UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO

ODDELEK ZA FIZIKO

Iztok Urbančič

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNA ČEVALCEV

Diplomsko delo

MENTOR:SOMENTOR:

prof. dr. Igor Muševič doc. dr. Janez Štrancar

Ljubljana, 2009

V veliko pomoč pri pripravi diplomske naloge so mi bili sodelavci v Laboratoriju za biofiziko na Institutu »Jožef Stefan«, ki so me prijazno vpeljali na raziskovalno pot. Hvala Igorju, Janezu, Marjani, Marjeti, Zoranu, Tilnu, Iztoku, Olegu, Sandri, Maji, Ajasji, Slavku ter Stanetu in Nacetu, ki sta sodelovala pri izvedbi dela meritev.

Iskreno sem hvaležen tudi vsem ostalim dobrim ljudem, ki so mi v času nastajanja

pričujočega dela pomagali rasti z nasvetom, zgledom in prijazno besedo.

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

5

Povzetek

Kombinacija spinskega označevanja in elektronske paramagnetne resonance (EPR) je v zadnjih petdesetih letih postala ena izmed pomembnejših raziskovalnih spektroskopskih metod v biofiziki in molekularni biologiji. Pri uporabi maščobnih spinskih označevalcev za raziskovanje membranskih sistemov se navadno privzema, da se slednji vgradijo v dvosloj nemoteče, da v njem zavzamejo po svoji osnovni zgradbi predvidljivo lego, da idealno posnemajo gibanje molekul v svoji okolici ter tako zanesljivo poročajo o lastnostih dvosloja. Prva predpostavka je upravičena, v kolikor je koncentracija dovedenih tujih molekul tako nizka, da ne spreminja razporeda maščobnih molekul in ne vpliva na njihove medsebojne interakcije. Vse ostale domneve so nasprotno lahko precej vprašljive, saj zanemarjajo vsakršen učinek razmeroma velike in močno polarne paramagnetne skupine na položaj molekule v membrani. Na poročanje lahko vplivajo tudi malenkostne razlike v biokemijski zgradbi osnove poročevalcev, saj se slednji najprej sami prilagodijo zahtevam okolja in ga šele nato po preostalih možnostih tudi opisujejo. Omenjeno zahteva posebno previdnost pri razlagi EPR meritev s spinskimi označevalci ter ponovno temeljito preverjanje temeljne narave le-teh.

V tem delu smo zato izbrali osem tovrstnih poročevalcev, ki se pogosto uporabljajo v raziskavah bioloških membran, in primerjali njihove odzive iz modelnih okolij s preprosto biokemijsko sestavo. Iz zbranih podatkov smo lahko po temeljiti obdelavi s pomočjo prostih rotacijskih prostorov in konformacijske entropije izluščili nekaj vplivov polarne glave označevalske molekule, dolžine njenega nepolarnega repa ter položaja pripete paramagnetne enote na poročanje spinskih označevalcev. Njihovo vrojeno neidealnost je potrebno izločiti z zaporedno uporabo več označevalcev in temeljito obdelavo meritev.

Klju čne besede: EPR, spinski označevalci, biološke membrane, konformacijska entropija

NON-IDEALITY OF SPIN LABELS

7

Abstract

Spin labelling coupled to electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) has become a powerful experimental technique to tackle various problems in the fields of biophysics and molecular biology, such as biological membrane characterization. To interpret the results of such experiments ideal reporting of the probes is assumed, i.e. that spin labels readily take a predicted place in the membrane and adopt motional patterns of neighbouring lipids without significantly disrupting the environment. While the latter can indeed be achieved by a low enough concentration of inserted molecules, the former never holds completely since the probe is subjected to its own free energy minimization. The rather large and polar paramagnetic centre, attached to the fatty acid, as well as the headgroup chemical composition and tail length, can non-negligibly influence the probe’s equilibrium state. Hence, much prudence is required when interpreting results obtained from spin labelling experiments which calls for a reconsideration of the technique.

To reveal the effect of the probe’s biased reporting EPR measurements of various mono-alkyl lipophilic spin probes in different model membranes with simple biochemical compositions were performed. Further on, a high-throughput advanced spectral analysis of acquired EPR data for membrane characterization in terms of free rotational space and conformational entropy was applied. A careful comparative analysis of the spin probe reporting unveils that the probe conformational entropy reflects not only the lipid state but depends also on the headgroup dissociation, the label-to-lipid alkyl chain length mismatch as well as on the nitroxide position. The spin labelling experiments should therefore take the biased reporting into account and eliminate it by successive multiple labelling and thorough EPR spectral analysis.

Key words: EPR, spin labels, biological membranes, conformational entropy

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

9

Kazalo

Povzetek ................................................................................................................................ 5

Abstract.................................................................................................................................. 7

Seznam pogosto uporabljenih kratic in oznak..................................................................... 11

1 Opredelitev in utemeljitev raziskave ........................................................................... 13

2 Osnove bioloških membran......................................................................................... 15

2.1 Osnovni gradniki so maščobne molekule............................................................ 15 2.2 Membranski dvosloj je posledica amfifilnosti maščob ....................................... 16 2.3 Biološke membrane so dvorazsežne tekočine ..................................................... 17 2.4 Vpliv biokemijske sestave na lastnosti membrane.............................................. 18 2.5 Nitroksidni membranski spinski označevalci ...................................................... 19

3 Elektronska paramagnetna resonanca.......................................................................... 21

3.1 Osnovna kvantna mehanika EPR ........................................................................ 21 3.2 Magnetne interakcije v molekularnih sistemih.................................................... 23 3.3 Oblika spektra nitroksidnega radikala ................................................................. 25 3.4 Zgradba in delovanje EPR spektrometra .............................................................28

4 Ozadje računalniške obdelave spektrov ...................................................................... 33

4.1 Optimizacijske metode spektralnih simulacij...................................................... 33 4.2 Združevanje rezultatov v domene ....................................................................... 35 4.3 Predstavitev z vzorci gibanja............................................................................... 37 4.4 Vpeljava rotacijske konformacijske entropije ..................................................... 39

5 Potek dela – od vzorcev do analize ............................................................................. 41

5.1 Priprava liposomov.............................................................................................. 42 5.2 Spinsko označevanje vzorcev.............................................................................. 43 5.3 Meritve EPR ........................................................................................................ 44 5.4 Obdelava meritev................................................................................................. 45

6 Razkrivanje neidealnega poročanja spinskih označevalcev ........................................ 47

6.1 Vpliv kemijske zgradbe glave (HFASL : MeFASL)........................................... 47 6.2 Vpliv položaja paramagnetnega centra (5-doxyl : 13-doxyl) .............................. 52 6.3 Vpliv dolžine repa označevalca (16-C : 18-C) .................................................... 53 6.4 Zaznavanje prisotnosti holesterola ...................................................................... 56

7 Razprava o metodi ....................................................................................................... 59

8 Zaključne ugotovitve ................................................................................................... 63

9 Viri............................................................................................................................... 65

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

11

Seznam pogosto uporabljenih kratic in oznak

EPR elektronska paramagnetna resonanca

SO spinski označevalec

NO nitroksidni obroč, paramagnetni center SO

HFASL SO na osnovi maščobne kisline

MeFASL SO na osnovi metilnega estra maščobne kisline

n-doxyl mesto, kjer je na verigo SO pritrjen NO: n C-atomov od karboksilne skupine oz. estrske vezi

DMPC lipid 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DPPC lipid 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DSPC lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

PBS fosfatni pufer

HEO hibridna evolucijska optimizacija

GHOST metoda za združevanje rešitev v domene

ϑ0 kot, ki v modelu opletanja NO opisuje odprtost stožca [rad], ∈ (0, π/2) ϕ0 kot, ki opisuje nesimetričnost (priščipnjenost) stožca [rad], ∈ (0, π/2) Ω prosti rotacijski prostor [ ], ∈ (0, 1)

SΩ konformacijska entropija [J/K, eV/K ali kB]

Tm temperatura glavnega faznega prehoda membrane [K]

13

1 Opredelitev in utemeljitev raziskave

Elektronska paramagnetna resonanca (EPR) se je sredi prejšnjega stoletja uveljavila kot pomembna biofizikalna, biokemijska in medicinska tehnika predvsem na področju detekcije in karakterizacije prostih radikalov [1]. Slednji so lahko atomi, molekule ali ioni z neničelnim elektronskim spinom, torej z vsaj enim nesparjenim elektronom, ki je običajno zelo reaktiven [2]. Manjkajoče elektrone zato taki delci ob prvi ugodni priliki »ukradejo« okoliškim molekulam, kar ima v celicah lahko zelo škodljive posledice, denimo cepljenje nenasičenih vezi ali mutacije pri podvojevanju dednega materiala. Zaradi visoke reaktivnosti prostih radikalov in njihove posledične kratkoživosti jih je v naravi razmeroma malo. Metoda EPR, ki opazuje prav snovi z nesparjenimi elektroni, je bila sprva zato omejena predvsem na prepoznavanje in opazovanje tistih redkih naravno prisotnih paramagnetnih snovi, npr. ionov prehodnih kovin, ter spremljanje različnih vrst prostih radikalov, nastalih v celicah med presnovnimi procesi ali kot posledica ionizirajočega obsevanja. Pravi razmah v bioloških znanostih pa je EPR doživela z odkritjem stabilnih organskih molekul z nesparjenim elektronom, t. i. spinskih označevalcev (SO), ki se vgradijo v preiskovani biološki sistem in nato »poročajo« o svojem okolju. Na ta način je možno proučevati mnoge lastnosti celičnih membran, proteinov, DNA ter interakcije med njimi [1].

Za uporabnost v ta namen morajo biti poročevalske molekule občutljive na spremembe v lastnostih okolice, kamor se vgrajujejo, ter informacije posredovati do ustreznega detektorja. Spinskim označevalcem to omogoča močna anizotropija magnetnih sklopitev, zaradi česar so njihova energijska stanja v magnetnem polju in posledično oblika absorpcijskega spektra odvisna od hitrosti in nesimetričnosti rotacijskega gibanja molekul ter od relaksacijskih mehanizmov zaradi interakcij z okolico, kar uspešno opisujejo ustrezni kvantnomehanski modeli. Pri tem je najpomembneje, da lahko biološki vzorci ostanejo v svojem naravnem okolju, torej v fiziološki raztopini s presežkom proste vode ter pri biološko sprejemljivih temperaturi in tlaku.

Hkrati se seveda predpostavlja, da vnos označevalcev ne spremeni bistveno lastnosti preiskovanega sistema. Pri načrtovanju zgradbe poročevalskih molekul si raziskovalci zato močno prizadevajo, da bi bile le-te ob čim večji občutljivosti na zunanje spremembe hkrati tudi čim bolj podobne naravnim molekulam, med katere se vgrajujejo, pri izvedbi poskusov pa poskrbijo, da je koncentracija označevalcev v preiskovanem vzorcu zadovoljivo majhna [1]. Tako naj bi dosegli skoraj »idealno« poročanje, pri katerem poročevalec ne ustvarja novice, ampak jo zares le posreduje.

