유전성 유방암·난소암에서 BRCA1/BRCA2 돌연변이 검출을 위한 ... · 2019. 11. 14. · brca2 유전자는 27개 엑손으로 이루어져 있으며 크기는 10.3

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의학석사 학위논문

유전성 유방암·난소암에서

BRCA1/BRCA2 돌연변이 검출을 위한

차세대 염기서열 분석법의 임상 적용

2016년 2월

서울대학교 대학원

의학과 검사의학 전공

이 승 준

i

국문초록

서론: 국내 통계에 따르면 유방암 및 난소암은 여성에서 발생하는

암 중 각각 2번째, 10번째로 흔한 암이다. BRCA1 및 BRCA2

유전자의 돌연변이는 유전성 유방암 및 난소암의 발병위험도를 5배

이상 높이는 것으로 알려져 있다. 상기 유전자들은 각각 5.6 Kb,

10.3 Kb의 크기를 가지고 있으며, 대립유전자의 이질성을 보일

뿐만 아니라 돌연변이 호발 부위도 없다. 이러한 이유로 BRCA1 및

BRCA2 유전자는 검사 및 해석이 용이하지 않다. 본 연구에서는

전통적인 검사법인 Sanger sequencing 및 multiplex ligation-

dependent probe amplification (MLPA)을 대체할 수 있는 방법인

next-generation sequencing (NGS)을 이용한 유전자 패널의

임상적 적용 가능성을 검토하고자 한다.

방법: 서울대학교병원 분자유전검사실에서 시행한 Sanger

sequencing 및 MLPA로 BRCA1 및 BRCA2 유전자에서

돌연변이가 확인된 50명의 환자 (9명의 엑손 결손 및 41명의

점돌연변이)를 분석대상으로 하였다. 평가대상인 유전자 패널 3종은

TruSeq Custom Amplicon, BRCA Tumor MASTR Plus 및 Ion

AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel이었으며, MiSeq 및 Ion

torrent PGM을 이용하여 염기서열 분석을 시행하였다.

결과: 염기서열 분석에 있어 Sanger sequencing와 비교했을 때

TruSeq Custom Amplicon은 100%, BRCA Tumor MASTR

ii

Plus는 99.6%, Ion AmpliSeq BRCA panel은 99.2%의 민감도를

보였다. 위양성 결과는 BRCA Tumor MASTR Plus에서만 133건

보고되었다. Copy number variation 분석을 이용한 엑손 결손의

여부 예측에 있어 TruSeq Custom Amplicon은 100%, BRCA

Tumor MASTR Plus은 88.9%, Ion AmpliSeq BRCA panel은

40%의 민감도를 보였다. 특히 TruSeq Custom Amplicon은 9명의

환자 중 8명에서 엑손 결손 범위까지 정확하게 예측하였다.

결론: 본 연구에서는 NGS 기법을 이용한 유전자 패널은 우수한

분석능을 지니고 있음을 확인하였다. 분석 알고리즘을 보완한다면

Sanger sequencing 및 MLPA를 대체할 수 있을 것으로 판단된다.

따라서 NGS 기반의 BRCA1/2 유전자 패널은 유전성 유방암 및

난소암을 진단하는데 있어 유용한 검사 전략으로 생각된다.

----------------------------------------------------------------------------------------------

주요어: 유전성 유방암·난소암, 차세대 염기 서열 분석법, 유전자

패널, BRCA1, BRCA2

학 번: 2014-21147

iii

목 차

국문초록 ......................................................................................i

목차 ........................................................................................... iii

표 목록 ...................................................................................... iv

그림 목록 ................................................................................... v

약어 ........................................................................................... vi

서론 ........................................................................................... 1

연구 재료 및 방법 ..................................................................... 3

1. 연구대상 .......................................................................... 3

2. DNA 추출 ....................................................................... 3

3. Library Preparation and Targeted Sequencing ............. 4

4. 데이터 분석 ..................................................................... 4

결과 ........................................................................................... 9

1. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene ............. 9

2. Copy number variation analysis of BRCA1 gene .......... 11

고찰 ......................................................................................... 32

참고문헌 .................................................................................. 36

영문초록 .................................................................................. 38

iv

표 목록

Table 1. Patient list of three gene panel studies .................... 7

Table 2. Analytic performance of sequence analysis using

gene panels ............................................................................ 15

Table 3. False negative variant cases in gene panels .......... 16

Table 4. False positive variant cases in gene panels ........... 17

Table 5. Result of exon deletion prediction in gene panel

studies .................................................................................... 18

Table 6. Analytical performance of exon deletion

prediction using gene panel ................................................... 20

Table 7. Prediction of exon deletion range using gene

panel ....................................................................................... 21

v

그림 목록

Figure 1. Frameshift mutation of Patient S17 identified by

gene panel .............................................................................. 22

Figure 2. ROC curve of estimation of BRCA1 gene deletion

by Z-score ............................................................................ 23

Figure 3. Prediction of exon deletion in patient S01 ....... 24,25




vi

약 어

CNV Copy number variation

MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification

NGS Next-generation sequencing

PCR Polymerase chain reaction

- 1 -

서 론

중앙암등록본부에서 제시한 국내 통계에 따르면 유방암 및

난소암은 여성에서 발생하는 암 중에 2번째, 10번째로 많은 비율을

차지한다. 2012년 한 해 동안 유방암 발생자수는

16,521명이었으며, 난소암 발생자수는 2,167명이었다.

