Aus dem Institut für Physiologie und Pathophysiologie des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Dr. J. Daut Arbeitsgruppe Neuroendokrinologie und Neurodynamik

Leiter: Prof. Dr. K. Voigt In Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH,

Standort Marburg

Noradrenerge Modulation thermosensitiver Neurone

im Hypothalamus der Ratte

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Zahnmedizin

dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Christian Talke aus Trier

Marburg, 2007

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 20.09.2007.

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. B. Maisch Referent: Prof. Dr. K. Voigt Korreferent: Prof. Dr. R. Flores-de-Jacoby

Ein Experiment ist eine List, mit der man die Natur dazu bringt, verständlich zu reden.

Danach muss man nur noch zuhören.

(Nobelpreisträger George Wald, amerikanischer Biochemiker)

INHALTSVERZEICHNIS 1.0 Einleitung

1.1 Der Hypothalamus als oberste Integrationseinheit vegetativer Funktionen

1.1.1 Nuclei praeoptici (PO/AH)

1.1.2 PVN und SON

1.2 Noradrenerges System

1.3 Fragestellung

2.0 Material und Methoden

1 1

5

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72

82 86

101 101

102

103

2.1 Hirnschnitt-Technik

2.2 Präparation und Anfertigung der Hirnschnitte

2.3 Versuchsdurchführung: Der Messstand

2.4 Auswertung und Datendarstellung

3.0 Ergebnisse 3.1 Entladungsverhalten spontanaktiver Neurone des PVN und SON

3.2 Thermosensitivität spontanaktiver Neurone des PVN und SON

3.3 Wirkung von Phenylephrin auf Neurone des PVN und SON

3.3.1 Phenylephrin-Effekte bei konstanter Temperatur

3.3.2 Phenylephrin-Effekte bei sinusförmigen Temperaturwechseln

Phenylephrin-ON-OFF-Effekt

Phenylephrin-Phasenverschiebung

4.0 Diskussion 4.1 Hirnschnitt-Technik

4.2 Die Thermosensitivität hypothalamischer PVN- und SON-Neurone

4.3 Der Einfluss von Phenylephrin auf die Thermosensitivität

5.0 Zusammenfassung 6.0 Literaturverzeichnis 7.0 Anhang

7.1 Publikationen

7.2 Akademische Lehrer

7.3 Danksagung

LISTE DER ABKÜRZUNGEN aCSF Artifizielle Cerebrospinalflüssigkeit Ang II Angiotensin II AV3V Anterio-ventrale Wand des 3. Ventrikel BD Burstdauer BC Burstzyklus BP Burstpause B/P Burstzeit/Pausenzeit-Quotient CRH Corticotropin Releasing-Hormon CVO Circumventrikulär-Organ HPA-Achse Hypothalamo-Hypophysen-Nebennieren-Achse IBF Intraburstfrequenz ID (Interspike-) Intervalldauer IL Interleukin LPS Lipopolysaccharid MNC Magnozelluläre neurosekretorische Zellen MnPO Medianer präoptischer Nucleus NSAIDS Nonsteroidal antiinflammatory drugs OVLT Organum vasculosum laminae terminalis OXY Oxytozin PG Prostaglandin PHE Phenylephrin PO/AH Area praeoptica des anterioren Hypothalamus PRA Prazosin PVN Nucleus paraventricularis SFO Subfornikalorgan SON Nucleus supraopticus TC Temperaturkoeffizient VLM Ventrolaterale Medulla oblongata VSA Area septalis ventralis

Einleitung - 1 -

1.0 Einleitung 1.1 Der Hypothalamus als oberste Integrationseinheit

vegetativer Funktionen

Der Hypothalamus bildet den am weitesten basal gelegenen Teil des

Dienzephalons, sowie den Boden des dritten Ventrikels. Ihm sind folgende

zerebrale Strukturen zugeordnet: Corpora mamillaria, Tuber cinereum,

Infundibulum mit der Neurohypophyse und die Eminentia mediana.

Er erstreckt sich von der Lamina terminalis und dem Chiasma opticum bis zum

Corpus mamillare. Dorsal grenzt ihn der Sulcus hypothalamicus vom Thalamus

dorsalis ab. Ventral findet sich die Neurohypophyse als Abkömmling des

Hypothalamus. Der Sulcus hypothalamicus liegt ungefähr auf Höhe der CA-CP-

Linie (CA, Commissura anterior; CP, Commissura posterior) (s. Abb. 1.1).

1 Lamina terminalis 2 Chiasma opticum 3 Corpus mamillare 4 Sulcus hypothalamicus 5 Neurohypophyse CA = Commissura anterior CP = Commissura posterior

Abb. 1.1 Anatomische Lage des Hypothalamus (Sobotta, Bd. 1, S. 294).

Von großer Bedeutung ist auch seine enge topographische Lage zu den

Circum-Ventrikulären-Organen (CVOs), welche als die „durchlässigen Anteile“

der Blut-Hirn-Schranke (BHS) bekannt sind. Zu den CVOs gehören u.a. das

Einleitung - 2 -

Subfornikalorgan (SFO) und das Organum-Vasculosum-Laminae-Terminalis

(OVLT). Diese Strukturen machen eine Beeinflussung der ZNS-Neurone durch

im Blut befindliche Hormone möglich, wie z.B. Angiotensin II (Ang II), welches

an Rezeptoren im SFO bindet und so Signale weiterleitet (Sumners et al. 1994).

Obwohl der Hypothalamus (5 g) mit 0,4% nur einen sehr kleinen Anteil des

Gesamtvolumens des Zentralnervensystems einnimmt, kann er funktionell als

die oberste Integrationseinheit aller vegetativer Funktionen (autonomes

Nervensystem und endokrine Organe) angesehen werden und hat so einen

wesentlichen Einfluss auf vitale Homeostase-Systeme, z.B. erfolgen über seine

relativ autonomen vegetativen Steuerungszentren die Regulation von

Nahrungsaufnahme („Hunger- und Sättigungszentrum“), Wasserhaushalt

(Trinkverhalten, Osmoregulation), Körpertemperatur, Arterhaltung

(Reproduktionsfunktion), Selbsterhaltung (aggressives oder defensives

Verhalten) und zirkadiane Rhythmik (z.B. Schlaf-Wach-Rhythmus). All dies

geschieht in sehr enger Verzahnung mit dem Endokrinium über

hormonproduzierende Neurone, die in bestimmten hypothalamischen

Kerngebieten lokalisiert sind und einerseits Hormone direkt in die Blutbahn

abgeben, bzw. anderseits über die Sekretion sogenannter Releasing- bzw.

Inhibiting-Hormone, die endokrinen Zellen des Hypophysenvorderlappens

kontrollieren. Zudem ist seine Konnektivität geprägt durch multiple nervale

Efferenzen aus diesen Kerngebieten ins limbische System, sowie durch

Afferenzen und Efferenzen zu weiteren vegetativen Zentren in Hirnstamm und

Rückenmark. Afferent ist die postkomissurale Fornix; efferent sind der Tractus

mamillothalamicus (Vic d’Azyr) und der Tractus mamillotegmentalis (Gudden).

Als weitere Faserbahnen sind zu nennen: Fasciculus telencephalicus medialis

(mediales Vorderhirnbündel), Fasciculus longitudinalis dorsalis (SCHÜTZ), Stria

terminalis und die basale Mandelkernstrahlung.

Der Fasciculus telencephalicus medialis ist eine locker zusammengesetzte

Bahn, die in beide Richtungen verlaufend, sich zwischen Riechhirn und

Tegmentum mesencephali erstreckt. Absteigende Fasern kommen unter

anderem vom Tuberculum olfactorium, Septum, Nucleus accumbens.

Aufsteigende Fasern stammen häufig von Transmitter-spezifischen

Projektionsneuronen wie den dopaminergen Fasern aus der Area tegmentalis

ventralis, den noradrenergen Fasern aus dem Locus coeruleus oder den

Einleitung - 3 -

serotonergen Fasern aus den Raphe-Kernen. Auch hypothalamische

Assoziationsfasern sind in diesem Bündel zu finden. Die monoaminergen

Komponenten können als Teil des ARAS (Aufsteigendes Retikuläres

Aktivierendes System) aufgefasst werden.

Der Fasciculus longitudinalis dorsalis verbindet peri- und paraventrikulär

gelegene hypothalamische Gebiete mit dem rhombenzephalen und spinalen

Eigenapparat, ebenso mit verschiedenen vegetativen Kerngebieten, wie dem

Kopfparasympathikus und dem thorakalen Sympathikus.

Die Stria terminalis und die basale Mandelkernstrahlung bestehen vor allem

aus, von der Amygdala zum Hypothalamus verlaufende Bahnen und besitzen

eine weniger starke gegenläufige Komponente. Sie sorgen für den Zugriff der

mit der emotionalen Tönung von Sinneseindrücken beschäftigten Amygdala auf

die endokrinen und vegetativen Steuerzentralen des Hypothalamus, sowie der

„FIGHT-FLIGHT-FRIGHT“-Reaktionen.

Insgesamt kann man im Hypothalamus 13 verschiedene neuronale Kerngebiete

unterscheiden (s. Abb. 1.2), die jeweils an unterschiedlichen vegetativen

Steuerungsfunktionen beteiligt sind. Die für diese Arbeit wichtigsten

Kerngebiete, die Nuclei praeoptici (PO/AH), der Nucleus paraventricularis (pars

magnocellularis) und der Nucleus supraopticus, sind im anterioren Bereich des

Hypothalamus lokalisiert und sollen im Folgenden genauer beschrieben

werden.

Einleitung - 4 -

1 Nucleus praeopticus medialis 2 Nucleus praeopticus medianus 3 Nucleus suprachiasmaticus 4 Nucleus supraopticus 5 Nucleus anterior hypothalami 6 Nucleus paraventricularis 7 Nucleus dorsomedialis hypothalami 8 Nucleus ventromedialis hypothalami 9 Nucleus arcuatus 10 Corpus mamillare 11 Nucleus posterior hypothalami 12 Laterale hypothalamische Zone 13 Zona incerta

Abb. 1.2 Schematische Darstellung der Kerne und Zonen des Hypothalamus.

Oben: Ansicht von medial; Kerne der periventrikulären Zone nur teilweise berücksichtigt. Unten: Kernprojektionen in die Horizontalebene und Zuordnung in entsprechende Längs- und Querzonen (Benninghoff, Bd. 2, S. 545).

Einleitung - 5 -

1.1.1 Nuclei praeoptici (PO/AH)

Die wichtigste vegetative Funktion, die den Neuronen der Regio praeoptica des

anterioren Hypothalamus (PO/AH) zugeschrieben wird, ist die Regulation der

Körperkerntemperatur. Hier lokalisierte Neurone zeigen eine besonders hohe

Temperatursensitivität (Boulant 1986, Hardy et al. 1964). Warmsensitive

Neurone antworten auf steigende Temperaturen mit einer Erhöhung ihrer

Entladungsfrequenz, während kaltsensitive Neurone maximale Entladungsraten

bei sinkenden Temperaturen zeigen (Boulant und Dean 1986). Dabei scheint es

eine direkte Korrelation zwischen der elektrischen Aktivität der

temperatursensitiven Neurone im PO/AH und peripheren Mechanismen der

Körpertemperaturadaptation (wie z.B. Schwitzen zur Wärmeabgabe oder

Muskelzittern und Piloerektion zur Wärmeisolation/-schutz) zu geben. So

können artifizielle Temperaturänderungen, die über Thermoden in den PO/AH

appliziert werden, entsprechende periphere Wärmeabgabe- und

Wärmeproduktionsmechanismen auslösen (Hammel et al. 1960, Jacobson und

Squires 1970).

Auch während pathophysiologischer febriler Zustände unterliegt die Einstellung

der Körpertemperatur der Aktivität von Neuronen aus dem PO/AH. Evolutionär

gesehen stellt Fieber, definiert als eine Erhöhung des Sollwertes („set-point“)

der Körperkerntemperatur, eine schützende Reaktion des Körpers im Rahmen

der sogenannten Akut-Phase-Antwort dar. Auslöser für eine solche

Fieberantwort sind Produkte des Immunsystems, welche als endogene

Pyrogene bezeichnet werden und vor allem aus den Zytokinen Interleukin 1

(IL 1) und Interleukin 6 (IL 6) bestehen. IL 1 und IL 6 werden als Antwort auf

den Reiz durch exogene Pyrogene, z.B. Lipopolysaccharide (LPS) von

Immunzellen, wie zum Beispiel Phagozyten in die Blutbahn ausgeschüttet.

Beide Zytokinarten, peripher appliziert oder erzeugt, wirken zum einen

hemmend auf warmsensitive Neurone im PO/AH, sowie andererseits

aktivierend auf kaltsensitive Neurone, was im Sinne des

Temperaturregelsystems eine Sollwerterhöhung bedeutet (Blatteis 1990b,

Boulant 1986, Dascombe et al. 1989, Dinarello et al. 1991, Shibata und Blatteis

1991, Xin und Blatteis 1992).

Einleitung - 6 -

Die genaue Wirkungsweise dieser Zytokine auf zentraler Ebene wird zu Zeit

noch kontrovers diskutiert. Aufgrund der Bluthirnschranke kann eine direkte

pyrogene Wirkung peripherer Zytokine an den temperatursensitiven

hypothalamischen Neuronen des PO/AH faktisch ausgeschlossen werden

(Blatteis 1992). Allerdings wurde IL 1-Rezeptor mRNA im Endothel

postkapillärer Venolen und in Gliazellen um Arteriolen im gesamten Gehirn

gefunden, welches das Konzept des Blut-Hirn-Schranken-überwindenden-

Interleukins unterstützt (Wong und Licino 1994). Man vermutet daher eine

bidirektionale Kommunikation auf humoralem und neuronalem Wege

(Besedovsky und Del Rey 1996). Über circumventrikuläre Organe erfolgt unter

Einwirkung von IL 1 oder IL 6, die zentrale Ausschüttung von Prostaglandin E2

(PGE2) als Mediator durch Astrozyten oder Neurone (lokalisiert an den

fenestrierten Endothelzellen, besonders im OVLT), welches über cAMP als

second messenger den Stoffwechsel der thermoregulatorischen PO/AH-

Neurone moduliert (Blatteis und Sehic 1997, Elmquist et al. 1997, Watkins et al.

1995). Gleichfalls erreichen neuronale Afferenzen aus der Peripherie via

Nervus vagus (Sehic und Blatteis 1996) den Nucleus tractus solitarius (NTS)

und die noradrenergen Kerngebiete (A1/A2) in der Medulla oblongata, die

ihrerseits über das ventrale noradrenerge Bündel (VNB) anteriore präoptische

Kerne und die magnozellulären PVN- und SON-Neurone innervieren (Day und

Sibbald 1989, Sehic und Blatteis 1996).

Um jedoch den febrilen Zustand steuern und diesen gegebenenfalls limitieren

zu können, aktivieren die o.g. Zytokine IL 1 und IL 6 (vermutlich auch

Prostaglandin-abhängig) die Hypothalamo-Pituitar-Adrenale-Achse (HPA-

Achse), die als Glied der neuroimmunologischen Rückkopplung fungiert.

Hypothalamische PVN-Neurone mit warmsensitiven Eigenschaften werden

daraufhin zur Freisetzung der antipyretisch wirksamen Hormone CRH und ADH

stimuliert (Berkenbosch et al. 1987, Blatteis 1990a, Braun et al. 1994a, Ericson

et al. 1994, Inenaga et al. 1987, Sapolsky et al. 1987, Shibata und Blatteis

1991, Yasin et al. 1994). Beide bewirken an den Zellen der Adenohypophyse

eine erhöhte Synthese von Proopiomelanocortin-mRNA und stimulieren die

Freisetzung von ACTH (ACTH= Adrenocorticotropes Hormon). ACTH

schließlich führt zu einer Ausschüttung von immunsuppressiven

Glukokortikoiden in der Nebennierenrinde (Besedovsky et al. 1991, Van de

Einleitung - 7 -

Pavert et al. 1997), welche über einen weiteren Rückkopplungskreis, der das

endokrine System mit dem Immunsystem verbindet (Besedovsky und Del Rey

1996), die PVN-Neuronenaktivität inhibiert (Chen et al. 1991, Saphier und

Feldmann 1988).

Einleitung - 8 -

1.1.2 PVN und SON

Abb. 1.3 Frontalschnitt durch den menschlichen Hypothalamus auf Höhe des Ncl. paraventricularis (PAV) und Ncl. supraopticus (SOp). Immunhistochemischer Nachweis von Neurophysinen, der Trägerproteine von Vasopressin und Oxytozin. Man beachte die Bahnen (PFEIL), welche nach ventral zum Hypophysenhinterlappen ziehen. 3V= III. Ventrikel (Benninghoff, Bd. 1, S.550).

Der Hypothalamus fungiert sowohl als neuronales Netzwerk, als auch als

endokrine Drüse (Neuroendokrinie). Hier besitzen die magnozellulären

neurosekretorischen Zellen (MNCs) des Nucleus paraventricularis und Nucleus

supraopticus einen hohen Stellenwert im sogenannten hypothalamo-

neurohypophysären System (s. Abb. 1.3). Sie synthetisieren die beiden

Effektorhormone Vasopressin

(ADH, Adiuretin) und Oxytozin

(OXY) und leiten diese zur

Neurohypophyse. Hierbei

verlaufen die Axone des

Tractus hypothalamohypo-

physialis zu ihrem „Zielgebiet“,

der Pars nervosa, wo sie bei

nervalen Reizen hin in den

Blutkreislauf sezerniert

werden. Im Hypophysen-

hinterlappen finden sich häufig

Speichervesikel (HERRING-

Körperchen), die den

Charakter der Pars nervosa

als Speicher- und Abgabeort

(aber keine Synthese) von

Hormonen unterstreichen

(siehe Abb. 1.4).

Beide Hormone sind aus neun

Aminosäuren bestehende Polypeptide und unterscheiden sich nur in zwei

Aminosäuren.

Die Sekretion von ADH erfolgt als Antwort auf einen Druckabfall an den

peripheren Barorezeptoren oder einen Anstieg der Plasmaosmolarität. Es

steigert den Blutdruck über Vasokonstriktion der peripheren Widerstands-

gefäße und fördert die Rückresorption von Wasser (H2O) aus den

Einleitung - 9 -

Sammelrohren der Nierentubuli, durch Einbau von Aquaporinen

(Wasserkanäle).

Oxytozin regt die in der Schwangerschaft sensibilisierte glatte Muskulatur des

Uterus (Geburtseinleitung) und der Brustdrüsenendstücke zur Kontraktion an

(Laktation). Als Reiz für die Sekretion von OXY gilt eine Uterus-Dehnung, sowie

das Stimulieren der Brustwarze.

Abb. 1.4 Hypothalamus-Hypophyse: Portalkreislauf (Benninghoff, Bd. 1, S.187).

Einleitung - 10 -

Im Gegensatz zum SON besitzt der PVN (pars parvocellularis) zu den

magnozellulären Zellen noch separate zusätzliche parvozelluläre

Neuronenverbände, welche zum hypothalamo-adenohypophysären

(parvozelluläres) System (Nucleus paraventricularis, Nuclei praeoptici, Nucleus

periventricularis, Nucleus arcuatus) gehören und über hypophysiotrope

Hormone die Stimulation oder Hemmung der Freisetzung von glandotropen

oder Effektor-Hormonen der Adenohypophyse steuern.

Zur elektrophysiologischen Differenzierung von magnozellulären oxytozinergen

und vasopressinergen Neuronen wurden physiologische Stimuli in Kombination

mit einer antidromischen Reizung gegeben. Die elektrische Stimulation

axonaler Projektionen im Hypophysenstiel, sowie die mechanische Reizung der

Mammillen laktierender Ratten führten zu kurzen (2-4 s), aber sehr

hochfrequenten (30-60 Hz) Entladungen der oxytozinergen Neurone (Poulain et

al. 1977). Ohne applizierte Stimuli wurde eine unregelmäßige, langsame

Aktivität („random-firing“) registriert.

Vasopressinerge Neurone reagierten auf hypovolämische (Blutentnahme) oder

hyperosmotische Reize (Infundieren einer hyperosmotischen NaCl-Lösung in

die Carotis) mit einer verstärkten rhythmisch phasischen Aktivität. Es

wechselten sich sekundenlange Phasen kontinuierlicher Aktivität (15-45 s), mit

Gruppen von oft mehr als 100 Impulsen, von entsprechend langen

Entladungspausen ab.

Mittels Injektion von „Lucifer-Yellow“ über die Ableitelektrode und

anschließender immunhistochemischer Identifizierung mit entsprechend

markierten Antikörpern gegen ADH-Neurophysin oder OXY-Neurophysin

konnten immunzytochemische Charakterisierungen vorgenommen werden

(Andrew und Dudek 1984, Dudek et al. 1980, Gähwiler und Dreifuss 1980,

Smithson et al. 1984). Korrelierte man das Entladungsverhalten mit den

immunzytochemischen Befunden, so zeigten auch hier vasopressinerge

Neurone vor allem phasische Entladungen (Brimble und Dyball 1977, Cobett et

al. 1986, Poulain et al. 1977, Yamashita et al. 1983), sowie kurze rhythmische

Gruppenentladungen (Bursts) mit wenigen Impulsen und schnellem Rhythmus

(Gähwiler und Dreifuss 1979, Mason 1983).

Von größter Bedeutung für das Maß der Sekretion sind die markanten

Entladungsmuster (Impulsfolge der Aktionspotentiale) der spontanaktiven

Einleitung - 11 -

PVN-/SON-Neurone (Brimble und Dyball 1977, Cazalis et al. 1985, Dutton und

Dyball 1979, Dyball 1971, Harris 1947, Poulain et al. 1977, Poulain und

Wakerley 1982). Dabei wird die Sekretionsrate vor allem durch Modifikationen

der applizierten Gruppenentladungen, hier besonders durch die Frequenz

innerhalb dieser bestimmt. Kürzere Intervalle, vor allem zu Beginn der Bursts

(hochfrequent) waren effektiver in der Sekretionsrate als konstante

Intraburstintervalle. Aber auch die Pause zwischen neuronaler burstender

Aktivität war ausschlaggebend. Nach Gabe von Gruppenentladungen gleichen

Musters, aber mit unterschiedlichen Pausen zwischen diesen, zeigte sich, dass

eine bestimmte Pausenlänge notwendig ist, damit wieder optimale

Bedingungen für hohe Sekretionsraten gegeben waren.

