MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ

MÔN: SINH HỌC PHÂN MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬTỬ

GVHD: GVHD: NGUYỄN THỊ DUY KHOANGUYỄN THỊ DUY KHOAGVHD: GVHD: NGUYỄN THỊ DUY KHOANGUYỄN THỊ DUY KHOA

1.1. NGUYỄN ĐÌNH BẢONGUYỄN ĐÌNH BẢO2.2. TRẦN QUỐC HỌCTRẦN QUỐC HỌC3.3. NGUYỄN HỮU SĨNGUYỄN HỮU SĨ4.4. PHAN NGỌC THỊNHPHAN NGỌC THỊNH5.5. TRẦN XUÂN ÁI TRẦN XUÂN ÁI 6.6. QUÁCH THỊ QUỲNH MAIQUÁCH THỊ QUỲNH MAI7.7. HỒ THỊ NHƯ SANGHỒ THỊ NHƯ SANG8.8. PHẠM THỊ TỈNHPHẠM THỊ TỈNH9.9. VÕ THỊ BẢO ÁI VÕ THỊ BẢO ÁI 10.10. NGUYỄN THỊ THU LỰUNGUYỄN THỊ THU LỰU11.11. NGUYỄN MINH THẬTNGUYỄN MINH THẬT

TRẦN QUỐC HỌCTRẦN QUỐC HỌC

NGUYỄN HỮU SĨNGUYỄN HỮU SĨ

PHAN NGỌC THỊNHPHAN NGỌC THỊNHTRẦN XUÂN ÁI TRẦN XUÂN ÁI QUÁCH THỊ QUỲNH MAIQUÁCH THỊ QUỲNH MAIPHẠM THỊ TỈNHPHẠM THỊ TỈNH

VÕ THỊ BẢO ÁI VÕ THỊ BẢO ÁI

NGUYỄN THỊ THU LỰUNGUYỄN THỊ THU LỰUNGUYỄN MINH THẬTNGUYỄN MINH THẬT

TRẦN ĐÔNG ANHTRẦN ĐÔNG ANHNGUYỄN ĐÌNH BẢONGUYỄN ĐÌNH BẢO

I. KHÁI NIỆMI. KHÁI NIỆM

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng

khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm

khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men.

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống

II. II. LỊCH SỬLỊCH SỬ

Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase

III. THỰC NGHIỆMIII. THỰC NGHIỆM PCR PCR

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen.

PCR cần rất nhiều thành phần. - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase

III. THỰC NGHIỆM PCRIII. THỰC NGHIỆM PCR

PCR machine

chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD Phản ứng PCR được thực hiện trong

III.1 Đoạn mồi

Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides)

III.2 Quy trình

Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

- Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA.

- Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi.

- Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài

IV. Những ứng dụng của PCRIV. Những ứng dụng của PCR

Vân tay di truyền Kiểm tra huyết thống Chuẩn đoán bệnh di truyền Tách dòng gen Gây đột biến điểm Phân tích mẫu DNA cổ Xác định gen của các đột biến So sánh mức độ biểu hiện của gen

Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tômtrong xét nghiệm bệnh tôm

Việc xét nghiệm bệnh tôm bằng hệ thống PCR Real-time được tiến hành theo qui trình khép kín.

Trước tiên, mẫu tôm Post được nghiền nhuyễn trong một dung dịch tách chiết gen di truyền (DNA).

Sau đó, hỗn hợp này được đưa qua nồi hấp cách thủy trong vòng 10 phút nhằm làm sốc nhiệt để trích ly DNA.

Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tôm

Hỗn hợp dung dịch và tôm post nghiền nhuyễn lại trải qua công đoạn làm lạnh nhanh, cho vào tủ đông ở nhiệt độ (-200C) trong vòng 15 phút.

Hỗn hợp tiếp tục được đưa vào máy ly tâm khoảng 5 phút, với tốc độ 780.000 vòng/h để loại tạp chất.

Phần cặn bã và chất hữu cơ bị lắng xuống đáy. Phần dung dịch còn lại có chứa DNA.

Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tôm

Dùng thiết bị chuyên dụng lấy khoảng 2 µl (microlít) dung dịch này cho vào một ống có chứa hóa chất gọi là ống phản ứng.

Ống phản ứng được đặt vào máy lưu nhiệt trong vòng 2 tiếng đồng hồ. Tại đây sẽ diễn ra quá trình phản ứng nhân bản DNA.

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 NGƯỜI VIỆT NAMNGƯỜI VIỆT NAM

1. Nguyên liệu1. Nguyên liệu::

- Máu tươi của những người khoẻ mạnh không có cùng quan hệ huyết thống do Viện Quân y 108 cung cấp.

- Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN (hãng Sigma); hoá chất dùng cho quá trình PCR đối với locus D7S820 (mồi đặc hiệu cho locus D7S820 của hãng Pharmacia-Thuỵ Điển; Taq ADN polymeraza-của Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ương); hoá chất dùng cho điện di và nhuộm băng ADN (của các hãng Promega, Pharmacia, Sigma, MERCK).

I. Phương pháp nghiên cứu

2. Phương pháp:

a. Tách ADN: ADN từ máu được tách chiết theo phương pháp chuẩn dùng phenol và chloroform để tinh sạch. Kết quả tách chiết thu được ADN có độ tinh sạch khá cao với OD trung bình 1,75 và hàm lượng >50ng/ml

b. Kỹ thuật PCR:Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi và tổng hợp. Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC. Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm ethidium bromide (25mg/ml).

2. Phương pháp:

c. Kỹ thuật điện di:Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR đã được kiểm tra trên gel agaroza 2% sau đó được điện di trên gel polyacrylamide 6% sử dụng ure 7M. Băng ADN được phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991.

d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen

* Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alen quan sát được của các mẫu khác nhau trên bản điện di, chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và đánh số alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ băng ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến băng ADN có trọng lượng phân tử cao nhất). Việc đánh số ở đây chỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định được có ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu chưa có thang alen chuẩn để so sánh.

d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen

* Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh số, chúng tôi đồng thời chọn ra những mẫu mang những alen khác nhau tập hợp lại để tạo thang alen. Thang alen được tạo bằng phương pháp trộn mẫu.

* Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các alen đã khảo sát được theo quy ước quốc tế. Alen của locus D7S820 được ký hiệu từ 6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi alen.

II. Kết quả

1. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi quá trình PCR :

ở tất cả các điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ 50oC đến 58oC đều có sự hình thành sản phẩm PCR thể hiện ở sự có mặt của các băng ADN trên bản gel agaroza.

Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR ở một số mẫu trên gel agaroza theo điều kiện nhiệt độ gắn mồi 58oC

2. Kết quả chọn lọc alen và tạo thang alen :

Thang alen chuẩn của locus D7S820 với 7 alen khác nhau được phân tách bằng kỹ thuật điện trên gel PA

biến tính

Xác định quan hệ huyết thống: Xác định quan hệ huyết thống: Đạt chính xác 99,9%Đạt chính xác 99,9%

GS Lê Đình Lương và các cộng sự đã tự bỏ tiền túi để nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trong việc xác định quan hệ huyết thống

Đến năm 2000, với đề tài "Xác định nhanh, chính xác các đặc trưng cá thể ở người bằng kỹ thuật PCR" Với các mẫu máu, tóc, nước bọt ở các cá thể khác nhau, dùng PCR có thể tìm ra các tính trạng chung ở các cá thể có cùng huyết thống

Hiện nay, để xác định huyết thống, thế giới thường dùng từ 8-14 gen. Phòng thí nghiệm của chúng tôi đã đưa vào ứng dụng thường xuyên hàng ngày 13 gen. Vì với mỗi trường hợp cụ thể, cần sử dụng những gien khác nhau và với mỗi trường hợp chỉ dùng từ 8-14 gien là đủ

CÁC CÁCH LẤY MẪU

Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm bông: Mẫu lấy ở đây không phải là nước bọt mà là các tế bào má từ bên trong miệng

Việc lấy mẫu máu khô

Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm bông:bông:

Xúc miệng bằng nước sôi để nguội cho thật sạch, khoảng mười lần.

Lấy một que tăm bông trong phong bì có tên mình, không chạm tay vào đầu có bông. Há rộng miệng, đưa đầu bông vào phía trong má rồi chà xát đầu bông vào thành má lên xuống tối thiểu mười lần, vừa chà xát, vừa xoay tròn đầu tăm bông để toàn bộ các mặt của đầu tăm được thấm tế bào má.

Lấy xong que thứ nhất, đưa trả lại ngay vào phong bì mà bạn vừa lấy ra.

Lặp lại như thế với ba que tăm còn lại (nên nhớ là có bốn que thì hai que lấy tế bào má bên trái, hai que lấy tế bào má bên phải).

Với trường hợp trẻ còn nhỏ, không tự lấy được thì người lớn lấy hộ. Lưu ý: Không nói chuyện khi lấy mẫu, để tránh bắn... nước bọt của mình vào mẫu của trẻ.