유방암 및 난소암의 5-10%는 유전성인 것으로 보고되어

있다(1). 유전성 유방암, 난소암의 원인 유전자 중 가장 대표적인

것은 BRCA1 (17q21; OMIM *113705) 및 BRCA2 (13q12.3;

OMIM *600185) 유전자이다. 이들 유전자는 유전성 케이스 중의

15% 정도를 설명한다(2). 이들 유전자에서 돌연변이가 양성인

경우, 일생 동안의 유방암 발병 확률은 50%-80%이며 난소암

발병 확률은 20%-40% 이다(3-5).

BRCA1 유전자는 23개 엑손으로 구성되어 있으며 크기는 5.6

Kb 이다. 점돌연변이뿐만 아니라 엑손의 결손 및 중복도 발견된다.

BRCA2 유전자는 27개 엑손으로 이루어져 있으며 크기는 10.3

Kb로 BRCA1 유전자의 2배에 해당한다. 그리고 BRCA1

유전자와는 달리 엑손의 결손 및 중복이 거의 관찰되지 않는다. 두

유전자 모두 돌연변이가 호발하는 부위는 없는 것이 특징이다.

현재까지 알려진 바로는 BRCA1 및 BRCA2 유전자에서 각각

1706개 및 1446개의 돌연변이가 보고되어 있다.

BRCA1 및 BRCA2 유전자를 분석하기 위해 전통적으로

사용되어 온 검사방법은 Sanger sequencing이 일반적이다. 개별

엑손별로 PCR을 시행하고 각각의 증폭산물로 직접 염기서열

분석을 시행하는 방법이다. 엑손의 결손 및 중복을 확인하기

- 2 -

위해서는 multiplex ligation-dependent probe amplification

(MLPA) 또는 정량 PCR을 사용하고 있다. 해당 유전자들의 크기가

큰 편이고, 엑손 개수도 많아 상기 검사법들은 시간 및 인력이 많이

소요된다. 이를 극복하기 위해서 최근 next-generation

sequencing (NGS) 기법을 이용하려는 시도가 많이 이루어지고

있다.

본 연구에서는 염기서열 분석을 위해 사용 중인 Sanger

sequencing을 대체할 수 있는 방법인 NGS 기반의 유전자 패널을

임상적으로 적용해보고 유용성을 평가하고자 한다. 그 외에 엑손의

결실 및 중복을 확인하기 위해 시행 중인 MLPA와 비교하여 유전

자 패널의 임상적 적용 가능성을 검토하고자 한다.

- 3 -

연구 재료 및 방법

1. 연구대상

연구대상은 서울대학교병원 분자유전검사실로 BRCA1 및

BRCA2 유전자 검사가 의뢰되었던 환자 중 잔여검체 활용에 동의

한 경우만 포함하였으며, 돌연변이 양성인 50명을 선정하였다. 41명

은 점돌연변이가, 나머지 9명은 엑손 결손이 확인된 경우였다. 기본

적으로 해당 검사항목이 의뢰되면 해당 유전자의 모든 엑손에 대해

Sanger sequencing 및 MLPA를 시행하였다. 다만 17명은 가족 내

돌연변이가 확인된 경우라서 특정범위에 대한 분석만 시행한 사례

였다. 본 연구는 서울대학교병원의 의학연구윤리심의위원회

(institutional review board)에서 연구승인(IRB No. H-1511-

103-722)을 받았다.

2. DNA 추출

연구에 참여한 환자의 말초혈액을 EDTA 진공튜브에 채혈하였고,

제조사의 지침을 따라 Puregene® DNA purification kit (Gentra

Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 채혈한 말초혈액에

서 유전체 DNA를 추출하였다. NanoDrop 2000c

Spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA,

USA)를 이용하여 DNA의 농도 및 순도를 확인하였다. DNA 순도

- 4 -

는 A260/A280의 비율이 1.8에서 2.0사이임을 확인하고 검사를 시

행하였다.

3. Library Preparation and Targeted Sequencing

본 연구에 사용된 유전자 패널은 3가지 종류였으며, 각 패널에 포

함된 환자의 명단은 Table 1과 같다. 첫번째로 TruSeq Custom

Amplicon (Illumina, San Diego, CA, USA)는 50명 환자 전체를

대상으로 실험을 진행하였으며 MiSeq (Illumina, San Diego, CA,

USA)을 이용하여 염기서열분석을 시행하였다. 두번째로 BRCA

Tumor MASTR Plus (Multiplicom, Niel, Belgium)은 46명의 환자

(9명의 엑손 결손 사례 포함)를 대상으로 실험을 진행하였으며

MiSeq으로 염기서열분석을 시행하였다. 세번째로 Ion AmpliSeq

BRCA1 and BRCA2 panel (Life Technologies, Carlsbad, CA,

USA)는 30명의 환자 (5명의 엑손 결손 사례 포함)를 대상으로 하

였고 Ion torrent PGM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)으

로 염기서열분석을 시행하였다. Libarary preparation 부터

targeted sequencing까지의 전 과정은 제조사 지침에 따라 시행하

였다.