Die spontane Aktivität unterliegt zusätzlich dem Einfluss der Körpertemperatur,

bedingt durch eine intrinsische Temperatursensitivität im Rahmen der

Thermoregulation durch die PO/AH (Boulant 1986, Braun et al. 1994b, Inenaga

et al. 1987). Durch thermale Stimulation der Regio praeoptica wurden die

neuroendokrinen Zellen des PVN und SON in ihrer Entladungsrate

mitbeeinflusst (Matsumura et al. 1983, 1985). So führten Injektionen

hypertonischer Lösungen verschiedenster Temperaturen in die Carotis zu

Veränderungen der Neuronenaktivität (Brooks et al. 1966). Dabei zeigten einige

Neurone bei Temperaturerniedrigung eine verminderte Entladungsrate

(warmsensitives Verhalten). Gegensätzlich führte eine Abkühlung des Gehirns,

mittels einer Thermode an der Carotis-Arterie bei etwa der Hälfte der

extrazellulär abgeleiteten Neurone zu einer Aktivitätssteigerung (Ferguson et al.

1984). Der exzitatorische Effekt korrelierte gut mit einem erhöhten

Vasopressin-Spiegel in der Peripherie und ließ sich mit einer in dieser Phase

auftretenden Antidiurese in Zusammenhang bringen, einer der wohl wichtigsten

Aufgaben im Sinne der zentralen Regulation des osmotischen Verhältnisses in

der Extrazellulär-Flüssigkeit.

Existiert ein Ungleichgewicht in der Wasserbilanz, so werden regulatorische

humorale und nervale Mechanismen wirksam, um das Körperwasser auf ein

isoosmotisches Niveau zu bringen. Bei Abnahme des Blutvolumens und damit

des Blutdruckes (Volumenmangel) wird der osmoregulierende Signalstoff

Angiotensin II freigesetzt. Ang II gehört zu den potentesten Vasokonstriktoren

und ist zugleich ein wichtiges Glied in der Regulation des Flüssigkeitsvolumens,

Einleitung - 12 -

da es die Natrium-Rückresorption im distalen Tubulussystem der Niere erhöht

und somit auch eine zusätzliche Retention von Wasser auslöst. Eine zentrale

Applikation von Ang II in die anterioventrikuläre Region des 3. Ventrikels

(AV3V-Region; CVO= Circumventrikulär-Organ) mit dem Organum Vasculosum

der Lamina terminalis (OVLT) und dem Subfornikalorgan (SFO) (Ferguson

1992, Müller et al. 1994), als die für das periphere Angiotensin durchlässigen

Anteile, führt zu einer Erhöhung der spontanen Entladung von PVN-/SON-

Neuronen (Ferguson und Renaud 1986, Johnson 1985). Dabei haben die

Terminalen der SFO-Neurone eine direkte Verbindung zu den Somata der

magnozellulären und parvozellulären PVN- und SON-Neurone, deren Axone mit

dem Neurotransmitter Ang II zu kardiovaskulären Kontrollzentren im Hirnstamm

und autonomen Kerngebieten der Medulla projizieren (Bains und Ferguson

1995, Changaris et al. 1978, Fuxe et al. 1976, Gehlert et al. 1986, Hwang et al.

1986, Li und Ferguson 1993). Somit können als Reaktion auf osmotische

Veränderungen in der Peripherie freigesetzte humorale Faktoren (Ang II),

Informationen über das CVO an den PVN und SON weitergeben und

Mechanismen der Gegenregulation im Sinne einer gesteigerten ADH-

Freisetzung aus dem Hypophysenhinterlappen (Okuya et al. 1987, Thrasher

und Keil 1987), einhergehend mit erhöhtem Durstempfinden und Blutdruck

(„neurohumorale Kontrolle“) ausgelöst werden.

Neben diesem Ang II-Mechanismus werden nervale Signale von zentralen und

peripheren Rezeptoren dem nervösen Zentrum über den osmotischen IST-Wert

vermittelt. Sie messen Unterschiede in der Osmolalität der extrazellulären

Flüssigkeit und Schwankungen der Natrium-Konzentration. Zentral lokalisierte

osmorezeptive Zellen finden sich im SFO, OVLT und der AV3V-Region im

Hypothalamus (Bourque et al. 1994, Müller et al. 1994), mit den bereits

beschriebenen Efferenzen zu den magnozellulären Neuronen des PVN und

SON, wo sich auch osmosensitive Zellen nachweisen lassen (Han et al. 1992,

Silva und Boulant 1984) und mit diesen im neuronalen Verbund einen

Osmorezeptor-Komplex bilden (Honda et al. 1990).

Neben zentralen rezeptiven Einheiten existieren auch extrakraniale

Osmorezeptoren in der Leber (Adachi et al. 1984) und im Carotissinus (Kunze

und Brown 1977), die zu den osmoregulatorisch relevanten Gebieten im

vorderen Hypothalamus projizieren. Zusätzlich existieren Afferenzen von

Einleitung - 13 -

Barorezeptoren, Chemorezeptoren und atrialen Dehnungsrezeptoren zu

noradrenergen A1-Zellen der Medulla oblongata und des NTS (= Nucleus

tractus solitarii), die wiederum magnozelluläre PVN- und SON-Neurone

innervieren (Kubo et al. 1985). Über afferente Nerven (N. glossopharyngeus

und N. vagus) die im NTS synaptisch verschaltet werden, gelangen die Impulse

zu den vegetativen Zentren in der ventrolateralen Medulla oblongata (VLM).

Über den Sympathikus erfolgen dann regulierende efferente Signale, die eine

Dilatation bzw. Konstriktion der Widerstandsgefäße zur Folge haben. Zuvor

jedoch ziehen von der VLM afferente Neurone unter Verwendung

verschiedenster Transmitter zu den Kerngebieten des Hypothalamus (Sladek

und Sladek 1985), woraufhin ein Durstgefühl ausgelöst und ADH freigesetzt

wird (1963: Gauer-Henry-Reflex: ADH-Sezernierung entsprechend der

Vorhofdehnung).

Impliziert man nun einen dehydrierten Zustand, so käme es aufgrund

gemeinsamer Konnektiven zwischen Osmoregulation und Thermoregulation zu

einem höheren Körpertemperatur-Anstieg als bei einem physiologisch

homöostatischen Körper (Pitts et al. 1944). Einerseits erniedrigt eine

Hyperosmolarität die Sensitivität der Schweißdrüsen für neuronale Afferenzen

(Nielsen 1974), was eine verminderte Wärmeabgabe bedeutet, aber

andererseits wird der Sollwert („set-point“) im thermoregulatorischem Zentrum

erhöht (Mitchell et al. 1971). Mittels in den Hypothalamus von Enten und

Hunden implantierten Thermoelektroden, konnte eine kälteinduzierte Diurese

und eine wärmeinduzierte Antidiurese eine neuronale Vernetzung beider

Regelsysteme deutlich machen (Simon-Oppermann und Gunther 1990,

Szcepanzka-Sadowska 1974). Zudem ist der Plasmaspiegel von ADH der

Säuger und AVT der Vögel nicht nur von osmotischen Bedingungen abhängig,

sondern zusätzlich auch von der Körpertemperatur (Keil et al. 1994, Simon und

Nolte 1990, Takamata et al. 1995). So beeinflussen lang andauernde Kühlung

bzw. Erwärmung des Hypothalamus die durch Hyperosmose erhöhte ADH-

Konzentration im Blut kaum, doch führen kurzzeitige Temperaturänderungen im

Hypothalamus zu einer veränderten ADH-Konzentration (gesteigerte Diurese

bzw. Antidiurese unter Hyperosmose) (Keil et al. 1994). In-vitro-

Untersuchungen an Hirnschnitten der Ratte im PO/AH und MnPO (= Mediane

präoptische Region) zeigten, dass sich diese integrative Verarbeitung osmo-

Einleitung - 14 -

und thermoregulatorischer Interaktionen bereits auf neuronaler Ebene in der

Entladungsrate abzeichnet (Nakashima et al. 1985, Silva und Boulant 1984,

Travis und Johnson 1993). Einhergehend steigt die Aldosteron- und

Corticotropin-Konzentration im Blut, bedingt durch die Kolokalisation und

-freisetzung von ADH und CRH, welche gemeinsamen Einfluss auf die ACTH-

Freisetzung haben (Cobett et al. 1986).

Die Freisetzung von ADH aus dem PVN/SON spielt zudem eine wichtige Rolle

während eines Fiebers, da das Hormon eine antipyretische Wirkung besitzt und

somit diesen Zustand limitieren kann. Das Hormon entfaltet seine Wirkung in

der Area septalis ventralis (VSA) des limbischen Systems (Kiss 1988), wo

Mikroinfusionen von ADH eine dosisabhängige signifikante Fieberreduktion

bewirken, während die Applikation eines ADH-Antagonisten zu einer

Fiberinduktion mit verlängerter Intensität führt (Blatteis 1990b, Cooper et al.

1987, Merker et al. 1989). Eine Applikation dorsal oder lateral von der VSA,

sowie eine Applikation des strukturähnlichen Peptides OXY zeigen keinen

antipyretischen Effekt. Die Fieberreduktion ist also dosisabhängig, sowie Ort-

und Peptid-spezifisch (Naylor et al. 1986). Die VSA-vermittelte endogen

antipyretische Wirkung von ADH erklärt man sich einerseits durch neuronale

Projektionen von der VSA zu hypothalamischen thermoregulatorischen

Strukturen, die pyrogen-induzierte Veränderungen unterdrücken können.

Andererseits fand man von der VSA stammende perivaskuläre ADH-Fasern im

OVLT, die zu der Überlegung führten, dass ADH an dieser Stelle die

Permeabilität oder Interleukin-Bindung behindern könnte, um somit die

Fieberentwicklung in einem sehr frühen Glied der Signalkette zu inhibieren

(Zeisberger und Merker 1992).

Bei afebrilen oder passiv erwärmten Tieren wird jedoch keine

Temperatursenkung vermittelt und es kommt auch nicht zu einer basal erhöhten

ADH-Freisetzung in der VSA. ADH wirkt somit nicht generell Körpertemperatur-

senkend, sondern nur als Antipyretikum (Horowitz et al. 1992, Wilkinson et al.

1994).

Bedeutsam ist auch die Tatsache, dass unter besonderen physiologischen

Zuständen (Neugeborene, präpartale Schwangere, chronische Hypertoniker)

eine verminderte Fieberreaktion auf Pyrogene vorliegt. Bei allen diesen

Bedingungen konnte entweder ein erhöhtes ADH in der VSA oder Reversibilität

Einleitung - 15 -

der natürlichen Antipyrese durch Applikation eines ADH-Antagonisten in der

VSA festgestellt werden (Cooper et al. 1988, Pittman und Wilkinson 1992, Roth

und Zeisberger 1992).

Wie aus den oben stehenden Abschnitten ersichtlich wird, können eine Vielzahl

von regulatorischen Kontrollmechanismen genannt werden. Doch von größter

Bedeutung für diese hier vorliegende Arbeit sind die Projektionen noradrenerger

A1/A2-Zellen der Medulla oblongata zu den relevanten Gebieten im vorderen

Hypothalamus, die im folgenden Kapitel ausführlich behandelt werden.

Einleitung - 16 -

1.2 Noradrenerges System

Synthese und Funktion

Abb. 1.5 Synthese von Noradrenalin.

Das Hormon Noradrenalin (lat.: glandula adrenalis= Nebennierenmark;

Synonym: Norepinephrin) ist ein zur Gruppe der Katecholamine (Synonym:

Brenzkatechinamin) gehöriges

Neurohormon. Unter Kate-

cholaminen versteht man die

Gruppe der biogenen Amine

Noradrenalin und Dopamin

(primäre Katecholamine), sowie

Adrenalin und deren Derivate

(sekundäre Katecholamine). Auf-

grund ihrer chemischen Struktur

v.a. der Polarität der Hydroxyl-

Gruppen sind die Katecholamine

weder in der Lage, die Blut-Hirn-

Schranke zu durchdringen, noch

können sie oral appliziert werden. Ihre Wirkungsdauer ist eher kurz, bedingt

durch die zirkulierenden Abbau-Enzyme Monoaminooxidase (MAO) und

Catechol-O-Methyltransferase (COMT).

Noradrenalin wird im menschlichen Organismus aus den Aminosäuren

Phenylalanin bzw. Tyrosin synthetisiert (siehe Abb. 1.5). Im ersten Schritt der

Noradrenalin-Biosynthese wird das Tyrosin-Molekül am C3-Atom mit einer

zweiten Hydroxylgruppe hydroxyliert und liegt damit als 3,4-

Dihydroxyphenylalanin (DOPA) vor. Danach decarboxyliert das Enzym DOPA-

Decarboxylase das entstandene Molekül zum biogenen Amin Dopamin. Durch

die Hydroxylierung der Seitenkette mit Hilfe der Dopamin-Hydroxylase und der

Ascorbinsäure als Kofaktor, entsteht schließlich Noradrenalin.

Synthetisiert wird Noradrenalin in Zellen des Nebennierenmarks, in den

postsynaptischen (noradrenergen) Neuronen des Sympathikus, sowie in Zellen

des Hirnstammes (entwicklungsgeschichtlich gleicher Ursprung der Zellen).

Einleitung - 17 -

Nach Ausschüttung in den synaptischen Spalt kann Noradrenalin teilweise

wieder vom präsynaptischen Neuron aufgenommen werden. Besonders das

aus der Nebenniere freigesetzte Hormon muss jedoch enzymatisch inaktiviert

werden. Dabei wird mittels katalytischer Hilfe des Enzyms Catechol-O-

Methyltransferase (COMT) eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin auf

das Katecholamin übertragen und anschließend durch eine Monoaminooxidase

(MAO) zu Vanillinmandelsäure desaminiert.

Im peripheren Nervensystem sind Noradrenalin und in geringem Maße auch

Adrenalin Überträgerstoffe der sympathischen postganglionären Endigungen.

Ferner fungiert Noradrenalin nach Ausschüttung aus dem Nebennierenmark

auch als Hormon. Es führt z.B. zur Kontraktion der Widerstands- und

Kapazitätsgefäße, Dilatation der Koronararterien und Steigerung von Blutdruck

und Herzfrequenz.

Pathophysiologisch kann eine Überproduktion von Noradrenalin beim

sogenannten Phäochromozytom vorkommen, dessen Leitsymptome

Hypertonie, Schweißausbrüche, Kopfschmerzen und Tachykardie sind. Darüber

hinaus sind verschiedene Defekte der Enzyme des Noradrenalin-Stoffwechsels

beschrieben.

Pharmakologisch findet es Verwendung in der Notfall- und Schocktherapie, z.B.

als Medikament erster Wahl bei der kardiopulmonalen Reanimation, sowie zur

akuten Hebung des Blutdruckes bei Hypotonie.

Seine Wirkung entfaltet Noradrenalin an selektiven Adrenozeptoren (siehe Abb.

1.6), von denen die vier Haupttypen als α1-, α2-, β1- und β2-Rezeptoren

bezeichnet werden. Sie unterscheiden sich in ihrem Ansprechen auf

verschiedene Agonisten bzw. Antagonisten, aber auch in ihren

postsynaptischen Effekten. Die spezifischen α1-Agonisten Ephedrin,

Phenylephrin (chemische Bezeichnung: (R)-3-Hydroxy-a-[(methylamino)-

methyl]benzenmethanol), sowie Terbutalin gehören zu den Nicht-

Katecholaminen. Aufgrund ihrer unterschiedlichen chemischen Struktur haben

diese eine längere Halbwertszeit, bedingt durch einen fehlenden Angriffspunkt

für das Abbau-Enzym COMT. Auch kann eine orale Applikation der Nicht-

Katecholaminen erfolgen. Jedoch am bedeutendsten ist die Tatsache, dass

eine Überwindung der Blut-Hirn-Schranke möglich ist. Pharmakologisch finden

α1-Agonisten Anwendung als Vasokonstringentien v.a. in Lokalanästhetika, zur

Einleitung - 18 -

therapeutischen Behandlung von chronischen Hypotonien und der Rhinitis,

sowie in der Ophthalmologie als Mydriatika (Alphasympathomimetika: Reizung

des M. dilatator pupillae).

In dieser Arbeit wurde die Auswirkung des α1-Agonist Phenylephrin auf die

neurosekretorischen Zellen des PVN und SON untersucht. Dabei entfaltet der

Agonist seine Wirkung nicht direkt über eine Konformationsänderung der

Membrankanäle, sondern führt über eine intrazelluläre Gq-Protein-Kaskade zur

Aktivierung der „second-messengers“ Inositoltriphosphat (IP3) und

Diacylglycerol (DAG). Daraus resultiert die Freisetzung von Ca2+-Ionen aus

intrazellulären Calciumspeichern und die Phosphorylierung von

Membrankanälen, was exzitatorisch auf die Neurone wirkt.

Prazosin ist, wie seine pharmakologischen Verwandten Terazosin, Doxazosin,

Alfuzosin ein sogenannter α1-Rezeptorantagonist und wird peripher vorrangig

zur Behandlung der arteriellen Hypertonie eingesetzt. Seine Halbwertszeit

beträgt 2,5-2,9 Stunden. Seine genaue chemische Bezeichnung lautet:

4-Amino-2-[4-(2-furoyl)-1-piperazinyl]-6,7-dimethoxychinazolin.

Bei Therapie mit α-Rezeptorantagonisten müssen einige Nebenwirkungen

beachtet werden. So verursachen sie relativ häufig orthostatische

Beschwerden. Demzufolge wird Prazosin in der Behandlung von

hypertonischen Beschwerden nur als Mittel zweiter Wahl eingesetzt. Weiterhin

wurden als Nebenwirkungen u.a. beschrieben: Müdigkeit, Unwohlsein,

Schwächegefühl, Gewichtszunahme, Leberfunktionsstörungen, Pankreatitis.

Einleitung - 19 -

Agonist

Phenylephrin

Adrenozeptoren

Alph

a 1

Alpha 1: α1B, α1A, α1D

G-Protein: Gq, GiGo

Effektor-Mechanismus: ↑ Phospholipase C, D, A2

Antagonist

Prazosin

Agonist

Clonidin

Alph

a 2

Alpha 2: α2A, α2B, α2C

G-Protein: Gi, Go

Effektor-Mechanismus: ↓ cAMP

Antagonist

Yohimbin

Agonist

Dobutamin

Beta

1

Beta 1:

G-Protein: Gs

Effektor-Mechanismus: ↑ cAMP, ↑ L-Typ Ca 2+

Antagonist

Metoprolol

Agonist

Albuterol

Abb. 1.6

Adrenozeptoren.

Beta

2

Beta 2:

G-Protein: Gs

Effektor-Mechanismus: ↑ cAMP

Antagonist

Butoxamin

Einleitung - 20 -

Zentrale noradrenerge Zellgruppen

Die Formatio reticularis, lokalisiert im Mesencephalon (Pons, Medulla

oblongata), beinhaltet eine große Gruppe an Nervenkernen, die noradrenerge,

dopaminerge und serotonerge Neurone enthalten. Sieben noradrenerge

Zellgruppen, als A1 bis A7 bezeichnet, wurden bei Nagern beschrieben. Die

meisten dieser Gruppen wurden auch bei Primaten gefunden. Diese

Zellgruppen entsenden sich stark verzweigende, auf- und absteigende

Fasersysteme, die in Längsrichtung der „Neuraxis“ verlaufen und terminale

Netzwerke in den verschiedenen Grisea bilden.

Die größte noradrenerge Zellgruppe ist der Locus coeruleus (v.a. A4, A6, A7)

am Boden der Rautengrube, ein makroskopisch sichtbarer blauschwarzer

Gewebestreifen in Höhe der rostralen Ponsabschnitte. Er enthält beinahe die

Hälfte der Gesamtzahl aller Noradrenalin-synthetisierenden Zellen und ist

quantitativ das bedeutendste noradrenerge Zentrum des Gehirns. Dieser Kern

besteht aus nur etwa 1000 Zellen, deren Axone sich jedoch so vielfach

verzweigen, dass die zugehörigen noradrenergen Endigungen an vielen Stellen

des ZNS zu finden sind.

Von größter Bedeutung sind jedoch die Gruppen A1, A2, A5 und A7, von denen

ein aufsteigendes Fasersystem ausgeht, das als ventraler noradrenerger

Bahnzug bezeichnet wird. Die Gruppen A1 und A2 liegen in der unteren

Medulla oblongata. Die Neurone der Gruppe A1 umgeben den Kern des

Funiculus lateralis und erstrecken sich dorsomedial in den lateralen Anteil der

Formatio reticularis; die der Gruppe A2 liegen dorsal und lateral des Nucleus

nervi hypoglossi, nahe der ventrikulären Oberfläche. Die Gruppe A5 besteht

aus ziemlich locker angeordneten Zellen, die den Nucleus nervi facialis und die

obere Olive umgeben. In den rostralen pontinen Abschnitten der lateralen

Formatio reticularis befinden sich die Zellen der Gruppe A7.

Der ventrale noradrenerge Bahnzug (Fasergruppen A1, A2, A5 und A7) verläuft

durch das retikuläre Gebiet des Hirnstamms und setzt sich nach vorn

hauptsächlich im medialen Vorderhirnbündel fort. Terminationsgebiete sind der

ventrolaterale Anteil der Substantia grisea im Mesencephalon, die Formatio

reticularis, der gesamte Hypothalamus im Diencephalon, insbesondere die

Einleitung - 21 -

Nuclei dorsomedialis, periventricularis, infundibularis, supraopticus,

paraventricularis und die innere Schicht der Eminentia mediana, die Area

praeoptica im Telencephalon und der Binnenkern der Stria terminalis. Ebenfalls

beschrieben ist eine noradrenerge Innervation des Bulbus olfactorius (Swanson

und Hartman 1975).

