CYTOKINY, ADHESIVNÍ

MOLEKULY - klíčové molekuly pro mezibuněčnou

komunikaci, buněčná migrace a mezibuněčná

signalizace

Ústav imunologie LF UP

Mezibuněčná komunikace –

základ fungování organizmů

K zajištění fyziologických procesů musí spolu buňky komunikovat

Komunikace (mezibuněčný kontakt, buněčná migrace a mezibuněčná signalizace):

– Cytokiny, chemokiny

– adhezivní molekuly (mechanismy mezibuněčného kontaktu)

Počet buněk v lidském těle: v řádech bilionů (1012-1013) - údaje se rozchází, počet imunitních buněk: 1011

• Co jsou cytokiny, chemokiny, adhesivní

molekuly?

• Jaká je funkce a dělení cytokinů,

chemokiny, adhesivní molekuly?

• Jakou hrají cytokiny roli ve zdraví a

nemoci?

• Receptory a antagonisté

• Intracelulární signalizace

• Cytokiny a jejich využití v terapii

Co si odnesete z přednášky?

Mezibuněčná komunikace

-signalizující buňky secernují/expremují signální

molekuly (exocytóza nebo difúze přes

cytoplazmatickou membránu)

-cílové buňky mají specifické receptory pro

signální molekuly ( ligandy)

Vznikají ligand – receptorové komplexy

Cytokiny - historie

• Identifikace v 1960-letech (1957 Issacs a Lindenmannasi objevili solubilní faktor produkovaný buňkami po expozici inaktivovaným virem chřipky – interferon)

• Supernatanty kultur lymfocytů – indukce proliferace, diferenciace, zrání buněk.

• Aktivace lymfocytů s antigeny – zvýšená aktivita supernatantů

• Aktivní při nízkých koncentracích – těžko identifikovatelné

Co jsou to cytokiny? • Skupina nízko-molekulárních proteinů a

glykoproteinů (<30kD)

• Produkovány mnoha buněčnými populacemi

jako odpověď na různé stimuli

• Působí na leukocyty i jiné buňky prostřednictvím

povrchových receptorů jako “tkáňové hormony“

•Většinou sekretované, ale existují i membránové

formy (nebo obojí)

•Aktivní v picomolárních množstvích

•Komunikace a přenos signálu od jedné buňky ke

druhé

Charakteristika cytokinů

1. produkce cytokinů-nutný

stimul (signal)

2. Většinou sekretovány (i

membránové formy)

3. nízkomolekulární proteiny

4. účinné při nízkých

koncentracích

5. vazba na receptory

6. Výsledek-biologický efekt

(proliferace, diferenciace,

aktivace atd)

Působení cytokinů

• Autokrinně-na receptor na buňku, která cytokin produkuje

• Parakrinně-na receptor buňce v těsné blízkosti

• Endokrinně- po transportu řečištěm působí na vzdálené tkáně/buňky

Většina cytokinů působí autokrinně a/nebo parakrinně

Pleiotropní účinek cytokinů

Působí na různé typy buněk

Redundance cytokinů

Více cytokinů stejný efekt, jeden nahradí jiný

Synergie cytokinů

Efekt kombinace vyšší než efekt jednotlivých

cytokinů

Antagonismus cytokinů

Jeden cytokin inhibuje druhý.

Kaskádová indukce

Jeden cytokin indukuje tvorbu druhého

Cytokinová síť

Koordinované

spolupůsobení cytokinů

• Prozánětlivé

• Protizánětlivé

• Růstové faktory

hemopoetických buněk

• Humorální imunita

• Buněčně zprostředkovaná

imunita

• Antivirové účinky (IFN)

Role cytokinů

• Indukce a regulace interakcí mezi

buňkami imunitního, zánětlivého a

hematopoetického systému

• aktivace vrozené i specifické imunity

• kontrola vývoje a funkce buněk

imunitního systému, zánětlivých a

hematopoetických buněk

• ovlivňují proliferaci, diferenciaci a migraci

buněk

1. Hematopoietiny (např. Interleukiny 1-37) 2. Interferony a, b, g (IFN-a …) 3. Chemokiny (IL-8 a příbuzné molekuly) 4. Transformující růstové faktory (TGF-a …) 5. Faktory nekrotizující nádory (TNF-a, b) 6. Faktory stimulující kolonie (G-CSF, M-

CSF, GM-CSF) 7. Růstové faktory (SCF, EPO, FGF …)

Cytokiny dle funkce

Zdroje: Lymfokiny (produkce leukocyty)

Funkce: Chemokiny

Intercelularní signalizace: Interleukiny

známo více než 120 cytokinů

Buňky produkující a

ovlivňované cytokiny

• Vrozená imunita – Makrofágy

– Endoteliální buňky

– Epiteliální buňky

– Fibroblasty

• Specifická imunita – T lymfocyty

– Makrofágy

– NK buňky

produkce různými typy buněk, různé cílové buňky

Hlavní funkce cytokinů

• Hematopoéza (např. CSF, colony stimulating factor).