4. 데이터 분석

4.1. Sequence analysis

- 5 -

MiSeq에서 얻어진 기본 데이터를 MiSeq Reporter (Illumina) 및

NextGENe software version 2.4 (SoftGenetics, State College,

PA)를 이용하여 분석하였다. Genome Reference Consortium

Human genome build 37 (GRCh37)을 기준으로 맵핑을 하였다.

BRCA1 및 BRCA2 유전자의 표준염기서열은 각각 NM_007294.3

및 NM_000059.3을 기준으로 하였고, 분석범위는 엑손 coding

region 및 그 주변 20 bp까지 포함하였다. 1000 Genome database,

dbSNP135 및 Exome Aggregation Consortium의 자료를 이용하

여 다형성 여부를 확인하였다. 이미 보고되어 있는 돌연변이인지를

확인하기 위해서는 Breast Cancer Information Core Database

(BIC database; http://research.nhgri.nih.gov/bic/) 및 Human

Gene Mutation Database (HGMD; http://www.hgmd.cf.ac.uk)를

이용하였다.

4.2. Copy number variation analysis

BRCA1 유전자의 Copy number variation (CNV)를 파악하기 위

해서 depth에 대한 자료를 표준정규분포를 이용하여 분석하였다.

먼저 엑손 결손이 거의 없는 것으로 알려진 BRCA2 유전자에 대한

평균 depth를 이용하여 투입된 핵산의 양을 보정하였다. 보정된

BRCA1 유전자의 depth에 대한 데이터 중 엑손 결손이 없는 41명

의 환자의 데이터를 표준정규분포화 하였고, 이를 기반으로 하여 나

머지 9명의 환자 데이터의 표준정규분포 내에서의 위치를 확인하였

- 6 -

다. 최종적으로 얻어진 각 엑손에 대한 Z-score를 분석하여 엑손

결손의 유무 및 범위를 확인하였다. 보완적으로 인접한 2개 엑손의

Z-score 평균값을 활용하여 결손 범위를 예측하는데 적용하였다.

CNV 분석법에 대해서 IBM SPSS Statistics 22 (IBM, Chicago, IL,

USA)를 이용하여 ROC 곡선을 그려 분석능을 평가하였다.

- 7 -

Table 1. Patient list of three gene panel studies

Patient TruSeq Custom

Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus

Ion AmpliSeq

S01 Y Y Y

S02 Y Y Y

S03 Y Y Y

S04 Y Y Y

S05 Y Y Y

S06 Y Y N

S07 Y Y N

S08 Y Y N

S09 Y Y N

S10 Y Y Y

S11 Y Y N

S12 Y Y N

S13 Y Y Y

S14 Y Y Y

S15 Y Y Y

S16 Y Y Y

S17 Y Y Y

S18 Y Y N

S19 Y Y N

S20 Y Y Y

S21 Y Y Y

S22 Y Y Y

S23 Y Y N

S24 Y Y Y

S25 Y Y N

S26 Y Y Y

S27 Y Y Y

S28 Y Y Y

S29 Y Y Y

S30 Y Y Y

S31 Y Y N

S32 Y Y N

S33 Y Y N

S34 Y Y N

S35 Y Y Y

- 8 -

S36 Y Y N

S37 Y Y N

S38 Y Y N

S39 Y Y Y

S40 Y Y Y

S41 Y Y N

S42 Y Y Y

S43 Y Y Y

S44 Y Y Y

S45 Y Y N

S46 Y Y Y

S47 Y N Y

S48 Y N Y

S49 Y N Y

S50 Y N N

Total number of patient included

50 46 30

- 9 -

결 과

1. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene

키트 종류 및 분석 파이프라인과는 무관하게 Sanger sequencing

결과와 달리 유전자 패널에서 추가로 보고된 BRCA2 유전자의

염기변이가 있었다. c.4563A>G (rs206075; Variant allele

frequency, 99.96%), c.6513G>C (rs206076; Variant allele

frequency, 56.28%) 및 c.7397T>C (rs169547; Variant allele

frequency, 99.86%)가 해당 염기변이이다. 이는 GRCh37에서의

해당 위치의 표준염기가 BRCA2 유전자의 표준염기서열인

NM_000059.3과 달라서 위와 같이 보고된 것으로 염기변이 분석의

통계에서는 제외하였다. 상기 3종류의 염기변이를 제외하고 50명의

환자에서 Sanger sequencing으로 확인된 염기변이의 개수는

289개 였으며, 각 유전자 패널별로 대상이 되는 환자에 대해

염기서열분석 결과의 일치도를 비교하였다.