1 Interstitialkern der Stria terminalis 2 Commissura anterior 3 Nucleus paraventricularis 4 Nucleus praeopticus 5 Nucleus dorsomedialis 6 Bulbus olfactorius 7 Nucleus supraopticus 8 Nucleus infundibularis

9 Griseum centrale mesencephali 10 Formatio reticularis mesencephali 11 Zellgruppe A7 12 Zellgruppe A5 13 Nucleus solitarius 14 Nucleus dorsalis nervi vagi 15 Zellgruppe A2 16 Zellgruppe A1

Abb. 1.7 Noradrenerges System (Rudolf Nieuwenhuys: The Human Central Nervous System, 1988).

Somit hat der ventrale noradrenerge Bahnzug einen erheblichen modulierenden

Einfluss z.B. auf Reifungsprozesse und Lernvorgänge, Verarbeitung von

Sinnesreizen, Schlafregulation und endogene Schmerzhemmung. Der Locus

Einleitung - 22 -

coeruleus wird indessen als „Alarmsystem des Gehirns“ in körperlichen und

seelischen Stress-Situationen aktiviert und ist dabei entscheidend an der

Entstehung charakteristischer Symptome wie Angstempfindung oder

Tachykardie beteiligt.

Der ventrale noradrenerge Bahnzug projiziert aber auch gleichzeitig über zwei

absteigende noradrenerge bulbospinale Fasern. Zum einen über den Funiculus

anterior, welcher im Vorderhirn endet und zum anderen über den dorsolateralen

Teil des Funiculus lateralis mit der Endigung im Nucleus intermediolateralis und

in der Substantia gelatinosa. Erwähnenswert ist noch die Tatsache, dass auch

die Nuclei dorsalis nervi vagi und solitarius noradrenerge Fasern beziehen,

hauptsächlich aus A1 und A2 (Bourque und Renaud 1990).

Die Projektionen der noradrenergen Zellgruppen ins limbische System spielen

klinisch eine Rolle bei depressiven Erkrankungen. Angenommen wird eine

Unterfunktion, weshalb man mit Medikamenten die Wirkung noradrenerger

Neurone verstärkt und den Kranken erheblich Linderung schafft.

Abb. 1.8 Schematische Darstellung der afferenten und efferenten Hauptverbindungen der hypothalamischen Kerngebiete (Sawchenko und Swanson 1983).

Einleitung - 23 -

Der PVN und SON erhalten direkten exzitatorischen Input von den

noradrenergen A1-Neuronen in der kaudalen ventrolateralen Medulla oblongata

(Alonso und Assenmacher 1984, Day und Renaud 1984) (s. Abb. 1.8). Dieser

besitzt eine große Bedeutung für die Stimulation der Vasopressin-Freisetzung

auf modulierenden Blutdruck (Raby und Renaud 1989). Eindeutige Studien, die

Noradrenalin als alleinigen primären Transmitter belegen, waren jedoch nicht

erfolgreich (Day et al. 1990). Neuere Experimente bestätigten die Vermutung,

dass Noradrenalin seine exzitatorische Wirkung via α1-Rezeptoren

magnozellulärer Neurone im Hypothalamus mittels Kotransmitter entfaltet. In

Zusammenhang mit Noradrenalin werden unterschiedlichste Substanzen

(Neuropeptid Y, Substanz O, ATP), ebenfalls lokalisiert in der A1-Zellgruppe,

parallel zu Noradrenalin freigesetzt (Everitt et al. 1984, Sawchenko et al. 1985).

So aktivieren noradrenerge Projektionen aus den A1/A2-Zellgruppen in der

Medulla oblongata glutamaterge Interneurone im Hypothalamus z.B. PVN, die

intranukleäre exzitatorische Projektionen zu den magnozellulären Neurone

senden (Daftary et al. 1998). Andererseits führt man die exzitatorische Wirkung

von Noradrenalin auf eine Konvergenz von intrazellulären Signalkaskaden

zurück. Neben Noradrenalin setzen die A1-Neurone noch ATP frei, das an

purinerge P2x-Rezeptoren bindet. Dabei bewirkt die Aktivierung des α1-

Rezeptors und des P2x-Rezeptors einen enormen Anstieg der intrazellulären

Ca2+-Konzentration (Kapoor und Sladek 2000).

Einleitung - 24 -

1.3 Fragestellung

Der Hypothalamus, als oberste Integrationseinheit vegetativer Funktionen,

besitzt einen überragenden Stellenwert in multiplen wissenschaftlichen

Untersuchungen, in denen man es sich zur Aufgabe gemacht hat, die

vielseitigen physiologischen Abläufe zu verstehen und Rückschlüsse auf den

Gesamtorganismus zu ziehen. Dabei hat sich gezeigt, dass die Systeme nicht

einer strikten Trennung unterliegen, sondern dass sie vielmehr miteinander

kommunizieren und, dass ihre Neurone für mehrere endogene Stimuli

(Temperatur, osmotischer Druck, Glukose, diverse Steroide) sensitiv sind

(Boulant und Silva, 1988).

Die dieser Dissertation zugrundeliegenden elektrophysiologischen Experimente

sollten die Frage klären, inwieweit sich im Entladungsverhalten

hypothalamischer Neurone physiologisch relevante Stimuli homöostatischer

Regelsysteme widerspiegeln. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob sich

die zwischen diesen Reizen bekannten Wechselwirkungen ebenfalls in der

neuronalen Entladung zeigen. In der hier vorliegenden Arbeit wird speziell die

Verknüpfung des noradrenergen α1-Agonisten Phenylephrin mit thermischen

Signalen in den magnozellulären neurosekretorischen Neuronen des Nucleus

paraventricularis (PVN) und Nucleus supraopticus (SON) untersucht. Jegliche

Auswirkungen würden zu einer Umstellung der Impulsaktivität führen, die

möglicherweise für eine funktionell sinnvolle Veränderung der Hormonsekretion

steht. Konkrete Ansatzpunkte für solche elektrophysiologischen Experimente

ergeben sich aus den oben angesprochenen, physiologisch gut dokumentierten

funktionellen Wechselwirkungen.

Die Kerngebiete PVN und SON sind für diese Untersuchungen besonders gut

geeignet, da sich hier neurophysiologische Ableitungen in einem direkten

Zusammenhang von physiologischer Hormonausschüttung, sprich ADH und

OXY befinden und wegen ihrer vielfältigen homöostatischen Kontrollfunktion.

Zum einen steuern PVN und SON die HPA-Achse über die Freisetzung von

CRF und regulieren den Wasserhaushalt über ADH, welches eine

Schlüsselrolle in der Vasomotion (Vasokonstriktion) einnimmt. Zusätzlich besitzt

es eine antipyretische und zusammen mit dem Releasing-Hormon CRH eine

Einleitung - 25 -

immunsuppressive Wirkung. Die magnozellulären neurosekretorischen Zellen

des PVN und SON als Herkunftsort des ADH sind somit integrative Zentren mit

gegenregulatorischen Domänen im Rahmen der Thermoregulation. Zwar kennt

man die entscheidende Vernetzung verschiedener Homöostasesysteme im

Hypothalamus, doch ist über die Integration multipler Stimuli und derer

gemeinsamen Konnektiven weniger bekannt.

Die erste Serie dieser Untersuchungen beschäftigte sich daher mit der Frage,

ob sich im Entladungsverhalten der neurosekretorischen Zellen des PVN und

SON Hinweise finden, dass sinusförmige Temperatustimuli, im Sinne einer

negativen Rückkopplung, über eine gesteigerte ADH-Sekretion

gegenregulatorische Mechanismen auslösen könnten.

Die zweite Frage betrifft die etwaigen Wechselwirkungen der verschiedenen

neuronalen Temperatureffekte mit anderen Parametern, wie in diesem Fall der

Einfluss noradrenerger Stimuli (Phenylephrin), die ebenfalls einen Einfluss auf

das Entladungsverhalten der PVN und SON Neurone haben. Hier könnte man

eine Nichtlinearität der elektrischen Aktivität in Verbindung mit den kombinierten

Stimuli erwarten. Die für diese Untersuchungen gewählten Methoden

entsprechen den herkömmlichen Verfahren zur extrazellulären Registrierung

der Impulsaktivität von Einzelneuronen in Hirnschnittpräparaten. Angesichts der

funktionellen Bedeutung der Impulsgruppen-Entladungen (Bursts), gerade für

die ADH-Sekretion, wurde der für diese Fragestellung besonders wichtige

Aspekt der gemittelten Entladungsfrequenz aufgezeichnet, sowie teilweise auch

die Veränderungen der Impulsmuster analysiert.

Material und Methoden - 26 -

2.0 Material und Methoden 2.1 Hirnschnitt-Technik

Bei den in dieser Arbeit zugrunde liegenden in-vitro Experimenten handelt es

sich um eine neurobiologische Untersuchungsmethode, mit der man

elektrophysiologische Messungen an Zellen zerebraler Areale, hier speziell des

hypothalamischen Areals von Säugetieren durchführen kann.

Seinen Ursprung findet diese elektrophysiologische Methode jedoch in der

Biochemie. Der amerikanische Biochemiker McIlwain beschrieb dieses Prinzip

erstmals 1961. Bereits 1966 konnten erste Aktivitäten neokortikaler Neurone

durch Yamamoto und McIlwain gemessen werden. Erstmalige

elektrophysiologische Untersuchungen am Hypothalamus, in Bezug auf

Spontanaktivität und Osmosensitivität, erfolgten 1978 durch Brimble et al.,

Dudek et al. 1980, Haller und Wakerley 1980, Hatton et al. 1978, Hatton 1982.

Andrew et al. führten im Jahre 1981 Versuche zur elektrischen Koppelung

magnozellulärer neurosekretorischer Neurone auf zellulärer Ebene durch.

Ebenfalls konnte bereits Anfang der achtziger Jahre, die Thermosensitivität

hypothalamischer Neurone durch Kelso und Boulant (1982), sowie Kelso et al.

(1982) mit Hilfe der Hirnschnitt-Technik untersucht werden.

Superfusionslösungen

Zur Vermeidung des Zelltodes mussten die Zellen geeigneten physiologischen

Bedingungen ausgesetzt werden, damit deren Spontanaktivität untersucht

werden konnte. Die Aufbewahrung der Hirnschnitte und die Superfusion in der

Ableitkammer erfolgte mit einer artifiziellen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF). Die

Konzentrationen der in der aCSF gelösten Ionen richteten sich nach Schmid

und Pierau 1993 (siehe Abb. 2.1). Die Substanzen wurden in 10-fach

konzentrierten Stammlösungen angesetzt; NaCl, KCl und KH2PO4 in derselben

Lösung, die vier anderen Substanzen separat. Am jeweiligen Versuchstag

Material und Methoden - 27 -

wurden die vier Stammlösungen zusammengegeben und mit Aquadest auf die

Endkonzentration verdünnt. Vor Versuchsbeginn wurde diese Nährlösung mit

Carbogen, einem Gasgemisch aus 95% O2 und 5% CO2 für eine Stunde begast

(Yamamoto 1972).

Substanzname Summenformel Konzentration [mmol/l] Hersteller

Natriumchlorid NaCl 124 Merck

Kaliumchlorid KCl 5 Merck

Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 1,24 Merck

Magnesiumsulfat-Heptahydrat MgSO4 x 7H2O 1,3 Merck

Natriumhydrogencarbonat NaHCO3 26 Merck

Calciumchlorid-Dihydrat CaCl2 x 2H2O 0,9 Merck

D(+)-Glukose-Monohydrat C6H12O6 x H2O 10 Merck

Abb. 2.1 Zusammensetzung der aCSF (nach Schmid und Pierau 1993).

Eine pH-Wert-Überprüfung mit einem pH-Meter der Firma Greisinger ergab im

Mittel einen Wert von 7,39, sowie einer Osmolalität von 297 mOsm/kg Lösung

(gemessen mit einem Osmometer der Firma Knauer). Mittels geregelter

Heizung konnte die Temperatur in der Daueraufbewahrung auf konstanten

35°C gehalten werden. In der Ableitkammer selbst wurde auf ein

Körpertemperatur-Niveau mit 37°C erhöht und nach einer Adaptationsphase

den Versuchbedingungen entsprechend modifiziert.

Versuchstiere

Als Versuchstiere dienten juvenile Sprague-Dawley-Ratten, männlichen

Geschlechtes (siehe Abb. 2.2). Es handelte sich um Albino-Tiere, deren

Gewicht ca. 100-185 g betrug. Entscheidendes Kriterium war die Juvenilität.

Juvenile Tiere wiesen eine weichere und konsistentere Gehirnmasse auf, im

Material und Methoden - 28 -

Gegensatz zu adulten Ratten. So konnte eine schnellere und effizientere

Präparation durchgeführt werden. Ein weiterer Vorteil war das geringere

Volumen des Gehirns, was eine schnellere Kühlung (innerhalb von 3 Minuten)

zuließ. Zudem zeigten adulte Ratten eine höhere Neigung zur Anoxie, sprich

der neuronale Schaden nimmt im Laufe des Alters zu, aufgrund vermehrter

Myelinisation und Zellverbindungen.

Abb. 2.2 Juvenile Sprague-Dawley-Ratte, männlichen Geschlechtes.

Die Tiere wurden aus der Versuchstierzucht GmbH&COKG HARLAN-

WINKELMANN (Borchen, BRD) bezogen.

Die Haltung der Tiere erfolgte im Institut-eigenen Tierraum, gemäß den

Standardlaborrichtlinien. Hier herrschte eine konstante Temperatur von 21 bis

23°C und eine relative Luftfeuchtigkeit von 55%, bei einer Beleuchtungszeit von

12 Stunden pro Tag. Die Ernährung der Tiere erfolgte ad libitum mit

Trockenfutter Altromin 1314 (ALTROMIN GmbH, Lage, BRD) und

Leitungswasser.

Material und Methoden - 29 -

2.2 Präparation und Anfertigung der Hirnschnitte

Vorbereitungen

Zu den Vorbereitungen gehörte die Herstellung einer Agarose-Plattform, zur

späteren Fixierung des Hirnblockes. Nach Aushärtung konnte ein ca. 2x2 cm

großer Block mit dem Skalpell entfernt werden. In der Plattform wurde eine

Aussparung von 8x8 mm gesetzt und mittels Sekundenkleber auf einer

Plexiglasscheibe in Längsrichtung fixiert.

Um einen frühzeitigen Zelltod zu verhindern, musste das Gewebe während der

Zeitspanne von der Freilegung bis zur Daueraufbewahrung der Hirnschnitte in

seinem Metabolismus heruntergeregelt werden, womit die Gefahr der

Nervenzell-Läsionen durch Anoxie so gering wie möglich gehalten wurde.

Deshalb wurde ein Teil, der in Kapitel 2.1 hergestellten Lösung, das benötigte

Präparationsbesteck, sowie die Sezierfläche (Metallzylinder, Rundfilter mit

Markierung zur Schnittführung) für die Herstellung des Hirnblocks auf eine

Temperatur von 4°C mit Eiswasser gekühlt. Zudem musste der Inkubator mit

den Hirnschnitt-Körbchen bestückt, mit aCSF gefüllt und die Begasungseinheit

installiert werden. Dieser wurde dann in ein auf ca. 37°C erhitztes Wasserbad

eingelassen.

Hirnentnahme

Das Versuchstier wurde während der Vorbereitungen in einem separierten

Gehäuse im Labor gehalten. Nachdem diese abgeschlossen waren, wurde das

Versuchstier durch einen gezielten Schlag auf den Thorax ohne Anästhesie,

sowie unter Berücksichtigung des Eigenschutzes, getötet. Anschließend wurde

die Ratte mit einer großen anatomischen Rundschere, knapp hinter den Ohren

dekapitiert. Nach dem Setzen eines Hautschnittes in sagittaler Richtung vom

Foramen magnum entlang der Sutura sagittalis bis zum Nasenbein, konnte die

Kopfhaut beidseitig nach lateral abgezogen werden. Unter Sicht wurden jetzt

etwaige Halswirbel und Nacken- bzw. Rückenmuskulatur entfernt. Bevor die

Material und Methoden - 30 -

Kalotte jedoch mit Hilfe einer Knochenzange zur Seite hin weg gebrochen

werden konnte, mussten noch Hilfsschnitt gesetzt werden: zum einen im

Nasenbein und zum anderen eine Verbindung vom Foramen magnum bis zur

ipsilateralen Orbita einseitig. Dabei war darauf zu achten, dass das Hirngewebe

nicht traumatisiert wurde. Zur endgültigen Entnahme des Gehirns drehte man

den Schädel um, wobei durch die Erdanziehungskraft das Hirn von der Basis

abgehoben wurde und trennte mit einem stumpfen löffelartigen Spatel alle

Verbindungen (Hirnnerven) zur Basis cranii, bis es aus kurzer Höhe selbständig

in das Becherglas mit der gekühlten aCSF fiel. Besondere Aufmerksamkeit

musste dabei den beiden Nn. optici gewidmet werden, denn es galt, einen

ausreichenden Abstand zum Chiasma opticum mit dem hypothalamischen

Zielgebiet einzuhalten. Aufgrund hoher Temperaturen im Labor und der

ischämischen Phase war höchste Eile geboten, damit das spätere

Versuchsobjekt nicht allzu sehr geschädigt wurde. Die Präparation erfolgte

deshalb innerhalb von 60 bis 130 Sekunden.

Cerebellum

Hypothalamus

Chiasma opticum

Abb. 2.3 Schematische Umrisszeichnung der Gehirnareale einer Ratte in koronaler Ansicht (Paxinos und Watson 1986). Die hervorgehobene Fläche markiert den Bereich des entnommenen Gewebeblocks mit dem Hypothalamus und die in den Versuchen verwendeten Gehirnschnitte mit den Kerngebieten PVN und SON. Daneben ein entnommenes Gehirn, wie es sich post preparationem darstellt (mit schematisierter Schnittfläche).

Material und Methoden - 31 -

Inkubation

Die Inkubation des entnommenen Gehirns (siehe Abb. 2.3) erfolgte in der auf

4°C gekühlten Nährlösung maximaler Begasung (O2/CO2 im Verhältnis 95% zu

5%) für etwa 1 Minute.

Durch die nun folgende Erniedrigung der Temperatur sollte das Gehirn seinen

Metabolismus soweit herunterfahren, damit bei der Anfertigung der Hirnschnitte

die hypoxischen Schäden so gering wie möglich gehalten wurden. Ein weiterer

Vorteil der Abkühlung war nun eine festere Konsistenz, die so eine exaktere

und saubere Präparation ermöglichte.

Anfertigung der Hirnschnitte

Nach Inkubation erfolgte die Anfertigung der Hirnschnitte. Dazu wurde das

Gehirn mit Hilfe eines Netzrahmens atraumatisch aus dem Becherglas

entnommen und mit seiner Basis nach oben auf

den eisgekühlten Metallblock gelegt. Mit einer

entfetteten Rasierklinge wurde das zu

untersuchende Hirnareal, in diesem Fall der

Hypothalamus herausgeschnitten. Die Schnitt-

führung erfolgte nach folgenden markanten

Punkten: zwei sagittale Schnitte jeweils 3 mm

lateral der Medianlinie, ein Frontalschnitt 1 mm

rostral des Chiasma opticum und einem

Frontalschnitt in Höhe der Pons. Dabei musste

unbedingt auf eine zur Unterlage senkrechte

Schnittführung geachtet werden. Zentriert,

zwischen den beiden Markierungen auf dem

Filterpapier wurde beidseits überstehendes

Gewebe entfernt. Nach Drehung des Hirnblockes konnte unter Sicht auf das

Chiasma opticum problemlos der Block erneut im Kortex-Bereich reduziert

werden. Als Ergebnis erhielt man einen festen Quader aus Hirnmasse mit einer

Abb. 2.4 Hirnblock in der Agarose-Stabilisierung.

Material und Methoden - 32 -

Grundfläche von 8x8 mm. Mittels Backenpinzette konnte der Quader in die

Aussparung des Agarose-Blockes gesetzt werden (s. Abb. 2.4). Die

Befestigung erfolgte mit Gewebekleber (Histoacryl®, blau, Firma BRAUN,

Melsungen, BRD) auf der Plexiglasplatte. Dabei zeigte das Chiasma opticum

nach oben und die Hypothalamus-Linse befand sich an der vorderen Öffnung.

Die Plexiglasplatte wurde in den Vibratom-Aufsatz gespannt, so dass die

Hypothalamus-Linse parallel in Richtung Rasierklinge zeigte. Nach diesen

Vorbereitungen konnten nun die Frontalschnitte hergestellt werden. Mit dem

Vibratom (Vibracut, Firma

FTB, Bensheim, BRD) wurden

die Hirnschnitte (Slices) in der

Frontalebene im Abstand von

400 µm gelegt, bei

gleichzeitiger Umspülung mit

der gekühlten und oxy-

genierten Nährlösung (siehe

Abb. 2.5). Zuvor wurde die, in

einem Winkel von 13°

eingespannte Rasierklinge mit

2-Propanol entfettet.

Abb. 2.5 Anfertigung der Hirnschnitte mit dem Vibratom.

Anschließend inkubierten die Hirnschnitte erneut für eine Stunde, jeweils verteilt

auf 10 Acrylbehälter mit Nylonnetz-Boden bei ausreichendem Sauerstoff- und

Nährstoff-Angebot. Die Nährlösung unterlag einem kontinuierlichen

Temperaturanstieg bis auf 35°C innerhalb dieser Stunde.

Durch zügiges Präparieren und möglichst intensiver Kühlung des Gewebes

konnten hypoxische Schäden nahezu vermieden werden und somit war eine

neuronale Aktivität auch nach einer 24-stündigen Inkubation noch zu messen.

Material und Methoden - 33 -

2.3 Versuchsdurchführung: Der Messstand

Ableitkammer und Hirnschnittversorgung

Die in dieser Arbeit beschriebenen extrazellulären Ableitungen im PVN und

SON der Ratte wurden in einer selbst konzipierten Ableitkammer durchgeführt,

in der die Schnitte vollständig in der Superfusionslösung lagen (s. Abb. 2.6).