Kljub vsemu ostaja vsaka poročevalska molekula svoja enota, ki se v prvi vrsti sama podreja vsem zunanjim vplivom. Četudi je še tako podobna vsem molekulam v okolici, se od njih nezanemarljivo razlikuje po dodani atomski skupini s stabilnim radikalskim

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

14

centrom. Novejše raziskave opozarjajo, da lahko lastnosti nekaterih vrst spinskih označevalcev prav zaradi te skupine presenetljivo odstopajo od predpostavljenega idealnega obnašanja [3]. Če pa neka poročevalska molekula ne posnema lastnosti svojega okolja, ampak se mu zaradi minimizacije lastne proste energije sproti in nepričakovano prilagaja, je lahko zanesljivost razlage njenega poročanja močno vprašljiva. Pri izpeljavi kakršnihkoli zaključkov na podlagi poskusov z izbranim označevalcem je zato potrebno preveriti in izločiti njegovo morebitno neidealno poročanje.

Značilnosti posameznih spinskih označevalcev lahko določimo s pazljivo primerjavo odzivov različnih poročevalcev iz enakih modelnih okolij, ki morajo biti dovolj preprosta, da njihova pestrost ne zamegli resničnega predmeta raziskave. Rezultati predstavljajo nekakšno umeritev raziskovalne metode za brezskrbnejše nadaljnje delo s tovrstnimi molekulami. V pričujočem diplomskem delu so zbrani in predstavljeni nekateri izidi raziskav, s katerimi smo preverjali obnašanje različnih spinskih označevalcev, ki se najpogosteje uporabljajo v raziskavah lastnosti celičnih membran [4]. Med seboj so si na prvi (vsaj fizikalni) pogled morda sicer res precej podobni, a se po nekaterih biokemijskih lastnostih vseeno močno razlikujejo, kar vpliva tudi na njihovo poročanje o preiskovanih membranskih sistemih.

15

2 Osnove bioloških membran

Celična membrana je tanka plast, ki ločuje notranjost celice od njene zunanjosti. Podobne membrane omejujejo tudi posamezne funkcionalne enote znotraj celice, t. i. organele. V obeh primerih je osnovna naloga membrane razmejevati predele, ki za svoje pravilno delovanje potrebujejo različno okolje. Membrana zato uravnava pretok posameznih snovi v celico in iz nje oz. med različnimi njenimi podprostori. Poleg tega z različno prepustnostjo posameznih molekul in ionov vzdržuje različne koncentracije snovi na obeh straneh membrane. S tem celici zagotavlja stalne koncentracijske gradiente, ki poganjajo ali uravnovešajo različne celične procese, denimo prenos informacij v obliki akcijskega potenciala. Čeprav se različne membrane po kemijski sestavi in posledično tudi fizikalnih lastnostih ter bioloških vlogah med seboj močno razlikujejo, imajo mnogo skupnih značilnosti. Predvsem so vse sestavljene iz dvosloja maščobnih molekul, ki se ob stiku z vodo spontano oblikuje zaradi hidrofobne interakcije, kar je posledica zgradbe osnovnih gradnikov.

2.1 Osnovni gradniki so maščobne molekule

Več kot polovico mase membran običajnih živalskih celic gradijo maščobne (lipidne) molekule [5], med katerimi so najpogostejši fosfolipidi. To je skupno ime za družino molekul, ki jih gradi polarni del s fosfatno skupino, t. i. glava molekule, na katero sta z estrsko vezjo pripeta dva nepolarna repa (Slika 1a). Repi so enostavne ogljikovodikove (alkilne) verige oz. maščobne kisline dolžine med 14 in 24 ogljikovih (C) atomov, najpogostejše so tiste s po 16 in 18 C-atomi. Če so vse vezi med njimi enojne, se take verige imenujejo nasičene maščobne kisline, tiste z eno ali več dvojnimi vezmi pa nenasičene maščobne kisline.

Poleg fosfolipidov celične membrane sestavljajo še glikolipidi, ki se od prvih razlikujejo po sladkornih skupinah, pripetih na fosfatno, ter steroidi s sistemom štirih ogljikovodikovih obročev in le enim repom (Slika 1b, holesterol kot najpomembnejši predstavnik družine). Tudi molekule teh dveh skupin sestavljata polarni in nepolarni del, torej hidrofilna skupina na eni strani ter hidrofobni del na drugi. Prav ta lastnost osnovnih gradnikov, t. i. amfifilnost, je ob stiku z vodo odgovorna za samourejanje maščobnih molekul v različne zgradbe, tudi v biološke membrane.

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

16

(a)

Nasičena m

aščobna kislina

Nenasičena

maščobna kislina

Glicerol

Fosfat

Holin

Polarna (hidrofilna)

glava

Nepolarni(hidrofilni)

repi

Nasičena m

aščobna kislina

Nenasičena

maščobna kislina

Glicerol

Fosfat

Holin

Polarna (hidrofilna)

glava

Nepolarni(hidrofilni)

repi

(b)

OHOH

Slika 1: Fosfatidilholin (a) je značilni predstavnik fosfolipidov, najpogostejših gradnikov bioloških membran. Na polarno glavo molekule sta pripeti po dve hidrofobni maščobni kislini. Dvojna vez v alkilni verigi povzroči zlom v poteku repa, kar ima pomembno vlogo pri zlaganju molekul v dvosloj in posledično na njegove makroskopske lastnosti. Te se močno spreminjajo tudi s koncentracijo holesterola (b), ki zaradi precej drugačne zgradbe povzroča odločno preurejanje maščobnih molekul. (V strukturnih formulah neoznačeni zlomi predstavljajo C-atome z ustreznim številom vodikov H.)

2.2 Membranski dvosloj je posledica amfifilnosti maščob

Maščobe zaradi močno nepolarnega dela svojih molekul v vodi niso topne. Stik med vodnimi in maščobnimi molekulami je namreč energijsko neugoden, ker nobena privlačna interakcija med njimi ne nadomesti energijskega primanjkljaja zaradi prisilne cepitve vodikovih vezi med molekulami vode. Maščobne molekule se zato raje uredijo v zgradbe, pri katerih proti vodi izpostavijo polarne dele, nepolarne repe pa zaščitijo v sredico brez stika z vodnimi molekulami. Tako stanje je energijsko toliko ugodnejše od neurejene raztopine maščob, da je sistem za dosego ravnovesja v minimumu proste energije pripravljen plačati entropijsko kazen zaradi visokega reda molekul.

Glede na obliko maščobnih gradnikov in njihovo koncentracijo lahko nastanejo različne oblike maščobnih tvorb (Slika 2), značilne za t. i. liotropske tekoče kristale. Za fosfolipidne molekule, ki gradijo celične membrane, je pri koncentracijah nad okoli 10−10 mol/l [6] najugodnejši maščobni dvosloj. Molekule se v njem razporedijo v dve plasti, ki se med seboj stikata z nepolarnimi repi, kar nazorno prikazujejo slike z elektronskim mikroskopom in potrjujejo rezultati sipanja rentgenske svetlobe. Celotna ravnina se nato ukrivi in zapre vase, da prepreči stik med vodo in hidrofobno sredico še na robovih. Dobljen maščobni mehurček, ki se v modelnih sistemih imenuje liposom, predstavlja stabilno obliko, ki jo izkoriščajo celice za osnovo svoje zgradbe. Za popolno delovanje membran v živih organizmih je poleg stabilnosti ključnih še nekaj lastnosti, med katerimi je verjetno najpomembnejša njihovo tekoče stanje.

2 Osnove bioloških membran

17

Liposom

Micela

Dvosloj

Liposom

Micela

Dvosloj

Slika 2: Maščobne molekule ob stiku z vodo proti topilu izpostavijo polarne glave, hidrofobne repe pa skrijejo v sredico. Glede na obliko posameznih gradnikov in njihovo koncentracijo se uredijo v eno izmed zgornjih oblik: liposom, micelo ali maščobni dvosloj. (Povzeto po prosto dostopnem spletnem viru [7].)

2.3 Biološke membrane so dvorazsežne tekočine

Okoli leta 1970 so z različnimi tehnikami ugotovili, da se lahko posamezne maščobne molekule precej neomejeno gibljejo po membrani [5]. Med najpripravnejšimi metodami je prav kombinacija spinskega označevanja in EPR, s katero je preko oblike spektra mogoče meriti urejenost in gibanje označenih fosfolipidov (podrobnejša razlaga sledi v poglavju 3, posvečenem EPR). Rezultati kažejo, da posamezne molekule zelo redko preskočijo v nasprotni sloj membrane, v povprečju redkeje kot enkrat na mesec, medtem ko znotraj vsakega sloja zelo hitro zamenjujejo mesta s sosedi. Izmerjeni difuzijski koeficient znaša okoli 10−8 cm2/s [5], tako da mikrometrsko razdaljo, primerljivo z velikostjo značilne bakterijske celice, posamezna maščobna molekula prepotuje v približno eni sekundi.

Gibljivost maščobnih molekul, ki je močno odvisna tako od temperature kot od biokemijske sestave membrane, je za živo celico ključnega biološkega pomena. Tekočnost membrane namreč določa njene transportne lastnosti ter aktivnosti v njej vgrajenih encimov, kot že dolgo potrjujejo raznovrstne raziskave na modelnih sistemih [5]. Umetna membrana iz ene same vrste fosfolipidov med ohlajanjem pri določeni temperaturi Tm preide iz tekoče (L) v t. i. gelsko fazo (S). Prehod poleg skoka v difuziji gradnikov za tri do devet redov velikosti [8] spremlja tudi nezvezna sprememba orientacijskega ureditvenega parametra Sz

( )21 3cos 12zS ϑ= − , (1) ki preko kotov ϑ opisuje usmerjenost fosfolipidnih repov glede na normalo membrane z*. Ob tem se sprošča utajena toplota, tako da gre za pravi termodinamski fazni prehod prve vrste (glej npr. [9]).

* Za razliko od izotropne faze termotropskih tekočih kristalov ima ureditveni parameter maščobnih zgradb tudi pri visokih temperaturah končno vrednost, kar je posledica hidrofobne interakcije.

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

18

Temperatura Tm, pri kateri se spremeni stanje membrane, je odvisna od dolžine in nasičenosti njenih gradnikov. Med krajšimi verigami je prisotnih manj interakcij, za razrahljanje katerih posledično zadošča nižja temperatura kot v primeru molekul z dolgimi repi. Temperaturo faznega prehoda niža tudi prisotnost nenasičenih vezi v verigi, ki povzročajo koleno v poteku verige, kar otežuje tesno prileganje maščobnih molekul in s tem zmanjšuje učinek privlačnih sil med fosfolipidnimi repi. Ker celične membrane niso sestavljene zgolj iz ene vrste maščob, je iz opisanega razvidno, da lahko celica na tekočnost svoje celične membrane in z njo povezane lastnosti pomembno vpliva s spreminjanjem sestave dvosloja.

2.4 Vpliv biokemijske sestave na lastnosti membrane

Celice bakterij biofizikalno obnašanje svoje membrane glede na zunanjo temperaturo uravnavajo s spreminjanjem deležev različno dolgih fosfolipidov z različnim številom dvojnih vezi [5]. Živalske celice podobno dosežejo z vmešavanjem različnih koncentracij holesterola. Osnovni gradniki le-tega se po obliki namreč močno razlikujejo od fosfolipidnih, tako da s svojim vključevanjem v dvosloj na molekularni ravni spreminjajo red in z njim ključne lastnosti membrane.

Polarna hidroksilna (–OH) skupina holesterolnih molekul se v mešanih membranah nahaja v hidrofilnem delu dvosloja, torej med glavami fosfolipidov. Sistem obročev tako pride v področje zgornjega dela nepolarnih verig ter jim s svojo velikostjo in togostjo nekoliko omeji sposobnost gibanja. Po drugi strani v spodnjem delu membrane zavzema holesterol z eno samo verigo precej manj prostora kot fosfolipidi, tako da se tem v spodnjem delu repov, tj. v sredini membrane, sprosti nekaj prostora za svobodnejše gibanje. Poleg tega visoke koncentracije holesterola, ki ga je v nekaterih membranah celo več kot fosfolipidov, preprečujejo bližnji stik ostalih maščobnih molekul, ki je odgovoren za urejanje v gelsko fazo.