환자 S17의 경우 c.922_924delinsT를 원인 돌연변이로 가지고

있는 경우이었다. BIC 데이터베이스에는 c.922_923delAG가

등재되어 있었다. 기존의 Sanger sequencing 결과로는 기보고된

돌연변이인 c.922_923delAG와 c.924C>T가 서로 반대편

대립유전자에 존재하는 것인지 아니면 c.922_924delinsT인지를

구분할 수 없었다. 이번 연구를 통해 얻어진 유전자 패널의 결과로

c.922_924delinsT가 확실함을 실제로 확인할 수 있었다 (Fig. 1).

- 10 -

1.1. TruSeq Custom Amplicon

대상 환자인 50명에서 Sanger sequencing으로 확인된

염기변이는 총 289개였다. 분석 파이프라인은 2가지를

사용하였으며 Illumina 분석 플랫폼인 MiSeq Reporter와

NextGENe이었다. MiSeq Reporter의 경우 검출한 염기변이는

289개로 분석 민감도는 100%에 해당하며, 위양성 사례는 없었다

(Table 2). NextGENe의 경우 1건의 위음성 사례가 있어

분석민감도는 99.7%에 해당하였다. 위음성 사례는 환자 S20의

BRCA1 유전자에서 보고된 c.1511G>A 였다 (Table 3). 해당

염기변이의 allele frequency는 20% 미만이었다. 위양성 사례는

환자 S15에서 보고된 c.468_469delTA 및 환자 S46에서 보고된

c.3463dupG였다 (Table 4).

1.2. BRCA Tumor MASTR Plus


염기변이는 총 263개였다. MiSeq Reporter의 경우 검출한

염기변이는 261개로 분석 민감도는 99.2%에 해당하였다. 위양성

사례는 145건이었다 (Table 2). 위음성 사례는 2건으로 모두

틀이동 돌연변이였으며, 환자 S33의 BRCA2 유전자 돌연변이인

c.3744_3747delTGAG 및 환자 S40의 BRCA1 유전자 돌연변이인

c.5496_5506delinsA였다 (Table 3). 이들 모두 20% 미만의

allele frequency를 보여 검출되지 않았다. 위양성 사례 145건은

모두 8종의 염기변이였으며, BRCA2 유전자에만 분포하고 있었다

(Table 4). NextGENe의 경우 263개의 염기변이 중 262개를

검출하여 99.6%의 분석 민감도를 보였다. 위음성 사례 1건은 환자

- 11 -

S33의 BRCA2 유전자 돌연변이인 c.3744_3747delTGAG였으며,

20%미만의 allele frequency로 인해 검출하지 못 했다. 위양성

사례는 모두 133건으로 6종의 염기변이였으며, BRCA2 유전자에만

분포하고 있었다.

1.3. Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel


염기변이는 총 257개였으며, 분석 플랫폼은 Ion Reporter를

사용하였다. 257개의 염기변이 중 255개를 검출하여 99.2%의

분석 민감도를 보였다 (Table 2). 위음성 사례 2건은 환자 S17의

BRCA1 유전자 돌연변이인 c.922_924delinsT 및 환자 S40의

BRCA1 유전자 돌연변이인 c.5496_5506delinsA였으며, variant

calling의 오류로 인해 검출하지 못 했다 (Table 3). 위양성 사례는

존재하지 않았다 (Table 4).

2. Copy number variation analysis of BRCA1 gene

MLPA에서 엑손 결손을 보인 환자는 총 9명이었다. BRCA1

유전자의 1번 엑손은 non-coding 부위로 분석 대상에서

제외하였으며, 그 외의 범위인 엑손 2-23번에 대한 유전자 패널의

엑손 단위의 결손에 대한 분석능을 평가하기 위해 ROC 곡선

분석을 시행하였고 결과는 Fig. 2와 같다. 각 유전자 패널의 곡선

아래 영역은 TruSeq 1.000, Ion AmpliSeq 0.998 및 Multiplicom

0.987 순이었다.

2.1. TruSeq Custom Amplicon

50명의 환자들에 대해 BRCA2 유전자의 depth를 분석하였다.

