega časa testnih substanc smo opazili, da se rezultati med seboj

razlikujejo glede na dodan antioksidant. Za troloks velja, da se največji antioksidativen

učinek pokaže že po 1 - 2 uri inkubacije s celicami, nato se s časom ta učinek postopoma

zmanjšuje. Medtem ko se pri vitaminu C antioksidativna aktivnost pojavi šele po 6 urah

inkubacije s celicami, krajše inkubacije tega učinka niso pokazale. Tretjo hipotezo lahko

torej potrdimo za obe testni substanci. Te ugotovitve so bile osnovane na zaporedju nanosa

testna substanca - DCFH-DA – t-BuOOH.



Opazili smo, da je za meritve fluorescence vrstni red nanosa reagentov pomemben, zato

lahko četrto hipotezo v celoti potrdimo. Kombinaciji t-BuOOH - DCFH-DA - testna

substanca ter testna substanca - DCFH-DA - t-BuOOH sta neprimerni, saj pri prvi

kombinaciji pri višjih koncentracijah testnih substanc pride do »zadušitve« fluorescence,

medtem ko je pri drugi kombinaciji verjetno problem v izgubi DCFH-DA iz celic med

daljšo inkubacijo. Kot primerni sta se izkazali kombinaciji testna substanca - DCFH-DA -

t-BuOOH in t-BuOOH- testna substanca - DCFH-DA, pri čemer je slednja učinkovitejša,

saj je v primerjavi s pozitivno kontrolo do znižanja fluorescence prišlo prav pri vseh

koncentracijah testnih substanc.



6 VIRI

Abram V. 2000. Antioksidativno delovanje flavonoidov. V: Antioksidanti v živilstvu. 20.

Bitenčevi živilski dnevi, 26. in 27. oktober 2000, Portorož. Žlender B, Gašperlin L (ur.).

Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 23-32.

Barros AIRNA, Nunes FM, Gonçalves B, Bennett RN, Paula A. 2011. Effect of cooking

on total vitamin C contents and antioxidant activity of sweet chestnuts ( Castanea sativa

Mill.). Food Chem., 128: 165–172.

Bergendi L, Benes L, Durackova Z, Ferencik M. 1999. Chemistry, physiology and

pathology of free radicals. Life Sci., 65: 1865–1874.

Burton GW and Traber MG. 1990. Vitamin E: Antioxidant activity, biokinetics, and

bioavailability. Annu. Rev. Nutr., 10: 357–382.

Cadenas S, Barja G, Poulsen HE, Loft S. 1997. Oxidative DNA damage estimated by

oxo8dG in the liver of guinea-pigs supplemented with graded dietary doses of ascorbic

acid and α-tocopherol. Carcinogenesis, 18: 2373–2377.

Carocho M and Ferreira ICFR. 2013. A review on antioxidants, prooxidants and related

controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and

future perspectives. Food Chem. Toxicol., 51: 15–25.

Carr A and Frei B. 1999. Does Vitamin C act as a pro-oxidant under physiological

conditions? FASEB J., 13:1007–24.

Cornelli U. 2009. Antioxidant use in nutraceuticals. Clin. Dermatol., 27: 175-194.

Dikalov SI and Harrison D. 2014. Methods for detection of mitochondrial and cellular

https://www.researchgate.net/publication/230858203_Methods_for_Detection_of_Mitochondrial_and_Cellular_Reactive_Oxygen_Species



reactive oxygen species. Antioxid. Redox Sign., 20: 372-82.

Fiala ES, Sodum RS, Bhattacharya M, Li H. 1996. Epigallocatechin gallate, a polyphenolic

tea antioxidant, inhibits peroxynitrite-mediated formation of 8-oxodeoxy- guanosine and 3-

nitrotyrosine. Experientia, 52: 922–926.

Fischer-Nielsen A, Loft S and Jensen KG, 1993. Effect of ascorbate and 5-aminosalicylic

acid on light-induced 8-hy- droxydeoxyguanosine formation in V79 Chinese hamster cells.

Carcinogenesis, 14: 2431–2433.

Frankel EN and Meyer AS. 2000. The problems of using one- dimensional methods to

evaluate multifunctional food and biological antioxidants. J. Sci. Food Agric., 80: 1925–

1941.

Girard-Lalancette K, Pichette A, Legault J. 2009. Sensitive cell-based assay using DCFH

oxidation for the determination of pro- and antioxidant properties of compounds and

mixtures: Analysis of fruit and vegetable juices. Food Chem., 115: 720–726.