Die Wände der Ableitkammer bestanden aus einem aufgesteckten

Kunststoffaufsatz und der Boden wurde von einem Platinblech gebildet,

welches die Thermoden-Oberfläche

bedeckte. Diese Thermode

erlaubte es, thermische Reize

unterschiedlichster Form (rampen-

/sinusförmig, Änderungsgeschwin-

digkeit 0,0001 bis 10°C/s) und

Größe definiert und reproduzierbar

über den Rampengenerator zu

applizieren. Die thermische

Reizung der Hirnschnittpräparate,

die direkt auf der Thermoden-

Oberfläche platziert und mit

Platinringen stabilisiert wurden, erfolgte als Kontaktwärmereizung. Die

Thermode basierte auf einem Eiswasser/Heizwendel-Antagonismus, gesteuert

über ein Kupfer/Konstantan-Thermoelement (Durchmesser: 0,5 mm), welches

als Fühler, unterhalb der Platinoberfläche, den Istwert (= aktuelle

Oberflächentemperatur) direkt an den Regler weitergab. Dieser steuerte die

Thermode über die Heizwicklungen innerhalb der Thermode, bezogen auf die

vorher eingestellte Solltemperatur. Als Gegenspieler diente die mit 5-10°C

durchspülte Kühlspirale. Der in Abbildung 2.7 gezeigte aCSF-Zufluss erlangte

über direkten Kontakt mit der Thermoden-Oberfläche noch vor Eintritt ins

Kammerlumen die Solltemperatur und wurde über eine Rollerpumpe mit einer

Geschwindigkeit von 1-2 ml/min geregelt. Bei einem maximalen

Kammerfüllungsvolumen von 0,5 ml ergab sich bei einem Zufluss von 2 ml/min

Abb. 2.6 Die Ableitkammer mit der Thermode.

Material und Methoden - 34 -

ein viermaliger Austausch des gesamten Kammervolumens pro Minute.

Dadurch war eine ausreichende Nährstoff- und Sauerstoff-Versorgung

gewährleistet. Auch die Testsubstanzen wurden so schnell herangeführt;

Auswertungsfehler, aufgrund unterschiedlicher Konzentrationen in der

Ableitkammer waren nicht zu erwarten.

Material und Methoden - 35 -

Abb. 2.7 Schematische Darstellung der Ableitkammer mit Thermode und deren Komponenten.

Material und Methoden - 36 -

Elektroden

Als Elektroden zur Ableitung der spontanen Neuronenaktivität dienten

Glaskapillar-Elektroden aus Borosilikatglas, welche mit einem Filament

versehen waren. Ihr Außendurchmesser betrug 1,5 mm; der Innendurchmesser

0,86 mm. Damit besaßen die Elektroden eine Wanddicke von 0,32 mm.

Zur Herstellung dieser, wurden Kapillarrohlinge mit einer Länge von 100 mm

der Firma CLARK Electromedical Instruments, UK, Produkt GC150F-10

verwendet. Der Rohling wurde in einem Flaming/Brown Micropipette Puller P-87

befestigt und über ein vorgegebenes Programm in der Mitte angeschmolzen,

bei gleichzeitigem Zug von beiden Seiten. Nach kurzer Zeit entstanden

schließlich zwei Spitzen, aus denen dann die Glaskapillaren resultierten.

Grundvoraussetzung für beste Messergebnisse waren optimierte

Elektrodeneigenschaften, bedingt durch das Puller-Programm. Die Elektroden

hatten eine Impedanz zwischen 3,5 und 4,5 Megaohm. Durch das Vorliegen

unterschiedlicher Widerstände konnten nun einerseits wenig-selektive

niederohmige Elektroden zur Registrierung niedrigere Amplituden, als auch

andererseits hochohmige Elektroden für die endgültige Registrierung einzelner

Nervenzellen verwendet werden.

Registrierung und Signalerfassung

Nach Inkubation wurde ein Hirnschnitt mit einer Pipette in die Ableitkammer

überführt, wo er erneut für ca. 5 Minuten bei 37°C inkubierte. Anschließend

wurde mittels Mikromanipulator (MO-150, Narishige, Tokyo) die

Elektrodenspitze in das Zielkerngebiet vorgeschoben. Dabei war darauf zu

achten, dass diese von Schnittober- bis zur Schnittunterseite hindurchgefahren

wurde, bis neuronale Aktivität zu erkennen war, die sich über den Lautsprecher

akustisch vom Rauschen abhob. Optisch konnte die Einführung der

Elektrodenspitze unter einem Stereo-Zoom-Binokular (SZ40, Olympus, Tokyo)

beobachtet werden. Eine grobe Orientierung lieferte die klare Abgrenzung des

SON als hell-granuläre Region gegenüber dem dunklen Umfeld und die

Material und Methoden - 37 -

eindeutige anatomisch-topographische Beziehung zum Chiasma

opticum/Tractus opticus, sowie die Lage des PVN zum Ventrikel.

Zu Beginn der Versuche war jedoch die neuronale Spontanaktivität eher etwas

herabgesetzt (Adaptationsphase), die sich aber nach einiger Zeit wieder

besserte. In einer Arbeit von Silva et al. von 1983 wird von einem leichten

Rückgang des Hirnschnitt-Sauerstoffverbrauchs in den ersten zwei Stunden der

Inkubation berichtet. Nach diesen zwei Stunden der Inkubation sei der

Sauerstoffverbrauch aber in allen Fällen wieder auf Normalniveau angestiegen.

Die Registrierung extrazellulärer Zellaktivität setzte einen hohen

Eingangswiderstand voraus, da die zu messenden Ströme im Vergleich zu

intrazellulären Ableitungen nochmals um mindestens eine Zehnerpotenz

niedriger lagen („Impedanzwandlung“). Somit wurden auch Rauschsignale und

andere Störungen mitverstärkt. Um diesem entgegenzuwirken, musste das

Ableitsystem mit Hilfe eines Faradayschen Käfigs abgeschirmt werden.

Die Elektrode vermittelte die gemessenen Aktionspotentiale zunächst an einen

Vorverstärker (10000-fach) mit einem 0,3 bis 3 KHz-Bandpassfilter, dann weiter

zu einem Verstärker DAM 80 mit 50 Hz-Filter. Dieses Signal wurde sowohl

visuell auf einem digitalen 2-Kanal-Speicher-Oszilloskop (Firma HAMEG mit

Drucker), als auch akustisch auf einem Lautsprecher dargestellt.

Das Originalsignal wurde über einen Impulshöhen-Fensterdiskriminator (Fa.

BM&T, Heidelberg) weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Impulshöhen-

Fensterdiskriminator konnte die untere Amplitudenschwelle festgelegt werden,

um Aktionspotentiale akustisch vom Rauschen zu trennen. Selektierte

Aktionspotentiale wurden umgewandelt und als gleichamplitudige

Rechteckimpulse („Transistor-Transistor-Logik“= TTL) an ein Computerinterface

(HAL-Com, Firma Enghusen, Halstenbek) als Interspike-Zeitintervall-Werte mit

den entsprechenden Analogsignalen (Temperatur, Pharmaka-Applikation)

weitergeleitet. Zusätzlich registrierte der über einen Impuls-Spannungswandler

gesteuerte Linienschreiber (Linseis L6514B, 1 cm/min) die momentane

Entladungsfrequenz und die vom Thermoelement gemessene Temperatur.

Zeitpunkt und Dauer der Substanz-Applikation wurden manuell markiert (siehe

Abb. 2.8). Zudem bestand die Möglichkeit über den Bandrekorder (Tascam

Portastudio 424) neben dem Originalsignal, Analogsignale und

Versuchskommentare aufzuzeichnen.

Material und Methoden - 38 -

Abb. 2.8 Schematische Übersicht der wichtigsten Systembestandteile zur Registrierung,

Verarbeitung und Speicherung extrazellulär gewonnener neuronaler Aktivität und der applizierten Stimuli.

Material und Methoden - 39 -

2.4 Auswertung und Datendarstellung Die Daten wurden neben dem Schreiber, auch digitalisiert über ein Computer-

System aufgezeichnet. Somit konnte die spätere Auswertung mittels Computer-

Daten (Off-Line) erfolgen.

Über ein Computerinterface (HAL-Com, Firma Enghusen, Halstenbek) wurden

Informationen über Temperatur, die Substanzapplikation und die Neuronen-

Spontanaktivität digitalisiert erfasst und nachfolgend auf der Festplatte

gespeichert. Die vom Fenster-Diskriminator generierten TTL-Signale erhielt der

PC in Form von ID-Daten („interval duration“; gibt den zeitlichen Abstand

zwischen zwei aufeinander folgende TTLs an, also die Pause zwischen zwei

Aktionspotentialen und ist somit umgekehrt proportional der Frequenz). Die

neuronale Entladungsaktivität ließ sich also schon versuchssynchron via

Lautsprecher, zweier Oszilloskope, Schreiber und Computermonitor (Online mit

der Software „Spike 98“ von M. Hirsch und H.A. Braun am Marburger Institut für

Normale und Pathologische Physiologie entwickelt) verfolgen.

Die Ereignisse wurden in Tabellenform gespeichert und die Auswertung erfolgte

mit IGOR Pro (WaveMetrics). Ein weiterer Computer erhielt mit einer Sample-

Frequenz von 50 kHz das original Zell-Signal aus dem Verstärker DAM 80 mit

50 Hz-Filter und Informationen über den Temperaturverlauf aus der

Temperatur-Steuerung. Als Software wurde das eigens hierfür konzipierte

Programm TREC Neuroscience Studio erprobt.

Für die hier vorliegende Arbeit wurden im Wesentlichen folgende graphische

Analyseverfahren eingesetzt:

- Auftragung der Intervalldauer zwischen zwei Aktionspotentialen gegen

die Zeit (ID-Plot oder Intervallpunktkurve).

- Auftragung der Frequenzwerte gegen die Zeit als Peristimulus-Zeit-

Histogramm (Frequenzpunktkurve).

- Auftragung der aktuellen Temperatur in der Versuchskammer (konstant,

rampen-/sinusförmig).

- Auftragung der Substanz-Applikationsdauer.

Material und Methoden - 40 -

Weiterhin von Bedeutung war die Entladungscharakteristik der Neurone aus

dem PVN und SON, aufgrund der in der Literatur beschriebenen funktionellen

Relevanz des Entladungsverhaltens für die Art und Menge des freigesetzten

Neuropeptids (siehe Kapitel 1.1.2). Deshalb wurde die neuronale elektrische

Aktivität mittels einer im Labor entwickelten Auswerte-Software analysiert und

eine Einteilung in kontinuierliche und phasische Entladungsmuster verwendet.

Kontinuierliche Entladungen zeigten entweder mehr oder weniger gleiche

Abstände zwischen allen Aktionspotentialen (= regelmäßig) oder weniger

einheitliche Intervalle (= unregelmäßig). Demgegenüber standen phasisch

entladende Neurone, bei denen sich Phasen hochfrequenter

Gruppenentladungen (Bursts) mit Entladungspausen abwechselten. Zur

Charakterisierung dieser Gruppenentladungen konnten folgende Parameter,

wie in Abb. 2.9 ersichtlich, herangezogen werden (Dewald et al. 2001).

IBI/SB

IBI1...............................IBIn

BD BP

BC

Abb. 2.9 Schematisierte Burstsequenz mit Definition der Burstparameter: - Mittlere Intraburst-Intervalle (IBI) - Burstdauer (BD) - Burstpause (BP) - Spikes pro Burst (SB): Anzahl der Aktionspotentiale innerhalb einer Gruppenentladung - Burstzyklus (BC): Summe aus BD und BP (Zeit von Beginn eines Bursts bis zum Beginn des

nächsten Bursts) - Intraburstfrequenz (IBF): Die Frequenz innerhalb einer Gruppenentladung, errechnet aus

SB/BD; Kehrwert der durchschnittlichen Intervalldauer der Entladung im Burst und somit ein Maß für die Burstverstärkung oder -verminderung.

Ergebnisse - 41 -

3.0 Ergebnisse 3.1 Entladungsverhalten spontanaktiver Neurone des PVN

und SON

Die im Folgenden gezeigten Untersuchungen basierten auf extrazellulären

Registrierungen der Impulsaktivität von 20 Einzelneuronen (Single-Unit), sowie

von 19 Neuronenverbänden (Multi-Unit) des Nucleus paraventricularis (PVN; n=

34) und Nucleus supraopticus (SON; n= 5). Hierzu wurden ca. 203 Hirnschnitte

von 27 juvenilen männlichen Versuchstieren angefertigt. Diese Ableitungen

stellten bereits eine Selektion aus einer weitaus größeren Zahl registrierter

Zellen dar, die jedoch meist aus vorzeitigen Zelltod oder Verlust der

Elektrodennähe zum Neuron aufgrund von Erschütterungen, in dieser Arbeit

nicht zum tragen gekommen sind. Ein weiteres wichtiges Kriterium für die

Durchführung der Experimente war die zeitliche Stabilität der registrierten

Entladungen von spontanaktiven Neuronen, die eine Beständigkeit von

mindestens 30 Minuten zeigen mussten, bevor mit den Untersuchungen

begonnen wurde.

Aufgrund der in der Literatur beschriebenen funktionellen Relevanz des

Entladungsverhaltens für die Art und Menge des freigesetzten Neuropeptids

(siehe Kapitel 1.1.2), wurden die neuronalen elektrischen Aktivitäten mittels

einer im Labor entwickelten Auswerte-Software analysiert, wodurch eine

differenzierte Betrachtung des Entladungsmusters möglich wurde. Das

Spektrum des Entladungsverhaltens der untersuchten Neurone reichte von sehr

regelmäßig-kontinuierlichen Aktionspotentialfolgen bis hin zu phasischen

(„burstenden“) Gruppenentladungen mit nahezu stabilen Burstrhythmus und

-dauer (siehe Abb. 3.1). Kontinuierliche Entladungen zeigten entweder mehr

oder weniger gleiche Abstände zwischen allen Aktionspotentialen

(= regelmäßig) oder weniger einheitliche Intervalle (= unregelmäßig).

Demgegenüber standen phasisch entladende Neurone, bei denen sich Phasen

hochfrequenter Entladungen (Bursts) mit Entladungspausen abwechselten.

Damit waren die Intervalle innerhalb eines Bursts (Intra-Burstintervalle)

Ergebnisse - 42 -

wesentlich kürzer als die Abstände zwischen zwei Bursts (Inter-Burstintervalle

oder Burstpausen). Zusätzlich zeigten sich besonders im SON lang andauernde

phasische Gruppenentladungen mit mehreren hundert Impulsen über einen

Zeitraum von bis zu 1 Minute mit entsprechend langen Pausen.

A

Auffallend war die Tatsache, dass die Entladungsmuster keineswegs einheitlich

und nicht immer eindeutig waren. So reagierten einige Neurone mit zunächst

phasischem Entladungsmuster auf eine Temperaturänderung, indem sie

nunmehr kontinuierlich feuerten. Das gesamte prozentuale Verhältnis von

phasisch und kontinuierlich feuernden Neuronen betrug im PVN 69% zu 23%

und im SON 75% zu 25% (siehe Abb. 3.2).

Abb. 3.1 Schematische Sequenz neuronaler Entladungen (Spikesequenz): regelmäßig-kontinuierlich (A), unregelmäßig-kontinuierlich (B) und phasisch (C). Die horizontale Achse entspricht der Zeitachse, ein senkrechter Strich einem Aktionspotential.

Abb. 3.2 Verteilung der Neurone hinsichtlich ihres Entladungsmusters. Das gesamte prozentuale Verhältnis von phasisch und kontinuierlich feuernden Neuronen betrug im PVN 69% zu 23% und im SON 75% zu 25%.

PVN: phasisch (69%)PVN: kontinuierlich (23%) Nicht klassifizierbar (8%)

B

C

PVN: phasisch (75%)PVN: kontinuierlich (25%) Nicht klassifizierbar (0%)

Ergebnisse - 43 -

Ein Beispiel für ein phasisches, hochfrequent-entladendes Neuron zeigt die

Abbildung 3.3. Hier können eindeutig Burst-Dauer und Burst-Pause

voneinander abgetrennt werden. Durch Zugabe des sinusförmigen

Temperaturstimulus von 37°C±3°C (f= 0,005 Hz) verlängert sich die Burst-

Dauer und die Pausen zwischen diesen; das Entladungsverhalten erhält ein

markanteres Muster.

424038363432Te

mpe

ratu

re [°

C]

1400120010008006004002000Time [sec]

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

]

lc

s [s

e

terv

a

In

40

30

Abb. 3.3 Darstellung eines phasisch, hochfrequent-entladenden Neurons aus dem SON. Oberste Darstellung: Intervall-Dauer-Kurve (ID: intervall duration), welche die Zeiten zwischen zwei Impulsen angibt; Mitte: Frequenzdarstellung in Hertz als Peristimulus-Zeit-Histogramm; Unten: konstanter bzw. sinusförmiger Temperaturstimulus bei 37°C±3°C (f= 0,005 Hz).

20

10

0Freq

uenc

y (m

ean/

sec)

[Hz]

Ergebnisse - 44 -

3.2 Thermosensitivität spontanaktiver Neurone des PVN und SON

Im Mittelpunkt dieser elektrophysiologischen Experimente stand die

Untersuchung des Entladungsverhaltens der Neurone der paraventrikulären

und supraoptischen Kerngebiete (PVN und SON) unter dem Einfluss von

Temperaturreizen.

Die übliche Charakterisierung einer Zelle bezüglich ihrer Thermosensitivität

geschieht durch Ermittlung des Temperaturkoeffizienten (TC). Dieser

Koeffizient (Einheit: Impulse*s-1*°C-1= Hz/°C) definiert sich als

Frequenzänderung [Δ Hz] der Entladung pro Grad Celsius

Temperaturänderung. Positive Werte zeigen eine gleichsinnige Änderung an,

also einen Anstieg der Entladungsrate bei Temperaturerhöhung und sind somit

ein Kriterium für Warmsensitivität. Negative Werte deuten dementsprechend auf

eine gegensinnige Reaktion hin (Frequenzabfall bei Temperaturerhöhung) und

charakterisieren das untersuchte Neuron als kältesensitiv.

Experimentell wurde die Thermode der Versuchskammer (siehe Kapitel 2.3)

über einen Spannungsgenerator gesteuert und rampen-/sinusförmige

Temperaturschwankungen von 37°C±3°C mit einer Frequenz von f= 0,005 Hz

generiert. Das Temperaturmaximum von 40°C simulierte somit einen

pyretischen Zustand (Fieber) des menschlichen Organismus, wo hingegen das

Temperaturminimum von 34°C einen Zustand nach Unterkühlung darstellte.

Von insgesamt 39 ausgewerteten Zellen zeigten 34 Neurone (= 87%) eine

Sensitivität auf Temperaturreize im physiologischen Bereich zwischen 34°C und

41°C. Nur 5 Nervenzellen (= 13%) aus dem PVN oder SON waren

temperaturinsensitiv, das heißt, sie änderten ihr Entladungsmuster nicht in

Abhängigkeit zum appliziertem Temperaturstimulus.

Von den temperatursensitiven, spontanaktiven Nervenzellen zeigten 29 von 34

(= 85%) das Maximum ihrer Entladungsfrequenz im Bereich des

Temperaturmaximums und wurden deshalb als „warmsensitiv“ klassifiziert.

Dagegen zeigten 5 (= 15%), als „kaltsensitiv“ charakterisierte Neurone, ihr

Frequenzmaximum im Bereich des Temperaturminimums (s. Abb. 3.4B+C).

Ergebnisse - 45 -

Abb. 3.4 Beispiele für verschieden temperatursensitive Zellen. A: Mittlere Impulsfrequenz eines temperaturinsensitiven Neurons (oben, blaue Linie) während Applikation eines sinusförmigen Temperaturstimulus zwischen 34°C und 40°C (f= 0,005 Hz, rote Linie unten). Es zeigt sich keine Abhängigkeit der Entladungsrate vom Temperaturstimulus. B: Mittlere Impulsfrequenz eines kaltsensitiven Neurons (oben, blaue Linie) während Applikation eines rampenförmigen Temperaturstimulus zwischen 34°C und 41°C (rote Linie unten). Die höchste Entladungsrate zeigt sich im erniedrigten Temperaturbereich. C: Mittlere Impulsfrequenz eines warmsensitiven Neurons (oben, blaue Linie) während Applikation eines rampenförmigen Temperaturstimulus zwischen 34°C und 41°C (rote Linie unten). Die rampenförmige Temperaturerhöhung (von 37°C auf 41°C) führt zu einem Frequenzanstieg der Entladungsrate.

42

40

38

36

34

32

Temperature [°C]

110010501000950900850800Time [sec]

10

8

6

4

2

A

0

f [Hz]

Freq

uenz

[Hz]

Te

mpe

ratu

r [°C

]

25

20

15

10

5

0

f [Hz]

424038363432

°C

200018001600140012001000sec

42

40

38

36

34

32

Temperature [°C]

12001000800600Time [sec]

8

6

4

2

B

0

f [Hz]

Freq

uenz

[Hz]

Te

mpe

ratu

r [°C

]

C

Freq

uenz

[Hz]

Te

mpe

ratu

r [°C

]

Ergebnisse - 46 -

Die Abbildung 3.4 zeigt je ein Beispiel für verschieden temperatursensitive

Zellen, wobei in Abb. 3.4A ein temperaturinsensitives Neuron dargestellt ist.

Hier sind keine markanten Frequenzänderungen der Entladungen während

eines sinusförmig-verlaufenden Temperaturstimulus zwischen 34°C und 40°C

(f= 0,005 Hz) ersichtlich.

In Abbildung 3.4B ist der Frequenzverlauf der Entladung eines schwach

kaltsensitiven Neurons gezeigt. Die höchste Entladungsfrequenz zeigt sich hier

im niedrigsten Temperaturbereich. Entgegengesetzt verhält sich ein

warmsensitives Neuron (siehe Abb. 3.4C), dessen Entladungsverhalten dem

rampenförmigen Temperaturstimulus folgt. Dabei wird die höchste

Aktionspotentialrate von etwa 15 Hz bei der maximalen Stimulationstemperatur

von 40°C erreicht, während sich das Minimum der Entladungsfrequenz von

etwa 7 Hz auf das Temperaturminimum von 33°C projiziert.