- 12 -

평균값은 2519X, 표준편차는 573X로 나타났으며, 변동계수는

22.7% 이었다. 이를 이용하여 BRCA1 유전자의 depth를

보정하였으며, 결손이 없는 환자들의 데이터를 기반으로 하여

표준정규분포화를 시행한 뒤 Z-score를 산출하였다. ROC

곡선상에서 민감도와 특이도의 합이 가장 큰 지점은 각각 100% 및

99.6%이었으며, 해당하는 Z-score 범위는 -2.55부터 -

2.61이었다. 일반적으로 많이 쓰이는 cut-off인 Z-score -3.0을

적용하여 결손 여부 및 그 범위를 예측해보았다. 각 환자의 엑손

결손 여부는 단 하나의 엑손에서라도 결손을 시사하는 소견이 있는

경우를 양성으로 분류하였다. 분석 대상인 환자 50명 중 엑손

결손을 시사하는 소견을 보인 환자는 12명이었다 (Table 5). 엑손

결손 여부를 예측에 있어서의 분석능은 민감도 100% 및 특이도

92.7%이었다 (Table 6). 9명의 환자 중 8명에서 결손 범위를

정확하게 예측하는 분석능을 보였다 (Table 7). 각 사례별로

확인해보면 환자 S01의 경우 엑손 2-23번의 결손이 정확하게

확인되었다 (Fig. 3A). 환자 S02 및 S03의 경우 각각 엑손 10-

12번 및 엑손 17-18번의 결손이 정확하게 확인되었다 (Fig. 4A &

5A). 하지만 환자 S04의 경우 엑손 7번과 9번이 cut-off를 약간

상회하는 소견을 보여 결손 범위의 예측에 있어 일부 오차가

있었다 (Fig. 6A). 오차를 보정하기 위해 인접한 2개 엑손의 Z-

score 평균값을 산출하여, 해당 값이 -3 미만인 경우 인접 엑손이

모두 결손 범위에 해당한다고 판정하였다. 이 결과를 결손 여부 및

범위를 예측하는데 적용하였을 때, 9명의 환자에서 모두 정확한

결과를 도출할 수 있었다.

- 13 -

2.2. BRCA Tumor MASTR Plus


평균값은 6087X, 표준편차는 1288X로 나타났으며, 변동계수는

21.2% 이었다. 이를 이용하여 BRCA1 유전자의 depth를

보정하였으며, 결손이 없는 환자들의 데이터를 기반으로 하여

표준정규분포화를 시행한 뒤 Z-score를 산출하였다. ROC

곡선상에서 민감도와 특이도의 합이 가장 큰 지점은 각각 96.1%

및 95.6%이었으며, 해당하는 Z-score의 범위는 -1.83부터 -

1.85였다. 앞서 분석한 바와 같이 Z-score -3미만을 cut-off를

적용하여 실제 환자의 결손 여부 및 그 범위를 예측해보았다. 분석

대상인 환자 46명 중 엑손 결손을 시사하는 소견을 보인 환자는

10명이었다 (Table 5). 엑손 결손 여부를 예측에 있어서의

분석능은 민감도 88.9% 및 특이도 94.6%이었다 (Table 6). 9명의

환자 중 결손 범위를 정확하게 예측한 사례는 없었다 (Table 7).

각 사례별로 확인해보면 환자 S01의 경우 엑손 2, 3, 7, 10, 12,

14-17, 19-22번의 결손만을 정확하게 예측하였다 (Fig. 3B).

환자 S02에서는 결손이 정확하게 예측된 엑손이 없었다 (Fig. 4B).

환자 S03의 경우 엑손 17번의 결손만이 정확하게 확인되었으며,

환자 S04의 경우 엑손 2, 3, 7, 10번의 결손만이 정확하게 확인되어

상당한 오차가 있었다 (Fig. 5B & 6B).

2.3. Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel


평균값은 1746X, 표준편차는 126X로 나타났으며, 변동계수는 7.2%

- 14 -

이었다. 이를 이용하여 BRCA1 유전자의 depth를 보정하였으며,

결손이 없는 환자들의 데이터를 기반으로 하여 표준정규분포화를

시행한 뒤 Z-score를 산출하였다. ROC 곡선상에서 민감도와

특이도의 합이 가장 큰 지점은 각각 98.0% 및 99.4%이었으며,

해당하는 Z-score의 범위는 -1.54부터 -1.68이었다. Z-score -

3미만을 cut-off를 적용하여 실제 환자의 결손 여부 및 그 범위를

예측했을 때, 분석 대상인 환자 30명 중 엑손 결손을 시사하는

소견을 보인 환자는 2명이었다 (Table 5). 엑손 결손 여부를

예측에 있어서의 분석능은 민감도 40.0% 및 특이도 100%이었다

(Table 6). 5명의 환자 중 결손 범위를 정확하게 예측한 사례는

1건이었다 (Table 7). 각 사례별로 확인해보면 환자 S01의 경우

엑손 2, 3, 5, 7, 10, 13-23번의 결손이 정확하게 확인되었다 (Fig.

3C). 환자 S02 및 S04의 경우 정확하게 결손이 예측된 엑손은

없었다 (Fig. 4C & 6C). 환자 S03에서는 엑손 17-18번의 결손이

정확하게 확인되었다 (Fig. 5C).