Glade MJ. 2003. The role of reactive oxygen species in Health and Disease Northeast

Regional Environmental Public Health Center University of Massachusetts. Amerst

Nutrition, 19: 401–3.

Goya Luis M, Martín A, Ramos S, Mateos R. 2009. A cell culture model for the

assessment of the chemopreventive potential of dietary compounds. Curr. Nutr. Food Sci.,

5: 56–64.

Gülçin I. 2012. Antioxidant activity of food constituents: An overview. Arch. Toxicol., 86:

345–391.

https://www.researchgate.net/publication/230858203_Methods_for_Detection_of_Mitochondrial_and_Cellular_Reactive_Oxygen_Species



Hall NK, Chapman TM, Kim HJ, Min DB. 2010. Antioxidant mechanisms of Trolox and

ascorbic acid on the oxidation of riboflavin in milk under light. Food Chem., 118: 534–

539.

Halliwell B. 1996. Oxidative stress, nutrition and health: Experimental strategies for

optimization of nutritional antioxidant intake in humans. Free Radical Res, 25: 57–74.

Halpner AD, Handelman GJ, Belmont CA, Harris JM, Blumberg JB. 1998. Protection by

vitamin C of oxidant-induced loss of vitamin E in rat hepatocytes. J. Nutr. Biochem., 9:

355–359.

Huang D, Ou B, Prior R. 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agri.

Food Chem., 53: 1841–1856.

Kalyanaraman B, Darley-Usmar V, Davies KJA, Dennery PA, Forman HJ, Grisham MB,

Ischiropoulos H. 2012. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent

probes: Challenges and limitations. Free Radical Bio. Med., 52: 1–6.

Korošec L. 2000. Prosti radikali in vloga antioksidantov v bioloških sistemih.V:

Antioksidanti v živilstvu. 20. Bitenčevi živilski dnevi, 26. in 27. oktober 2000, Portorož.

Lakowicz Joseph R. 2006. Quenching of Fluorescence. V: Principles of Fluorescence, 3rd

edition. Center for Fluorescence Spectroscopy, University of Maryland School of Medicine

(ed.), Springer United States: 277–330.

LeBel CP, Ischiropoulos H, Bondy SC. 1992. Evaluation of the probe 2',7'-

dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative

stress. Chem. Res. Toxicol., 5: 227–231.

Liu RH and Finley J. 2005. Potential cell culture models for antioxidant research. J. Agri.

Food Chem., 53: 4311–4314.



Lucas-Abellan C, Mercader-Ros MT, Zafrilla MP, Gabaldon JA, Nunez-Delicado E. 2010.

Comparative study of different methods to measure antioxidant activity of resveratrol in

the presence of cyclodextrins. Food Chem. Toxicol., 49: 1225-1260.

Mates JM and Sanchez-Jimenez F. 1999. Antioxidant enzymes and their implications in

pathophysiologic processes. Front. Biosci., 4: 339–345.

Nazirog M and Butterworth PJ. 2005. Protective effects of moderate exercise with dietary

vitamin C and E on blood antioxidative defense mechanism in rats with streptozotocin-

induced diabetes. Can. J. Appl. Physiol., 30: 172–185.

Niki E. 2010. Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo. Free Radical Bio.

Med., 49: 503–515.

Norooz M, Angerson WJ, Lean MEJ. 1998. Effects of flavonoids and vitamin C on

oxidative DNA damage to human lymphocytes. Am. J. Clin. Nutr., 67: 1210–1218.

Pflaum M, Kielbassa C, Garmyn M, Epe B. 1998. Oxidative DNA damage induced by

visible light in mammalian cells: extent, inhibition by antioxidants and genotoxic effects.

Mutat. Res., 408: 137–146.

Pietta P. 2000. Flavonoids as antioxidants. J. Nat. Prod., 63: 1035–1042.

Piga R, Saito Y, Yoshida Y, Niki E. 2007. Cytotoxic effects of various stressors on PC12

cells : Involvement of oxidative stress and effect of antioxidants. Neurotoxicology, 28: 67–

75.

Pisoschi AM, Negulescu GP. 2011. Methods for total antioxidant activity determination: A

review. Biochem. Anal. Biochem., 1:106-114.



Poli G, Leonarduzzi G, Biasi F, Chiarpotto E. 2004. Oxidative stress and cell signaling.

