Optimizacija PCR

8/13/2019 Optimizacija PCR

1/20

OPTIMIZACIJA STANDARDNOG PCRa


2/20

PCR - polimerazna lanana reakcija (engleski: Polymerase Chain Reaction) je metodakojom se relativno kratki dio DNK umnoavau veliki broj ientinihkopija.

Kary Mullis je 1983. otkrio, a 1993. dobio Nobelovu nagradu

molekularnogfotokopiranjaVrijeme potrebno za odvijanje jedne PCR reakcije je 3 do 6 sati. Kvalitativna analiza PCR

produkata vrise elektroforezom na agaroznom gelu

PCR


3/20

Za izvoenje PCR-a neophodni su:

DNK uzorakPrajmer F

Prajmer R

dNTPs- nukleotidi

Mg2+

Taq polimeraza

Pufer

ddH2O

U PCR metodi se koristi DNK polimeraza izolovana iz bakterije Thermus

aquaticus (nazvana Taq polimeraza) koja ivi u termalnim izvorima natemperaturi oko 72 oC. Usljed toga je sposobna da na toj temperaturi vrireplikaciju DNK molekula.


4/20

Napravljena reakciona smjesa se stavlja u aparat nazvan

Termocycler koji omoguduje tok reakcije. PCR se izvodiponavljanjem u 2030 ciklusa od kojih se svaki sastoji iz tri

osnovne faze :

Incijalna denaturacija- 5 minuta, 95C

1. Denaturacija- 2-5 minuta, 95C

2. Hibridizacija primera (annealing)-

20 sekundi-1 minute, 42-65C

3. Sinteza komplementarnog lanca (extension ili elongacija)-

30 sekundi- 2 minute, 72C

Zavrna elongacija- 9 15 minuta,

72C


5/20

Optimizacija standardnog PCR-a

Ne postoji niti jedan set uvjeta koje je optimalna za sve PCR.

Dakle, svaki PCR de vjerovatno zahtijevati specifine optimizacije za matricu/prajmer koji smo izabrali.

Nedostatak optimizacije esto rezultira problemima, tako to se ne moedetektirati PCR proizvod ili imamo nisku uinkovitost amplifikacije, prisutnostnespecifinih bendova ili mutacije uzrokovane grekama kod ugradnjenukleotida.

Nedostatak optimizacije esto rezultira problemima, tako to se ne moedetektirati PCR proizvod ili imamo nisku uinkovitost amplifikacije, prisutnostnespecifinih bendova ili mutacije uzrokovane grekama kod ugradnjenukleotida.


6/20

Optimizacija oreenog PCR moe biti dugotrajana ikomplicirana, jer zavisi od razliitih parametara koji suukljueniu cijelokupni proces.

Ti parametri su slijeedi:

Kvaliteta i koncentracija DNK molekule

Dizajn i koncentracija prajmera;

Koncentracija magnezijevih iona,

Koncentracija etiri dezoksinukleotida(dNTPs)

PCR puferski sistem

Odabir i koncentracija DNK Polimeraze

Temperaturni uvjeti za PCR cikluse

Dodavanje tane koncentracije PCR aditivi /otapala;


7/20

KOLIINAI KVALITET DNK

Teoretski dovoljna je jedna molekula

DNK, ali u praksi je potrebno

najmanje 100 do 1000 molekula.

Poeljno je da je izolirana DNK tokvalitetnija. Ipak, nekada PCR

funkcionira optimalno iako

nemamo najoptimalniji materijal

u obradi.

KONCENTRACIJA ENZIMA

Taq polimeraza iz razliitihproizvoaase moe

ponaati razliito, to ovisi od formulacije,uvjeta, te definiranih jedinica. Ovo uo od

enzima ima maksimalnu aktivnost ili

djelotvornost pri temperaturi od 72Ci pH 8.

Preporuena koncentracija Taqpolimeraze, u sluajukada su svi ostaliuvjeti optimizirani, krede se od 1 do2,5 jedinice na 100 l reakcione

smjese.

Ukoliko je koncentracija enzima

previsoka moe odi do akumulacijenespecifinih produkata(s povedanjem koncentracije opada

specifinost), a ukoliko je pak premala

moe se desiti da imamo nedovoljnu

koliinueljenogprodukta.


8/20

PRAJMERI

Optimalna koncentracija prajmera kredese od 0,1 do 0,6 M.