Dán kín các phong bì đã có mẫu. Cho các phong bì chứa mẫu cùng với bản cam đoan vào phong bì lớn đã ghi sẵn địa chỉ của Phòng Phân tích rồi dán lại. Khi hoàn tất mọi việc, nên đem gửi mẫu đi xét nghiệm ngay. Nếu vì lý do nào đó không gửi ngay được thì bảo quản mẫu ở nơi khô ráo, sạch sẽ ở nhiệt độ bình thường (khoảng 250C).

Việc lấy mẫu máu khô

Chuẩn bị một miếng vải bông trắng sạch (mới), kích thước khoảng 3x3 cm. Viết tên người cho mẫu vào mép miếng vải trước khi lấy mẫu.

Dùng cồn và bông lau sạch đầu ngón tay. Dùng kim chích máu chích vào đầu ngón tay. Nhỏ ba - bốn giọt máu thấm vào giữa miếng vải. Sau đó, phơi hoặc hong khô.

Sau khi khô, mỗi mẫu được cho vào một túi ny-lông sạch, mới, rồi đưa vào một phong bì nhỏ. Ghi tên người cho mẫu ngoài phong bì.

Bảo quản mẫu ở 40C (ngăn rau của tủ lạnh), nếu chưa đi gửi ngay.

Kiểm tra lại xem các phong bì đã dán kín chưa. Sau đó, gộp tất cả các phong bì nhỏ lại, cho vào một phong bì lớn cùng với đơn xin xét nghiệm và lệ phí xét nghiệm, rồi gửi ngay bằng dịch vụ chuyển phát nhanh (EMS)

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

1. Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ những mẫu khác nhau, như máu tươi, máu khô, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, da, phân, v.v... Mẫu có thể lấy tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng nghìn kilômet, mất nhiều ngày, trong phong bì bình thường, qua bưu điện, không cần bảo quản lạnh.


2. Tách chiết ADN: Nhiều quy trình tách chiết ADN khác nhau của thế giới đã được nghiên cứu, thử nghiệm và thích ứng với điều kiện nước ta. Do vậy, góp phần giảm giá thành, tiết kiệm kinh phí. Với mỗi loại mẫu có một quy trình tách chiết thích hợp riêng. Đảm bảo chất lượng và số lượng ADN từ những lượng mẫu nhỏ.


3. Nhân ADN đặc hiệu: Đây là khâu quan trọng nhất của quy trình. Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và các chu trình nhiệt khác nhau đã được thử nghiệm cho từng cặp mồi. Trên cơ sở đó, đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn hợp, từng chu trình nhiệt cho từng cặp mồi, dựa vào những hoá chất sẵn có trên thị trường trong nước


4. Điện di: Điện di được dùng để tách biệt các đoạn ADN có độ dài ngắn khác nhau. Độ tách biệt này phụ thuộc nhiều yếu tố. Các yếu tố đã được lựa chọn và tối ưu hoá trên cơ sở vật liệu sẵn có, hạ giá thành đáng kể và tăng độ phân giải lên hàng trăm lần, giúp phân biệt rõ các đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau bốn nucleotid


5. Nhuộm ADN: Chất lượng điện di và kết quả nhân ADN đặc hiệu chỉ có thể hiện rõ trên bản gel với quy trình nhuộm ADN được tối ưu hoá và phương pháp nhuộm thích hợp được lựa chọn. Ngoài ra, kinh nghiệm và kỹ năng của kỹ thuật viên cũng rất cần thiết, góp phần hạ giá thành chung.


6. Phân tích kết quả: Bản gel sau khi nhuộm xong sẽ có dạng như hình trên. Các đoạn ADN có độ dài khác nhau hiện rõ trên bản gel, có thể quan sát bằng mắt thường và đo đếm. Trong một số trường hợp, có thể xác định trình tự ADN để có kết luận cuối cùng. Hàng nghìn bản gel như thế đã được phân tích và hiện được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm

Phát hiện nhanh bệnh lạ.

Cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Vệ sinh Y tế Công cộng pha trộn hóa chất - khâu quan trọng của ứng dụng kỹ thuật PCR. Mỗi phản ứng PCR dùng 10-25 µl (micro lit) hóa chất.