Curr. Med. Chem., 11:1163–82.

Pisoschi AM, Pop A. 2015. The role of antioxidants in the chemistry of oxidative stress: A

review. Eur. J. Med. Chem., 97: 55–74.

Priyadarsini KI, Kapoor S, Naik DB. 2001. One- and two-electron oxidation reactions of

Trolox by peroxynitrite. Chem. Res. Toxicol., 14: 567–571.

Rahman K. 2003. Garlic and aging: new insights into an old remedy. Aging Res. Rev., 2:

39–56.

Rahman K. 2007. Studies on free radicals, antioxidants, and co-factors. Clin. Interv. Aging,

2: 219–236.

Raspor P, Kovač B, Batič M, Berglez D. 2000. Bioprocesi pridobivanja antioksidantov. V:

Antioksidanti v živilstvu. 20. Bitenčevi živilski dnevi. 26. in 27. oktober 2000, Portorož.

Žlender B, Gašperlin L (ur.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 11-15.

Ratnam DV, Ankola DD, Bhardwaj V, Sahana DK, Kumar MNVR. 2006. Role of

antioxidants in prophylaxis and therapy : A pharmaceutical perspective. J. Control.

Release, 113: 189–207.

Reddy VN, Giblin FJ, Lin LR, Chakrapani B. 1998. The effect of aqueous humor ascorbate

on ultraviolet-B-induced DNA damage in lens epithelium. Invest. Ophth. Vis. Sci., 39:

344–350.

Sies H. 1997. Oxidative stress: Oxidants and antioxidants. Exp. Physiol., 82: 291–295.

Stohs SJ. 1995. The role of free radicals in toxicity and disease. J. Basic Clin. Physiol.

Pharmacol., 6: 205–228.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chiarpotto%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15134513



Wan H, Liu D, Yu X, Sun H, Li Y. 2015. A Caco-2 cell-based quantitative antioxidant

activity assay for antioxidants. Food Chem., 175: 601–608.

Wang H and Joseph JA. 1999. Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein

assay using microplate reader. Free Radical Bio. Med., 27: 612–616.

Wattamwar P, Mo Y, Wan R, Palli R, Zhang Q, Dziubla DT. 2010. Antioxidant activity of

degradable polymer poly (trolox ester) to suppress oxidative stress injury in the cells. Adv.

Funct. Mater., 20: 147–154.

Wei H, Cai Q, Tian L, Lebwohl M. 1998. Tamoxifen reduces endogenous and UV light-

induced oxidative damage to DNA, lipid, and protein in vitro and in vivo. Carcinogenesis,

19: 1013–1018.

Weingerl V, Štrlič M, Kočar D. 2010. Evaluation of the chemiluminometric method for

determination of polyphenols in wine. Anal. Lett., 44: 1310–1322.

Wright JS, Johnson ER, Di Labio GA. 2001. Predicting the activity of phenolic

antioxidants: theoretical method, analysis of substituent effects, and application to major

families of antioxidants. J. Am. Chem. Soc., 123: 1173–1183.

Yettella RR and Min DB. 2010. Effects of Trolox and ascorbic acid on the riboflavin

photosensitised oxidation of aromatic amino acids. Food Chem., 118: 35–41.

ZAHVALA



Za vso pomoč, nasvete in potrpežljivost se zahvaljujem svojemu mentorju izr. prof. dr.

Tomažu Langerholcu ter asistentki mag. Maši Primec.

Zahvala gre tudi vodstvu Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede, ki je omogočila

nakup naprave ter ostalih pripomočkov, potrebnih za izvajanje eksperimentov.

Za vso razumevanje, in predvsem hitro odzivanje na moje prošnje, bi se želela zahvaliti

tudi vodstvu referata za študijske zadeve Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede, ter

članoma svoje študijske komisije, izr. prof. dr. Metki Šiško in mag. Maksimilijanu Brusu.

Posebej bi se rada zahvalila tudi svoji družini in prijateljem, ki so mi ob študijem stali ob

strani in me podpirali, ter vsem ki so mi kakorkoli pomagali pri oblikovanju dokončne

oblike magistrskega dela.

Documents

OPTIMIZACIJA METODE ZA OCENJEVANJE ...Oswald B. Optimizacija metode za ocenjevanje antioksidativne aktivnosti…na celični liniji TLT. III Mag. delo. Maribor, Univerza v Mariboru,