Ein weiteres Beispiel für ein warmsensitives Neuron ist deutlich der Abbildung

3.5 zu entnehmen. Im Vergleich zur Abbildung 3.4A wird während des

Übergangs der konstanten Temperatur von 37°C auf 40°C die mittlere

Entladungsfrequenz der spontanaktiven Hypothalamuszelle von ca. 2,0 Hertz

auf fast 8,0 Hertz erhöht. Die in der ID-Kurve dargestellten Intervallzeiten, d.h.

die Zeiten zwischen den einzelnen Aktionspotentialen, nehmen mit

zunehmender Temperatur ab; die Anzahl der langen Intervalle wird geringer,

während gleichzeitig die der kurzen Intervalle stark zu nimmt. Markant ist

hierbei ein dunkler Streifen aus dicht gebündelten ID-Punkten. Die Zunahme

der Einzelspikes pro Zeit bewirkt den hohen Frequenzanstieg. Diese

Veränderungen sind in der Darstellung der Aktionspotential-Folge über einen

Zeitraum von 2 Sekunden deutlich zu erkennen. Zudem ändert sich neben der

Frequenz auch das Entladungsmuster von einer unregelmäßigen zu einer

gleichmäßig phasischen Entladung während konstant erhöhter Temperatur.

Ergebnisse - 47 -

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

ID

[sec

]

14

Abb. 3.5 Änderung im Entladungsmuster während Temperaturerhöhung bei einem warmsensitiven Neuron aus dem PVN. Oberste Darstellung: Aktionspotentialfolge (Spiketrain) entnommen aus der Ableitung bei 36°C und 38°C; darunter die Intervall-Dauer-Kurve (ID: intervall duration), welche die Zeiten zwischen zwei Impulsen angibt; Mitte: Frequenzdarstellung in Hertz als Peristimulus-Zeit-Histogramm; Unten: Temperaturverlauf. Das Entladungsverhalten dieser Zelle ändert sich von unregelmäßiger Entladung bei 36°C zu phasischem Impulsmuster bei 38°C.

42

40

38

12

10

8

6

36

34

32

T [°

C]

1000900800700600t [sec]

4

2

0

f [H

z]

1 s

36°C 38°C

Ergebnisse - 48 -

Um einen Hinweis auf die Stärke ihrer Temperatursensitivität zu bekommen,

wurde von 29 als warmsensitiv klassifizierten Neuronen der

Temperaturkoeffizient (TC) ermittelt, das heißt die Änderung der Entladungsrate

pro Grad Temperaturänderung bestimmt (bei sinusförmigen

Temperaturverläufen wurde der TC zum Zeitpunkt der maximalen

Temperaturänderung errechnet). Das Ergebnis dieser Untersuchung ist als

Verteilungs-Histogramm in Abbildung 3.6 gezeigt: Gut 2/3 der Neurone

besaßen einen Temperaturkoeffizienten von 0,2-0,6 Hz/°C, während 6 von 29

Neuronen mit TC-Werten von >0,9 Hz/°C als sehr stark temperatursensitiv

klassifiziert werden konnten.

012345678

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 > 1,0

Neurone mit einem TC <0,2 Hz/°C

Neurone mit einem TC von 0,2-0,6 Hz/°C

Neurone mit einem TC >0,6 Hz/°C

Anz

ahl d

er N

euro

ne

Temperaturkoeffizient [Impulse*s-1*°C-1= Hz/°C]

Abb. 3.6 Verteilungs-Histogramm der Temperaturkoeffizienten für als warmsensitiv klassifizierte Neuronen des PVN und SON: Die Abszisse zeigt jeweils 0,1 Impulse*s-1*°C-1= Hz/°C; die Ordinate die Anzahl der Zellen in diesem Bereich. Gut 2/3 der Neurone besaßen einen Temperaturkoeffizienten von 0,2-0,6 Hz/°C (blau), während 6 von 29 Neuronen mit TC-Werten von >0,9 Hz/°C (rot) als sehr stark temperatursensitiv klassifiziert werden konnten.

Ergebnisse - 49 -

3.3 Wirkung von Phenylephrin auf Neurone des PVN und SON

Es ist bekannt, dass noradrenerge Afferenzen v.a. aus den A1- und A2-Kernen

der Medulla oblongata direkt auf magnozelluläre Neurone der

hypothalamischen Kerngebiete PVN und SON projizieren (Alonso and

Assenmacher 1984, Day and Renaud 1984, Raby and Renaud 1989). Um den

noradrenergen Einfluss auf die Aktivität spontanaktiver Neurone in diesen

Kerngebieten unter physiologischen Temperaturbedingungen zu untersuchen,

wurde der noradrenerge α1-Rezeptor-Agonist Phenylephrin (PHE) während

konstanten Temperaturen von 37°C, bzw. sinusförmigen Temperaturverläufen

zwischen 34°C und 40°C (f= 0,005 Hz) appliziert.

3.3.1. Phenylephrin-Effekte bei konstanter Temperatur Bei einer konstanten Bad-Temperatur von 37°C wurde der klassische

noradrenerge α1-Rezeptor-Agonist Phenylephrin (PHE) in Konzentrationen von

2-11 µM auf 23 Neurone des PVN, sowie ein Neuron des SON appliziert, wobei

sich alle untersuchten Nervenzellen zum Zeitpunkt der PHE-Applikation in einer

stabilen Ableitung befanden. Die Applikation des Pharmakons erfolgte dabei

derart, dass PHE in der jeweiligen Konzentration der normalen, die

untersuchten Schnittpräparate überspülenden Badlösung (aCSF) beigefügt und

schließlich nach Applikationsende wieder ausgewaschen wurde.

Der überwiegende Teil der untersuchten Nervenzellen, nämlich 18 von 24

(75%), antwortete auf PHE mit einer Erhöhung der Entladungsfrequenz von bis

zu 400% gegenüber dem Aktivitätszustand vor Gabe des noradrenergen

Agonisten. Die exzitatorische Wirkung von 5 µM PHE ist exemplarisch in

Abbildung 3.7 gezeigt: Bei konstanter Temperatur von 37°C zeigt das

untersuchte Neuron eine spontane und kontinuierliche Entladung mit schnellem

Burstzyklus und relativ kurzen Burstpausen (8-12 Impulse/s). Nach Gabe von 5

µM Phenylephrin nehmen die Spikes pro Burst (14-20 Impulse/s) deutlich zu,

d.h. das Neuron zeigt hochfrequente Entladungsraten, die sich durch die kürzer

werdenden Intervallzeiten zwischen den Einzelimpulsen erklären.

Ergebnisse - 50 -

20

10

0

]

F [im

p/s

Phenylephrine (5 µM)

400 8000

Time [s]1200 1600

Abb. 3.7 Exzitatorische Wirkung von Phenylephrin (5 µM) auf ein Neuron im N. paraventricularis bei konstanter Temperatur von 37°C. Die Perfusionsdauer ist untenstehend mit einem Balken markiert.

Die exzitatorische Wirkung von Phenylephrin trat meist sofort ein und war

reversibel, dass heißt die untersuchten Neurone zeigten in den meisten Fällen

nach Beendigung der Substanz-Applikation wieder Entladungsmuster und

-raten wie vor der PHE-Gabe.

Doch war die PHE-Wirkung auf die untersuchten Neurone nicht immer

exzitatorischer Natur: In vier Fällen führte eine Phenylephrin-Gabe zu keiner

erkennbaren Veränderung des Frequenzmusters, während zwei Neurone mit

einer Abnahme der Frequenz auf Phenylephrin-Gabe reagierten (jeweilige

Daten nicht gezeigt).

Eine Aufschlüsselung dieser Versuchsreihe zeigt die Abbildung 3.8. Es erfolgte

eine Einteilung der hypothalamischen Neurone (n= 24) nach ihrem zuvor

bestimmten Temperaturkoeffizienten in 3 Gruppen (TC <0,2 Hz/°C, TC 0,2-0,6

Hz/°C und TC >0,6 Hz/°C). Die Applikation von Phenylephrin führt zu einem

deutlichen Anstieg der Entladungsfrequenz bei fast 80% der untersuchten

Neurone. Nur 15% der Neurone zeigten keine Veränderung ihrer Aktivität; 5%

der Zellen reagierten mit einem Rückgang auf PHE bei konstanter Temperatur.

Besonders auffallend ist die Tatsache, dass alle Neurone (= 100%) der Gruppe

mit einem TC >0,6 Hz/°C auf den α1-Agonisten Phenylephrin mit einem Anstieg

Ergebnisse - 51 -

ihrer Entladungsaktivität reagierten. Eine Frequenzabnahme zeigten nur

Neurone mit einem Temperaturkoeffizienten (TC) <0,2 Hz/°C.

ihrer Entladungsaktivität reagierten. Eine Frequenzabnahme zeigten nur

Neurone mit einem Temperaturkoeffizienten (TC) <0,2 Hz/°C.

Impulse*s-1*°C-1= Hz/°C

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Frequenz-Zunahme Frequenz-Abnahme Keine Veränderung

A

nzah

l der

Neu

rone

in P

roze

nt (%

)

TC <0,2 TC 0,2-0,6 TC >0,6 Gesamt

Abb. 3.8 Frequenzveränderung durch Phenylephrin bei konstanter Temperatur (37°C). Es erfolgte eine Einteilung der hypothalamischen Neurone (n= 24) nach ihrem zuvor bestimmten Temperaturkoeffizienten in 3 Gruppen (TC <0,2 Hz/°C, TC 0,2-0,6 Hz/°C und TC >0,6 Hz/°C). Die Applikation von Phenylephrin führt zu einem deutlichen Anstieg der Entladungsfrequenz bei fast 80% der untersuchten Neurone. Nur 15% der Neurone zeigten keine Veränderung ihrer Aktivität; 5% der Zellen reagierten mit einem Rückgang auf PHE bei konstanter Temperatur. Besonders auffallend ist die Tatsache, dass alle Neurone (= 100%) der Gruppe mit einem TC >0,6 Hz/°C auf den α1-Agonisten Phenylephrin mit einem Anstieg ihrer Entladungsaktivität reagierten. Eine Frequenzabnahme zeigten nur Neurone mit einem Temperaturkoeffizienten (TC) <0,2 Hz/°C.

Ein weiteres Beispiel für einen markanten Phenylephrin-Effekt bei einer

konstanten Temperatur (37°C) zeigt die Abbildung 3.9. Auch hier antwortete

das abgeleitete Neuron auf eine Superfusion mit 10 µM PHE mit einer

exzessiven Frequenzzunahme seiner Entladung von 2 auf bis zu 5 Hz. Nach

Beendigung der Applikation und Ausschwemmen des noradrenergen α1-

Rezeptor-Agonisten durch die normale Badlösung, zeigte sich die Reversibilität

der PHE-Wirkung, da nun wieder Entladungsraten wie vor PHE-Gabe erreicht

wurden. Auch bei einer wiederholten Zugabe von Phenylephrin reagierte das

gezeigte Neuron mit einer Frequenz-Zunahme von Aktionspotentialen, die

jedoch nicht ganz so stark ausfiel wie bei der ersten PHE-Gabe.

Ein weiteres Beispiel für einen markanten Phenylephrin-Effekt bei einer

konstanten Temperatur (37°C) zeigt die Abbildung 3.9. Auch hier antwortete

das abgeleitete Neuron auf eine Superfusion mit 10 µM PHE mit einer

exzessiven Frequenzzunahme seiner Entladung von 2 auf bis zu 5 Hz. Nach

Beendigung der Applikation und Ausschwemmen des noradrenergen α1-

Rezeptor-Agonisten durch die normale Badlösung, zeigte sich die Reversibilität

der PHE-Wirkung, da nun wieder Entladungsraten wie vor PHE-Gabe erreicht

wurden. Auch bei einer wiederholten Zugabe von Phenylephrin reagierte das

gezeigte Neuron mit einer Frequenz-Zunahme von Aktionspotentialen, die

jedoch nicht ganz so stark ausfiel wie bei der ersten PHE-Gabe.

Ergebnisse - 52 -

2.5

Die Wirkung von PHE auf die Aktivitätsraten und -muster der untersuchten

Neurone war jedoch nicht immer einheitlich. Einige Neurone antworteten auf

PHE-Gabe mit einer Verkürzung der Burstpausen, ohne dass es jedoch zu

einer Veränderung des Burstverhaltens kam. In anderen Fällen konnte zudem

eine deutliche Frequenzsteigerung beobachtet werden, ohne dass eine

nennenswerte Änderung des Entladungsmusters verzeichnet werden konnte.

Hinsichtlich des Antwortverhaltens der untersuchten Neurone auf PHE-Gabe

spielte die Konzentration, in der der noradrenerge α1-Rezeptor-Agonist

appliziert wurde, keine entscheidende Rolle.

Abb. 3.9 Typische Frequenzzunahme durch Phenylephrin in einer Konzentration von 10 µM, am Beispiel eines regelmäßig entladenen Neurons des Nucleus paraventricularis. Obere Kurve: Darstellung der Intervall-Dauer in ms; mittlere Kurve: Frequenzkurve in Hertz; untere Kurve: Temperaturverlauf (konstante 37°C). Nach Beendigung der Applikation und Ausschwemmen des noradrenergen α1-Rezeptor-Agonisten durch die normale Badlösung, zeigte sich die Reversibilität der PHE-Wirkung.

40

38

36

34

T [°

C]

140012001000800600400Time [sec]

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

Inte

rval

s [s

ec]

8

6

4

2

0

f [H

z]

Phenylephrine 10 µM Phenylephrine 10 µMPHE 10 µM PHE 10 µM

400 600 800 1000 1200 1400

Ergebnisse - 53 -

3.3.2. Phenylephrin-Effekte bei sinusförmigen Temperaturwechseln In diesem Versuchsblock wurden die Zellen zwei Stimuli ausgesetzt. Wie

bereits zuvor beschrieben, besitzen die hypothalamischen Neurone zum

größten Teil temperatursensitive Eigenschaften und stellen eine wichtige

Einheit zur Steuerung der Homöostase dar. Infolge von Temperaturreizen

reagieren sie mit einer Veränderung im Entladungsverhalten.

Um zu untersuchen, welchen Einfluss Phenylephrin auf die

Temperatursensitivität von Neuronen aus den hypothalamischen Kerngebieten

PVN und SON hat, wurde diese Substanz in einem weiteren

Untersuchungsansatz parallel zu sinusförmigen Temperaturreizen (37°C±3°C,

f= 0,005 Hz) appliziert.

Die Zugabe des noradrenergen α1-Agonisten Phenylephrin (2-10 µM) resultierte

bei den meisten der untersuchten Neurone ein Anstieg der Entladungs-

Frequenz von bis zu 400% des Ausgangwertes während Phasen ansteigender

Temperatur oder nahe des Temperaturmaximums, bei gleichzeitiger

Verlangsamung der Entladungsfrequenz während niedriger Temperaturen

(s. Abb. 3.12 und 3.13). Dies führte bei 12 von 21 untersuchten warmsensitiven

Neuronen zu einem deutlichen Anstieg des Temperaturkoeffizienten (TC) im

Vergleich zum TC-Ausgangswert vor Applikation von PHE. In 6 Fällen führte

eine Stimulierung sogar zu TC-Werten über 0,8 Hz/°C. Die Abbildung 3.11 zeigt

eine Aufschlüsselung aller Neurone in Bezug zu ihrem TC-Wert vor

Phenylephrin-Gabe (Abszisse) und unter Einfluss des α1-Agonisten (Ordinate).

Die Grafik zeigt deutlich, dass die Applikation von PHE bei der Mehrzahl der

Neurone (n= 12) zu einer Erhöhung der Temperatursensitivität führt (Neurone

bzw. Punkte oberhalb der Winkelhalbierenden). Nur bei wenigen der

untersuchten Nervenzellen hatte PHE kaum (n= 5) oder keinen Einfluss auf

deren Temperatursensitivität (n= 3). Lediglich ein Neuron zeigte unter PHE eine

verminderte Temperatursensitivität (n= 1; Neuron bzw. Punkt unterhalb der

Winkelhalbierenden).

Ergebnisse - 54 -

Abb. 3.10 Aufschlüsselung aller Neurone in Bezug zu ihrem TC-Wert vor Phenylephrin-Gabe (Abszisse) und unter Einfluss des α1-Agonisten (Ordinate). Die Grafik zeigt deutlich, dass die Applikation von PHE bei der Mehrzahl der Neurone (n= 12) zu einer Erhöhung der Temperatursensitivität führt (Neurone bzw. Punkte oberhalb der Winkelhalbierenden). Nur bei wenigen der untersuchten Nervenzellen hatte PHE kaum (n= 5) oder keinen Einfluss auf deren Temperatursensitivität (n= 3). Lediglich ein Neuron zeigte unter PHE eine verminderte Temperatursensitivität (n= 1; Neuron bzw. Punkt unterhalb der Winkelhalbierenden).

Ein Beispiel aus der Praxis für eine Erhöhung des Temperaturkoeffizienten

zeigt die Abbildung 3.11. Vor Phenylephrin-Applikation verlaufen der

sinusförmige Temperaturstimulus und die Entladungsfrequenz parallel

zueinander. Eine genaue Abgrenzung ist jedoch nicht eindeutig. Im Gegensatz

dazu, folgt nach Applikation von Phenylephrin 10 µM bekanntermaßen eine

Erhöhung der mittleren Frequenz, sowie eine Zunahme der

Temperatursensitivität. Nun projiziert sich folglich das Temperaturmaximum

eindeutig auf das Entladungsmaximum und das Frequenzminimum fällt

dementsprechend in den Bereich der niedrigen Temperaturen. Verdeutlicht wird

dieser Effekt zudem in der Intervall-Dauer-Kurve. Merklich verkürzt erscheinen

die Abstände zwischen den Impulsen (schwarzes Band), während der

Phenylephrin-Applikation. Zuvor zeigten sich nur vereinzelte ID-Punkte,

vornehmlich im Bereich des Temperaturmaximums.

Genauere Analysen des Antwortverhaltens der untersuchten Neurone vor,

während und nach Gabe von PHE unter dem Einfluss sinusförmiger

Temperaturverläufe zeigten, warum es bei vielen dieser Zellen zu TC-

Ergebnisse - 55 -

Änderungen kommt. Wie schon in Kapitel 3.2 erwähnt, folgen die meisten

warmsensitiven Zellen in ihrem Entladungsverhalten den sinusförmig

verlaufenden Temperaturreizen, d.h. sie zeigen maximale Aktions-

potentialfrequenz im Bereich des Temperaturmaximums und minimale

Entladungsraten während niedriger Temperaturphasen (s. Abb. 3.11 und 3.12).

Dieses temperaturgesteuerte Verhalten wird unter dem Einfluss von 10 µM PHE

verstärkt, d.h. die Impulsraten während maximalen Temperaturen sind

gegenüber dem pharmakologisch unbehandelten Zustand nochmals erhöht und

während minimaler Temperaturen stark erniedrigt oder sogar Null (s. Abb.

3.12). In einer Phase des sinusförmigen Temperaturstimulus erhöht sich unter

10 µM PHE somit die Änderung der Impulsrate pro Temperaturänderung und

damit definitionsgemäß der Temperaturkoeffizient.

Dass die beschriebenen PHE-Effekte tatsächlich über noradrenerge α1-

Rezeptoren vermittelt werden, zeigen Versuche, in denen PHE zusammen mit

dem spezifischen α1-Rezeptor-Antagonisten Prazosin (PRA) appliziert wurde.

Wie aus der untenstehenden Abbildung 3.12 zu entnehmen ist, führte die

alleinige Applikation von Phenylephrin (10 µM), während gleichzeitiger

Applikation eines sinusförmigen Temperaturstimulus von 37°C±3°C (f= 0,005

Hz) am Temperaturmaximum zu einem deutlichen Anstieg der

Entladungsfrequenz von 2-4 Hz auf 6-8 Hz. Da dieser Effekt reversibel war,

wurde ca. 600 Sekunden nach Applikationsende wieder die Ausgangslage

erreicht, d.h. das Entladungsverhalten des untersuchten Neurons entsprach

wieder dem Zustand vor PHE-Applikation. Bei einer erneuten Applikation von

10 µM Phenylephrin in Kombination mit 10 µM Prazosin zeigte sich dagegen

typischerweise eine generelle, d.h. temperaturunabhängige geringe Ver-

ringerung der Entladungsfrequenz, d.h. das zuvor temperatursensitive Neuron

wurde unter dem Einfluss des α1-Rezeptor-Antagonisten Prazosin deutlich

temperaturinsensitiver. Diese Wirkung hatte PRA auch auf andere untersuchte

Nervenzellen, wobei beobachtet werden konnte, dass in Verbindung mit

Phenylephrin der hemmende Effekt geringer ausgeprägt war, als bei alleiniger

Prazosin-Applikation (Daten nicht gezeigt). Nach Beendigung der Superfusion

der Schnittpräparate mit Prazosin oder PHE+PRA zeigten alle untersuchten

Neurone nahezu ihr ursprüngliches temperatursensitives Verhalten, d.h. die α1-

antagonistische Wirkung war weitgehend reversibel (s. Abb. 3.12).

Ergebnisse - 56 -

424038363432

T[°C

]

4000350030002500200015001000500t [sec]

12

10

8

6

4

2

0

f [H

z]

PHE (10µM) PHE + PRA (10µM)

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

ID [s

ec]

Abb. 3.11 Änderung im Entladungsmuster während Applikation von Phenylephrin (10 µM) und von Phenylephrin/Prazosin (10 µM) bei einem warmsensitiven Neuron aus dem PVN. Oberste Darstellung: Intervall-Dauer-Kurve (ID: intervall duration), welche die Zeiten zwischen zwei Impulsen angibt; Mittlere Darstellung: Frequenzdarstellung in Hertz als Peristimulus-Zeit-Histogramm; Unten: Sinusförmiger Temperaturverlauf bei 37°C±3°C (f= 0,005 Hz). Klar ersichtlich ist auch die sukzessive Verlängerung der Intervalldauer zwischen den einzelnen Aktionspotentialen während der Superfusion mit Prazosin. Dies zeigt sich als ein weit gestreutes Feld weniger Punkte. Nachdem der Antagonist wieder abgesetzt worden ist, wird zudem auch die Intervalldauer zwischen den einzelnen Aktionspotentialen wieder kürzer; das Neuron nimmt wieder seine ursprüngliche spontane Aktivität auf.