Đối với nhưng nơi chế biến thủy hải sản, muốn kiểm tra vi sinh vật gây bệnh thì phải mất ba - bốn ngày xét nghiệm, khiến cho thời gian bảo quản kéo dài, làm tăng giá thành sản phẩm. Sử dụng kỹ thuật PCR, thời gian xét nghiệm nay chỉ cần 4 giờ là có thể cho kết quả

Bộ kit phát hiện bệnh đốm trắng ở tôm, do Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM nghiên cứu và làm ra

Trong lĩnh vực PCR, Nam Khoa sản xuất và cung cấp cho các phòng thí nghiệm lâm sàng các bộ thử nghiệm PCR (bộ kit) để phát hiện các virus gây bệnh cho người như: lao, viêm gan B, viêm gan C, sốt xuất huyết, u nhú (virus Human Pailloma), mụn giộp (virus Herpes). Ngoài ra, để giúp các phòng thí nghiệm có thể ứng dụng những kỹ thuật tiên tiến trong lĩnh vực PCR, Công ty còn sản xuất các bộ thử nghiệm real-time PCR, PCR-ELISA để giúp phát hiện và định lượng virus viêm gan B, viêm gan C.

CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (WHITE SPOT SYNDROME VIRUS) CHO TÔM SÚ BẰNG CÁC KỸ THUẬT PCR

(a) Kỹ thuật PCR tổ (nested PCR)

Kỹ thuật này sử dụng 2 cặp mồi thay vì 1 cặp mồi như kỹ thuật PCR cổ điển, trong đó cặp mồi thứ hai nằm giữa cặp mồi thứ nhất. Kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật PCR 2 bước.

Kỹ thuật này sẽ có nhiều đoạn sản phẩm DNA hơn là kỹ thuật PCR cổ điển, số đoạn ADN được phát hiện sẽ nói lên tính định lượng tương đối của phản ứng.

Kỹ thuật nầy được Lo et al. công bố vào năm 1996

(b) Kỹ thuật real-time PCR

Thay vì dùng kỹ thuật điện di để phát hiện ADN người ta thiết kế một hệ thống quang học ngay trên máy PCR để đo cường độ ánh sáng sinh ra tương ứng với lượng sản phẩm PCR được khuếch đại.

Có nhiều cách phát hiện lượng ánh sáng (màu) sinh ra:

Sử dụng SYBR GREEN Dùng đoạn dò TaqMan (TaqMan probe)

Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán sớm bệnh Virus đốm trắng

1. Chuẩn bị mẫu

+ Mẫu tôm Postlarvae: lấy mẫu nguyên con khoảng 100 - 150 con còn sống (là tốt nhất) hoặc cố định trong cồn 950 .

+ Mẫu tôm giống: lấy toàn bộ phần đầu của tôm (có cả các cơ quan bên trong), số lượng khoảng 100 - 150 con, tùy số lượng tôm trong đàn nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, lấy mẫu tươi hay đã được cố định trong cồn 950.

+ Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10 - 20 con có biểu hiện bệnh lý đặc trưng nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950.

+ Mẫu tôm mẹ: lấy mẫu tôm mẹ phức tạp hơn vì phải đảm bảo tôm vẫn còn sống để tham gia sinh sản. Do vậy, ưu tiên lấy mẫu mắt, chân bơi 2 hoặc một phần mang, lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950. Lượng mẫu không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam

2. Tách chiết DNA (Desoxyribonucleic Acid

Nguyên tắc của việc tách chiết này là dựa trên sự phối hợp cơ học (nghiền), hóa học và sốc nhiệt để tách chiết DNA virus ra dịch chiết. Cụ thể, mẫu được nghiền trong bộ nghiền mẫu vô trùng với một lượng dung dịch tách chiết DNA (NaOH và SDS). Dịch nghiền được đưa vào biến tính bằng cách đun sôi 5 - 10 phút rồi làm lạnh nhanh ở điều kiện lạnh. Sau đó dịch nghiền được ly lâm 5 phút với tốc độ 13.000 vòng/phút. Dịch nổi thu được sau khi ly tâm đưa vào khuyếch đại DNA hoặc bảo quản lạnh –20oC trong vòng một tuần (khi mẫu chưa được phân tích ngay).

3. Khuyếch đại DNA

+ Giai đoạn biến tính (denaturation): phân tử DNA được tách ra làm hai mạch đơn ở nhiệt độ 94oC. Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút

+ Giai đoạn lai (hybridization): là giai đoạn các “mồi” bắt cặp với “khuôn” ở nhiệt độ thấp hơn (khoảng 55oC). Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút

+ Giai đoạn kéo dài (elongation) hay tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho enzyme DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút

4. Điện di sản phẩm khuyếch đại

Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử này tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.

5. Phân tích kết quả

- Mẫu tôm bố mẹ + Nếu kết quả của phép thử PCR bước 1 là

dương tính thì tôm mẹ đó khó sống được sau sinh sản và sẽ có biểu hiện đặc trưng của bệnh do virus đốm trắng. Ngược lại, nếu âm tính thì tôm mẹ này có thể tạo ra đàn postlarvae nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức thấp hay chưa nhiễm virus đốm trắng.