- 15 -

Table 2. Analytic performance of sequence analysis using gene panels

TruSeq Custom Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus Ion AmpliSeq

MiSeq reporter NextGENe MiSeq reporter NextGENe Ion Reporter

Total variants reported in Sanger sequencing

289 289

263 263

257

True positive variants 289 288

261 262

255

False negative variants 0 1

2 1

2

False positive variants 0 2

145 133

0

Analytic sensitivity % 100.0 99.7

99.2 99.6

99.2

PPV % 100.0 99.3 64.3 66.3 100.0

PPV, positive predictive value

- 16 -

Table 3. False negative variant cases in gene panels

Patient Gene NT change AA change Classification Gene panel (Analysis platform) Cause

S17 BRCA1 c.922_924delinsT p.Ser308* Pathogenic Ion AmpliSeq (Ion Reporter) Variant calling

S20 BRCA1 c.1511G>A p.Arg504His VUS TruSeq (NextGENe) Low allele frequency

S33 BRCA2 c.3744_3747delTGAG p.Ser1248Argfs*10 Pathogenic Multiplicom (Miseq Reporter) Multiplicom (NextGENe)

Low allele frequency Low allele frequency

S40 BRCA1 c.5496_5506delinsA p.Val1833Serfs*7 Pathogenic Multiplicom (Miseq Reporter) Ion AmpliSeq (Ion Reporter)

Low allele frequency Variant calling

NT, nucleotide; AA, amino acid; VUS, variant of uncertain significance

- 17 -

Table 4. False positive variant cases in gene panels

Total number of the patients

Gene NT change Gene panel (Analysis platform) Cause

1 BRCA1 c.3463dupG TruSeq (NextGENe) Amplification error

1 BRCA2 c.468_469delTA TruSeq (NextGENe) Amplification error

30 BRCA2 c.1964C>G BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error

13 BRCA2 c.3869G>A BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error

30 BRCA2 c.68-7delT BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error

2 BRCA2 c.7504C>T BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error

28 BRCA2 c.8830A>T BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error

30 BRCA2 c.10121C>T BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error

29 BRCA2 c.1151C>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error

29 BRCA2 c.1964C>G BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error

27 BRCA2 c.2138A>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error

5 BRCA2 c.3869G>A BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error

21 BRCA2 c.4068G>A BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error

26 BRCA2 c.7504C>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error

5 BRCA2 c.8830A>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error

3 BRCA2 c.10121C>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error NT, nucleotide

- 18 -

Table 5. Result of exon deletion prediction in gene panel studies

Patient MLPA TruSeq Custom Amplicon

BRCA Tumor MASTR Plus

Ion AmpliSeq

S01 Y Y Y Y

S02 Y Y N N

S03 Y Y Y Y

S04 Y Y Y N

S05 Y Y Y N

S06 Y Y Y N/A

S07 Y Y Y N/A

S08 Y Y Y N/A

S09 Y Y Y N/A

S10 N N N N

S11 N N N N/A

S12 N N N N/A

S13 N Y N N

S14 N N N N

S15 N N N N

S16 N N N N

S17 N N N N

S18 N N Y N/A

S19 N N N N/A

S20 N N N N

S21 N N N N

S22 N N N N

S23 N N N N/A

S24 N N N N

S25 N N N N/A

S26 N N N N

S27 N N N N

S28 N N N N

S29 N N N N

S30 N N N N

S31 N N N N/A

S32 N N N N/A

S33 N Y N N/A

S34 N N N N/A

S35 N N N N

- 19 -

S36 N N N N/A

S37 N N N N/A

S38 N N N N/A

S39 N N N N

S40 N N N N

S41 N Y N N/A

S42 N N N N

S43 N N N N

S44 N N N N

S45 N N N N/A

S46 N N Y N

S47 N N N/A N

S48 N N N/A N

S49 N N N/A N

S50 N N N/A N/A

MLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification; N/A, not

applicable

- 20 -

Table 6. Analytical performance of exon deletion prediction using gene panel

TruSeq Custom

Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus

Ion AmpliSeq

Total number of patient included

50 46 30

True positive 9 8 2

False negative 0 1 3

False positive 3 2 0

True negative 38 35 25

Analytic sensitivity (%) 100.0 88.9 40.0

Analytic specificity (%) 92.7 94.6 100.0

PPV (%) 75.0 80.0 100.0

NPV (%) 100.0 97.2 89.3

PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value

- 21 -

Table 7. Prediction of exon deletion range using gene panel

Patient MLPA TruSeq Custom Amplicon*

BRCA Tumor MASTR Plus*

Ion AmpliSeq*

S01 1-23 2-23 2, 3, 7, 10, 12, 14-17, 19-22 2, 3, 5, 7, 10, 13-23

S02 10-12 10-12 None None

S03 17-18 17-18 17 17-18

S04 1-13 2-6, 8, 10-13 2, 3, 7, 10 None

S05 1-13 2-13 2, 3, 10 None

S06 1-13 2-13 2, 3, 7, 10 N/A

S07 1-13 2-13 2, 3, 7, 10, 12 N/A

S08 1-13 2-13 2, 3, 7, 10, 12 N/A

S09 1-13 2-13 2, 3, 10, 11 N/A * Exon 1 was not included in prediction of exon deletion range

MLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification; N/A, not applicable

- 22 -

Figure 1. Frameshift mutation of Patient S17 identified by gene panel

- 23 -

Figure 2. ROC curve of estimation of BRCA1 gene deletion by Z-score

- 24 -

Continued.