Vedekoncentracije mogu dovesti do pogrenogprijanjanja i

akumulacije nespecifinihprodukata.

Male kocentracije se obino iscrpe prije nego se reakcija

zavritodovodi do niske produktivnosti PCRa.

DEOKSINUKLEOTIDI TRIFOSFATI

Ono o emutreba voditi raunakod dNTPs-ova je da u otopini imamo izbalansirane

koliine sve etiri vrste dNTPs kako bi se

mogudnostgrekesvela na minimum.

Ukoliko povedavamo koliinu dNTPs-apotrebno je povedati i koncentraciju Mg++iona kako se ne bi naruila aktivnost Taqpolimeraze.


9/20

Mg2++

TEMPERATURA VEZANJA PRAJMERA

Optimizacija koncentracije magnezijevih jona je od kljunogznaaja jer moe znaajno utjecati na neke od sljeedihparametara: prijanjanje prajmera za DNK matricu,

temperaturu disocijacije DNK lanaca, specifinost podukta,formiranje dimera prajmera, formiranje artefakta te enzimsku

aktivnost.

Taq polimeraza zahtjeva slobodne ione magnezija, dakle ne vezane za DNK matricu,

prajmere i dNTPs-ove.

Optimalna koncentracija Mg++ iona se kredeu rasponu od 1 do 10 mM i ona treba dabude vedaod ukupne koncentracije dNTPs.

Ona se efiniekao temperatura na kojoj 50% molekula DNK

disocira, pri emu je za raskidanje GC baznih parovapotrebna vedatemperatura u odnosu na AT parove.

Klasinaformula je:

Tm= 4 x (broj G + broj C) + 2 x (broj A + broj T)


10/20

HIBRIDIZACIJA

ELONGACIJA

Elongacija ovisi od uine i koncentracije ciljne sekvence, te

naravno o temperaturi.

Elongacija se odvija na ustaljenoj temperaturi od 72 C.

Vrijeme i temperatura potrebna za prijanjanje prajmera ovise

o uini ciljnog fragmenta, kompoziciji uikovih baza i osamoj koncentraciji prajmera.

Temperatura koja se primjenjuje u ovoj fazi je za 5 do 10 C

ispod taketopljenja prajmera.


11/20

BROJ CIKLUSA

Optimalan broj ciklusa ovisi uglavnom o koliine izolirane DNKkoja se nastoji amplificirati.

Kary Mullis je jednom prilikom izjavio:Ukoliko vam je

potrebno vie od 40 ciklusa da amplificirate jednu kopiju gena,

neto ozbiljno nije uredu s vaim PCR-om.

DENATURACIJA-VRIJEME I TEMPERATURA

Preporueniuvjeti za denaturaciju su 95 C 30 sec ili 97 C15 sec. Vie temperature su prikladnije ukoliko su ciljnesekvence bogate GC baznim parovima.

estoje korisno uraditi prvi ciklus denaturacije s poetnomdenaturacijom na 92 do95 C tijekom 2 do 5 minuta, da bi se osiguralo potpuno razdvajanje DNK.

Takoer je vanonapomenuti da devietemperature denaturacije smanjiti koliinuaktivne DNK polimeraze koja je dostupna.Poluivot Taq DNK polimeraze i njena

aktivnost je vieod 2 sata pri 92,5 C, 40 min na 95 C, i 5 min pri 97,5 C.


12/20

Mogui problemi

Moe se desiti da nam se u rezultatima pojave neeljeniprodukti velike uine. Ova pojava se moe izbjedi na

provoenjemnekih od slijeedihkoraka:Kod hibridizacije moemo skratiti vrijeme,povisiti temperaturu

Skratiti vrijeme elongacije, a temperaturupovedatina 62 don 68 C

Smanjiti koncentraciju KCl pufera 1,2do 2x, akoncentraciju Mg++ iona rati u rasponu od1,5 do 2 mM

Povedati koncentraciju Mg++ iona do 3-4,5mM, ali pri tome paziti da koncentracija dNTPs-

ova ostane konstantna

Smanjiti koliinu prajmera, DNK i Taqpolimeraze

Ukoliko se nita od navedenog ne pokae

djelotvornim, provjeriti prajmere zaponavljajudesekvence, te ih promjeniti.