Ergebnisse - 57 -

40

38

36

34

T [°

C]

10

8

6

4

2

0

F [im

p/s]

10

8

6

4

2

0

F [im

p/s]

10

8

6

4

2

0

F [im

p/s]

40

38

36

34

T [°

C]

40

38

36

34

T [°

C]

A (control) B (PHE) C (PHE+PRA)

Abb. 3.12 Veränderung der Entladungsfrequenz eines warmsensitiven Neurons vor, bzw. während Applikation von PHE (10 µM) und PHE/PRA (10 µM) über einen Zeitraum von einer Periode des sinusförmigen Temperaturreizes (37°C±3°C, f= 0,005 Hz). A: Als warmsensitives Neuron zeigt sich ein Entladungsverhalten gemäß dem sinusförmigen Temperaturstimulus. B: Unter Applikation von 10 µM PHE folgt eine deutliche Zunahme der Entladungsfrequenz während des sinusförmigen Temperaturreizes. C: Die Kombination von PHE mit seinem Antagonisten PRA (10 µM) bewirkt keine Veränderung des Entladungsverhaltens unter dem Temperaturstimulus.

Die hemmende und temperaturinsensitivierende Wirkung von PRA zeigt sich

auch in einer Verringerung des Temperaturkoeffizienten. Zusammenfassend ist

das in der Abbildung 3.13 gezeigt, in der die Veränderung des durch PRA-

Applikation bei den 10 derart untersuchten Neuronen dargestellt ist. Bei 3

Neuronen führte die Applikation von 10 µM PRA bzw. 10 µM PHE+PRA zu

einer leichten, bei 3 anderen Zellen zu einer deutlichen Abnahme des TC.

Das Ausmaß der Gesamt-Veränderung der Temperaturkoeffizienten zeigt sich

im Verhältnis der Ausgangswerte zu den TC-Werten nach Applikation von PRA.

Im Durchschnitt verdoppelte sich der TC-Wert nach Applikation von PHE,

Ergebnisse - 58 -

während PRA zu einer direkten Erniedrigung der Thermosensitivität, manchmal

sogar auf die Hälfte des Ausgangswertes, führte.

1.2

Abb. 3.13 Veränderung des Temperaturkoeffizienten unter Applikation von Prazosin bei den 10 derart untersuchten Neuronen. Bei 3 Neuronen führte die Applikation von 10 µM PRA bzw. 10 µM PHE+PRA zu einer leichten, bei 3 anderen Zellen zu einer deutlichen Abnahme des TC. 4 Neurone zeigten keine, bzw. kaum merkliche TC-Veränderungen durch PRA.

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

TC(P

ra) [i

mp

s-1°C

-1]

0.2 0.4 0.6 0.80.0

TC(control) [imp s-1°C-1]

1.0 1.2

Ergebnisse - 59 -

Phenylephrin-ON-OFF-Effekt Neben den bereits oben erwähnten Auswirkungen des α1-Agonisten

Phenylephrin, zeigte sich bei einigen Neuronen (n= 5) eine derartige Wirkung

bei sinusförmigen Temperatur-Stimuli, dass es zu einem On-Off-Effekt kam.

Dieser Effekt wurde bei 5 Neuronen aus dem Nucleus paraventricularis

beobachtet, die alle warmsensitiv auf einen sinusförmigen Temperaturstimulus

von 37°C (±3°C; f= 0,005 Hz) reagierten. Bei diesen Zellen betrug die spontane

Entladungsfrequenz am Temperaturmaximum durchschnittlich 4,4 Hz; am

Temperaturminimum durchschnittlich 1 Hz.

Durch Phenylephrin-Gabe (10 µM) wurden die spontanaktiven Neurone bei

Einwirkung von hohen Temperaturen im Bereich des Temperaturmaximums

erheblich aktiviert, wobei die Entladungsfrequenz im zeitlichen Verlauf dieses

Phasenbereiches des Temperatursinus die Form eines Plateaus annahm (s.

Abb. 3.14 und 3.15). Dagegen stellten die Neurone ihre Aktivität an einem

gewissen Punkt des absteigenden sinusförmigen Temperaturverlaufes

weitgehend ein. Erst beim Überschreiten der Temperaturschwelle von ca. 37°C

war der Temperaturreiz wieder stark genug und die Zellen nahmen ihre Aktivität

wieder in dem bekannten Maße auf (s. Abb. 3.14 und 3.15).

Wie aus der Abbildung 3.16 zu entnehmen ist, zeigten die 5 untersuchten

Neurone eine erhebliche Frequenzänderung im Verlauf der sinusförmigen

Temperaturänderung: Im erhöhten Temperaturbereich (40°C) eine starke

Frequenzzunahme und im erniedrigten Temperaturbereich (34°C) eine starke

Frequenzabnahme bis zu 0 Hz (keine Aktivität) (s. auch Abb. 3.17).

Ergebnisse - 60 -

PHE 10 µM

Abb. 3.14 Wirkung von Phenylephrin (10 µM) auf ein warmsensitives phasisches Neuron im N. paraventricularis (ON-OFF-Effekt). Oberste Darstellung: Intervall-Dauer-Kurve (ID: intervall duration), welche die Zeiten zwischen zwei Impulsen angibt; Mitte: Frequenzdarstellung in Hertz als Peristimulus-Zeit-Histogramm; Unten: sinusförmiger Temperaturverlauf (37°C±3°C; f= 0,005 Hz). Durch Phenylephrin (10 µM) wurden die spontanaktiven Neurone bei Einwirkung von hohen Temperaturen im Bereich des Temperaturmaximums erheblich aktiviert, wobei die Entladungsfrequenz im zeitlichen Verlauf dieses Phasenbereiches des Temperatursinus die Form eines Plateaus annahm.

Ergebnisse - 61 -

Abb. 3.15 Wirkung von Phenylephrin (10 µM) auf ein warmsensitives phasisches Neuron im N. paraventricularis (ON-OFF-Effekt). Das anfangs spontanaktive warmsensitive Neurone wird erheblich moduliert. Die Frequenzzunahme während erhöhten Temperaturen ist besonders ausgeprägt, sowie eine extreme Abnahme unter niedrigen Temperaturen. Die Entladungsfrequenz nahm im zeitlichen Verlauf dieses Phasenbereiches des Temperatursinus die Form eines Plateaus an.

12

9

6

3

0

F [im

p/s]

12

9

6

3

0

F [im

p/s]

42

40

38

36

34

T [°

C]

1000950900850800750700

50 s

A

B

(PHE)

(control)

Die Antiparallelität des Auseinanderweichens der Frequenz bei hohen und

niedrigen Temperaturen vor und nach Applikation von Phenylephrin (10 µM)

zeigt die Abbildung 3.17. Bei niedrigen Temperaturen von 34°C zeichnen sich

die Neurone mit einer durchschnittlichen Impuls-Frequenz von 1,2 Impulse/sec

aus, die sich nach einer Temperatursteigerung auf 40°C parallel auf 4,4 Hz

erhöht. Anders stellt es sich dagegen unter dem Einfluss des α1-Agonisten dar.

Hier sinkt die durchschnittliche Entladungsfrequenz im erniedrigten Temperatur-

bereich auf 0,5 Hz ab, während sie im Bereich von 40°C auf durchschnittlich 6,1

Hz ansteigt.

Ergebnisse - 62 -

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Zelle 1 Zelle 2 Zelle 3 Zelle 4 Zelle 5

Freq

uenz

-Änd

erun

g (m

ean/

sec)

[Hz]

Frequenz-Änderung im Bereich von 40°CFrequenz-Änderung im Bereich von 34°C

Abb. 3.16 Durchschnittliche Frequenz-Änderung der untersuchten Zellen mit charakteristischem On-Off-Effekt. Die 5 untersuchten Neurone wurden in ihrer Aktivität unter PHE (10 µM) im Verlauf der sinusförmigen Temperaturänderung intensivst moduliert: Im erhöhten Temperaturbereich (40°C) erfuhren sie eine starke Frequenzzunahme und im erniedrigten Temperaturbereich (34°C) eine starke Frequenzabnahme bis zu 0 Hz (keine Aktivität).

Abb. 3.17 Darstellung der Entladungsfrequenz der warmsensitiven phasischen Neurone des PVN vor Applikation (Kreis) und nach Applikation (Dreieck) von Phenylephrin (10 µM) mit charakteristischem ON-OFF-Effekt bei 34°C und 40°C. Bei niedrigen Temperaturen von 34°C zeichnen sich die Neurone mit einer durchschnittlichen Impuls-Frequenz von 1,2 Impulse/sec aus, die sich nach einer Temperatursteigerung auf 40°C parallel auf 4,4 Hz erhöht. Anders stellt es sich dagegen unter dem Einfluss des α1-Agonisten dar. Hier sinkt die durchschnittliche Entladungsfrequenz im erniedrigten Temperaturbereich auf 0,5 Hz ab, während sie im Bereich von 40°C auf durchschnittlich 6,1 Hz ansteigt.

0

1

2

3

4

34°C 40°C

F [im

p/s]

5

6

7

0

1

2

3

4

34°C 40°C

F [im

p/s]

5

6

7

control PHE

Ergebnisse - 63 -

Phenylephrin-Phasenverschiebung Wie bereits in den vorherigen Kapiteln erläutert, zeigten die meisten

warmsensitiven Neurone während sinusförmigen Temperaturreizen maximale

Entladungsraten etwa zum Zeitpunkt des Temperaturmaximums und minimale

Entladungsraten während des Temperaturminimums. Neben den bereits

beschriebenen Phänomenen unter der Einwirkung des noradrenergen α1-

Agonisten Phenylephrin (z.B. ON-OFF-Effekt) kam es bei 7 von 21

untersuchten warmsensitiven Zellen des PVN und SON zu einer

Phasenverschiebung zwischen der sinusförmig verlaufenden Temperatur und

der Entladungsfrequenz. Durchschnittlich betrug diese temporäre Verschiebung

bei den untersuchten Zellen -36 sec (SD 20,5 sec).

In Abb. 3.18 ist dieser PHE-Effekt bei einem Neuron in der Übersicht, in Abb.

3.19 im Detail gezeigt. Vor Applikation des α1-Agonisten zeigten die

dargestellten Neurone das bereits bekannte temperatursensitive Verhalten, d.h.

sie antworteten auf sinusförmige Temperaturverläufe zwischen 34°C und 40°C

(f= 0,005 Hz) mit veränderlichen Entladungsraten, wobei das Maximum der

Entladungsfrequenz mit dem Temperaturmaximum und das Entladungs-

Abb. 3.18 Schematische Darstellung eines warmsensitiven Neurons. Projektion des sinusförmigen Temperaturstimulus (37°C±3°C; f= 0,005 Hz) auf das Frequenz-Histogramm zur Darstellung der Phasenverschiebung von Temperaturmaxima und Frequenzmaxima unter Phenylephrin-Gabe (5 µM). Die maximale Entladungsrate wurde bereits bei geringeren Temperaturen erreicht als vor PHE-Applikation. Dies bedeutet, dass PHE den Bereich verkleinert, in welchem Neurone dynamisch auf Temperaturänderungen antworten und somit die Sensitivität auf Änderungen innerhalb dieses Temperaturbereichs erheblich erhöht.

14

12

10

8

6

4

2

0

f [H

z]

8500800075007000t [sec]

40

38

36

PHE (5 µM)

34

T [°C]

Ergebnisse - 64 -

minimum mit dem Temperaturminimum zusammenfiel. Die Applikation von 5

µM (Abb. 3.18), bzw. 10 µM (Abb. 3.19) PHE führte bei den genannten

Neuronen nun nicht nur zu einer gesteigerten Entladungsrate bei Erwärmung,

bzw. eine gehemmte Entladungsfrequenz bei Kühlung, sondern nunmehr wurde

die maximale Entladungsrate bereits bei geringeren Temperaturen erreicht als

zuvor, nämlich bei ca. 38°C gegenüber ca. 40°C in der Kontrolle und die

minimale Entladungsrate bei höheren Temperaturen, nämlich bei ca. 36,5°C

gegenüber 34°C in der Kontrolle. Dies bedeutet, dass PHE den Bereich

verkleinert, in welchem Neurone dynamisch auf Temperaturänderungen

antworten und somit die Sensitivität auf Änderungen innerhalb dieses

Temperaturbereichs erheblich erhöht.

8

6

4

2

0

F [im

p/s]

42

40

38

36

34

T [°C]

8

6

4

2

0

F [im

p/s]

42

40

38

36

34

T [°C]

100 s

Fmax Tmax

Tmax Fmax

A (PHE)

B (control)

Abb. 3.19 Schematische Darstellung eines Neurons zum Phasenshift. Der sinusförmige Temperaturverlauf (37°C±3°C; f= 0,005 Hz) wurde wie in Abb. 3.18 auf die Frequenzkurve projiziert. A zeigt das Entladungsmuster während, B vor Phenylephrin-Applikation (10 µM). Durch die Applikation wurde die maximale Entladungsrate bereits bei geringeren Temperaturen erreicht als zuvor, nämlich bei ca. 38°C gegenüber ca. 40°C in der Kontrolle und die minimale Entladungsrate bei höheren Temperaturen, nämlich bei ca. 36,5°C gegenüber 34°C in der Kontrolle. Dies bedeutet, dass PHE den Bereich verkleinert, in welchem Neurone dynamisch auf Temperaturänderungen antworten und somit die Sensitivität auf Änderungen innerhalb dieses Temperaturbereichs erheblich erhöht.

Diskussion - 65 -

4.0 Diskussion 4.1 Hirnschnitt-Technik

Das Konzept der dieser Arbeit zugrunde liegenden elektrophysiologischen,

extrazellulären Untersuchungen am Hirnschnitt der Ratte, basiert auf der seit

den sechziger Jahren etablierten in-vitro-Methode. Primär wurde versucht, die

extrazelluläre Aktivität von magnozellulären Neuronen im Hypothalamus zu

registrieren. Hierbei wurde eine gezielte Elektrodenplazierung im Slice, durch

direkte optische Übersicht unter dem Binokular, über klar erkennbare

Gehirnstrukturen, im Vergleich zu topographischen Landmarken ermöglicht. Die

korrekte Positionierung der Elektrodenspitze im Hypothalamus mit Hilfe eines

Atlanten (Paxinos und Watson 1986) unter dem Binokular konnte bereits in

früheren histologischen Untersuchungen mit Markern bestätigt werden (Hatton

et al. 1978). Die typische Anordnung des 3. Ventrikels, der Fornices und des

Chiasma opticum ließen Rückschlüsse auf die Lage des untersuchten Nucleus

paraventricularis zu. Auch die Lokalisation des Nucleus supraopticus, direkt

neben den lateralen Endungen des Chiasma opticums war gut zu bestimmen.

Ein weiterer Anhaltspunkt für die Typisierung der abgeleiteten Neurone war

deren Entladungsmuster. Wie bereits bekannt, zeigen Vasopressin-

synthetisierende magnozelluläre Neurone phasische Entladungen und

oxytozinerge Neurone ein unregelmäßig-kontinuierliches Entladungsmuster

(Brimble und Dyball 1977). Die topographische Lokalisation und das

Entladungsmuster sind nur indirekte Anhaltspunkte, so dass nicht eindeutig ist,

von welchem Subtyp an PVN- und SON-Neuronen abgeleitet wurde. Jedoch ist

diese experimentelle Unzulänglichkeit aufgrund der sehr homogenen Daten von

geringerer Relevanz und interferiert nicht wesentlich mit der Interpretation der

Resultate und den Zielen der Untersuchung.

Die Tatsache, dass aufgrund der Präparation die Blut-Hirn-Schranke nicht

vorhanden war, ermöglichte freie Diffusion im Extrazellulärraum und

uneingeschränkte direkte Wirkung am Versuchsobjekt, wobei die jeweilige

Diffusionsgeschwindigkeit der verwendeten Testsubstanzen kaum eine Rolle

Diskussion - 66 -

gespielt hat. Auch die unsichere Dauer der Auswaschzeit hat bei unseren

Versuchen keine entscheidende Rolle gespielt, da es sich hierbei meist um

reversible Effekte handelte. Ein weiterer allgemein bekannter Nachteil ist die

unterbrochene Perfusion des Gewebes. Sauerstoff und Nährstoffe gelangen nur

noch per diffusionem zu den Zellen. In der Literatur wird eine maximale Slice-

Dicke von 500 µm für eine adäquate Sauerstoffversorgung empfohlen (Hatton

1983). Laut Kettenmann und Grantyn (1992) bleiben auch Hirnschnitte mit einer

Dicke von 700 µm für Stunden intakt. Relativ dünne Hirnschnitte sind aus

technischen Gründen zu anfällig für mechanische Schäden. So boten unsere

Slices mit einer Dicke von 400 µm einen Kompromiss, waren aber

morphologisch in ihrem Zustand nach Stunden der Inkubation, trotz guter

Versuchsbedingungen, nicht mehr dem nicht-manipulierten Hirngewebe gleich.

Jedoch konnten Rice et al. (1994) zeigen, dass trotz des initialen Trauma der

Präparation, die Hirnschnitte noch weiterhin durch einen schonenden Umgang

für solche elektrophysiologischen Versuche eingesetzt werden können und sich

so die Eigenschaften und Reaktionen der zu untersuchenden Zellen hierbei

wesentlich besser spezifizieren lassen.

Unphysiologische Membraneffekte durch Anästhetika, wie sie im

Ganztierversuch vorkommen können, kamen hier zwar nicht zu tragen, doch

in-vitro spielt die Zusammensetzung der Superfusionslösung eine

bemerkenswert große Rolle. Primär sollte sie dem natürlichen

Extrazellulärmedium möglichst gleich sein und gleichzeitig eine gute

Trägerlösung für die angewendeten Testsubstanzen darstellen (Hatton 1982).

Die von uns genutzte aCSF, exakt in Konstanz und Steuerbarkeit in ihrer

Zusammensetzung (nach Schmid und Pierau 1993), stellte ein gutes Medium

zur Vitalerhaltung des Gewebes dar.

Spontane Entladungen der PVN- und SON-Neurone im Hirnschnittpräparat sind

ein Zeichen für Vitalität der Neurone. Zur Auswertung der Messdaten kamen in

dieser Arbeit nur Registrierungen von Zellen mit stabiler Amplitude

der Aktionspotentiale, als Zeichen vitalen Gewebes und stabiler

Ableitbedingungen.

In vielen Fällen wurde die Entladungsaktivität mehrerer Neurone parallel

registriert. Hierbei handelte es sich um sogenannte Multi-Units, die aufgrund

ihrer unterscheidbaren Größe und Gestalt der Aktionspotentiale in der Regel

Diskussion - 67 -

eindeutig von den Single-Units abzugrenzen waren. Bei Multi-Unit-Ableitungen

konnten die Entladungen einer einzelnen Zelle oft direkt am Messstand mittels

Fensterdiskriminator selektiert und somit dann später auch ausgewertet

werden. Multi-Unit-Ableitungen, bei denen die Einzel-Zell-Selektion mittels

Fensterdiskriminator nicht gelang, wurden „offline“ einer digitalen

Schwellenwert-Analyse unterzogen und nur ausgewertet, wenn diese

erfolgreich war.

Wie ersichtlich, hat die angewendete Hirnschnitt-Technik ihre Vor- und

Nachteile, doch von größter Relevanz ist jedoch die Tatsache, dass mit den hier

durchgeführten Versuchen immer nur Einblick in einen begrenzten Ausschnitt

der Physiologie ermöglicht wird. Zwar sind die Hirnschnitte ihrer

neurochemischen Zusammensetzung, den synaptischen Strukturen und der

zellulären Organisation lebendem Gewebe weitaus ähnlicher als z.B.

Zellkulturverbände, doch durch die Schnittpräparation wird das Gewebe selbst

vom neuronalen Netzwerk des Gesamtorganismus getrennt. Somit werden

in-vitro die interzerebralen Vernetzungen eines Areals mit einem anderen und

dessen neurophysiologischen Auswirkungen, sowie den humoralen Einflüssen

anderer Systeme, wie z.B. des Immunsystems und des vegetativen

Nervensystems, ausgeschaltet. Die Betrachtung von Effekten an einem

isolierten Zellsystem stellt somit nicht die Realität von vernetzten Funktionen

und homöostatischen Wechselwirkungen im lebenden Organismus dar.

Diskussion - 68 -

4.2 Die Thermosensitivität hypothalamischer PVN- und SON-Neurone

Der Hypothalamus als oberste Integrationseinheit vegetativer Funktionen, ist

zudem auch als neuroendokrines Organ bekannt. Magnozelluläre Neurone aus

dem PVN und SON von Säugetieren sezernieren in der Neurohypophyse

Arginin-Vasopressin (AVP; ADH) und Oxytozin (OXY) in den systemischen

Blutkreislauf. Die sich im PVN zusätzlich befindlichen parvozellulären Neurone

steuern über ihr Sekretionsprodukt Corticotropin Releasing Hormon (CRH) die

Ausschüttung von ACTH aus der Adenohypophyse. Weiterhin besitzen die

parvozellulären Neurone Projektionen in zentrale Hirnstrukturen, welche unter

anderem eine Rolle bei der Antipyrese und der Blutdruckregulation spielen. Als

Regelzentrum für verschiedene Homöostasesysteme stellt der Hypothalamus

zudem eine Schnittstelle zwischen Zentralnervensystem und peripheren

endokrinen Organen wie Schilddrüse oder Nebenniere dar.

Wie bereits in Kapitel 1.1.1 erläutert, findet sich das thermoregulatorische

Zentrum für die Steuerung der Körperkerntemperatur in der präoptischen

anterioren Hypothalamusregion (PO/AH), dass nahe einem zirkumventrikulären

Organ, des Organum vasculosum laminae terminalis (OVLT), an der vorderen

Wand des dritten Ventrikels liegt. Im Rahmen von pathophysiologischen

Erhöhungen der Temperatur unter Fieber, kommt es in diesem Bereich auch zu

neuronal essentiellen Umstellungen auf zellulärer Ebene.