Tekoča faza s holesterolom bogate membrane se po ureditvenem parametru in koeficientu difuzije nekoliko razlikuje od visokotemperaturne faze čistega fosfolipidnega dvosloja [8], zato jima za lažje razločevanje in predstavljanje v faznih diagramih (Slika 3) pripisujejo še pridevnika urejena (Lo) oz. neurejena tekoča faza (Ld). Pri vmesnih koncentracijah holesterola, med približno desetimi in štiridesetimi množinskimi odstotki, se v membranah oblikujejo domene s posameznimi fazami, značilnimi za oba mejna primera koncentracij. Pojav področij z različno biokemijsko sestavo, t. i. koeksitenca faz, je za delovanje celice ključnega pomena, saj je delovanje mnogih membranskih proteinov močno odvisno od maščobnih molekul v okolici. Tako lahko ista celica na različnih delih svoje membrane gosti encime, ki za opravljanje svojih nalog potrebujejo različne pogoje.

Mnogo raziskav lastnosti membran in njene domenske zgradbe so opravili z metodo EPR. Ker maščobne molekule nimajo nesparjenih elektronov, ki bi jih s to tehniko lahko zaznali, so sredi prejšnjega stoletja razvili t. i. membranske spinske označevalce, ki se vgradijo v biološki dvosloj in nato poročajo o njegovih lastnostih.

2 Osnove bioloških membran

19

275

285

295

305

315

325

335

0 0.1 0.2 0.3 0.4Xchol

T (K)

DMPC : holesterol

Delež holesterola

Tem

pera

tura

[K] Ld

Ld + Lo

Lo

S + LoS

275

285

295

305

315

325

335

0 0.1 0.2 0.3 0.4Xchol

T (K)

DMPC : holesterol

Delež holesterola

Tem

pera

tura

[K] Ld

Ld + Lo

Lo

S + LoS

Slika 3: Fazni diagram mešanice fosfolipida DMPC (14:0) in holesterola. Čisti fosfolipidni dvosloji pri določeni temperaturi preidejo iz gelske (S) v neurejeno tekočo fazo (Ld). S holesterolom bogate membrane ne glede na temperaturo vzdržujejo urejeno tekočo fazo (Lo), ki se od neurejene razlikuje po višjih povprečnih vrednostih ureditvenega parametra in nižjem koeficientu difuzije posameznih molekul. V vmesnih območjih koncentracij holesterola so v sistemu hkrati prisotne domene s fazama obeh skrajnosti. (Z dovoljenjem avtorja povzeto po viru [10].)

2.5 Nitroksidni membranski spinski označevalci

Naravna izbira za molekule, ki naj bi poročale iz bioloških membran in bi jim zato radi umetno pripeli paramagnetni center, so seveda maščobne molekule, denimo fosfolipidi. Te so okoliškim gradnikom najpodobnejše, zato naj bi najmanj motile izvirni sistem in o njem poročale najzanesljiveje. V primeru raziskovanja modelnih membran, kjer jih lahko liposomom dodamo že med pripravo vzorca, so se zares izkazale za učinkovite, medtem ko pri naknadni vgradnji povzročajo kar nekaj eksperimentalnih težav [11]. Za vključevanje takih označevalcev v membrano je potrebno uporabiti posebne transportne proteine, poleg tega je lahko porazdeljevanje tovrstnih poročevalcev v togih membranah prepočasno za nekatere biološko zanimive poskuse.

Naslednja logična izbira so zato označevalci na osnovi maščobnih kislin, torej z le eno alkilno verigo in brez velikih atomskih skupin v polarnem delu (Slika 4a). Taki označevalci so mnogo bolj gibljivi in se veliko hitreje in enakomerneje porazdelijo po dvosloju, zato se danes povečini uporabljajo za raziskovanje membran. Poročevalci se med seboj lahko razlikujejo po dolžini hidrofobnega repa, po kemijski zgradbi polarnega dela, ki ga lahko predstavljata denimo hidroksilna kislinska skupina (–COOH) ali njen metilni ester (–COO–CH3), ter po položaju, kamor je pripet paramagnetni center.

Med slednjimi se je kot najuporabnejša izkazala nitroksidna skupina ali na kratko nitrokisid (NO) [1], ki jo tvori kisik, pripet na dušikov atom (Slika 4b). Eden od kisikovih elektronov v taki razporeditvi ostane nesparjen, a mu sosednji atomi v obroču oblikujejo dovolj globoko potencialno jamo in s tem poskrbijo za potrebno stabilnost radikala. Tak

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

20

paramagnetni center je možno z usmerjenimi reakcijami pripeti na različne dele izbrane temeljne molekule, denimo na različne lege vzdolž hidrofobnega repa, prav tako lahko za osnovo izberemo različne vrste molekul.

Poleg dolgoživosti in prilagodljivosti nitroksidnega radikala je za razmah uporabe ključna še njegova občutljivost na fizikalno-kemijske spremembe v okolju. Zaradi močne anizotropije elektronske orbitale nesparjenega spina takih označevalcev se razlike v gibanju molekul ter njihovem položaju glede na magnetno polje odražajo v obliki absorpcijskega spektra, ki ga meri EPR, kar daje tej metodi občutljivost na anizotropijo lokalnih gibanj in kemijske lastnosti lokalnega okolja [1].

(a) (b)

Slika 4: (a) Maščobne kisline s pripetim paramagnetnim centrom in njihovi derivati so zaradi podobnosti maščobnim molekulam med najpogosteje uporabljanimi membranskimi spinskimi označevalci. (b) Nesparjen elektron, ki omogoča meritve EPR, je med dušikom (N) in kisikom (O) nitroksidne skupine ujet v potencialni jami med štirimi okoliškimi metilnimi skupinami.

21

3 Elektronska paramagnetna resonanca

Elektronska paramagnetna resonanca (EPR) je spektroskopska metoda, ki preko absorpcije elektromagnetnega valovanja zaznava prehode med elektronskimi spinskimi nivoji v zunanjem magnetnem polju. Energije elektronskih stanj radikalov so odvisne od elektronskih orbital, lege in gibanja molekule ter nekaterih lastnosti njenega okolja, denimo lokalne polarnosti in koncentracije protonov. Ker je fizikalno ozadje posameznih vplivov razmeroma dobro raziskano, je možno z analizo glavnih značilnosti posnetega absorpcijskega spektra, tj. resonančne frekvence, multipletnih razcepov in oblike spektralnih črt, natančno in zanesljivo opredeliti marsikateri preiskovani sistem. Globlje razumevanje mehanizmov, ki omogočajo tudi raziskovanje bioloških membran s spinskimi označevalci, leži v kvantnomehanskih osnovah uporabljene merilne metode.

3.1 Osnovna kvantna mehanika EPR

Za paramagnetni odziv snovi na zunanje magnetno polje potrebujejo njeni gradniki lastni magnetni dipol µµµµ, ki je v prvi vrsti posledica elektronske vrtilne količine J. Slednjo sestavljata tirni prispevek L ter spinski del S. Kvantna števila elektrona L, S in J v približku za prost elektron preko Landéjevega sklopitvenega faktorja g

( 1) ( 1) ( 1)

2 ( )1

1

J J L L S S

J Jg

+ − + +=+

+ + (2)

določajo magnetni moment atoma ali molekule

ˆ ˆBgµ= −µ J . (3)

Konstanta Bµ predstavlja Bohrov magneton 0 / 2B emeµ = ℏ , ki združuje velikost naboja elektrona 0e ter njegovo maso em z reducirano Planckovo konstanto / 2h π=ℏ . Strešice v zapisu označujejo kvantnomehanske operatorje.

Energijo magnetnega momenta v zunanjem magnetnem polju B z gostoto B0 določa Hamiltonov operator

0ˆˆ · ˆ·Ĥ JB B zg g Bµ µ− == =µ B B J , (4)

kjer je Ĵz operator, ki ustreza projekciji vrtilne količine na smer zunanjega magnetnega polja. Pričakovane vrednosti teh projekcij m so v splošnem vrednosti, ki se med –J in +J

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

22

razlikujejo za celo število. Populacija elektronov se torej v magnetnem polju razsloji na 2 1J + nivojev z vrednostjo energij 0BmE gB mµ= (Slika 5).

Verjetnost za zasedenost stanja m pri temperaturi T podaja Boltzmannova porazdelitev

( )

( )exp /

exp /m

mm

B

Bm

E k T

E TP

k

−−

=∑

, (5)

kjer kB kot običajno označuje Boltzmannovo konstanto. Elektroni lahko med sosednjimi stanji prehajajo z absorpcijo fotonov, katerih energija po frekvenci elektromagnetnega valovanja 0ν ravno ustreza energijski razliki ∆Ε med nivojema m in 1m±

0 0BEh gBν µ= ∆ = , (6)

kar imenujemo resonančni pogoj in predstavlja osnovo delovanja EPR. Pri večini molekulskih sistemov, tudi v primeru nitroksidnega radikala, k skupni

elektronski vrtilni količini J prispeva skoraj izključno le spinski del S [1], saj so zaradi simetrije orbital vrednosti vseh prostorskih integralov, s katerimi so določene projekcije tirne vrtilne količine, enake nič. Kvantna števila, ki opisujejo naš sistem, tako ostanejo 0L = ter 12J S= = , torej ima sklopitveni člen po enačbi (2) vrednost 2g ≈ . Malenkostna odstopanja od vrednosti za prost elektron so posledica majhnih popravkov zaradi sklopitve spinske in preostanka tirne vrtilne količine [1].

V primeru radikalov z zanemarljivim tirnim prispevkom k skupni vrtilni količini se stanja torej razcepijo na dva nivoja s projekcijama spina 12m= ± (Slika 5). Energijska razlika med njima je odvisna od izbrane gostote magnetnega polja. Pri EPR meritvah v t. i. »pasu X« mikrovalov s frekvenco okoli 9 GHz po resonančnemu pogoju (6) ustreza gostota magnetnega polja 0,34 T. Energija magnetnega momenta v zunanjem polju po enačbi (4) pri teh pogojih znaša okoli 4⋅10−5 eV, kar je več kot tisočkrat manj od termične energije delcev pri sobni temperaturi kBT. Relativna razlika v zasedenosti obeh stanj (5) je zato izjemno majhna, prav tako pod 10−3, a je vseeno odločilna za zajem EPR spektra. Ko vzorec obsevamo z mikrovalovi, elektroni v nižjem energijskem stanju absorbirajo energijo valovanja in prehajajo na višji nivo. Hkrati z absorpcijo potekajo tudi obratni prehodi stimulirane emisije, pri katerih elektroni z višjega elektronskega nivoja padajo v nižje stanje in pri tem oddajajo energijo v obliki mikrovalovnih fotonov. Ker je hitrost prehodov v eno ali drugo smer sorazmerna z zasedenostjo izhodiščnih nivojev, v seštevku sistem absorbira več energije, kot je odda s stimulirano emisijo, dokler se zasedenosti obeh nivojev ne izenačita. Takrat pride do nasičenega stanja in EPR signal, ki je sorazmeren neto absorpciji energije, izgine.