13/20

Povedati temperaturu na kojoj se vriprijanjanje prajmere za matricu, prouitii vrijeme potrebno za hibridizaciju

Smanjiti koncentraciju KCl pufera za 0,7-0,8x, pri tome orati koncentracijuMgCl2 u rasponu od 1,5 do 2 mM

Povedati koncentraciju MgCl2 na 3 do4,5 mM, koncentracija dNTPs-ovamora

ostati konstantna

Primjeniti manju koliinu prajmera,DNK, Taqpolimeraze

Ukoliko se nita od navedenog nepokae djelotvornim, provjeriti prajmereza ponavljajudesekvence, te ih promjeniti

Ukoliko se u rezultatima pojave neto kradinespecifiniprodukti, treba uzeti u razmatranjesljeedetake:


14/20

Ukoliko je reakcija prethodno funkcionisala u najboljem redu, a u datom trenutku ista

ne daje nikakve rezultate poduzmite sljeede:

Provjerite da li su svi sastojciza PCR reakciju prisutni u

reakcionoj smjesi

Promjenite otopinu dNTPs-ova

Ukoliko ste upravo kupili nove

prajmere, provjerite njihovu

pouzdanost

Povedajte koliinu prajmera iuzorka

Smanjite temperaturuhibridizacijeza 6-10C te

provjerite a li dete obiti ikakavrezultat

Provjerite pouzdanost iispravnost svakog od sastojaka

potrebnih za PCR


15/20

Postepeno smanjujte temperaturuprijanjanja prajmera za matricu do

najniemogude

PovedajtekoliinuPCR prajmera, DNKuzorka i Taq polimeraze

Promjenite koncentraciju DNK pufera( povedajte ju ukoliko je PCR proizvodmanji od 1000bp, ukoliko je vedi od1000bp smnjite ju)

Dodajte pomodna sredstva(5%DMSO, BSA ili glicerol)

U nastavku demo navesti neke od naina da povedateproduktivnost vaeg PCRa, kada ista nije nazaovoljavajudemnivou:


16/20

Ostali mogudiproblemi

Posebnu panju treba obratiti na izbjegavanjekontaminacije uzorka. Potencijalni izvori

kontaminacije su laboratorijska oprema,osobito ureajiza pipetiranje koji se lako mogukontaminirati ranije obraivanim uzorcimaDNK, plazmidnom DNK i sl.

Koliinauzorka snanoutjeena izvedbu PCRreakcije. Preporuena koliina uzorka zastandardni PCR je do 500 ng genomske DNK.

Optimalna koliina uzorka ovisi o samojprimjeni i dozvoljenoj grecipri radu.

Primeri se u principu sastoje od 18 do 24nukleotida. Primeri ne smiju bitikomplementarni jedan drugome na 3

krajevima kako se ne bi formirali dimeri

primera. Treba povesti rauna da se koristeprimeri ijesu Tm sline.


17/20


18/20

Perfektni rezultatiRealni rezultati

Pitanja koja se postavljaju su:

Da li postoji bend na gelu?

Je li ben oekivane veliine?Postoje li nespecifini benovi

pore oekivanog PCR bena nagelu?

Potva uspjenosti amplifikacije provoi se kvalitativnom analizom, onosnoelektroforezom na 1-2% agaroznom gelu.

Uspjena PCR trebao bi prikazati jean ben s oekivanom veliinom bez nespecifinihbendova


19/20

PCR je zbog svoje osjetljivosti naao iroku primjenu usvim biomedicinskimnaukama i od velikog je praktinogznaaja.

Upravo zbog injenice da PCR ima iroko poruje primjene, ne postoji jedan

jedinstven protokol koji bi u razliitimporujimadao zaovoljavajudirezultat.

Kao to smo ved u gore navedenom tekstu napisale, najvedi problem PCRpredstavlja optimizacija. Visoko na listi optimizacije nalaze se Mg++ joni, Ph pufer i

temperaturna kontrola ciklusa, ali situacija se komplikuje sa spoznajom da su neke

od komponenti meusobnopovezane.

Meutim i to je dosta olakanoputem strategija koje trebamo pratiti u procesuoptimizacije. Svaki korak i svaka komponenta je bitna, tako da se treba

skoncentrisati i razumijeti ono toradimo, da bismo postigli eljeniuspijeh.

ZAKLJUAK


20/20

HVALA NA PANJI

Documents

Optimizacija PCR