Die Thermosensitivität der Neurone dieser Kerngebiete ist hinlänglich

untersucht worden (Boulant & Dean 1986). Als Maß für die Thermosensitivität

wird der Temperaturkoeffizient (TC; Einheit: Impulse*s-1*°C-1= Hz/°C)

angegeben, der sich als Frequenzänderung [Δ Hz] der Entladung pro Grad

Celsius Temperaturänderung definiert. Für die Entscheidung, ob ein Neuron

warmsensitiv, kaltsensitiv oder temperaturinsensitiv ist, haben verschiedene

Arbeitsgruppen teilweise ganz unterschiedliche TC-Grenzwerte (willkürlich)

festgelegt (Boulant und Dean 1986). Die gebräuchlichste Einteilung der TC-

Grenzwerte liegt für kaltsensitive bei einem TC ≤-0,6 Hz/°C und für

warmsensitive Neurone für Werte ≥+0,8 Hz/°C. Der Bereich von -0,6 Hz/°C bis

+0,8 Hz/°C wird von den temperaturinsensitiven Zellen abgedeckt. Auf diese

Diskussion - 69 -

Einteilung wurde im Rahmen dieser Arbeit jedoch verzichtet, da diese willkürlich

und nicht standardisiert von Arbeitsgruppe zu Arbeitsgruppe schwanken.

Obwohl die Neurone der hypothalamischen Kerngebiete PVN und SON keine

direkte temperatur-regulatorische Aufgabe besitzen, stellt die Temperatur einen

effektiven Modulator ihrer neuronalen Funktion dar. So zeigten 34 von 39 der in

dieser Arbeit untersuchten spontanaktiven PVN- und SON-Neurone auf

konstante oder sinusförmige Temperaturreize im Bereich zwischen 34°C und

41°C deutliche Änderungen ihres Entladungsverhaltens. Von diesen Neuronen

wurden 29 als warmsensitiv mit TC-Werten zwischen 0,2 bis >1,0 Hz/°C

charakterisiert. Lediglich 5 der untersuchten Neurone zeigten keine Änderung

ihrer Entladungsfrequenz bzw. ihres Entladungsmuster auf die beschriebenen

Temperaturreize.

Erwähnenswert ist auch die Beobachtung, dass es in einigen Fällen durch

höhere Temperaturen zu einer Sensibilisierung der Neuronenpopulationen kam.

Dabei zeigten zuvor inaktive, das heißt nicht oder kaum spontanaktive Neurone

nach wiederholter thermischer Reizung im Bereich zwischen 38-40°C plötzlich

deutliche Entladungen. In der Regel konnten solche neuronalen Aktivitäten

nicht lange registriert werden, dass heißt sie waren nicht stabil und

verschwanden nach einigen Minuten, so dass sie aufgrund der gewählten

Analyse-Kriterien nicht weiter ausgewertet wurden. Neben der gezeigten

erhöhten Spontanaktivität unter dem Einfluss von Temperaturreizen ist diese

Aktivierung zuvor „stummer“ Neurone eine weitere Form, in der sich die

Temperatursensitivität hypothalamischer Neurone des PVN und SON darstellt.

Die Temperatursensitivität spontanaktiver Neurone des PVN und SON ist ein

Phänomen, das schon länger bekannt ist und von dieser und anderen

Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Boulant 1986, Braun et al. 1994b, Dewald et al.

1999, Inenaga et al. 1987, Matsumura et al. 1983). Es stellt sich die Frage nach

der biologischen Relevanz des modulatorischen Einflusses der Temperatur auf

das Entladungsverhalten der PVN- und SON-Neurone. Derartige

Untersuchungen wurden in der vorliegenden Arbeit nicht vorgenommen, andere

Arbeitsgruppen konnten jedoch im Tierversuch zeigen, dass es bei thermischer

Reizung der vorderen Hypothalamusregion zu einer Änderung des ADH-

Spiegels im Plasma kommt (Szczepanska-Sadowska 1974). Auch das

Auftreten kälteinduzierter Diurese unter physiologischen Bedingungen zeigt die

Diskussion - 70 -

Einflussnahme von Temperatur, bzw. Temperaturänderungen auf die

Sekretionsrate ADH-sezernierender magnozellulärer Neurone (MNCs), die auch

schon direkt in-vivo nachgewiesen wurden (Simon-Oppermann et al. 1980).

Hinsichtlich der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente zur

Temperatursensitivität lieferte eine genaue Analyse der Entladungsmuster der

untersuchten Neurone ein weiteres Ergebnis. So zeigten einige Zellen bei

Temperaturerhöhung einen Übergang von regelmäßigen Aktionspotentialfolgen

hin zu höherfrequenten phasischen (Burst-)Entladungen. Neben dem

dynamischen Verlauf der Entladungsfrequenz spontanaktiver Neurone und der

Aktivierung zuvor stummer Zellen bei Temperaturerhöhung ist die

Entladungsmusterveränderung somit eine weitere Variante neuronaler

Modulation, in der sich die Temperatursensitivität der Neurone des PVN und

SON äußerte.

Entladungsmusterveränderungen unter dem Einfluss bestimmter Reize ist ein

bekanntes Charakteristikum der Neurone des PVN und SON. So zeigten OXY-

sezernierende Zellen bei Reizung der laktierenden Brustdrüse einen Übergang

von regelmäßigen Aktionspotentialen hin zu kurzen hochfrequenten phasischen

Entladungen mit einer Burstdauer von 2-4 s bei einer Intraburstfrequenz von ca.

50 Hz (Poulain et al. 1977). Auch bei AVP-sezernierenden Zellen konnte nach

osmotischer Stimulation der Übergang einer konstanten Entladung zu längeren

Gruppenentladungen beobachtet werden, wodurch sich die ADH-Ausschüttung

beträchtlich erhöhte (Dutton und Dyball 1979). In der Literatur finden sich noch

weitere Hinweise bezüglich der Abhängigkeit von magnozellulärer

Entladungsaktivität und Höhe der ADH-Ausschüttung. So konnte gezeigt

werden, dass neben der Anhebung der mittleren Entladungsrate, auch die

Ausbildung von Gruppenentladungen und die Zunahme der Intraburstfrequenz

wichtige Parameter für eine gesteigerte ADH-Sekretion sind (Leng et al. 1992).

Andere Autoren zeigten, dass auch sehr kurze, hochfrequente

Burstentladungen die ADH-Ausschüttung induzieren und möglicherweise mit

ihrem Entladungsverhalten die oben genannten längeren Gruppenentladungen

modulieren, wie sie häufig in den neurosekretorischen paraventrikulären

Neuronen zu finden sind (Cazalis et al. 1985).

Nach Vorstellung der in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zur

Thermosensitivität stellt sich die Frage zur biologischen Relevanz der

Diskussion - 71 -

temperaturabhängigen Dynamik neuronaler Aktivität hypothalamischer PVN-

und SON-Neurone. Der Einfluss der durch Temperaturreize modulierten

Spontanentladungsfrequenz auf die Sekretionsrate dieser Nervenzellen wurde

in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht. Aufgrund der oben dargestellten

Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen

Entladungsfrequenz und -muster und Sekretionsrate magno- und

parvozellulärer Neurone kann jedoch postuliert werden, dass eine

Temperaturänderung bei temperatursensitiven neurosekretorischen Neuronen

einen modulatorischen Effekt auf die Ausschüttung von endokrinen

Botenstoffen hat und somit weitreichende Folgen für den Gesamtorganismus

besitzt. Aufgrund der Annahme, dass ADH antipyretisch wirkt (Zeisberger

1990), würde zum Beispiel eine Temperaturerhöhung in einem klassischen

Feedback-Mechanismus resultieren: die erhöhte Temperatur führt zu einer

gesteigerten ADH-Ausschüttung mit entsprechender antipyretischer Wirkung im

Gesamtorganismus (Merker et al. 1989).

Diskussion - 72 -

4.3 Der Einfluss von Phenylephrin auf die Thermosensitivität

Die neurosekretorischen Neurone im PVN und SON stehen unter

verschiedenartiger synaptischer Kontrolle aus anderen Hirnbereichen. Vor

allem erhalten sie über den ventralen noradrenergen Bahnzug aus den

Fasergruppen A1 und A2 noradrenerge Afferenzen aus der Medulla oblongata.

Die Neurone der medullären A1-Gruppe umgeben den Kern des Funiculus

lateralis und erstrecken sich dorsomedial in den lateralen Anteil der Formatio

reticularis; die der Neurone der A2-Gruppe liegen dorsal und lateral des

Nucleus nervi hypoglossi, nahe der ventrikulären Oberfläche. Die größte

noradrenerge Zellgruppe ist der Locus coeruleus (vor allem die Kerngruppen

A4, A6 und A7) am Boden der Rautengrube, ein makroskopisch sichtbarer

blauschwarzer Gewebestreifen in Höhe der rostralen Ponsabschnitte. Er enthält

beinahe die Hälfte aller Noradrenalin-synthetisierender Zellen im ZNS und ist

quantitativ das bedeutendste noradrenerge Zentrum. Der Locus coeruleus

besteht aus nur etwa 1000 Zellen, deren Axone sich jedoch so vielfach

verzweigen, dass die zugehörigen noradrenergen Endigungen an vielen Stellen

des ZNS zu finden sind. So hat der ventrale noradrenerge Bahnzug zum

Beispiel einen erheblichen modulierenden Einfluss auf Reifungsprozesse und

Lernvorgänge, Verarbeitung von Sinnesreizen, Schlafregulation und endogene

Schmerzhemmung. Weiterhin ist der Locus coeruleus als „Alarmsystem des

Gehirns“ in körperlichen und seelischen Stresssituationen aktiviert und dabei

entscheidend an der Entstehung charakteristischer Symptome wie

Angstempfindung oder Tachykardie beteiligt.

Über die genannten noradrenergen Afferenzen werden viele neuroendokrine

Funktionen im hypothalamischen PVN reguliert. So besitzt Noradrenalin einen

direkten Einfluss auf das Entladungsverhalten der PVN-Neurone (Alonso und

Assenmacher 1984, Day und Renaud 1984) und somit indirekten Einfluss auf

die Freisetzung der Hormone ADH und Oxytozin dieser neurosekretorischen

Zellen innerhalb der Neurohypophyse. Ein immunohistochemischer Nachweis,

dass oxytozinerge und vasopressinerge Neurone im PVN funktionelle α1-

Adrenozeptoren exprimieren, konnte bereits erbracht werden (Daftary et al.

1998). Der Nachweis des direkten modulatorischen Einflusses von Noradrenalin

Diskussion - 73 -

auf die neuronale Aktivität konnte Day bereits 1984 erbringen (Day et al. 1984).

In dieser Studie (extrazelluläre Ableitungen bei männlichen Ratten) führte die

Applikation von Noradrenalin bei 78% der magnozellulären Neuronen im PVN

zu einer Erhöhung der Entladungsfrequenz. In einer weiteren Studie von Han et

al. (2002) induzierte Noradrenalin besonders an selektiven α1-Rezeptoren

hypothalamischer PVN-Neurone in 59% der Fälle eine enorme

Frequenzsteigerung.

Auch in der vorliegenden Arbeit können wir die noradrenerge α1-Rezeptor-

vermittelte exzitatorische Wirkung auf spontanaktive Neurone des

hypothalamischen PVN und SON zeigen. Unter konstanten

Temperaturverhältnissen von 37°C führte die Phenylephrin-Gabe bei 18 von 24

Neuronen (75%) zu einem deutlichen Anstieg der Frequenz, wobei sich die

unbehandelten spontanaktiven Neurone zuvor durch eine stets konstante

Frequenz auszeichneten. In einigen Fällen erhöhte sich die Entladungsfrequenz

um ca. 400 % im Vergleich zur Baseline.

In der Versuchsreihe mit dem noradrenergen α1-Antagonisten Prazosin zeigte

sich bei alleiniger Gabe von 10 µM ein geringer Rückgang der

Entladungsfrequenz. Die hemmende Wirkung von Prazosin zeigte sich auch bei

Koapplikation zu äquimolaren Mengen von Phenylephrin, wodurch die vorherige

exzitatorische Wirkung der letztgenannten Substanzen vollständig aufgehoben

wurde. Auch das Entladungsmuster der untersuchten spontanaktiven Neuronen

blieb bei diesen Messungen völlig unbeeinflusst gegenüber dem unbehandelten

Zustand.

Interessanterweise hat die Applikation des β-Adrenozeptor-Antagonisten

Propanolol keine Auswirkungen auf das spontane Entladungsmuster der

untersuchten hypothalamischen Neurone. Die exzitatorische Wirkung der

noradrenergen Afferenzen im Untersuchungsgebiet scheint demnach alleine

über α1-Adrenozeptoren der PVN- und SON-Neurone vermittelt zu werden

(Daftary et al. 1998). Auch wenn Noradrenalin oder sein spezifischer Agonist

am α1-Rezeptor Phenylephrin in der vorliegenden Arbeit ausschließlich eine

exzitatorische Wirkung auf die untersuchten hypothalamischen Neurone hatte,

sollte nicht unerwähnt bleiben, dass andere Arbeitsgruppen Noradrenalin auch

eine inhibitorische Wirkung auf oxytozinerge Neurone, vor allem im PVN,

zusprechen (Honda et al. 1985).

Diskussion - 74 -

Neben der direkten exzitatorischen Wirkung auf spontanaktive Neurone des

PVN und SON hatte Phenylephrin auch einen deutlich modulierenden Effekt auf

die Temperatursensitivität dieser Zellen. Zur Untersuchung dieser, in der

Literatur bisher noch nicht beschriebenen PHE-Wirkung wurde die Thermode

der Versuchskammer über einen Sinusgenerator gesteuert, wobei sinusförmige

Temperaturschwankungen mit einer Frequenz von f= 0,005 Hz, im

Temperaturbereich von 37°C±3°C generiert wurden. Das Temperaturmaximum

von 40°C simulierte somit einen pyretischen Zustand (Fieber) des menschlichen

Organismus, wo hingegen das Temperaturminimum von 34°C einen Zustand

nach Unterkühlung darstellte.

Als Maß für die Temperatursensitivität eines spontanaktiven Neurons wurde

dessen Temperaturkoeffizient (TC) ermittelt, also die Änderung der

Entladungsfrequenz [Δ Hz] pro Grad Celsius Temperaturänderung (Einheit:

Impulse*s-1*°C-1= Hz/°C). Durch extrazelluläre Ableitungen im

hypothalamischen PVN und SON konnte nach Applikation von PHE (2-11 µM)

bei 12 von 21 untersuchten Neuronen ein meist deutlicher Anstieg des

Temperaturkoeffizienten (TC) im Vergleich zu ihrem TC-Ausgangswert vor der

PHE-Gabe gemessen werden. In 6 Fällen führte eine Stimulierung sogar zu TC-

Werten über 0,8 Hz/°C. Nur wenige der untersuchten Neurone änderten ihre

Temperatursensitivität kaum (n= 2); ein Neuron wurde unter Phenylephrin-Gabe

weniger temperatursensitiv (n= 1).

Eine genauere Analyse zeigte, dass die PHE-induzierte

Temperatursensitivitäts-Steigerung sich auf unterschiedliche Art und Weise

äußerte. Zum einen konnte ein sogenannter „ON-OFF-Effekt“ registriert werden.

Hierbei kam es durch Phenylephrin-Applikation zu einer derartigen Modulation,

dass warmsensitive Neurone ihre Aktivität bei gleichzeitiger Applikation eines

sinusförmigen Temperaturstimulus von 37°C±3°C (f= 0,005 Hz) im

verminderten Temperaturbereich gänzlich einstellten. Im Gegensatz dazu war

ihre Entladungsfrequenz bei Erwärmung oft schon vor Erreichen des

Temperaturmaximums maximal erhöht. Im Bereich um 37/38°C kam es unter

PHE-Einfluss also zu einem regelrechten Ein- und Ausschaltverfahren von

maximaler elektrischer Erregung, wenn erwärmt wurde und absoluter

Hemmung der Spontanentladungen, wenn gekühlt wurde, wohingegen die

Neurone vor PHE-Gabe und nach dem Auswaschen des α1-Adrenozeptor-

Diskussion - 75 -

Agonisten ihre Entladungsrate relativ genau den sinusförmigen

Temperaturschwankungen anpassten. PHE übersteigerte demnach die

Temperatursensitivität derart, dass im physiologischen Temperaturbereich der

modulierende Temperatur-Einfluss verloren ging, bzw. ihn auf einen sehr eng

umgrenzten Bereich um 37/38°C begrenzte. Die Sinnhaftigkeit eines solchen

α1-Adrenozeptor-vermittelten Einflusses von PHE könnte in einer Feinjustierung

der Temperaturmodulation im gesunden Organismus liegen. Außerhalb dieses

Temperaturbereichs, d.h. bei Unterkühlung oder Fieber, hätte die Temperatur

nur insofern modulierenden Einfluss auf die Entladungsrate von PVN- und

SON-Neurone, indem sie zu einem „Aus- oder Einschalten“ führen würde.

Vielleicht ist der Einfluss von Phenylephrin auf die Temperatursensitivität der

Neurone in den untersuchten hypothalamischen Kerngebieten aber auch viel

subtiler und mithin die bei der Durchführung der Experimente eingesetzten

Konzentrationen von PHE viel zu hoch gewesen. Obwohl dies nicht gänzlich

ausgeschlossen werden kann, ist anzumerken, dass es zwischen den

untersuchten Neuronen deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit

gegenüber PHE gab. So hatte PHE bei einigen der untersuchten Neurone

bereits in Konzentrationen von 2-5 µM deutlichen Einfluss auf die

Temperatursensitivität, während andere erst bei höheren Konzentrationen von

10 µM reagierten. Dies verhinderte die Erstellung einer Dosis-Wirkungs-

Beziehung, zeigt aber auch, dass wahrscheinlich keine überhöhten

Konzentrationen von PHE eingesetzt wurden. Eine weitere

Erklärungsmöglichkeit ist jedoch auch, dass der Konzentrationsbereich, in dem

Agonisten am α1-Adrenozeptor eine „sinnvolle“ physiologische Wirksamkeit

entfalten, eng begrenzt ist und zudem von Neuron zu Neuron schwankt. So

zeigten nicht alle Neurone mit gesteigerter Thermosensitivität unter PHE-

Einfluss das oben beschriebene „Ein-/Ausschalt-Verhalten“ bei gleichzeitiger

Applikation eines sinusförmigen Temperaturstimulus, sondern nur 5 von 21

Neuronen (23%). Bei 7 weiteren warmsensitiven Neuronen (33%) konnte unter

diesen Bedingungen eine sogenannte „Phasenverschiebung“ festgestellt

werden, bei der es sich vermutlich um eine Vorstufe des „Ein-/Ausschalt-

Verhalten“ handelt.

Unbehandelte spontanaktive Zellen mit hohen Temperaturkoeffizienten zeigten

bei Applikation eines sinusförmigen Temperaturstimulus von 37°C±3°C

Diskussion - 76 -

(f= 0,005 Hz) ein der Temperaturschwankung folgendes Entladungsverhalten,

wobei sie ihre maximale Entladungsrate im Bereich relativ kurz nach dem

Temperaturmaximum entwickelten, während sie kurz nach Durchschreitung der

Minimaltemperatur ihre geringste Entladungsrate hatten. Das heißt, die

warmsensitiven Neurone zeigten eine synchron dem sinusförmigen

Temperaturstimulus folgende Entladungsrate. Dieses Entladungsverhalten

änderte sich bei 7 Neuronen nach Applikation des noradrenergen α1-Agonisten

PHE. In einer Konzentration von 10 µM führte PHE bei diesen Zellen zu einer

Erhöhung der Wärmesensitivität, die sich in einer „Phasenverschiebung“ der

Entladungsrate in Bezug zum sinusförmigen Temperaturverlauf äußerte: Lag

zuvor das Frequenzmaximum noch kurz hinter dem Temperaturmaximum, so

projizierte sich dieses nun in den Bereich vor dem eigentlichen

Temperaturmaximum. Entsprechend zeigten die Neurone ihre minimale

Entladungsrate unter PHE-Einfluss nur vor Erreichen des

Temperaturminimums. Bei sinusförmigen Temperaturverläufen von 37°C±3°C

mit einer Periode von 200 Sekunden (f= 0,005 Hz) betrug die durchschnittliche

Phasenverschiebung der Entladungsrate während Applikation von 10 µM PHE

gegenüber dem unbehandelten Zustand durchschnittlich -36 sec (SD 20,5 sec).

Das bedeutet, dass die maximale Entladungsrate im sinusförmigen

Temperaturverlauf um 1,08°C niedrigeren Temperaturwerten des aufsteigenden

Sinus zugeordnet werden konnte. Diese Art der Temperatursensibilisierung

durch PHE ähnelt sehr stark dem zuvor beschriebenen „ON-OFF-Effekt“.

Wahrscheinlich variiert der Grad der Temperatursensibilisierung unter PHE-

Einfluss von Zelle zu Zelle, so dass solche, die besonders sensibel auf PHE

reagieren, bei Temperaturschwankungen einen ON-OFF-Effekt zeigen,

während etwas PHE-unempfindlichere Neurone unter diesen Bedingungen eine

„Phasenverschiebung“ erzeugen. Da bei der in dieser Arbeit angewandten

Methode extrazellulärer Ableitungen eine morphologische Charakterisierung der

untersuchten Neurone nicht möglich war, kann auch keine Aussage darüber

gemacht werden, ob mögliche Unterschiede hinsichtlich der PHE-

Empfindlichkeit zellspezifische Ursachen besitzen.