Sistem se vrne v termodinamsko ravnovesno stanje preko različnih relaksacijskih mehanizmov, s katerimi v obliki toplote sprosti odvečno energijo. Hitrost vračanja v ravnovesje podaja spinsko-mrežni relaksacijski čas T1. Ker je energija stanja, ki traja le določen čas ∆t, po Heisenbergovem načelu nedoločena na /E h t∆ ≈ ∆ , je tudi energijski razmik med spinskima nivojema razmazan za okoli 1/h T , kar prinese osnovno oz. naravno širino Lorentzove absorpcijske črte.

3 Elektronska paramagnetna resonanca

23

Gostota magnetnega polja – B0

Ene

rgija

–E

B0 = 0

m = -½

m =+½

Absopcijska črta

Odvod absorpcijske črte

M =+1M = 0M = -1

M = -1M = 0M =+1

∆E = hν

Gostota magnetnega polja – B0

Ene

rgija

–E

B0 = 0

m = -½

m =+½

Absopcijska črta

Odvod absorpcijske črte

M =+1M = 0M = -1

M = -1M = 0M =+1

∆E = hν

Slika 5: Energijska stanja elektrona s spinom s = ½ se v magnetnem polju B0 razcepijo glede na projekcijo spina na smer zunanjega polja m. Jedra z lastnim magnetnim momentom (denimo dušik z I = 1 in ustreznimi projekcijami M) povzročijo še dodaten hiperfini razcep. Sistem lahko absorbira energijo vpadnega valovanja, v kolikor energija fotonov hν ustreza energijski razliki ∆E med stanjema z dovoljenim prehodom.

Pri poskusih se nasičenju običajno izognemo z uporabo nizke moči mikrovalovnega

izvora, tako da na širino izmerjene absorpcijske črte vplivajo predvsem drugi relaksacijski procesi, pri katerih se zaradi lokalnih magnetnih interakcij z okolico izgublja faza magnetizacije [1]. Ker ne prihaja do prehodov elektronov med stanji, se celotna magnetna energija sistema ohranja. Vpliv tovrstnih mehanizmov na širino spektralne črte opisuje značilni relaksacijski čas T2, imenovan tudi spinsko-spinski relaksacijski čas.

Do sedaj našteti procesi oblikujejo vsako posamezno spektralno črto EPR spektrov, ne pojasnijo pa njihove najočitnejše lastnosti – števila absorpcijskih črt, ki je pomembna značilnost vsake paramagnetne enote.

3.2 Magnetne interakcije v molekularnih sistemih

Multipletna ali hiperfina zgradba spektrov, tj. število absorpcijskih vrhov, je najbolj prepoznavna značilnost EPR signala posameznih snovi in je zato uporaben določevalni ključ v vzorcu prisotnih radikalov. Je namreč neposredna posledica interakcije elektronskega spinskega magnetnega momenta z magnetnim momentom jedra, ki ima neničelno spinsko vrtilno količino I . Jedra najpogostejših izotopov ogljika in kisika 12C

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

24

oz. 16O spina nimajo, torej tudi magnetnega momenta ne, imajo pa ju jedra atomov nekaterih drugih elementov. Velikost spina jeder vodika 1H, fluora 19F in ogljikovega izotopa 13C v enotah ħ znaša 12 , dušikovega jedra

14N 1, kisikovega izotopa 17O 52 itd. Elektroni paramagnetne snovi glede na različne projekcije jedrskega spina na zunanje magnetno polje M čutijo nekoliko različna lokalna magnetna polja, zato resonančni pogoj ni za vse nesparjene elektrone izpolnjen hkrati. Ker se pri prehodu med stanji po izbirnih pravilih lahko spremeni le vrednost projekcije elektronskega spina, ne pa tudi jedrskega*, je EPR spekter paramagnetnih snovi glede na velikost jedrskega spina I sestavljen iz 2 1I + absorpcijskih črt. Nitroksidni radikali, pri katerih paramagnetni elektron v bližini čuti spin dušikovega jedra, imajo torej tri spektralne vrhove (Slika 5).

Medsebojni vpliv magnetnih momentov jedra in elektrona sestavljata dva prispevka – klasična dipolarna interakcija ter kvantna Fermijeva kontaktna sklopitev [1]. Slednja je znatna le v primeru, ko valovna funkcija elektrona na mestu jedra ni enaka nič, torej le za dele orbitale z s-simetrijo. Nasprotno dipolna interakcija prav pri orbitalah s krogelno simetrijo izgine, oba člena pa prideta do izraza v mešanih atomskih orbitalah. Po integraciji po prostorskih koordinatah njun skupni vpliv v dodatnem členu spinske hamiltonke opisuje tenzor hiperfine sklopitve AAAA, ki povezuje jedrski in elektronski spin†

ˆˆ ˆH · ·hf = I SAAAA . (7)

Od prostega elektrona, opisanega v prejšnjem razdelku, se nesparjen elektron v molekuli še v nečem pomembno razlikuje: okolica usmeritvi orbital predpisuje novo prostorsko referenco. Zaradi sklopitve med spinsko in tirno količino, ki prinaša majhne popravke že k osnovnemu stanju, je sedaj energija sistema odvisna od relativne smeri zunanjega magnetnega polja glede na lego molekularne osi. Sklopitveni faktor oz. giromagnetno razmerje, ki podaja zvezo med spinom in magnetnim momentom delca, zato iz skalarja g navidezno zrase v tenzor drugega reda gggg [1].

Skupna hamiltonka, ki določa energije molekularnega spinskega sistema v zunanjem magnetnem polju, se v tem opisu torej glasi

ˆ ˆˆ ˆH · · · ·Bµ= +S I SB g Ag Ag Ag A . (8)

Če poznamo vrednosti vseh členov, ki nastopajo v zgornjem izrazu, lahko določimo energijska stanja raziskovanega sistema in iz razlik med nivoji predvidimo absorpcijski spekter. V kolikor interakcije niso povsem znane oz. nas prav te zanimajo, lahko z meritvijo EPR signala in prilagajanjem parametrov ustreznega modela izluščimo koristne podatke o molekularnem dogajanju v vzorcu.

* Foton svojo energijo in vrtilno količino vloži v spremembo projekcije spina elektrona ali jedra, a ne obeh hkrati. Ker je magnetni moment jedra približno dvatisočkrat manjši od elektronskega, so pri isti vrednosti gostote magnetnega polja tudi razcepi med energijskimi nivoji tako različni. Pri določenem magnetnem polju torej z energijo vzbujevalnega valovanja izbiramo med elektronsko in jedrsko magnetno resonanco. † Globlja razprava o vsebini tenzorja na tem mestu ni potrebna, saj ni glavni predmet raziskave diplomskega dela niti ne prispeva pomembno k njegovemu temeljitejšemu razumevanju, je pa podrobno obdelana v standardni literaturi o EPR, npr. [1].

3 Elektronska paramagnetna resonanca

25

3.3 Oblika spektra nitroksidnega radikala

Zadnja enačba predstavlja osnovo za izračun energij lastnih stanj molekularnega paramagnetnega sistema v zunanjem magnetnem polju*. Pri tem se je potrebno zavedati, da je vsaka od količin dobro določena le v svojem koordinatnem sistemu (Slika 6) [12]. Smer zunanjega magnetnega polja B predpisuje laboratorijski koordinatni sistem (l), tenzorja gggg in AAAA, ki opisujeta magnetne lastnosti radikalskega centra, sta smiselno opisljiva le v molekularnem (orbitalnem) sistemu nitroksida (n), spinska operatorja pa sta dobro določena le v sistemu lokalnega magnetnega polja (lm). Izbira koordinatnih sistemov sicer ne vpliva na lastnosti hamiltonke (8) in posledično tudi ne na energije lastnih stanj sistema, a morajo biti za izračun slednjih vse nastopajoče količine izražene v isti bazi. Za prehode med sistemi poskrbijo ustrezne rotacijske transformacije med prostori i j→RRRR , dobljene kot zmnožek matrik za zasuke okoli ustreznih Eulerjevih kotov vrtenja pri prehodu med sistemoma. Resnično uporabna oblika Hamiltonovega operatorja paramagnetnega sistema v zunanjem magnetnem polju je torej

ˆ ˆˆ ˆH · · · · · · · ·l n lm n lm n lm nBµ→ → → →= +S I SB R g R R A RR g R R A RR g R R A RR g R R A R , (9)

kjer nadčrta označuje transformacijo v obratni smeri i j j i→ →=R RR RR RR R . V matričnem zapisu to pomeni transponirano izvorno matriko.

Prehod med laboratorijskim in nitroksidnim koordinatnim sistemom lahko razdelimo s še eno vmesno stopnjo – membranskim koordinatnim sistemom (m), ki ga pri vsaki označevalski molekuli v vzorcu določa normala membrane v okolici (Slika 6). Za prvi prehod med laboratorijskim in membranskim okoljem zadoščata že dve vrtenji za kota Φ in Θ

cos sin 0 cos 0 sin

sin cos 0 0 0

0 0 1 s

1

in 0 cos

l m→

= −

Φ Φ Θ ΘΦ Φ

Θ Θ −

RRRR , (10)

saj je hamiltonka invariantna na vrtenje okoli smeri magnetnega polja, ki določa laboratorijski koordinatni sistem. Drugi del prehoda, ki podaja medsebojni legi membranskega in nitroksidnega sistema z zaporedjem treh vrtežev za kote ϕ, ϑ in ψ, opisuje produkt matrik

cos sin 0 cos 0 sin cos sin 0

sin cos 0 0 0 sin cos 0

0 0 1 sin 0 cos 0 0 1

1m nϕ ϕ ϑ ϑ ψ ψϕ ϕ ψ ψ

ϑ ϑ

→

= − − −

RRRR . (11)

* V tem razdelku so predstavljeni le za razumevanje bistveni koraki, saj je celotna izpeljava za predstavitev na tem mestu preobsežna. Natančni izračuni so skupaj s tehničnimi podrobnostmi modela izčrpno opisani v viru [12].

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

26

Slika 6: V hamiltonki prisotne količine so dobro določene le v svojih koordinatnih sistemih: magnetno polje v laboratorijskem, spinski operatorji v sistemu lokalnega magnetnega polja, sklopitvena tenzorja v koordinatnem sistemu nitroksida, membranski koordinatni sistem pa je v pomoč pri nadaljnjih izračunih časovnega povprečevanja. Prehode med posameznimi opisi opisujejo vrteži z ustreznimi Eulerjevimi koti. (Z dovoljenjem avtorja povzeto po [12].)

Ker poročevalske molekule v preiskovanem vzorcu zavzemajo različne lege glede na

smer zunanjega magnetnega polja, je potrebno vse njihove prispevke ustrezno sešteti. Tenzorji in operatorji, ki nastopajo v enačbi (9), so za vse označevalce enaki, tako da se členi vsote razlikujejo le po transformacijskih matrikah. Pri uporabi slednjih je potrebno upoštevati termično gibanje označevalskih molekul, saj je lahko opletanje njihovih repov glede na membransko pravokotnico hitrejše kot to lahko zaznava EPR (Slika 7). Časovno okno metode je namreč omejeno s časom, ki ga vsak vzbujen elektron preživi v višjem energijskem stanju, tako da je vsakršno gibanje z značilnimi korelacijskimi časi τc pod nekaj ns »zamegljeno«. S tem se tudi magnetne lastnosti izpovprečijo po dovoljenih orientacijah nitroksidne skupine glede na okoliško membrano. Omenjena povprečja je mogoče določiti v okviru modela, ki dovoljuje prosto opletanje repov označevalcev znotraj nesimetričnega priščipnjenega stožca z značilnima kotoma 0ϑ in 0ϕ (Slika 8), ki v modelu nastopata kot nastavljiva parametra.