• Zánětlivé reakce (např. IL1, TNF).

• Chemotaxe (např. IL8, MIP1- macrophage inflammatory protein

1, BLC – B-lymphocyte chemoatractant).

• Imunostimulace (např. IL12, IFNg).

• Imunosuprese (např. IL10).

• Angiogeneze (např. VEGF- vacsular endothelial growth factor).

• Embryogeneze (např. TGF-b, LT - lymphotoxin).

Hematopoéza

• SCF (Stem cell

factor)

• GM-CSF

(Granulocyte-

macrophage

colony-stimulating

factor)

• IL-3

• IL-5

• IL-7

SCF (Stem cell factor) - funkce

Figure 5

Sakaguchi et al Cell 2008

Regulační T-buňky (Tregs)

Th1 – Th2

subsets

Aktivace Th1 imunitní odpovědi: IL-2, IL-12, IFN

gama a TNF

Aktivace Th2 imunitní odpovědi: IL-4, IL-5, IL-13

Role cytokinů u alergií a astma

Příklady významných cytokinů

Aktivace T-lymfocytů: IL-2, IL-15, IL-12

Aktivace Th1 imunitní odpovědi: IL-2, IL-12, IFN gama a

TNF

Aktivace Th2 imunitní odpovědi: IL-4, IL-5, IL-13

Aktivace B: IL-4 (IL-5, IL-6)

Aktivace NK: IL-12, IL-2

Aktivace makrofágů, exprese MHC: IFNgamma, TNF

Diferenciace myeloidních buněk: G-CSF, M-CSF, GM-

CSF, IL-3

Diferenciace kmenových buněk: SCF (IL-1, IL-3, IL-7)

GM-CSF (faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů)

G-CSF (faktor stimulující kolonie granulocytů)

Interferony INF-α, β

• inhibuje replikace

virové RNA

• Inhibuje expresi

virových receptorů

• Indukuje lytickou

aktivitu NK buněk

interferony - bílkovinné látky, produkované buňkami

napadenými viry, vážou se na membrány napadených

buněk => tyto buňky jsou rezistentní vůči virům

Chemokiny Chemotaktické

cytokiny

4 skupiny dle počtu a

vzdálenosti cysteinů

- Nejen migrace buněk

- regenerace, reparace,

- Sekrece kolagenu a

mucinu a dalších

Chemokinové receptory a ligandy

Regulace

chemokinové

sítě

Stone et al. Int J Mol

Sci. 2017

Exprese na všech buňkách

Chemotaxe – chemotaktické cytokiny

Receptory cytokinů

Vazba ligandu na receptor

Signální kaskáda

Biologický efekt

(chemotaxe, aktivace,

proliferace, apoptóza, sekrece)

Receptory na různých buňkách, i na buňkách

endokrinního a nervového systému

Ligand - receptor

• Cytokin může působit pouze na buňku,

která exprimuje receptor

• Aktivita cytokinu je cílená na danou buňku

díky specifickému profilu cytokinových

receptorů

Cytokinové receptory

Charakteristika

receptorů

• Receptory složeny z několika podjednotek

• běžné „signal-transducing subunits“

• unikátní vysoce afinitní podjednotky

• unikátní vysoce afinitní podjednotky asociovány s

aktivací cílových buněk

• Obvykle 2 podjednotky – VAZEBNÁ a

SIGNALIZAČNÍ (např. alfa jednotka-vazba

cytokinu, beta-signaling, minoritní role ve vazbě

cytokinu)

• Vazebná jednotka pro několik receptorů

Redundance

Antagonismus

• Receptory typu I (rodina receptorů hematopoetinu) : IL2, IL3, IL4,

IL5, IL6, IL7, IL9, IL13, IL15, GM-CSF (faktor stimulující kolonie granulocytů

a makrofágů ) a G-CSF (faktor stimulující kolonie granulocytů)

• Receptory typu II - receptory interferonů

• Receptory pro TGF

• Receptory pro TNF

• Imunoglobulinová

superrodina (IgSF)

• Receptory chemokinů

Klasifikace receptorů cytokinů

Receptory chemokinů

Chemokinové receptory –

migrace leukocytů

Receptory -

Signální dráhy Receptory většinou asociovány s

intracelulárními enzymy

(proteinkinázy – fosforylují další

proteiny)