+ Nếu kết quả phép thử PCR bước 2 dương tính thì tôm bố mẹ đó có thể sinh ra đàn post nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức thấp. Ngược lại, nếu âm tính thì tôm mẹ sinh ra đàn postlarvae là tốt nhất.

5. Phân tích kết quả- Mẫu tôm postlarvae+ Nếu kết quả PCR bước 1 là dương tính thì

đàn postlarvae cho khả năng mắc bệnh đốm trắng cao, cần loại bỏ không nên đem nuôi thịt. Ngược lại, nếu âm tính thì có thể đàn postlarvae này có mức cảm nhiễm virus đốm trắng còn thấp hay chưa nhiễm virus gây bệnh đốm trắng, có thể nuôi thịt được nhưng cần quản lý môi trường nuôi tốt, tránh sốc các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, oxy hòa tan và khí độc …

+ Nếu kết quả PCR bước 2 dương tính thì đàn postlarvae này có thể sống trong 13 tháng không biểu hiện bệnh virus đốm trắng khi điều kiện môi trường tốt. Ngược lại, nếu âm tính thì đàn postlarvae này có nguy cơ nhiễm bệnh virus đốm trắng thấp nhất.

6. Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR

- Ưu điểm: phương pháp PCR cho kết quả nhanh (trong ngày) và có độ tin cậy cao. Kết quả thu được mang tính khách quan, trung thực khi người phân tích kết quả tốt, đồng thời nó cũng có thể định lượng được số lượng virus trong mẫu đem phân tích đơn giản hơn các phương pháp khác.

6. Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR

- Nhược điểm: phương pháp này cũng có những hạn chế đáng kể đòi hỏi sự thận trọng khi sử dụng: sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuyếch đại bản sao của phương pháp này. Các sai sót gây ra do Taqpolymerase trong qua trình tổng hợp và kích thước của trình tự cần khuyếch đại phải dưới 1,5 kb.

Bộ kit phát hiện bệnh đốm trắng ở tôm, do Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM nghiên cứu và làm ra.

Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật

1. Xác định cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng

Dùng PCR cho những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn

Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum),

Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục Vi khuẩn lao Helicobacter pylori (HP) Amíp Vi rút

Ngày nay, người ta còn dùng PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin (dấu hiệu rất có giá trị để coi một M. tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB.

Nhờ vậy, những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một cách kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung ra môi trường bên ngoài.

Helicobacter pylori (HP): HP hiện đang là một trong những vấn đề thời sự của Y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét và ung thư dạ dày.

Xác định độc tố của vi sinh vật

PCR khuyếch đại các gen đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn

Xác định vi khuẩn ngoài môi trường:

Các vi khuẩn khó nuôi cấy và/hoặc thường có mặt ngoài môi trường có thể được tìm trực tiếp bằng PCR, ví dụ như các Legionella, Salmonella, Shigella và Vibrio cholerae

Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống.

2. Định loại (identification) vi khuẩn

Sau khi phân lập được vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng trong định loại chúng.

Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần. Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn thuần cho PCR rất đơn giản: chỉ cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn trong 10 phút rồi thu lấy dịch nổi sau ly tâm loại bỏ tế bào là đủ.

3. Phân loại (classification) vi khuẩn

Nhờ khuyếch đại những đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa các vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết hơn và chính xác

DÙNG KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH BỆNH DOWN

Bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn DNA rất nhỏ như: một giọt máu, một sợi tóc hay một tế bào... có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượng lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng

Có thể phát hiện chính xác hơn hội chứng Down chỉ với... máu của bố, mẹ.

LỢI ÍCH CỦA VIỆC DÙNG PCR ĐỂ XÁC ĐINH BỆNH DOWN

Giúp các gia đình đã có trẻ Down tránh nguy cơ lặp lại (sinh thêm 1 trẻ Down) chủ động hơn

Xét nghiệm máu mẹ giúp hạn chế tai biến cho mẹ và thai nhi so với các phương pháp can thiệp (như chọc nước ối, sinh thiết gai nhau...).

chỉ giúp phát hiện Down trong trường hợp thừa nhiễm sắc thể 21, không tìm ra được các trường hợp Down do các bất thường khác liên quan nhiễm sắc thể này.

TRÊN ĐÂY LÀ BÀI THUYẾT TRÌNH CỦA NHÓM I

MANG TÍNH THAM KHẢO TỪ TÀI LIỆU TRÊN MẠNG

NÊN RẤT MONG ĐƯỢC SỰ GÓP Ý CỦA CÁC BẠN

I love you,I want to kiss you!

Documents

MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