Poleg lastnosti gibanja nitroksida energije lastnih stanj določa tudi okolica, ki vpliva na obliko in orientacijo orbitale. Vpliv lokalne polarnosti in koncentracije protonov model upošteva s spremenljivkama pA in prot, ki linearno popravljata vrednosti elementov obeh sklopitvenih tenzorjev. Energije lastnih stanj tako opisanega spinskega sistema v zunanjem magnetnem polju po teoriji motenj dobimo med lastnimi vrednostmi Hamiltonove matrike, katere elementi so definirani s predpisom

3 Elektronska paramagnetna resonanca

27

Slika 7: Če so značilni časi gibanja molekule precej krajši od tistega, ki ga elektron preživi v vzbujenem stanju po absorpciji mikrovalovnega sevanja, lahko meritve EPR zaznajo le časovno povprečene vrednosti magnetnih lastnosti nitroksida.

Ĥij i jE ψ ψ= . (12)

Funkcije iψ , ki opisujejo spinska stanja elektrona in pripadajočega jedra, lahko pripadajo poljubnemu polnemu naboru baznih funkcij. Smiselna izbira za sistem z nesparjenim elektronom in jedrskim spinom so seveda funkcije z dobro določenima projekcijama obeh spinov na zunanje magnetno polje m in M. Za nitrokside z velikostjo jedrskega spina 1 se tak uporaben nabor šestih možnih kombinacij glasi

{ } { }1 1 1 1 1 12 2 2 2 2 21 , 1 , 0 , 0 , 1 , 1m M = − − − − − . (13)

Za pospešitev računanja lastnih vrednosti matrike velikosti 6 6× je namesto splošnih metod smiselno poiskati hitreje dostopen, a za dotični primer ustrezno natančen približek. Po analizi velikostnih redov nastopajočih elementov matrike in temeljitem preverjanju različnih poenostavitev [12] se je za najučinkovitejšo izkazala metoda, ki upošteva le glavno in dve stranski diagonali matrike Eij (12). V tem primeru so lastne vrednosti celo analitično izrazljive, od natančnih rešitev pa se razlikujejo za okoli 0,01 %. Velikostni red odstopanja je v absolutnem merilu primerljiv s korakom pri zajemu eksperimentalnega spektra EPR pri mikrovalovnem pasu X, tako da poenostavitev izračuna povsem zadošča

Slika 8: Gibanje paramagnetnega centra je po modelu, uporabljenem v spektralnih simulacijah, omejeno v nesimetrični priščipnjen stožec, ki ga opisujeta kota ϑ0 in ϕ0.

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

28

namenu. Tako lahko za vsako orientacijo membrane glede na zunanje magnetno polje dobimo energije elektronskih stanj, med katerimi elektromagnetno obsevanje vzbuja prehode.

Za določitev končne oblike absorpcijskega spektra, ki se v diskretizirani obliki imenuje tudi palični spekter (Slika 9, levo), je potrebno torej le še učinkovito sešteti prispevke vseh usmeritev molekul v vzorcu, ki jih opisujeta kota Φ in Θ. V primeru meritev na celicah ali liposomih so vse smeri enakovredno zastopane, za drugačne vzorce, denimo sklad ravnih membranskih plasti, pa je pripadajoče geometrije potrebno upoštevati z ustrezno prirejenimi porazdelitvami.

Palični spekter predstavlja torej porazdelitev resonančnih energij, ki bi jih absorbiral stabilni paramagnetni sistem brez relaksacijskih mehanizmov. Slednji po opisu v poglavju o kvantnomehanskih osnovah EPR 3.1 vsako spektralno črto razširijo, tako da je pričakovan absorpcijski spekter konvolucija paličnega spektra z Lorentzovo krivuljo ustrezne širine, ki jo določata fenomenološka parametra W in τc. Za primerjavo z izmerjenim EPR signalom moramo pravzaprav v konvoluciji uporabiti odvod omenjene funkcije (Slika 9), saj na izhodu iz spektrometra iz tehničnih razlogov, pojasnjenih v sledečem razdelku, namesto absorpcijskega spektra vedno dobimo približek njegovega prvega odvoda.

Slika 9: Palični spekter (levo) predstavlja izračunano porazdelitev resonančnih pogojev za absorpcijo danega mikrovalovnega vzbujanja za množico označevalcev v izbranem sistemu. Po konvoluciji z odvodom Lorentzove funkcije (v sredini), ki naravno širino črt združuje z delovanjem spektrometra, lahko izračunani spekter primerjamo z izmerjenim (desno).

3.4 Zgradba in delovanje EPR spektrometra

EPR spektrometer mora kot naprava za zaznavanje absorpcije elektromagnetnega valovanja v vzorcu z nesparjenimi elektroni glede na prej opisano fizikalno ozadje vsebovati vsaj tri osnovne enote: izvor elektromagnetnega valovanja, statično magnetno polje na mestu merjenega vzorca ter detektor za zaznavanje absorbirane energije. Do absorpcije v vzorcu pride, v kolikor energija fotonov vpadnega valovanja ustreza energijskim razmakom med spinskimi stanji. Energijo obsevanja pri optičnih spektrometrih običajno nadziramo s spreminjanjem frekvence svetlobe, pri meritvah EPR, kjer so mikrovalovni izvori iz kasneje pojasnjenih razlogov sicer »enobarvni«, pa spektrometrijo omogoča odvisnost energijskih razlik med spinskimi nivoji od gostote magnetnega polja (6). S spreminjanjem slednje lahko namreč enakovredno prečešemo celoten energijski spekter vzorca.

3 Elektronska paramagnetna resonanca

29

Po resonančnem pogoju (6) vsaki izbrani frekvenci vzbujevalnega valovanja načeloma ustreza neka vrednost magnetnega polja, pri kateri bo vzorec absorbiral energijo. Sama narava elektronskih stanj tako še ne narekuje izbire mikrovalovnega izvora ali jakosti magneta, a določa kombinacija obeh morda najpomembnejšo lastnost spektrometra – njegovo občutljivost. Slednja rase približno s kvadratom frekvence valovanja [13], torej bi bil na prvi pogled zaželen izvor valovanja s čim višjo energijo fotonov. Uporabo visokih frekvenc žal omejujejo trije dejavniki: (i) manjša količina vzorca, ki ga je možno postaviti v resonančno votlino, katere velikost je pogojena z valovno dolžino valovanja, kljub večji občutljivosti spektrometra v absolutnem merilu pomeni šibkejši signal, (ii ) visoka frekvenca vzbujevalnega valovanja obenem zahteva močno in zelo homogeno magnetno polje, (iii ) pri meritvah na vodnih vzorcih pa občutljivost niža še frekvenčno odvisna absorpcija valovanja v vodi zaradi njenih dielektričnih lastnosti. Zaradi omenjenih vplivov se za večino EPR meritev bioloških in drugih vzorcev v vodnih raztopinah običajno uporablja valovanje pri okoli 9,5 GHz (»pas X«) [13].

3.4.1 Osnovni sestavni deli

Slika 10 prikazuje bločno shemo bistvenih komponent uporabnega EPR spektrometra. Ustrezno magnetno polje z gostoto B0 okoli 0,34 T zagotavlja elektromagnet z nastavljivim izvorom moči, ki s krmiljenjem jakosti električnega toka po glavnih tuljavah omogoča spreminjanje gostote magnetnega polja po majhnih diskretnih korakih in s tem otipavanje absorpcijskega spektra preiskovanega spinskega sistema. Za sprotno preverjanje gostote magnetnega polja in zagotavljanje njene stabilnosti je v bližini vzorca vgrajena Hallova sonda, ki je preko krmilne zanke povezana z napajanjem magneta. Za meritve organskih radikalov v tekočih raztopinah morajo biti časovna odstopanja in tudi prostorske nehomogenosti manjše od 1 µT [13]. Za izvor mikrovalovnega sevanja nekdaj prevladujoč klistron danes večinoma nadomešča Gunnova dioda. To je polprevodniški element, v katerem se zaradi posebne karakteristike upornosti* ob nadkritični napetosti pojavijo tokovne oscilacije v frekvenčnem območju nekaj GHz [14,15]. Te v sklopljeni resonančni votlini vzbudijo stoječe valovanje, ki nato skozi prilagodljivi dušilni element po valovodu potuje proti vzorcu [16].

Na mestu, kjer preiskovani sistem absorbira dovedeno energijo, je zaželena visoka gostota energije vzbujevalnega valovanja, da je magnetni učinek na prisotne spinske centre čim večji in s tem EPR signal čim močnejši. Gostota energije potujočega valovanja v valovodu je razmeroma nizka, zato je vstavljanju vzorca namenjena resonančna votlina ali na kratko resonator, kjer se vzpostavi stoječe valovanje z lokalno precej višjo energijsko gostoto. Velikost in oblika votline določata resonančno frekvenco valovanja, kar je poglavitni vzrok, da EPR meritve potekajo z obsevanjem stalne frekvence.

Kot pri sorodnih akustičnih pojavih so tudi v elektromagnetnem resonatorju možni različni nihajni načini. Pri načrtovanju geometrije votline posebno pozornost zahteva prostorska razporeditev električne in magnetne komponente stoječega valovanja. V

* V določenem napetostnem območju Gunnova dioda zaradi posebne razporeditve elektronskih energijskih pasov ob večji napetosti prepušča manjši električni tok. Podroben izvor t. i. negativne diferencialne upornosti in z njo povezane oscilirajoče pojave opisujejo navedeni viri.

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

30

prevladujočem nihajnem načinu se mora vzorec nahajati na mestu s čim višjo gostoto magnetne energije, ki povzroča spinske prehode in v osnovi omogoča EPR meritve, medtem ko naj bo na tistem mestu električna komponenta valovanja čim manjša, saj je odgovorna za dielektrične izgube ter posledično za neželeno segrevanje vzorca in manjšo občutljivost meritev.

Slednja je prvotno sicer odvisna od frekvenčnega odziva resonatorja. Če je frekvenca vhodnega valovanja pravilno uglašena z lastno frekvenco votline ν0 (t. i. kritična sklopitev), se energija v resonatorju absorbira in shrani v obliki stoječega valovanja, sicer pa se potujoče valovanje od votline odbije. Frekvenčna širina absorpcije ∆ν določa dobroto resonatorja Q [13]

0največja v resonatorju shranjena energija

energijske izgube na niha2

jQ

ν πν

=∆

= . (14)

Nižja vrednost Q pomeni večjo razmazanost resonančne frekvence in s tem nižjo ločljivost spektrometra. Hkrati je razvidno, da dobrota opisuje, kako učinkovito resonator skladišči energijo vpadnega potujočega valovanja. Na faktor Q celote preko vpijanja valovanja vpliva tudi v votlini prisoten merjenec. Ko zunanje magnetno polje po resonančnem pogoju (6) ustreza energiji mikrovalov, vzorec absorbira energijo in s tem nekoliko spremeni impedanco votline. Ker resonator, ki je z mikrovalovnim obsevanjem uglašen brez vstavljenega vzorca, v tem primeru ni več kritično sklopljen, se del valovanja odbije nazaj po valovodu in predstavlja fizikalno osnovo izmerjenega EPR signala. Odbito valovanje pred izvorom poseben krožilni element (angl. »circulator«) preusmeri proti detektorju, ki ga običajno predstavlja Schottkyjeva dioda [13,16]. Slednja moč vpadnega valovanja pretvori v izhodni enosmerni tok, ki je pri obsevanju z več kot 1 mW sorazmerna s kvadratnim korenom moči mikrovalov [13].