Vazba cytokinu:

-agregace receptorů

-přiblížení a vzájemná fosforylace

asociovaných kináz, a tím jejich

aktivace

-fosforylace specifických substrátů

-spuštění signalizační kaskády

Receptor Ligandy (chemokiny) Exprese na buňkách

CCR1 RANTES, MIP-1a, MCP-3,

MCP-4 MF, aktivované T, neutrofily, bazofily

CCR2 MCP-2, -3, -4, -5 MF, aktivované T, bazofily

CCR3 Eotaxin, eotaxin-2, MCP-2,

-3, -4

Eosinofily, aktivované T (TH2),

bazofily

CCR4 TARC, MDC, RANTES,

MIP-1a, MCP-1 Aktivované T (TH2), bazofily

CCR5 RANTES, MIP-1a, MIP-1b MF, aktivované T (TH1)

CCR7 6Ckine, MIP-3b DC, T, B

CCR8 I-309 Aktivované T (TH2), NK

CCR9 TECK DC, thymocyty

CCR10 CTACK T (kožní)

CCR11 MCP-1 různé buňky

CXCR1 IL-8, GCP-2 Neutrofily, NK

CXCR2 IL-8, GCP-2, GRO,

ENA-78, NAP-2 Neutrofily, NK

CXCR3 IP-10, Mig, I-TAC Aktivované T (TH1), NK

CXCR4 SDF-1 MF, T

CXCR5 BLC B

CX3CR1 Fractalkine MF, aktivované T, NK

XCR1 Lymfotaktin a, b Aktivované T, NK

Viry napodobují cytokiny a receptory

Regulace cytokinů – cílená

léčba

•solubilní antagonisté

receptorů

•cirkulující solubilní

receptor

•Cirkulující protilátka

(blokující ligand)

• inhibitory kináz

• Inhibitory

transkripčních faktorů

Cílená anti-cytokinová terapie

Mechanizmy:

1) Antigonista cytokinových

receptorů (IL-1 receptor

antagonist IL-1Ra)

2) Solubilní cytokinové

receptory

3) Anti-cytokine antibodies

Terapeutické využití cytokinů

Tumor necrosis factor (TNF)

-Pro-zánětlivý cytokin produkován zejména monocyty a lymfocyty

-aktivuje endoteliální buňky k adhezi buněk

- Aktivuje lymfocyty k produkci cytokinů

-iniciace cytokinové kaskády

-rozvoj zánětlivé reakce

Nízké koncentrace – aktivace leukocytů a

endoteliálních buněk k adhezi (lokální zánět)

Zvýšené koncentrace - Systémový efekt

ZÁNĚT (low grade)

Vysoké koncentrace – septický šok

Terapie s anti-TNF

protilátkami

(např. Infliximab-protilátka,

Etanercept-circulating

receptor)

•reumatoidní arthritida

•Crohnova nemoc

•sarkoidóza

•další autoimunitní a zánětlivé

nemoci

Revmatoidní artritida

Increased inflammation

Increased production of MMP

Increased cytokine production (IL-1, IL-6)

Increased adhesion molecules

Cell migration into joints

Tissue remodeling

B cell

Macrophage

T cell

Synoviocyte

Cytokines

Komplikace léčby anti-TNF

Chemokiny - regulátory interginů

Specializované oblasti membrány - fokální

kontakty nebo adhezívní plaky (kde končí

svazky aktinových vláken)

► Integriny - transmembránové vazebné

buněčné receptorů pro matrix

-zprostředkovávají adhezi

- slouží jako spoj mezi matrix a svazky

aktinu v placích.

- Tvoří heterodimery (řetězce alfa a beta)

►Hemidesmosomy - spojují bazální

povrch epiteliálních buněk s bazální

laminou.

Adherentní spoje

buňka - mimobuněčná matrix (ECM)

Integrinový receptor

Selektiny

Struktura a funkce selektinů

Naivní T buňky migrují do LU

zralé T buňky – buněčná interakce

Poruchy adheze

zprostředkované E-

cadherinem

mohou vést k uvolnění

buněk z tkáně

Význam pro vznik

nádorových metastáz

Shrnutí - cytokiny

• Komunikace mezi buňkami

• Stimul - Cytokin – Receptor - vazba – efekt

• Promiskuitní, redundantní, synergie, sítě

• Ve zdraví i nemoci

• Využití k cílené biologické léčbě

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay (nutná znalost biomarkeru)

Stanovení cytokinů

Detekce více analytů - LUMINEX

Polystyrénové kuličky (beads)

Magnetické kuličky

-různá velikost

Průtoková cytometrie

-cytokiny

-receptory

-fosforylace

-internalizace