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(A)

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(B)

- 25 -

Figure 3. Prediction of exon deletion in patient S01, (A) TruSeq

Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent

two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1

and BRCA2 panel.

-5

-4.5

-4

-3.5

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(C)

- 26 -

Continued.

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(A)

-3.5

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(B)

- 27 -




and BRCA2 panel.

-3.5-3

-2.5-2

-1.5-1

-0.50

0.51

1.52

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(C)

- 28 -

Continued.

-6-5-4-3-2-10123

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(A)

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(B)

- 29 -




and BRCA2 panel.

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(C)

- 30 -

Continued.

-20

-15

-10

-5

0

5

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(A)

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(B)

- 31 -




and BRCA2 panel.

-3.5

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

0 5 10 15 20 25

Z-s

core

Exon

(C)

- 32 -

고 찰

본 연구에서는 NGS 기법을 이용한 유전자 패널이 Sanger

sequencing 결과에 비교했을 때 유사한 분석 민감도(99.2%-

100%)를 가지고 있음을 확인하였다. TruSeq Custom Amplicon의

경우 제조자의 권장 분석 플랫폼인 MiSeq Reporter를 이용하면

정확하게 일치하는 염기서열분석 결과를 얻을 수 있었다. BRCA

Tumor MASTR Plus의 경우 NextGENe을 이용하여 분석할 경우

가장 우수한 결과를 보였으나, 1건의 위음성 사례 및 다수의 위양성

사례를 보여 분석 플랫폼의 최적화가 더 필요하다고 생각된다. Ion

AmpliSeq BRCA panel은 제조사의 권장 분석 플랫폼인 Ion

Reporter를 사용하였을 때, 99.2%라는 분석 민감도를 보였고 이는

위음성 사례 2건 때문이었다. 2건의 사례는 모두 indel이라는

공통점이 있었으며, 분석 과정 중 variant calling에 문제가 있었던

것으로 확인되었기에 이를 보완한다면 분석 민감도를 개선할 수

있을 것으로 기대된다. 기타 다른 연구에서도 BRCA1/2 유전자

패널이 Sanger sequencing에 비해 동등하거나 우월한 분석능을

보였다고 보고된 바 있다(6-9).

환자 S17의 사례에서 보았듯이 NGS 기법은 대립유전자의

분리가 필요한 경우 raw data를 확인하여 정확한 판독이 가능하다.

Sanger sequencing의 경우 대립유전자를 분리하여 분석하기

위해서는 별도의 실험 설계가 필요할 뿐만 아니라 판독에도

어려움이 많다. 하지만 NGS 기법은 각각의 amplicon read가

하나의 대립유전자를 반영하기 때문에 복잡한 염기변이를

- 33 -

확인하는데 유용할 수 있다. Read length의 길이가 더 길다면

structural variation까지도 분석할 수 있는 장점이 있다(10).

본 연구에서는 NGS 데이터 중 depth를 이용하여 CNV를

분석하였다. 표준정규분포를 이용하여 Z-score를 산출하였고, 이를

통해 엑손 단위의 결손을 예측해보았다. ROC 곡선에서 얻어진

곡선아래영역은 0.987-1.000으로 매우 우수한 분석능을 보였다.

다만 이를 엑손 단위의 결손 예측이 아닌 환자 단위로 적용해야

하기 때문에 실제 검사법으로서는 다소 낮아진 분석능을 보였다.

3가지 유전자 패널 중 가장 우수한 분석능을 보인 것은 TruSeq

Custom Amplicon이었으며 엑손 결손의 여부를 예측하는데 있어

100%의 민감도를 보였다. 이는 기존에 쓰이는 유전자 용량

검사법인 MLPA를 시행하기에 앞서 선별검사로 적용하는데 적합한

검사법임을 의미한다. 선별검사 없이 MLPA를 시행했을 경우

41건의 음성 사례를 모두 포함해야겠지만, 선별검사로 적용했다고

가정하면 41건 중 위양성 사례는 단 3건이었기에 불필요한 MLPA

시행 건수를 획기적으로 줄일 수 있을 것으로 예상된다. 상기

기준만을 적용했을 때 9명의 환자 중 8명에서 정확한 결손 범위를

예측하였고, 나머지 1명에서는 결손 범위 예측에 일부 오류가

있었다.

위에서 기술한 바와 같이 TruSeq Custom Amplicon은 엑손

결손 예측에 있어 우수하지만 일부 오류를 내포하고 있었다. 이를

보완하기 위해 인접한 2개 엑손의 Z-score 평균값을 산출하여

추가로 적용하였을 때, 결손 여부 및 결손 범위 예측에 있어

100%의 일치도를 확보할 수 있었다. 실제 검사실에서 CNV 분석을

- 34 -

시행함에 있어 (1) 단일 엑손의 Z-score 수치로 결손 여부를

판정하고, (2) 2개 이상의 연속된 엑손의 결손이 있는 경우 인접한

2개 엑손의 Z-score 평균값으로 결손 범위를 예측한다면 MLPA를

대체할 수 있을 것으로 예상된다.