Slika 10: Shema EPR spektrometra, merjeni vzorec se nahaja med elektromagnetoma v resonatorju (v sredini). Tam se vzpostavi stoječe valovanje vzbujevalnih mikrovalov (MV), katerih izvor predstavlja frekvenčno stabilizirana Gunnova dioda. Od resonatorja odbiti signal krožilni element usmeri proti detektorju (Schottkyjeva dioda), katerega odčitki so amplitudno modulirani zaradi spreminjajočega se magnetnega polja (100 kHz). Fazni detektor s pomočjo referenčnega signala izloči vse frekvenčne komponente, ki ne prihajajo od preiskovanega sistema in tako močno zniža merski šum. Po pretvorbi v digitalno obliko (ADC) je signal pripravljen na nadaljnjo obdelavo.

3 Elektronska paramagnetna resonanca

31

3.4.2 Modulacija magnetnega polja

Posneti signal v realnem primeru neizogibno vsebuje merilni šum, ki ga prispevajo nečistoče v vzorcu, termično vzbujeno naključno gibanje nosilcev naboja v detekcijski diodi in vsej sledeči elektroniki ter motnje iz okolice, med katerimi je poleg standardnega sevanja omrežne napetosti moteče tudi zvočno valovanje, ki trese resonator. Za izboljšanje razmerja signala proti šumu se pri EPR meritvah standardno uporablja amplitudna modulacija gostote magnetnega polja, ki jo omogočajo majhne Helmholtzove tuljave, vgrajene v stene resonatorja z geometrijsko osjo vzdolž smeri zunanjega magnetnega polja B (Slika 10). Vzorec tako vidi magnetno polje, ki z majhno amplitudo Bm in modulacijsko frekvenco ωm niha okoli polja B0

0( ) sin( )m mtBB t B ω= + . (15)

Izhodni tok na diodi idet (Slika 11) torej prav tako niha z ωm, amplituda nihanja pa je približno sorazmerna strmini absorpcijske črte Iabs(B) v bližnji okolici in amplitudi modulacije Bm

( sin( )) absdet m mi tI

B tB

ω ϕ∆ +∆

∝ . (16)

Slika 11: Zaradi dodatnega polja modulacijskih tuljav gostota magnetnega polja na mestu vzorca s frekvenco 100 kHz niha med vrednostma B1 in B2. Posledično je enako modulirana tudi jakost diodnega toka na detektorju i, ki je sorazmeren intenzivnosti absorpcije mikrovalov v vzorcu I(B). Če je amplituda modulacije polja v primerjavi s širino spektralne črte dovolj majhna, je amplituda nihanja izhodnega EPR signala približno sorazmerna prvemu odvodu absorpcijske črte.

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

32

Glede na vzbujanje je lahko tok časovno zamaknjen za fazni kot ϕ. Ko tak signal v faznem detektorju preide množenje z referenčnim sinusnim signalom iste modulacijske frekvence, se dobljeni izraz po trigonometričnih zvezah razcepi na dva člena

( ) ( ) ( )( )sin cos cos 2absdet m m mi t I B tBω ϕ ω ϕ∆ + +∆

⋅ ∝ . (17)

Z nizkopasovnim filtriranjem lahko na koncu izločimo dvojno frekvenco, fazni kot ϕ pa naravnamo, da je izhodni signal največji. Preostanek je tako približno sorazmeren prvemu odvodu absorpcijske krivulje, kot je bilo omenjeno na koncu prejšnjega razdelka. Pri tem je najpomembneje, da se hkrati zadušijo tudi vse ostale frekvenčne komponente, ki ne nosijo informacije o dogajanju v vzorcu, tako da je po obdelavi šum glede na signal manjši za nekaj velikostnih redov. Ostanejo le tisti prispevki, ki slučajno padejo v frekvenčni pas blizu modulacijske frekvence ωm. Ta običajno znaša 100 kHz, saj je pri tej vrednosti šum kristalnega detektorja mikrovalov, ki načeloma s frekvenco pada (t. i. »1/f šum«), že nižji od vseh ostalih prispevkov [13]. Poleg tega pri tako visokih frekvencah tudi zvočnih motenj, ki tresejo resonator, ni več.

Drugi pomemben parameter, amplituda modulacije magnetnega polja Bm, prav tako zahteva previdno izbiro. Iz izraza za tok na detektorju (17) je razvidno, da s širšo modulacijo dosežemo močnejši končni signal. To res drži, dokler amplituda Bm ne postane primerljiva s širino absorpcijskih črt. V takem primeru bo posneta oblika spektra popačena, saj nihanje magnetnega polja ne otipava več zgolj lokalne strmine, ampak njeno povprečno vrednost na širšem območju. Z nadaljnjim večanjem modulacijske amplitude preko širine spektralnih črt začne signal zopet padati in o merjenem vzorcu ne daje več nobene uporabne informacije. Za nitroksidne radikale, katerih absorpcijski vrhovi so široki okoli 0,5 mT, je običajno najustreznejša in najpogosteje uporabljana amplituda modulacije magnetnega polja 0,1 mT. S spreminjanjem gostote magnetnega polja B0 okoli pričakovane vrednosti za absorpcijo preiskovanega spinskega sistema tako preiščemo njegov celoten energijski spekter.

3.4.3 Ostale nastavitve

Kvaliteto izmerjenega EPR spektra poleg že omenjenih nadzirata še dva nastavljiva parametra. Prvi določa, koliko časa zajemamo signal pri izbrani vrednosti B0, preden se premaknemo na naslednjo mersko točko, drugi pa podaja časovno konstanto povprečevanja signala. Oba morata biti pazljivo izbrana glede na jakost in druge lastnosti EPR signala vsake meritve posebej, da je šum posnetega spektra dovolj nizek za nadaljnjo obdelavo, spekter ne popačen, hkrati pa čas meritev v razumnih mejah glede na razpoložljivost merilne naprave, predviden obseg celotnega sklopa meritev in dinamiko sprememb raziskovanega sistema.

Pri prevedbi iz analognih vrednosti diodnega toka v digitalni zapis lahko signal še ustrezno ojačimo, da izkoristimo celoten razpon 24-bitnega pretvornika. S tem poskrbimo za ustrezno kvaliteto zajetih spektrov, ki je ključnega pomena za nadaljnjo računsko obdelavo.

33

4 Ozadje računalniške obdelave spektrov

Iz posnetih EPR spektrov spinsko označenih membran želimo pridobiti čim več informacij o lastnostih okolice, kjer se nahajajo poročevalske molekule, denimo omejitve in hitrosti njihovega rotacijskega gibanja, lokalne vrednosti polarnosti ipd. Določanje omenjenih količin močno otežuje dejstvo, da so tudi membrane z najpreprostejšo biokemijsko sestavo notranje nehomogene – pojavljajo se lateralne domene z lokalno različnimi lastnostmi. Le v primeru enokomponentnega sistema, tj. membrane iz ene vrste maščobnih molekul, bi pri visoki temperaturi vsi spinski označevalci poročali o enakem okolju [12]. V vseh ostalih primerih se za obliko EPR spektralnih črt skrivajo prispevki različnih domen, ki so lahko v mnogorazsežnem prostoru parametrov diskretno ločene ali tako rekoč zvezno razpotegnjene čez večje območje. Posebno slednji, močno kompleksni membranski sistemi so s simulacijskega stališča izrazito neugodni, saj jih je nemogoče zadovoljivo opisati s superpozicijo le nekaj spektralnih komponent, kar je glede na računsko zahtevnost danes najbolj razširjen pristop spektralnih simulacij. Zaradi takih potreb so v Laboratoriju za biofiziko Instituta »Jožef Stefan« v sodelovanju z Oddelkom za inteligentne sisteme razvili napredni algoritem, ki omogoča učinkovito karakterizacijo tudi sicer izrazito nehvaležnih membranskih sistemov [12].

Za ponazoritev posameznih korakov obdelave so ob opisu ozadja na slikah prikazani še dejanski podatki temperaturnega zaporedja meritev za primer poročanja spinskega označevalca na osnovi metilnega estra šestnajst C-atomov dolge maščobne kisline z nitroksidnim obročem na trinajstem atomu od estrske vezi (13-doxyl 16-C MeFASL, glej stran 43) iz liposomov iz nasičenih maščob, prav tako dolgih šestnajst C-atomov (DPPC, Tabela 1 na strani 42).

4.1 Optimizacijske metode spektralnih simulacij

Za določitev biofizikalnih lastnosti preiskovanega sistema iz posnetega EPR spektra je neobhodno reševanje obrnjenega problema, tj. prilagajanje parametrov modela glede na izmerjene podatke. Po opisu modela v razdelku 3.3 vsaka absorpcijska črta zahteva šest spremenljivk, pri simulacijah z vsoto več spektralnih komponent Nc pa se lahko razlikujejo še njihovi relativni deleži di. Vsota deležev je vedno normirana, torej je končno število prilagodljivih parametrov 7Nc −1, kar za tri ali štiri komponente tako pomeni nabor okoli 20-30 spremenljivk. Ker so v računanju vpliva na spekter le-te med seboj nelinearno prepletene, je analitično reševanje v osnovi neizvedljivo. Preostane torej le numerično reševanje, pri čemer vsak izračun spektra zahteva okoli 107 računskih operacij [12], kar

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

34

pomeni 10 ms na GFLOPS* procesorju. Upoštevaje, da je to le enkraten izračun, diskretiziran fazni prostor spremenljivk pa obsega kar 1020-1030 točk, je računska zahtevnost naloge nadvse očitna.

Različne raziskovalne skupine za tovrstne probleme uporabljajo nekatere samousmerjajoče se optimizacijske metode, denimo deterministični Downhill Simplex (DS) in Levenberg-Marquardt [12], ki pa za učinkovito konvergenco potrebujejo ustrezno podan začetni približek rešitve. Iskanje slednje je za spektroskopista lahko zelo zamudno opravilo, ki lahko v neugodnem primeru zahteva nekaj ur ali celo dni, predvsem pa je lahko končni rezultat odvisen od človeške presoje. Omenjeni pomanjkljivosti v precejšnji meri odpravlja hibridna evolucijska optimizacija (HEO), ki učinkovito naključno iskanje genetskih algoritmov po celotnem faznem prostoru parametrov združuje z deterministično metodo DS za lokalno fino določanje končne rešitve†. Obdelava posameznega spektra s kombinirano metodo zahteva okoli milijon izračunov, torej približno 1 h na GFLOPS procesorju, raziskovalcu pa prihrani vsakršno ročno poskušanje, saj rezultat ni odvisen od začetnih pogojev optimizacije.

Genetski algoritem, na katerem temelji metoda (Slika 12), oponaša razvoj bioloških vrst, ki vodi k uspešnejši in torej za preživetje bolje prilagojeni populaciji osebkov. »Dedni zapis« posameznika v tem primeru predstavlja vektor s parametri vseh spektralnih komponent (ϑ0,i, ϕ0,i, τc,i, Wi, pA,i, proti, di; i = 1-3 ali 4). Ob zagonu simulacijski program sestavi populacijo štiristotih predstavnikov z naključnimi vrednostmi spremenljivk in jih razvrsti glede na uspešnost. Mero zanjo predstavlja funkcija reduciranega χ2, ki upošteva vsoto kvadratov odstopanj računskega spektra od izmerjenega (ysim oz. yexp) po vseh N (navadno 1024) merskih točkah j, normalizirano s kvadratom deviacije izmerkov v delih spektra brez EPR signala σ (vrednost šuma)

( )22 21

1 N exp simj j

j

y yN

χσ =

−= ∑ . (18)

Najuspešnejša dva odstotka primerkov se uvrstita v t. i. elito družbe. Ko se v naslednjem koraku naključno izbira podmnožico predstavnikov, ki bo prenesla dedni zapis naslednji generaciji, je za člane elite verjetnost, da postanejo starši podmladka, nekoliko večja. Omenjeni mehanizem daje torej boljšim posameznikom večjo možnost preživetja, podobno kot pri razvoju vrst živih organizmov.