Man kann davon ausgehen, dass es sich bei den allermeisten in dieser Arbeit

untersuchten Zellen des PVN und SON um neurosekretorisch, d.h. ADH- oder

Oxytozin-synthetisierende Neurone gehandelt hat, die einen überwiegend

Diskussion - 77 -

positiven Temperaturkoeffizienten zeigten, d.h. bei Erwärmung stärker aktiv

wurden. Andere Autoren haben gezeigt, dass vor allem phasisches

Entladungsverhalten die Hormonfreisetzung aus den magnozellulären

neurosekretorischen Neuronen induzieren und regulieren soll (Dutton und

Dyball 1979, Leng et al. 1992). Geht man schließlich davon aus, dass die

Menge des sezernierten Hormons vom Entladungsmuster, insbesondere der

Entladungsfrequenz abhängig ist, führt der α1- Rezeptor-Agonist Phenylephrin

letztlich zu einer erhöhten mittleren Entladungsfrequenz und schließlich zu einer

daraus resultierenden höheren Hormonausschüttung. Die beschriebenen

Varianten der PHE-induzierten Temperatursensibilisierung dieser Neurone kann

auch als Sollwertverstellung, hin zu kälteren Temperaturen, interpretiert

werden. Unter physiologischen Temperaturbedingungen hätten noradrenerge

Afferenzen demnach einen stark fördernden Einfluss auf die elektrische Aktivität

und somit auf die Sekretionsrate der Neurone, während gleichzeitig die

Dynamikbereiche dieser α1-Rezeptoren-vermittelten Modulation geringer

werden würde. Unter fibrilen Körpertemperaturen hätte eine Steigerung der

afferenten Noradrenalin-Ausschüttung bei Zugrundelegung der in dieser Arbeit

gezeigten Ergebnisse keinen weiteren aktivitätssteigernden Einfluss, weil die

Entladungsrate der warmsensitiven Neurone unter derartigen Bedingungen

sowieso schon maximal ist. Dagegen lassen die Messergebnisse unter leicht

hypothermalen Zuständen des Organismus erwarten, dass bei vorhandener,

konstanter noradrenerger Afferenz schon geringe Änderungen der

Körpertemperatur massive Auswirkungen auf die Sekretionsrate von PVN- und

SON-Neuronen hätten. Die Sichtweise ist auch konform mit dem Mechanismus

der kälteinduzierten Diurese, die ihren Ausgangspunkt in den ADH-

sezernierenden Neuronen des hypothalamischen PVN und SON hat (Simon-

Oppermann et al. 1980). So zeigen zum Beispiel verschieden Autoren, dass

PHE eine Zunahme der ADH-Freisetzung bewirkt (Kapoor and Sladek 2000,

Randle et al. 1986). Hierbei hatten PHE-Konzentrationen im Bereich von 1-10

µM keinen nennenswerten Effekt auf die ADH-Sekretionsrate, während höhere

PHE-Mengen von 100 µM zu einer enormen Zunahme der Hormonfreisetzung

führten.

Trotz intensiven Literaturrecherchen gab es keinen Hinweis darauf, dass die

Modulation von Neuronen im PVN und SON der Ratte in Bezug auf ihre

Diskussion - 78 -

Temperatursensitivität durch noradrenerge α1-Agonisten wie Phenylephrin

bereits untersucht wurde. Aufgrund dessen, kann an dieser Stelle nur ein

Vergleich mit zuvor untersuchten anderen Substanzen erfolgen. Eine

deskriptive Analyse wurde beispielsweise durch Dewald et al. (2001)

veröffentlicht, wobei die neuromodulativen Effekte von Angiotensin II im

gleichen Kerngebiet untersucht wurden. In dieser Arbeit wirkte Ang II in 87%

der spontanaktiven Neurone exzitatorisch, d.h. es kam zu einer Zunahme der

Entladungsfrequenz. Dieser Effekt konnte durch den Ang II Rezeptor Antagonist

Sar1-Ile8-Ang II vollständig geblockt werden. Auch das Potential der Neurone

zur Integration weiterer Signale, wie hier durch zusätzlichen sinusförmigen

Temperatur-Stimulus geschehen, wurde untersucht (Dewald et al. 2001). In

Verbindung mit Ang II konnte in etwa der Hälfte der Neurone ein Anstieg der

Temperaturkoeffizienten beobachtet werden, jedoch nicht in dem Ausmaße zu

Phenylephrin.

Weiterhin von größter Bedeutung sind synaptische Mechanismen. Hohe TC-

Werte der PO/AH-Neurone scheinen intrinsisch bedingt zu sein, während

niedrige TC-Werte (vor allem negative TC-Werte) eher Folge von synaptischem

Input naher Neurone sein sollen (Curras et al. 1991).

Eine Schwäche der verwendeten Methode ohne Einsatz synaptischer Blockade

ist, dass der Einfluss von Afferenzen auf das jeweils extrazellulär abgeleitete

Neuron nicht eliminiert werden kann. Somit könnten andere im jeweiligen

Hirnschnitt enthaltene Strukturen ebenfalls auf Thermo- oder Phenylephrin-

Stimulation reagieren und die untersuchten Zellen manipulieren.

Auf das Ausschalten derartiger Netzwerkeffekte durch Blockade der

synaptischen Aktivitätsübertragung, z.B. durch Applikation von Cadminen (zur

Inhibierung von Ca2+-Kanälen) oder durch Verwendung von Ca2+-freier

Badlösung wurde jedoch verzichtet, da alle diese Manipulationen auf eine

Störung des intrazellulären Kalziumspiegels hinauslaufen. Jedoch stellt

Kalzium, neben seiner Schlüsselrolle bei der präsynaptischen

Transmitterausschüttung, auch ein wichtiger zytosolischer Botenstoff (ein

sogenannter „second-messenger“) dar, so dass ein äußerer Eingriff in diese

intrazelluläre Signalkaskade unabsehbare Folgen auf die individuelle neuronale

Signalverarbeitung und somit auf die Dynamik spontanaktiver Neurone hätte.

Diskussion - 79 -

Weitgehend geklärt scheint zu sein, dass Vasopressin-synthetisierende

Neurone des PVN und SON direkten exzitatorischen Input aus den A1

noradrenergen Neuronen der kaudalen ventrolateralen Medulla erhalten, um

hämodynamisch-regulierend wirksam zu werden (Alonso und Assenmacher

1984, Day und Renaud 1984). Adrenozeptor-Antagonisten waren in diesen

Arbeiten jedoch nicht in der Lage, die A1-Aktivierung der vasopressinergen

Neurone zu blocken, so dass diese Neurone vermutlich einen anderen

Noradrenalin-unabhängigen Input erhalten (Day et al. 1990). Ergänzend werden

in der Literatur multiple kolokalisierte und kofreigesetzte Substanzen der

Gruppe A1, als da wären Neuropeptid Y, Substanz P und ATP, in Verbindung

mit der Noradrenalin-Wirkung gebracht (Everitt et al. 1984, Sawchenko et al.

1985). Dies ist vergleichbar mit dem peripheren Nervensystem, bei dem ATP

neben Noradrenalin in synaptischen Vesikeln gespeichert ist (Whittaker 1982).

Dieses wird nach physiologischer Neuronenaktivität freigesetzt (Sperlagh und

Vizi 1996) und fungiert als Kotransmitter im sympathischen System. In

Verbindung mit ATP (100 µM) zeigt Phenylephrin (100 µM) einen drei- bis

vierfachen Anstieg der vasopressinergen Freisetzung; Phenylephrin allein

induziert nur einen 1,5-fachen Anstieg dieser (Kapoor und Sladek 2000, 2001).

Eine Verknüpfung dieser beiden Systeme zeigt sich anhand ihrer Rezeptoren.

Purinerge ATP-Rezeptoren entfalten ihre Wirkung über die identische

G-Protein-Klasse (Gq/11) wie noradrenerge α-Rezeptoren über einen Anstieg der

intrazellulären Ca2+-Konzentration (Zimmermann 1994).

Mehrere Untersuchungen beschäftigten sich auch mit der Freisetzung des

Hormons Oxytozin aus der magnozellulären hypothalamischen Region (PVN

und SON). Die oxytozinergen Neurone zeigen jedoch eher ein unregelmäßig-

kontinuierliches Muster (Brimble und Dyball 1977). Die Stimulation erfolgte

ebenfalls über noradrenerge α1-Rezeptoren mittels Phenylephrin und konnte

durch den Antagonisten Prazosin geblockt werden. Eine Zunahme der

Sekretion konnte jedoch nicht durch Applikation eines Agonisten am

noradrenergen α2-Rezeptor induziert werden. In Verbindung mit dem

Kotransmitter Neuropeptid Y war der Effekt besonders stark ausgeprägt, vor

allem im supraoptischen Kern (Bealer und Crowley 1998, Parker und Crowley

1993). Im Gegensatz dazu konnte nur ein minimal signifikanter Anstieg bei

Oxytozin durch alleinige Phenylephrin-Applikation festgestellt werden (Kapoor

Diskussion - 80 -

und Sladek 2000).

Über die multiplen Aufgaben der hypothalamischen Region wurde bereits

mehrfach berichtet und so wird diese auch als oberste Integrationseinheit

vegetativer Funktionen bezeichnet. Noradrenerge Modulation spielt so zudem

auch eine große Rolle beim Sattheitsgefühl. Stimulation noradrenerger

α1-Rezeptoren im PVN führt zu einer Hemmung des Esszentrums.

α2-Rezeptoren fördern das Hungergefühl über einen negativen Feedback-

Mechanismus (Wellman et al. 1993). Myers et al. (1986) induzierten eine

künstliche Hypothermie in-vivo bei Katzen über Injektionen von Phenylephrin in

die PO/AH-Neurone.

Zur funktionellen Relevanz der von uns untersuchten Effekte ist zu sagen, dass

unsere Daten die multimodale Sensitivität der paraventrikulären und

supraoptischen Neurone unter physiologisch relevanten Stimuli wie

Phenylephrin und Temperatur demonstrieren. Vergleichbare Effekte von

neuronaler Integration anderer hypothalamische Zellen außerhalb des PVN sind

bereits bekannt, wie zum Beispiel die essentielle Modulation der

Thermosensitivität der PO/AH Neurone bei Applikation von Kalzium (Schmid

und Pierau 1993).

Im Allgemeinen ist noch zu sagen, dass zu den direkten Effekten von

Temperaturänderung oder Phenylephrin-Applikation hier nur Einzelbefunde

vorgelegt werden konnten. Es bleiben viele Fragen offen, bezüglich des

Zusammenwirkens verschiedener Faktoren, wie zum Beispiel Differenzierung

bei gleichzeitiger Applikation verschiedener α- oder β-Agonisten. Schließlich

entspricht die in-vitro Situation nicht der (patho-) physiologischen Situation, in

der wahrscheinlich mehrere Substanzen, sowie andere involvierte Strukturen

und Neuromodulatoren gleichzeitig und voneinander abhängig agieren. Insofern

stellt diese Arbeit nur einen Einstieg in die elektrophysiologische Untersuchung

direkter Phenylephrin-Effekte an Neuronen des PVN und SON dar, ohne dass

näher auf das Zusammenwirken verschiedener Parameter eingegangen werden

konnte.

Wie aus den vorgehenden Kapiteln ersichtlich wird, ist die in dieser Arbeit

untersuchte Region von enormer Bedeutung für die Homöostase des

Organismus. Dennoch sind viele Aspekte neuronaler Funktionen noch nicht

geklärt. Eine Fortführung der Grundlagenforschung in diesem Gebiet würde

Diskussion - 81 -

jedoch den Rahmen dieser Dissertation sprengen. Es bleibt daher die Hoffnung,

dass der hier beschriebene neuromodulatorische Effekt an noradrenergen

α1-Rezeptoren von hypothalamischen Neuronen des PVN und SON zusammen

mit den vielen anderen Arbeiten auf diesem Gebiet einen Beitrag dazu leisten,

die physiologischen Verhältnisse in der Spezies Mensch leichter zu verstehen

und eventuell die Grundlage bilden, pathophysiologische Missverhältnisse zu

erkennen und gegebenenfalls zu beseitigen.

Zusammenfassung - 82 -

5.0 Zusammenfassung Der Hypothalamus repräsentiert den Ort der zentralen Steuerung

homöostatischer Systeme wie der Körpertemperatur und des Salz- und

Wasserhaushaltes. Daher wird er auch als oberste Integrationseinheit

vegetativer Funktionen bezeichnet. Via Afferenzen von peripheren und

zentralen Rezeptoren erhalten die hypothalamischen Kerngebiete

Informationen zum Status der Homöostase und lösen zu deren Regulation

effektorische neuronale, neurosekretorische und humorale Mechanismen aus.

Die Zellen der paraventrikulären und supraoptischen Kerne (PVN und SON)

bilden das osmoregulative Zentrum. Die temperatursensitiven magnozellulären

Neurone (MNCs) dieser Nuclei sezernieren die Hormone ADH (Vasopressin),

ein wichtiges Hormon für die Regulation des Wasserhaushaltes und der

Temperatur, sowie das Hormon Oxytozin. Auf zellulärer Ebene ist neben der

Frequenzzunahme die Ausbildung phasischer Entladungen (Bursts) der MNCs

ein entscheidender Faktor für die Hormonsekretion. Dementsprechend sind

diese Neurone in der Lage zahlreiche multimodale Signale zu integrieren, wie

zum Beispiel thermale oder osmotische Stimuli.

Einen überaus großen Einfluss zur Regulation dieser Mechanismen haben

Afferenzen aus anderen Hirnarealen. So erhalten die Neurone des PVN und

SON direkten Input via noradrenerger Afferenzen, deren Zellkörper den A2 und

A6 Zellpopulationen der Medulla oblongata und des Locus coeruleus

entstammen.

In dieser Studie wurden mittels extrazellulärer Registrierung in hypo-

thalamischen Schnittpräparaten (400 µm) juveniler Ratten, die Effekte des

noradrenergen α1-Agonisten Phenylephrin (PHE, 2-10 µM) auf spontanaktive

Neurone des PVN und SON untersucht.

1. In der ersten Versuchsreihe wurde die Auswirkung von PHE auf Neurone bei

konstanter Temperatur (37°C) untersucht. Dabei führte PHE bei 18 von 24

Neuronen (75%) zu einem deutlichen Anstieg der Frequenz (oftmals bis zu

400%), wobei sich die unbehandelten spontanaktiven Neurone zuvor durch eine

stets konstante Frequenz auszeichneten.

Zusammenfassung - 83 -

2. Um zu untersuchen, welchen Einfluss Phenylephrin auf die Temperatur-

Sensitivität (Temperaturkoeffizient (TC); Einheit: Impulse*s-1*°C-1= Hz/°C) von

Neuronen des PVN und SON hat, wurde diese Substanz in einem weiteren

Untersuchungsansatz parallel zu sinusförmigen Temperaturreizen (37°C±3°C,

f= 0,005 Hz) appliziert. Dies führte bei 12 von 21 untersuchten Neuronen zu

einem deutlichen Anstieg des Temperaturkoeffizienten. PHE bewirkt also eine

Sensitivierung der untersuchten Zellen gegenüber Temperaturänderungen. In 6

Fällen zeigten zuvor temperaturinsensitive Neurone nach Applikation von PHE

TC-Werten von über 0,8 Hz/°C.

Bei einigen Neuronen (n= 5) konnte eine derartige Wirkung bei sinusförmigen

Temperatur-Stimuli beobachtet werden, dass es zu einem On-Off-Effekt kam.

Nach PHE-Gabe (10 µM) wurden die anfangs spontanaktiven Neurone im

Bereich des Temperaturmaximums erheblich aktiviert, wobei die Entladungs-

frequenz im zeitlichen Verlauf dieses Phasenbereiches des Temperatursinus

die Form eines Plateaus annahm. Dagegen stellten die Neurone ihre Aktivität

an einem gewissen Punkt des absteigenden sinusförmigen Temperatur-

verlaufes weitgehend ein. Erst beim Überschreiten der Temperaturschwelle von

ca. 37°C war der Temperaturreiz wieder stark genug und die Zellen nahmen

ihre Aktivität wieder in dem bekannten Maße auf. Ein weiterer Effekt des PHE

war die Phasenverschiebung der Entladungsrate relativ zum Verlauf des

sinusförmigen Temperatur-Stimulus. Durchschnittlich betrug diese temporäre

Verschiebung -36 s (SD 20,5 s, n= 7). Dies bedeutet, dass PHE den Bereich

verkleinert, in welchem Neurone dynamisch auf Temperaturänderungen

antworten und somit die Sensitivität auf Änderungen innerhalb dieses

Temperaturbereichs erheblich erhöht.

Erwähnt werden muss, dass alle beschriebenen Effekte durch den α1-

Antagonisten Prazosin geblockt werden konnten.

Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Neurone des PVN und SON

unter starker modulatorischer Kontrolle via noradrenerger Afferenzen aus dem

Hirnstamm stehen. Die Sinnhaftigkeit dieser α1-Adrenorezeptor-vermittelten

neuronalen Modulation könnte in einer Feinjustierung des elektrischen

Aktivitätsniveaus der neurosekretorischen Zellen in Abhängigkeit von der

Körpertemperatur liegen und somit ein wichtiger Bestandteil der zentralen

Steuerung der Homöostase darstellen.

Zusammenfassung - 84 -

Summary The paraventricular nucleus (PVN) and the supraoptic nucleus (SON) are the

major sites of neuronal control for many homeostatic functions, such as the

osmoregulation, the adjustment of the body temperature and others. Neurons of

the PVN and SON receive direct input via noradrenergic afferents, the cell

bodies of which originate primarily in the A2 and A6 cell groups of the medulla

oblongata and locus coeruleus.

We have examined the effects of the noradrenergic α1-agonist Phenylephrine

(PHE) on the firing rate (FR) of neurons in slices of PVN and SON at constant

temperature and during sinusoidal temperature changes.

Hypothalamic brain slices (400 µm) were made from male Sprague-Dawley rats

(150-250g), incubated in artificial cerebrospinal fluid (aCSF) and constantly

oxygenated with 95%O2/5% CO2 at pH 7.3-7.5 and a osmolality of 295±5

mosmol kg-1.

A slice was placed on a thermode in the recording chamber and superfused

continuously with oxygenated aCSF. Extracellular single-unit activity was

recorded using glass electrodes with a resistance of about 0.8-2.0MΩ. During

recording, slices were exposed for 5-10 minutes to 2-10 µM PHE or 10 µM PHE

in combination with 10 µM of the α1-antagonist Prazosin (PRA). Constant

temperature or sinusoidal temperature changes (37°C±3°C, f= 0.005 Hz) was

controlled via a homemade thermostimulator device. Data was acquired with

homemade hard- and software and analysed with IGOR Pro (WaveMetrics).

Neuronal thermosensitivity was calculated off-line by linear regression analysis

of the frequency/temperature curves to determine the temperature coefficient

(TC; impulses*s-1*°C-1).

In response to bath application of 2-10 µM PHE, the majority (18 out of 24) of

the neurons showed a significant increase in FR of up to 400% at constant

temperature.

In most neurons application of PHE during sinusoidal temperature (37°C±3°C,

f= 0.005Hz) change, resulted in a dramatic increase in firing rate during

ascending phases or close to the maximum of the temperature sinus, while the

firing rate often was inhibited during descending phases close to the minimum

Zusammenfassung - 85 -

of the temperature sinus. This PHE-induced effect was completely blocked by

co-application of the α1-antagonist Prazosin.

The majority of temperature-insensitive neurons showed an augmentation in

thermosensitivity during PHE application (12 out of 21 neurons). In six of them,

PHE administration even lead to TC-Values above 0.8 Hz/°C.

The temperature-sensitivity of warmsensitive neurons were only hardly affected

by PHE (n= 2) or even decreased (n= 1).

In some neurons, the PHE-induced elevation of temperature sensitivity lead to

an sharp ON-OFF characteristic of the firing rate during sinusoidal temperature

changes. During exposure of ascending temperature the former silent neurons

rapidly increased their firing rate to a plateau, from which the activity dropped to

zero at a certain point of the descending temperature.

Another feature of increased temperature sensitivity during PHE was a

distinctive shift of the term of maximal neuronal firing rate relative to the

maximum of the sinusoidal temperature course and relative of the situation prior

PHE application. The mean of this temporal shift was in some of the examined

neurons -36 s (SD 20.5 s, n= 7) earlier, i.e. their maximal firing rate was shifted

to lower values of the ascending temperature sinus.

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Anhang - 101 -

7.0 Anhang 7.1 Publikationen

Kongressbeiträge: Talke C, Schneider H, Braun HA, Voigt K (2005)

Noradrenergic alpha-1 receptor mediated modulation of thermosensitive neurons in the

rat hypothalamic paraventricular and supraoptic nuclei.

7th Meeting of the German Neuroscience Society (Göttingen),

30th Göttingen Neurobiology Conference (February 17-20, 2005)

Anhang - 102 -

7.2 Akademische Lehrer

Meine akademischen Lehrer waren die Damen und Herren:

In Marburg:

Aumüller, Austermann, Barth, Cetin, Coca, Daut, Dibbets, Eckhorn, Feuser,

Flores-de-Jacoby, Folz, Gente, Glörfeld, Hasilik, Höffken, Holzheidt, Kohlmann,

Kuhn, Lehmann, Lill, Lohoff, Lotzmann, Mandrek, Mengel, Momeni, Mittag,

Pieper, Plant, Radsak, Ramaswamy, Röhm, Schrader, Seitz, Sonntag,

Stachniss, Stiletto, Stoll, Sundermayer, Suske, Umstadt, Voigt, Weihe, Werner.

Anhang - 103 -

7.3 Danksagung

Diese Arbeit entstand zwischen dem März 2004 und dem August 2006 am

Institut für Physiologie, Abteilung Neurophysiologie, der Medizinischen Fakultät

der Philipps-Universität Marburg.

Für die Überlassung des Themas und die Übernahme der Arbeit, die

hilfsbereite Arbeitsatmosphäre, Förderung in verschiedener Form, sowie sehr

guten Arbeitsbedingungen im Labor möchte ich Herrn Prof. Dr. Voigt sehr

herzlich danken.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Hans Braun und Herrn Dr. Horst

Schneider, ohne deren exzellente, freundschaftliche Betreuung und effiziente

Einführung in wissenschaftliche Arbeitsweisen diese Arbeit nicht entstanden

wäre. Die begeisternde, verantwortungsvolle Zusammenarbeit war für das

Gelingen von sehr großer Bedeutung.

Darüber hinaus hat es mir sehr viel Freude bereitet, am Institut für Physiologie

zu arbeiten und ich möchte allen Mitarbeitern, besonders Herrn Matthias Bauer

und Herrn Walther Born, für ihre fachkundige Hilfe und die wertvollen

Diskussionen danken.

Meiner Mutter Monika, meinem Bruder Fabian und meinen Großeltern, Änni

und Hans Lutz gebührt für ihre Geduld und fortwährende Unterstützung Dank.