본 연구에서 다루어진 2가지 유전자 이외에도 유전성 유방암에

관련된 여러 유전자들이 알려져 있다. p53 및 PTEN의 돌연변이는

종양 증후군과 관련되어 있으며, 유방암 발병 위험도를 매우 높인다.

그 외에도 CHEK2, ATM, NBS1, RAD50, BRIP 및 PALB2의

돌연변이는 유방암 위험도를 2배 가량 높이는 것으로 보고되어

있다(11). 이런 발병 위험도에 관련된 여러 유전자들을 한꺼번에

평가한 연구보고가 있다(9, 12). 그 밖에도 항암화학치료 후 예후에

대해 분석하여 유전적 특성을 규명한 연구보고도 있다(13, 14).

이와 같이 BRCA1 및 BRCA2 유전자 이외에도 환자의 발병

위험도 및 예후와 관련된 여러 유전자들이 보고되어 있으므로

유전자 패널의 분석 범위를 확장하여 적용하는 것도 임상적으로

중요할 것으로 생각된다.

본 연구에서는 유전성 유방암 및 난소암 발병의 주요 유전자인

BRCA1/2에 대한 유전자 패널이 기존 검사방법인 Sanger

sequencing을 대체할 수 있다는 가능성을 확인하였다. 더불어

CNV 검출에 있어서도 유용한 정보를 획득할 수 있다는 사실도

확인하였고, MLPA 시행에 앞서 선별검사로 적용할 수 있는

가능성을 확인하였다. 앞으로 발병 및 예후와 관련된 유전자들을

포함하여 패널로 활용한다면 임상적으로 유용한 정보를 한꺼번에

제공할 수 있을 것이며, 이는 유전성 유방암 및 난소암의 진단 및

- 35 -

치료에 있어 맞춤의학으로 나아가는 좋은 기회가 될 것으로

생각된다.

- 36 -

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- 37 -

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510.

- 38 -

Abstract

Introduction: According to domestic statistics, breast and ovarian cancer are

2nd and 10th most common cancer in females. Mutations of BRCA1 and

BRCA2 gene increase the risk of hereditary breast and/or ovarian cancer in

women five times. These genes have 5.6 Kb and 10.3 Kb size respectively,

and have allelic heterogeneity without mutation hot spot. Therefore

mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 gene have been challenging. The

objective of this study is to evaluate clinical usefulness of gene panel using

next-generation sequencing for replacement of Sanger sequencing and

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA).

Methods: This study enrolled 50 BRCA1 and BRCA2 gene mutation positive

patients (9 exon deletion cases and 41 point mutation cases), which were

confirmed by Sanger sequencing and MLPA in Molecular Diagnostics

Laboratory, Seoul National University Hospital. We included 3 gene panels,

which were as follows, TruSeq Custom Amplicon, BRCA Tumor MASTR

Plus, and Ion AmpliSeq BRCA panel. We performed next-generation

sequencing using MiSeq and Ion torrent PGM and compare the results with

traditional methods.

Results: In comparison to Sanger sequencing, TruSeq Custom Amplicon

revealed 100% analytic sensitivity, BRCA Tumor MASTR Plus 99.6%, and

Ion AmpliSeq BRCA panel 99.2%. False positive variants were reported in

only BRCA Tumor MASTR Plus. With regard to prediction of exon deletion

using copy number variation analysis, TruSeq Custom Amplicon revealed 100%

analytic sensitivity, BRCA Tumor MASTR Plus 88.9%, and Ion AmpliSeq

- 39 -

BRCA panel 40%. Especially TruSeq Custom Amplicon estimated precisely

exon deletion range 8 of 9 patients.

Conclusions: This study suggested gene panel using NGS technology have

excellent analytical performance. If analytic algorithm is complemented

appropriately, gene panel could replace Sanger sequencing. Furthermore gene

panel provide useful information for prediction of CNV analysis. And it was

able to support the screening of gene dose analysis. Considering cost and time

in addition to analytic performance, BRCA1/BRCA2 gene panel is useful test

strategy for diagnosis of hereditary breast and/or ovarian cancer.

----------------------------------------------------------------------------------

Keywords: Hereditary breast and/or ovarian cancer, Next-generation

sequencing, Gene panel, BRCA1, BRCA2

Student number: 2014–21147

서론 연구 재료 및 방법 1. 연구대상 2. DNA 추출 3. Library Preparation and Targeted Sequencing 4. 데이터 분석

결과 1. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene 2. Copy number variation analysis of BRCA1 gene

고찰 참고문헌 영문초록

Documents

유전성 유방암·난소암에서 BRCA1/BRCA2 돌연변이 검출을 위한 ... · 2019. 11. 14. · brca2 유전자는 27개 엑손으로 이루어져 있으며 크기는 10.3