Novo generacijo predstavnikov oblikujejo operacije, ki zopet posnemajo dogajanje v naravi. Po dva izbrana vektorja si med seboj izmenjata dele »kromosoma«, torej vektorja s spektralnimi parametri, pri čemer lahko z določeno majhno verjetnostjo pride tudi do mutacij. Slednje so lahko povsem naključne ali pa jih vršijo inteligentni operatorji, kot denimo DS, ki množico parametrov vodi v smeri nižjega χ2. Predstavniki podmladka nato zamenjajo starševsko generacijo, se ponovno razvrstijo po uspešnosti, najboljši pa se

* Oznaka za hitrost procesorja, ki v sekundi opravi milijardo operacij z decimalnimi števili, angl. »Giga FLOating Point Operations per Second«. † Celoten programski paket EPRSIM-C je podrobno opisan v viru [12], priložena je tudi izvorna koda.

4 Ozadje računalniške obdelave spektrov

35

uvrstijo v elito. Po stotih ponovitvah celotnega življenjskega kroga predstavlja končna družba eno možno množico rešitev problema.

Zaradi kombinacije naključnih in determinističnih metod HEO učinkovito išče rešitve po celotnem faznem prostoru in jih uspešno končno optimizira, predvsem pa so rezultati neodvisni od začetnega nastavka, kar uporabniku prihrani mnogo zamudnega dela. Po drugi strani naključna narava algoritma zahteva strogo statistično obdelavo nabora rešitev, za kar je njihovo število potrebno razširiti z vsaj dvajsetimi zagoni optimizacije. Celotno množico končnih podatkov, ki zdaj šteje 20×400×4×7 parametrov, v naslednjem koraku temeljito preveri, smiselno prefiltrira in za interpretacijo poenostavi postopek združevanja rešitev v domene s skupnimi značilnostmi.

4.2 Združevanje rezultatov v domene

Naloga te stopnje obdelave rezultatov je izluščiti uspešne in zanesljive rešitve ter jih skrčiti v uporaben opis z le nekaj modelskimi parametri [12]. V prvem koraku se preveri χ2 vrednosti vseh končnih kombinacij parametrov (Slika 13), saj so zaradi naključnih operacij

rand < Pcross

ovrednotenje novih in razvrščanje po χ2

rand < Pmut

nova populacija

TRUE

TRUE

ELITA

naključni izbor staršev novi starši

nov podmladeknaključna zamenjava staršev

naključna zamenjava iz elite

posodobitev elite

rand < PDS.mutTRUE

rand < PKBOTRUE

mutacije

lokalna DS mut.

KBO mutacije

Hibridna elvolucijska optimizacija – HEO

križanjerand < Pcross

ovrednotenje novih in razvrščanje po χ2

rand < Pmut

nova populacija

TRUE

TRUE

ELITA

naključni izbor staršev novi starši

nov podmladeknaključna zamenjava staršev

naključna zamenjava iz elite

posodobitev elite

rand < PDS.mutTRUE

rand < PKBOTRUE

mutacije

lokalna DS mut.

KBO mutacije

Hibridna elvolucijska optimizacija – HEO

križanje

Slika 12: Shema predstavlja ključne korake uporabljenega hibridnega algoritma za simulacije spektrov HEO, ki oponaša razvoj bioloških vrst. Populacijo sestavlja štiristo vektorjev s spektralnimi parametri, najboljši predstavniki so uvrščeni v elitno skupino. Ti imajo nekoliko večje možnosti, da z medsebojnim križanjem in različnimi mutacijami (naključne, Downhill Simplex ali inteligentno vodene, angl. »Knowledge Based Operators«) prenesejo dedni zapis potomcem. Stota generacija predstavlja eno možno množico rešitev problema. Zaradi naključne narave algoritma je za zanesljivo statistično obdelavo potrebnih dvajset zagonov celotnega procesa. (Z dovoljenjem avtorja povzeto po viru [12].)

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

36

med razvojem populacije na koncu lahko prisotni tudi povsem neustrezni osebki, ki jih je iz nadaljnje obravnave potrebno izločiti. Zanesljivost preostalih rešitev določa pogostost njihovega pojavljanja in je torej lastnost celotnega nabora rezultatov in ne le vsake posamezne rešitve. Če se določena kombinacija parametrov pojavi zelo poredko, postopek take osamljene rešitve prav tako zavrže. Iz diskretnih točk program v ta namen izračuna zvezno gostoto rezultatov, dobljeno kot vsoto večrazsežnih Gaussovih funkcij, nalepljenih čez vsako posamezno rešitev. V končni množici torej po strogi presoji ostanejo le najuspešnejše in hkrati najbolj verjetne kombinacije spektralnih parametrov.

V nadaljevanju algoritem prepozna množice rešitev, ki se v mnogorazsežnem prostoru spremenljivk pojavljajo blizu skupaj, in jih združi v ustrezne spektralne domene. Glede na

Slika 13: Rezultate dvajsetih zagonov hibridne evolucijske optimizacije spektrov je potrebno temeljito obdelati. Iz obravnave se izloči vse neuspešne ali v faznem prostoru osamljene rešitve. Glede na gostoto pojavljanja algoritem prepoznava skupine s podobnimi kombinacijami parametrov in jih združi v domene. V predstavitvi s t. i. GHOST diagrami so trije spektralni parametri zaznamovani z barvno shemo RGB, tako da omogoča prerez ϕ0(ϑ0) pregled v petih razsežnostih hkrati. Števila ob domenah predstavljajo spektralne uteži posameznih komponent (Z dovoljenjem avtorja prirejeno po viru [12].)

4 Ozadje računalniške obdelave spektrov

37

lokalno gostoto rešitev so le-te lahko diskretno ločene ali razmazane preko širšega faznega območja. Pri tem je najpomembneje, da program njihovo število določi brez kakršnihkoli vnaprejšnjih predpostavk o pestrosti preiskovanega sistema (Slika 14). Za prikladnejšo predstavitev domenam pripiše povprečne vrednosti vseh parametrov ter druge momente njihovih porazdelitev, za lažjo vidno predstavo pa rešitve še izriše v dvorazsežnih presekih faznega prostora s t. i. GHOST diagrami (Slika 15). Pri tovrstni predstavitvi so trije parametri (τc, W, pA) barvno kodirani po ustaljeni rdeče-zeleno-modri shemi (Slika 13), tako da omogoča že graf ϕ0(ϑ0) zgoščen pregled v petih razsežnostih hkrati.

4.3 Predstavitev z vzorci gibanja

Za obsežnejše sklope meritev, ki vključujejo več zunanjih spremenljivk in zahtevajo pregledne primerjave različnih serij, je pravkar predstavljen prikaz še vedno prebogat in premalo pregleden. Nadaljnjo zgostitev podatkov o rešitvah omogoča opis s prostim rotacijskim prostorom Ω, definiranim kot normaliziran produkt kotov stožca, ki omejuje opletanje radikala (Slika 8 na strani 27)

0 02( / 2)

ϑ ϕπ

Ω = . (19)

Vpeljana količina podaja velikost konformacijskega prostora, ki ga imajo na voljo spinski označevalci vsake domene in ki si delijo isti vzorec gibanja. Pri tem se sicer izgubi nekaj podatkov o vrednostih preostalih parametrov, a je ta kombinacija običajno najobčutljivejša na spremembe temperature in okolja ter torej za določene namene povsem uporabna [17].

T−Tm[K]0 +5 +15−15 −5

T [K]315 320 330300 310

Izmerjeni spekter Prilagojeni spekter Spektralne komponente

T−Tm[K]0 +5 +15−15 −5

T [K]315 320 330300 310

Izmerjeni spekter Prilagojeni spekter Spektralne komponente

Slika 14: Primer rezultatov simulacij (zgoraj) in združevanja rezultatov (spodaj). Brez vnaprej predpostavljene pestrosti sistema je metoda določila potrebno število različnih spektralnih komponent. Njihove parametre najlepše prikazujejo GHOST diagrami (Slika 15). (Primer: spinski označevalec 13-doxyl 16-C MeFASL v liposomih DPPC.)

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

38

th0 (rad)1.510.50

Pro

t (1)

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

60

40

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

tc (

ns)

3.0

2.0

1.0

0.0

6040

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

W (

G)

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

60

40

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

Pa

(1)

1.2

1.1

1.0

0.960

40

th0 (rad)1.510.50

fi0 (

rad)

1.5

1.0

0.5

0.0

60

40

th0 (rad)1.510.50

Pro

t (1)

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

tc (

ns)

3.0

2.0

1.0

0.0

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

W (

G)

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

Pa

(1)

1.2

1.1

1.0

0.9100

th0 (rad)1.510.50

fi0 (

rad)

1.5

1.0

0.5

0.0

100

th0 (rad)1.510.50

Pro

t (1)

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

tc (

ns)

3.0

2.0

1.0

0.0

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

W (

G)

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

Pa

(1)

1.2

1.1

1.0

0.9100

th0 (rad)1.510.50

fi0 (

rad)

1.5

1.0

0.5

0.0

100

th0 (rad)1.510.50

Pro

t (1)

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

48

27

25

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

tc (

ns)

3.0

2.0

1.0

0.0

48

27

25

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

W (

G)

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

48

27

25

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

Pa

(1)

1.2

1.1

1.0

0.9

48

27

25

th0 (rad)1.510.50

fi0 (

rad)

1.5

1.0

0.5

0.0

48

27

25

T−Tm[K]0 +5 +15−15 −5

T [K]315 320 330300 310

th0 (rad)1.510.50

Pro

t (1)

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

60

40

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

tc (

ns)

3.0

2.0

1.0

0.0

6040

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

W (

G)

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

60

40

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

Pa

(1)

1.2

1.1

1.0

0.960

40

th0 (rad)1.510.50

fi0 (

rad)

1.5

1.0

0.5

0.0

60

40

th0 (rad)1.510.50

Pro

t (1)

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

tc (

ns)

3.0

2.0

1.0

0.0

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

W (

G)

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

Pa

(1)

1.2

1.1

1.0

0.9100

th0 (rad)1.510.50

fi0 (

rad)

1.5

1.0

0.5

0.0

100

th0 (rad)1.510.50

Pro

t (1)

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

tc (

ns)

3.0

2.0

1.0

0.0

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

W (

G)

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

100

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

Pa

(1)

1.2

1.1

1.0

0.9100

th0 (rad)1.510.50

fi0 (

rad)

1.5

1.0

0.5

0.0

100

th0 (rad)1.510.50

Pro

t (1)

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

48

27

25

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

tc (

ns)

3.0

2.0

1.0

0.0

48

27

25

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

W (

G)

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

48

27

25

th0 (rad)1.51.2510.750.50.250

Pa

(1)

1.2

1.1

1.0

0.9

48

27

25

th0 (rad)1.510.50

fi0 (

rad)

1.5

1.0

0.5

0.0

48

27

25

T−Tm[K]0 +5 +15−15 −5

T [K]315 320 330300 310

Slika 15: GHOST diagrami omogočajo pregled rezultatov združevanja rešitev v domene s pomočjo različnih presekov skozi mnogorazsežni prostor parametrov; od zgoraj navzdol (ϕ0, ϑ0), (τc, ϑ0), (W, ϑ0), (pA, ϑ0) in (prot, ϑ0). Vsak stolpec pripada meritvi pri izbrani temperaturi (spodaj) in ustreza enakoležnemu spektru na prejšnji sliki. Barva po RGB shemi (Slika 13) kodira vrednosti parametrov (τc, W, pA), števila ob domenah pa njihove spektralne uteži v odstotkih. Z višanjem temperature se manjša kompleksnost sistema, kot je razvidno iz manjšega števila domen, ki predstavljajo različne vzorce gibanja (stožci zgoraj). Nad faznim prehodom prevladuje le še povsem izotropno gibanje brez omejitev, kar opisuje povsem odprt stožec z vrednostma parametrov ϕ0 in ϑ0 blizu π/2 (zgoraj desno). Zadnja parametra uporabljamo za preglednejši prikaz s prostimi rotacijskimi prostori Ω(T) (Slika 16a). (Primer: spinski označevalec 13-doxyl 16-C MeFASL v liposomih DPPC.)

4 Ozadje računalniške obdelave spektrov

39

Nova mera (19) je obenem tudi nadvse pripravna za predstavitev v obliki mehurčnih diagramov, ki podajajo odvisnost Ω(T) za vse vzorce gibanja, ki so hkrati prisotni v vzorcu (Slika 16a). Velikost posameznih točk v takem prikazu ponazarja spektralni delež vsake komponente, navpične oznake pa opisujejo razmazanost domene po faznem prostoru in statistično negotovost metode. Iz tovrstnega prikaza je mogoče hitro prepoznati prevladujoče vzorce gibanja in njihov temperaturni razvoj. S primerjavo mehurčnih diagramov različnih preiskovanih sistemov prav tako preprosto opazimo glavne razlike, po potrebi pa se lahko nato na podlagi opažanj poglobimo tudi v preostale lastnosti sistema, ki jih podajajo vrednosti zdaj skritih parametrov modela.

Še en pomemben vidik predstavitve v obliki mehurčnih diagramov je prepoznavanje in odpravljanje numeričnih »nečistoč«, ki se kljub zelo konzervativnemu pristopu filtriranja množice rešitev še vedno lahko pojavijo med končnimi rezultati. Verodostojne in za obravnavo pomembne vzorce gibanja prepoznamo po sledečih kriterijih [18]: (i) pojavljati se morajo redno in konsistentno v seriji zunanje spremenljivke, denimo temperaturne odvisnosti vzorcev morajo biti vsaj lokalno monotone; (ii ) njihov spektralni delež mora biti znaten, tj. denimo nad 10 %; (iii ) opisovati morajo pomembne značilnosti posnetega EPR spektra, kot so položaji spektralnih vrhov, razmaki med črtami ipd. V končni predstavitvi ali za nadaljnjo obdelavo tako obdržimo le tiste domene, ki ustrezajo vsem omenjenim zahtevam.

4.4 Vpeljava konformacijske entropije

Pri analizi vzorcev gibanja spinskih označevalcev v različnih lipidnih sistemih tudi po pravkar opisanem kritičnem filtriranju med končnimi rešitvami pogosto še vedno ostanejo množice hkrati obstoječih vzorcev gibanja, ki so predvidoma povečini posledica lateralne nehomogenosti membran. Podatki o slednji so sicer povsem polnopomenski, a lahko v

(a)

Ω

0

1

T [K]350270 310

Tm(DPPC)

Prosti rotacijski prostor ΩΩΩΩ

Ω

0

1

T [K]350270 310

Tm(DPPC)

Prosti rotacijski prostor ΩΩΩΩ

(b)

0

SΩ

−Sre

f[k

B]

1

T [K]350270 310

Tm(DPPC)

Konformacijska entropija SΩΩΩΩ

0

SΩ

−Sre

f[k

B]

1

T [K]350270 310

Tm(DPPC)

Konformacijska entropija SΩΩΩΩ

Slika 16: Mehurčni diagram (a) omogoča pregled temperaturne odvisnosti gibalnih vzorcev, kot jih opisuje prosti rotacijski prostor Ω. Višje vrednosti ustrezajo svobodnejšemu gibanju paramagnetnega centra (Slika 15, stožci na vrhu). Velikosti točk predstavljajo spektralne uteži posameznih komponent, navpične oznake pa razmazanost domene po faznem prostoru. Za enostavnejšo primerjavo obnašanja različnih spinskih označevalcev je včasih prikladnejši prikaz s preračunano konformacijsko entropijo SΩ (b), kot jo iz izbranega okolja poročajo spinski označevalci. (Primer: spinski označevalec 13-doxyl 16-C MeFASL v liposomih DPPC.)

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

40

nekaterih primerih nekoliko odvračajo pozornost od prevladujočega dogajanja ali zameglijo celotno sliko. Marsikatero primerjavo zato močno olajša prevedba vsega bogastva informacij na en sam parameter.

Prosti rotacijski prostor Ω po prejšnji razpravi opisuje velikost prostora, ki ga ima radikal na voljo za svoje opletanje. Ta velikost je pričakovano sorazmerna številu rotacijskih konformacijskih stanj, ki jih poročevalska molekula lahko zavzame, 0N N≈ Ω . Ker je naravni logaritem števila razpoložljivih stanj po Boltzmannovi definiciji možna mera za entropijo sistema [9], lahko za molekule z gibalnim vzorcem Ω ocenimo njihovo konformacijsko entropijo SΩ

* [4]

( ) ( )0 0log logB Bk N SS kΩ ≡ Ω = + Ω . (20)

Konstanta ( )0 0logBkS N= predstavlja vrednost konformacijske entropije pri popolnoma svobodnem gibanju molekul, torej pri 1Ω = . Ker mora biti ta vrednost enaka za vse kombinacije sorodnih spinskih označevalcev v podobnih lipidnih okoljih, lahko ostane absolutno merilo do konstante nedoločeno in v nadaljevanju primerjamo le preostali del.

Zgornji opis velja za domene z natančno določeno vrednostjo prostega rotacijskega prostora. Spektralne domene v resničnih vzorcih gibanja so navadno porazdeljene preko širšega področja, ki ga opisuje drugi moment δ, kar prikazujejo navpične oznake v mehurčnem diagramu (Slika 16a). Za izračun celotnega prispevka posamezne domene je torej potrebno vrednosti SΩ integrirati po celotnem razponu okoli srednje vrednosti Ω

( ) ( )

( ) ( )( ) ( ) ( )( )

log d2

log 1 log 12

log

,

BB

B

kk

k

Sδ

δδ

δ δ δ δδ

Ω+

ΩΩ−

′ ′= Ω = Ω Ω

Ω + Ω + − − Ω − Ω − −

=

=

∫ (21)

vsota po vseh domenah i, kjer so členi uteženi s svojimi spektralnimi deleži wi,

( ), log d2i i

i ii

iB i i B i

ii

i

Sw

k w S kδ

δδ

Ω +

Ω ΩΩ −

′ ′Ω Ω

= = =

…

∫∑ ∑ (22)

pa opisuje celotno konformacijsko entropijo, kot jo v izbranem sistemu čutijo spinski označevalci (Slika 16b). Vsakršne razlike v vrednostih, ki jih poročajo iz enakega lipidnega okolja, so lahko le posledica minimizacije proste energije poročevalcev samih, kar je končno glavna točka pričujoče raziskave.

* Konformacijska entropija je sicer pri raziskavah večjih molekul že dolgo uveljavljen koncept, ki ga s pridom izkoriščajo pri računski obravnavi zlaganja proteinov in drugih polimernih verig.

41

5 Potek dela – od vzorcev do analize

Delo je potekalo v EPR centru Laboratorija za biofiziko (LBF) na Institutu »Jožef Stefan« in je obsegalo vse korake značilnega eksperimentalnega raziskovanja biofizikalnih sistemov (Slika 17). Prva stopnja je bila laboratorijska priprava vzorcev, tj. disperzij liposomov različnih kemijskih sestav, označenih z različnimi spinskimi označevalci. Sledila je obsežna serija meritev na EPR spektrometru. Posnete podatke je bilo nato potrebno pripraviti za uporabo v računalniških simulacijah, rezultate le-teh obdelati s programskimi orodji, predstavljenimi v prejšnjem poglavju, ter temeljito preveriti smiselnost dobljenih rešitev. Iz preglednih prestavitev v obliki mehurčnih diagramov in različnih primerjav konformacijskih entropij je bilo končno možno izluščiti zanimive pojave, povezane z neidealnim poročanjem spinskih označevalcev.

Slika 17: Shematski prikaz uporabljenih metod dela. Po pripravi liposomov smo modelne membrane označili s spinskimi poročevalci in izvedli meritve EPR. Sledila je računska obdelava spektrov, ki zajema mnoge napredne optimizacijske prijeme. Ustrezno prečiščene rezultate združevanja v domene smo prikazali z mehurčnimi diagrami prostega rotacijskega prostora ali konformacijske entropije.

NEIDEALNOST SPINSKIH OZNAČEVALCEV

42

5.1 Priprava liposomov

Za pripravo liposomov smo uporabili pet vrst fosfolipidov*, ki so se med seboj razlikovali po dolžini repov (Tabela 1). Z vsako vrsto lipidov smo izdelali membrane v treh množinskih razmerjih s holesterolom† (0, 20 in 40 množinskih odstotkov holesterola), kar skupaj predstavlja petnajst različnih lipidnih okolij.

Postopek priprave je sledil uveljavljeni metodi tankih filmov, ki se standardno uporablja pri podobnih raziskavah [10]. Za vsako kombinacijo maščobnih molekul smo odtehtali skupno 100 mg izbranih lipidov v ustreznem razmerju in jih nato v 50-mililitrski stekleni bučki raztopili v 1,4 ml kloroforma (CHCl3) in 0,7 ml metanola (CH3OH). Organsko topilo smo nato pri znižanem tlaku okoli 18 mbar odhlapili na rotacijskem izparjevalniku »Büchi Rotavapor R-200« in nato še na močnejši mehanski vakuumski črpalki, kar je skupaj trajalo 3 h. Pri tem se je na stenah bučke nabral tanek sloj maščobnih molekul. Ob dodatku 2 ml fosfatnega pufra‡ (PBS), ki posnema fiziološko raztopino, so se zaradi amfifilnih lastnosti lipidov molekule same uredile v dvosloje, ti pa so se nato zaprli v večslojne liposome. Za lažje oblikovanje membran in hitrejše doseganje ravnovesja je bil pufer pred uporabo segret deset stopinj nad temperaturo faznega prehoda izbranih fosfolipidov Tm. Zapiranje liposomov je še pospešilo polurno stresanje v ultrazvočni kopeli »Iskra UZ 2R«, prav tako nad Tm, pri čemer naj bi se liposomi tudi po velikosti nekoliko izenačili – predvidoma s premeri med 0,1 in 1 µm§ [19]. Tako nastala raztopina s koncentracijo maščob 50 mg/ml, prelita v manjšo stekleničko, je za dosego popolnega ravnovesja pred nadaljnjo uporabo v kopeli nad Tm čakala vsaj 24 h.

Kratica Polno kemijsko ime fosfolipidov Dolžina verig [C-at.] :

št. dvojnih vezi v verigi Tm [K]

DMPC 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 14:0, 14:0 297

DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 16:0, 16:0 314

DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 18:0, 18:0 328

POPC 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine