3

AGRONOMSKI FAKULETE

SVUČILIŠTA U ZAGREBU

Tea Odak, dipl. ing.

MOLEKULARNO-BIOLOŠKA OBILJEŽJA ENDEMSKE

MEKOUSNE PASTRVE (SALMOTHYMUS

OBTUSIROSTIRS SALONITANA)

Magistarski rad

Zagreb, 2004.

4

1. UVOD

Hrvatska je u svjetskim ihtiološkim krugovima poznata po postojanju

brojnih endemskih vrsta i podvrsta riba (Economidis i Banarescu, 1991).

Razlog izuzetne specijacije slatkovodne ihtiofaune je postojanje dva velika

riječna sliva, dunavskog i jadranskog na relativno malom području, koji su u

Sloveniji međusobno odijeljeni Alpama, a u Hrvatskoj Dinaridima. Jadranski

sliv, sa pripadajućom površinom od 23800 km2 ubraja se među najmanja

ihtiofaunska područja ovog dijela Europe. Rijeke toga sliva znatno se

međusobno razlikuju po dužini toka i mjestu poniranja, (jezero, more ili kraške

rupe), a ako ih usporedimo s rijekama Dunavskoga sliva, uočavamo da su

izrazito kratke i izolirane (Mrakovčić i sur., 1995). Procesom specijacije u

njima su se razvile endemske riblje vrste i podvrste (ponajprije iz porodice

pastrva, Salmonidae te šaranki, Cyprinidae, ali i druge). Gotovo svaka rijeka

tog područja ima bar jednu endemsku vrstu. Iako su posljednjih godina vršena

su brojna istraživanja ihtiofaune (Popović, 1985; Bianco i Knežević, 1987;

Mrakovčić i Mišetić, 1989), postoji ipak određeni broj nedovoljno opisanih

vrsta, pa premda se brojni istraživači slažu da se radi o vrlo interesantnom

području (Lelek, 1989), mali se broj istraživača bavio ekologijom, biologijom,

taksonomijom i međuvrsnim odnosima riba. Za razliku od tropskog pojasa,

danas je rijetkost u Europi naći neku nepoznatu vrstu kralježnjaka. Pa ipak je

u Hrvatskoj još prije nekoliko godina otkrivena nova vrsta glavoča –

Knipowitichia mrakovcici (Mrakovčić i Kreovec, 1997).

Po nekim teorijama, baziranim na fosilnim i paleogeografskim

istraživanjima (Bianco, 1990; Snoj, 2001), endemi jadranskog sliva

predstavljaju ostatke populacija, izvedenih iz primarnih paratetskih riba, koje

su prodrijele u Jadransko područje prije pet milijuna godina, kada je cijelo

Sredozemno more bilo djelomično punjeno sa slatkom vodom iz Paratetisa.

Nakon invazije slane vode kroz Gibraltarski kanal, ribe u Jadranskom moru su

nestale, a preživjele su samo one koje su živjele u peri-Jadranskim prastarim

rijekama. Te ribe su kasnije bivale ugrožene sa nekoliko ledenih doba. Upravo

5

njihova dugotrajana izoliranost uzrokovala je formiranje nekoliko različitih

homogenih populacija.

Mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostris salonitana) je endemska

pastrva sa izvornim staništem u rijeci Jadro, pokraj Splita. Naknadno je dio

populacije prebačen i u rijeku Žrnovnicu, te danas ona i tamo obitava. Spada

u porodicu Salmonidae. Kao i ostale podvrste roda Salmothymus (S. o.

oxyrhynchus, S. o. krkensis i S. o. zetensis), ograničena je na usko područje

rasprostranjenja, te i najmanji utjecaji na njeno stanište imaju znatno

djelovanje na malu populaciju. U rijekama gdje uz mekousnu pastrvu živi i

potočna pastrva javlja se problem mogućeg križanja između dviju vrsta i

nastanak hibrida.

Prepoznati hibride između potočne i mekousne pastrve vrlo je teško,

stoga su uz morfološke korištene i molekularne metode razlikovanja

populacija.

Kod endemske mekousne pastrve solinke (Salmothymus obtusirostris

salonitana) evolucijska povijest, klasifikacija i filogenetsko mjesto u skupini

salmonida nisu još određeni. Također još nije jasno utvrđeno da li se solinka

križa sa potočnom pastrvom (Salmo trutta), te ako da, da li to ugrožava

njezino postojanje. Stoga je osnovni cilj ovoga rada bio odrediti molekularno

genetsku strukturu solinke te na taj način odgovoriti na gore navedena pitanja.

Pri tome ćemo uz klasične morfološke metode koristiti dva tipa molekularnih

metoda – analizu mitohondrijske i nuklearne DNA (mikrosateliti i gen za laktat

dehidrogenazu). Mitohondrijska DNA, koja je radi strukturalne jednostavnosti

genoma, hipervarijabilnih regija, homozigotnosti i drugih svojstava jedan od

najprimjenjenijih alata za molekularno genetske i populacijske studije, te

mikrosatelitska DNA, koja radi svoje lokusne specifične hipervarijabilnosti

predstavlja odličan molekularni alat, s kojim je moguće utvrditi razlike na nivou

roda, ali i nižih taksonomskih jedinca da bismo što potpunije ispitali

podudaranje evolucijske dinamike mitohondrijske i nuklearne DNA.

6

1.1. PREGLED LITERATURE

1.1.1. Općenito o Salmonidima

Porodica Salmonidae pripada u red Salmoniformes, koji spada u grupu

primitivnih Euteleostei. Red Salmoniformes sastoji se od dva podreda:

Osmeroidei i Salmonoidei.

Vrste podreda Osmeroidi razvrstane su u šest porodica, a

rasprostranjene su u sjevernim dijelovima Atlantskog i Tihog oceana. Žive u

priobalnim zonama, odakle za vrijeme mrijesta ulaze u rijeke. U nekim

dijelovima areala dostižu veliku brojnost, pa čine ekonomski važne ribe.

Salmonidi su karakteristični za sjevernu Zemljinu hemisferu. Nalazimo

ih u morima i rijekama Europe, sjeverne i zapadne Azije, sjeverne Amerike i

Afrike. Radi njihove ekonomske i športske vrijednosti introducirane su i u vode

južne Amerike, Novog Zelanda i Australije (Wheeler, 1992).

Sistematika Salmonidae prema Stearley i Smith (1993).

Red: Salmoniformes

Podred: Salmonoidei

Porodica: Salmonidae Regan, 1914

Podporodica: Coregoninae (ozimice)

Podporodica: Thymallinae (lipljani)

Podporodica: Salmoninae

Rod: Brachymystax

Rod: Platisalmo

Rod: Salmothymus

Vrsta: Salmothymus obtusirostris (mekousne pastrve)

Rod: Acantholingua

Rod: Hucho (mladice)

Rod: Salvelinus (zlatovčice)

Rod: Oncorhynchus (pacifički lososi i pacifičke pastrve)

Rod: Salmo

Vrsta: Salmo salar (atlantski losos)

Vrsta: Salmo trutta (pastrva)

7

Slika 1: Shematski odnos između rodova Salmonidae (Glubokovsky, 1995)

Podred Salmonoidei uključuje anadromne grupe, koje veći dio životnog

ciklusa provode u morima, sa spektakularnim migracijama u slatke vode za

vrijeme mrijesta. Zavičajno ponašanje je jako izraženo. Kod anadromnih

slatkovodnih riba primarna se metamorfoza događa za vrijeme nizvodnih

migracija, a sekundarna tijekom uzvodnih migracija pred period mrijesta. Kod

pripadnika roda Salmo dolazi do regresivne metamorfoze, odnosno do

gubljenja morfoloških karakteristika nastalih sekundarnom metamorfozom

tijekom njihovih nizvodnih migracija nakon reprodukcije. Ciklus morfoloških

promjena događa se svaki put u vrijeme mrijesta (Saunders i Schom, 1985).

Prema postojećoj klasifikaciji, podporodica Salmoninae, uz

podporodice ozimica (Coregoninae) i lipljena (Thymallinae) sačinjava

porodicu Salmonidae. Prema njihovoj morfologiji Coregoninae i Thymallinae

su evolucijski jako stare, dok su Salmoninae napredniji i noviji oblici.

Paleontološki dokazi ukazuju na pojavljivanje salmonidnih vrsta u periodu

kasnog tercijara, u epohi pliocena, dok su u pleistocenu već široko

rasprostranjene. Njihovi su preci pripadali redu sleđovki (Clupeiformes),

(Smith i sur., 1982). Mnogi se znanstvenici slažu da Salmonidae potječu iz

slatkih voda (Neave, 1958; Vladykov, 1963), iako postoje i oni koji vjeruju u

njihovo prvotno morsko stanište (Schmidt, 1947). Brojne studije o porijeklu

Salmonidae bave se filogenetskim odnosima između rodova, oslanjajući se

8

pritom na morfološke (Janković, 1961; Delling i sur., 2000), kariološke

(Svärdson, 1945; Simon, 1963) i genetske (Giuffra i sur., 1996; Bernatchez,

2001) podatke, pri čemu su sastavljena različita filogenetska stabla. Međutim,

gotovo svi se slažu da su rodovi Salmo i Oncorhynchus evolucijski

najnapredniji i najbolje proučeni (Domanico i sur, 1997), dok je mjesto ostalih

rodova još pod znakom pitanja (npr. Platysalmo, Acantholingua,

Salmothymus), (Osinov, 1999).

Složena sistematika porodice Samonidae pripisuje se njihovoj izuzetnoj

sposobnosti adaptacije koja je proizašla nakon tetraploidnog događaja, koji se

zbio kod njihova pretka prije 50 do 100 miliuna godina (Allendorf i Thorgaard,

1984). Tezu da Salmonidae imaju poliploidno porijeklo, prvi je propagirao

Svardson 1945. godine. On je promatrao kromosomski broj salmonidnih vrsta

i utvrdio njegovo opadanje u umnošku sa 10. Tek kasnije, 1970. godine Ohno

predlaže konkretne dokaze tezi da Salmonidae imaju tetraploidno porijeklo, a

to su:

- Količina DNA u stanici Salmonidae je 80% veća od količine DNA koju

nalazimo u sisavaca, a to je gotovo dvostruko više od DNA u

stanicama drugih srodnih riba.

- Salmonidae imaju obično oko 100 kromosoma što je gotovo dvaput

više od drugih srodnih riba.

- Multivalentnost je često nađena u mejotičkim preparatima od nekoliko

salmonidnih vrsta.

- Salmonidae nose velik broj dupliciranih enzimskih lokusa.

Slika 2: Područje rasprostranjenosti porodice Salmondiae (Maitland, 1995)

9

Osnovna obilježja koja su zajednička za vrste ove porodice su:

- sitna masna peraja na leđima, iza leđne peraje

- kratka leđna peraja

- čitavo tijelo, izuzev glave, pokriveno sitnim ljuskama

- dodatna kost na gornjo-viličnoj kosti

- velika usta

- šiljasti zubi, osim na čeljustima, koji su prošireni i na jezik

- izražena bočna linija

- velik broj piloričkih nastavaka (između 17 i 210)

- veliki riblji mjehur

- ribolovno su interesantne

- mrijeste se u slatkoj vodi (Vuković i Ivanović, 1971)

Sve salmonidne vrste riba obitavaju isključivo u hladnim, bistrim i

nezagađenim potocima, rječicama ili rijekama brzog toka, koje su bogate

otopljenim kisikom, ili u planinskim jezerima gdje se temperatura vode kreće

oko 10oC i koja, ni u najtoplije doba godine ne prelaze 18oC ili 20oC. To su

sve reofilne vrste riba, vretenastog oblika tijela, prilagođenog životu u brzim

riječnim tokovima.

Salmonidae su izraziti predatori, jedu živu hranu, stoga im je želudac

prilagođen probavi hrane animalnog porijekla, širok je i mišićav.

Sazrijevanje gonada riba iz ove porodice nastupa u kasnim jesenskim

danima, od studenog do prosinca. Izuzetak su mladica (Hucho hucho) i

mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostis) koje se mrijeste u proljeće

(ožujak – travanj). Relativna plodnost kod salmondinih vrsta riba je poprilično

mala, kod potočne pastrve se kreće oko 1500 jaja, a kod mladice oko 12 000

jaja na 1 kg tjelesne težine (Aganović, 1979).

Salmonidae su slatkovodne ribe, no mnoge od njih imaju hranidbene

migracije u more, a u slatke vode se vraćaju kada su zrele za mrijest. Nagon

odlaska u more nakon izvaljivanja više je izražen na sjeveru. Stoga svi

salmonidi arktičkih rijeka migriraju u more, dok se oni sa južnih predjela

ograničeni na slatke vode. Mnoge od tih južnih populacija je ograničavaju su

na jezera i rijeke, koje su kolonizirale tijekom perioda širenja polarnog leda, a

10

u kojima su ostale zarobljene podizanjem temperature mora. Živeći u tim

staništima tisućama godina znatno su promijenile svoj izgled i ponašanje.

Razlike u njihovim staništima uvjetovale su veliku fenotipsku različitost i

genetsku izolaciju odvojenih populacija. Stoga je sistematika porodice

Salmonidae izuzetno složena. Više od pedeset različitih vrsta opisano je kroz

prošla dva stoljeća, u kojima danas prepoznajemo samo jednu, Salmo trutta

(Behnke, 1986). Utvrđivanje točnog filogenetskog odnosa unutar porodice

Salmonidae je vrlo važno pri njihovoj zaštiti, budući da se mnoge vrste unutar

ove porodice smatraju ugroženima (Crivelli, 1996). Kod prijašnjih klasifikacija,

koje su se bazirale uglavnom na morfološkim i ekološkim karakteristikama,

uočene su brojne nepravilnosti. Kod nekih rodova (Oncorhynchus, Salmo,

Salvelinus, Brachymystax i Hucho) klasifikacija je obnovljena zahvaljujući

molekularnim metodama (Phillips i Oakley, 1997).

POTOČNA PASTRVA – Salmo trutta, Linnaeus 1758

Potočnu pastrvu kao autohtonu vrstu nalazimo na širokom području od

Europe i Azije do Sjeverne Amerike. Rasprostranjena je od sjevera Norveške

do sjeverno-istočnog dijela Rusije te južno do Atlas gorja u sjevernoj Africi.

Sastoji se od brojnih, udaljenih geografskih oblika, velike fenotipske

različitosti. Osnovna karakteristika pastrve je vretenasto, izduženo tijelo.

Odličan je i brz plivač. Na trupu ispod i iznad bočne linije nalaze se

mnogobrojne crne točke. Na glavi su izražena velika usta u kojima su zubi

raspoređeni u dva reda koje zadržava tijekom cijelog života. Gornja vilica

doseže do zadnjeg oboda oka. Na prvom škržnom luku ima od 18 do 24

branhiospina, a broj piloričkih nastavaka varira od 40 do 100. Diploidni broj

kromosoma iznosi 84, uz znatno variranje u intraspecijskim formama.

Za vrijeme mrijesta izražen je spolni dimorfizam. Ženke imaju zaobljen

trbuh i crveno nabubren spolni otvor. Mrijesti se krajem jeseni i početkom

zime od studenog do siječnja. Ikru odlaže na kamenitom dnu sa brzim tokom

vode. Dijametar jaja je veliki i iznosi od 4,5 do 5 mm. Inkubacijski period je

ovisan o temperaturi vode, od 60 do 90 dana. Ličinke izvaljene u siječnju ili

veljači imaju veliku žumanjčanu vrečicu, koja im omogućuje ishranu, ali im

11

istovremeno otežava kretanje. Aktivan život ličinki započinje trošenjem

žumanjčane vrečice na 1/3 njene veličine. Početkom jeseni, kad mlađ

dosegnu dužinu od oko 10 cm, seli se nizvodno u mirnije vode u potrazi za

hranom. Spolna zrelost nastupa sa 2 do 3 godine starosti. U prvoj godini

pastrva naraste od 10 do 14 cm. Tada nosi tzv. mladenačko ruho, obilježeno

sa desetak crnih vertikalnih mrlja na bokovima tijela. Daljnjim rastom ova

obilježja se gube.

Pastrva se hrani različitim organizmima: ribama, ličinkama vodenih

insekata, ikrom dugih riba, kukcima koji lete nad vodom i padaju na njenu

površinu, račićima i drugim beskralježnjacima.

Pastrva naseljava hladne vode u gornjim tokovima rijeka umjereno

kontinentalne klime, iako je nalazimo i u ravničarskim rijekama borealne zone,

i jezerima sa čistom, hladnom vodom sjeverne hemisfere. Izuzetno je

prilagodljiva na različite uvjete staništa, a prilagodljivost se odražava i u

različitim morfološkim oblicima, (Wheeler, 1992). Postoje tri različita ekološka

oblika pastrva:

Potočni oblik – Salmo trutta m. fario

Jezerski oblik – Salmo trutta m. lacustris

Morski oblik – Salmo trutta m. trutta

Potočna i jezerska pastrva stalno žive u slatkoj vodi. Jezerska pastrva

radi boljih uvjeta staništa dosta je krupnija od potočne. Lako se razlikuje od

nje i po tome što joj je tijelo prekriveno nepravilnim crnim točkama dok crvenih

točaka obično nema, a ako one i postoje imaju oblik slova x. Jezerske

pastrve, u jesen, za vrijeme mrijesta, odlaze iz jezera u rijeke, da bi se kasnije

ponovno vratile u jezera. Morski oblici pastrva vale se u slatkim vodama, no

odmah po izvaljenju migriraju u mora, gdje žive do spolne zrelosti, kada

odlaze na mrijest u rijeke ili jezera (Treer i sur., 1995).

Vanjski izgled tih triju tipova ponajprije ovisi o okolišu, u kojem riba živi,

jer ako bi mlađ potočne pastrve stavili u jezero, ona bi pridobila vanjski izgled

jezerskog tipa pastrve i obrnuto. Bernatchez i suradnici (1992) su promatrali

mtDNA sekvence triju različitih ekoloških oblika i nisu uočili signifikantne

12

razlike. Stoga su zaključili da se izvor različitih ekoloških oblika ne temelji na

njihovom zajedničkom pretku, već na zajedničkom okolišu.

Slika 3: Potočna pastrva iz rijeke Krke (foto Odak)

Genetskim analizama pastrva iz različitih dijelova Europe, uočeno je,

da pastrve određenog geografskog područja imaju zajedničke osobine i na

genetskom nivou, (Bernatchez, 2001). Na taj način uočeno je pet različitih

grupa pastrva vezanih za određena geografska područja, odnosno za

osnovne riječne slivove u Europi. Izdvojeno je pet samostalnih jedinica,

filogenetskih grupa, odnosno geografskih linija:

- atlantska linija

- dunavska ili crnomorska linija

- sredozemna linija

- jadranska linija

- marmoratus linija

Bernatchez i suradnici (1992) pokušavajući utvrditi složene filogenetske

odnose među udaljenim populacijama služe se teorijom molekularnog sata,

gdje razlika u sekvencama od 2% označava period od milijun godina (Brown i

sur., 1979).

Prije približno 10 milijuna godina, iz zajedničkog pretka došlo je do

nastanka dviju vrsta: lososa (Salmo salar) i pastrve (Salmo trutta).

Razdvajanje pastrva prema filogenetskim linijama od zajedničkog pretka zbilo

se prije 2,5 milijuna godina. Prvo se, prije 2,5 milijuna godina, iz jedinstvene

vrste pastrva odcijepila atlantska linija, a kasnije, kroz oko milijun godina (već

13

u ledenom dobu) formirale su se još dvije nove grupe: dunavska i jadransko-

mediteranska. Kasnije, radi burnih geomorfoloških zbivanja u ledenom dobu,

nastale su još tri linije: mediteranska, jadranska i linija marmoratus. Predviđa

se, da je staništa jadranskog sliva prvo naselila jadranska linija potočne

pastrve, a kasnije se na tom području pojavila i glavatica, odnosno linija

marmoratus. U vrijeme hladnijih intervala ledenog doba, radi nastanka velikih

količina leda, nivo mora spustio se čak za više od 150 metara. Posljedica

sniženja nivoa mora bilo je i povezivanje rijeka, koje su se ranije izlijevale

direktno u more. Upravo je to omogućilo ribama, da nesmetano migriraju iz

jedne rijeke u drugu (Bianco, 1990; Bernatchez, 2001).

Svaka linija ima neka zajednička morfološka obilježja. Za atlantsku

liniju karakteristična je crna pigmentacija, koja znatno prevladava nad

crvenom, i nalazi se pretežno na prsnom dijelu (Giuffra i sur., 1996).

Dunavska linija ima jednoliko zastupljene crne i crvene točke, koje su

jednakomjerno raspoređene po cijelom tijelu. Karakteristične osobine

vanjskog izgleda jadransko-mediteranske linije su četiri šira tamna pojasa u

obliku obruča oko tijela. Jedan se pojas nalazi na glavi, dva na trupu i jedan

na repu. Kod nekih primjeraka pojasi su jače izraženi, a kod nekih slabije. Za

jadransko-mediteransku liniju pastrva karakteristična je još i sitna, crno -

crvena pigmentacija. Linija marmoratus odnosi se na glavaticu, koja naseljava

isto područje kao i linija jadranskih pastrva.

MEKOUSNA PASTRVA (Salmothymus obtusirostris Heckel, 1851.)

Mekousna pastrva je zasigurno jedna od najintrigantnijih vrsta, čija je

klasifikacija pobuđivala pozornost znanstvenika od pionirskih studija do

današnjih dana. Uvrštavamo je u rod Salmothymus, u koji spada samo jedna

vrsta – monofiletski rod. Mekousna pastrva ima četiri podvrste koje su

endemične za srednji i južni jadranski sliv. Karakterizira je neobična sličnost

sa oboje, lipljenom i pastrvom. Osim morfološke sličnosti sa lipljenom,

naročito u području trupa, sa njim dijeli i neka druga obilježja; zauzimaju ista

staništa, imaju slične hranidbene navike, obje vrste žive u jatima i mrijeste se

u proljeće. Međutim, lipljen nikada nije bio autohton na područjima gdje

14

nalazimo mekousnu pastrvu, već je tamo naknadno unesen. Njihova izrazita

sličnost može se objasniti u sličnosti staništa koje su naselili u prošlosti i njima

se prilagodili (Snoj i sur. 2002b). Radi specifičnog izgleda mekousnu pastrvu

nazivaju reliktom ostatkom davne zemljine prošlosti, posjeduje veći broj

"primitivnih" obilježja – pleistomorfi (kratke čeljusti, mala usta, kratki zubi i

spada u obligatorne slatkovodne ribe).

Izdvojene su četiri podvrste mekousne pastrve:

Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus Steindachner, 1882.

Salmothymus obtusirostris salonitana Karaman, 1926.

Salmothymus obtusirostris krkensis Karaman, 1926.

Salmothymus obtusirostris zetensis Karaman, 1932.

Slika 4: Područje rasprostranjenja četiri podvrste mekousne pastrve (Snoj,

2003)

15

Zajedničke karakteristike podvrsta mekousne pastrve su:

- malene ljuske

- zlatni sjaj tijela

- mala usta sa mesnatim usnama

- kratke čeljusti

- sitni zubi

- želudac sa velikim brojem piloričkih nastavaka (48 – 91)

- guste tamne točke iza škrga sve do leđne peraje

- rijetko raspoređene crvene točke koje dopiru do kraja tijela

- peraje nisu pigmentirane, izuzev leđne peraje

- proljetni mrijest

Salmothymus obtusirostris salonitana Karaman, 1926.

Podvrsta mekousne pastrve ″solinka″ (S. o. salonitana) naseljava

kratke kraške rijeke Jadro i Žrnovnicu, koje se ulijevaju u more u blizini grada

Splita. Ukupna duljina Jadra je 4,5 km. Iako se vodom iz rijeke Jadro

opskrbljuje grad Split i njegova okolica, područje sliva te rijeke izuzetno je

podložno onečišćenju. Žrnovnica je kratka, kraška rijeka, dužine toka od

svega 5,3 km (Štambuk-Giljanovic, 2002). Prije izgradnje brane kod

Prančevića rijeka Žrnovnica nije imala je stalan tok. Za vrijeme ljetnih mjeseci

rijeka je presušivala, pa stoga ihtiofaune u njoj nije bilo. Kad je prije 25

godina, brana izgrađena, rijeka je dobila stalan tok. Tada su prof. Pažur sa

Agronomskog fakulteta i gosp. Ritterman, vlasnik obližnjeg ribogojilišta,

prenijeli dio populacije mekousne pastrve iz rijeke Jadro u rijeku Žrnovnicu.

Danas je Žrnovnica postala pogodna i za druge vrste riba, pa uz mekousnu

pastrvu nalazimo kalifornijsku pastrvu i jegulje. Treer i suradnici (2003a;

2003b) proučavali su rast i kondiciju mekousne pastrve u rijekama Žrnovnici i

Jadru. Zaključili su da ona ima dobar rast u oba staništa, no bolji rast ipak

pokazuje u rijeci Žrnovnici. Naglašavaju da se translokacija u novo stanište u

ovom slučaju pokazala kao dobar postupak za zaštitu ove ugrožene vrste.

16

Djelomično slabiji rast u rijeci Jadro objašnjavaju time što je Jadro znatno više

pod utjecajem čovjeka, od vodnih regulacija do izuzetne naseljenosti uz rijeku.

Osim toga u rijeci Jadro postoji mnogo veća vrsna kompeticija.

Mekousnu pastrvu karakterizira zaobljena njuška, usta su joj mala i

mesnata, a gornjovilične kosti su i kratke i široke. Kao i druge podvrste, ima

velik broj piloričkih nastavaka, do 81. Leđa su sivkasto-žuta bez točaka, crne

točke se nalaze samo na prednjem dijelu tijela, a crvene se pružaju po

čitavom tijelu. Peraje su bez točki, a dok jedino na leđnoj nalazimo. Broj žbica

u perajama je D IV 11, a IV 9, V II 8, P I 12, C 19. Živi u mirnim tokovima

rijeka. Hrani se gamarusima, malim puževima i insektima (Vuković i Ivanović,

1971). Mrijesti se u ožujku. Na osnovu podataka o kondiciji dobivenih pri kraju

perioda mrijesta, Treer i sur. (2003a) su zaključili da je početak mrijesta

mekousne pastrve u Žrnovnici u trećoj, a puni mrijest u četvrtoj godini života.

Slika 5: Mekousna pastrva ″solinka″ (S. o. salonitana) iz rijeke Jadro (foto

Odak)

17

Salmothymus obtusirostris krkensis Karaman, 1926.

Mekousna pastrva, ″zlousta″ endem je rijeke Krke. Krka spada među

najljepše rijeke u Hrvatskoj, nacionalnim parkom proglašen je 1985. godine.

Izvire podno slapa Krčića, pokraj grada Knina. Do spajanja s morem duga je

72 km. Kvaliteta vode varira od prve pa sve od četvrte kategorije koju

nalazimo u području grada Knina.

Mekousna pastva u rijeci Krki odlikuje se jakom, tupom i kratkom

njuškom na kojoj su smještena mala usta. Gornja vilica joj je kraća i šira nego

donja, pa ne doseže ni do sredine oka. Tijelo joj je srebrnaste boje, posuto sa

crvenim i crnim točkama. Crne točke su sitnije od crvenih koje su rasute po

čitavom tijelu. Za vrijeme mrijesta u proljeće, točke su prisutne i na leđnoj

peraji, dok su ostale peraje bez pjega. ″Zlousta″ živi u otvorenom dijelu rijeke i

nikada se na skriva pod kamenjem. Kao i ostale mekousne pastrve mrijesti se

u proljeće, na krupnijem pijesku. Hrani se pretežno kukcima s površine vode

(Vuković i Ivanović, 1971).

Slika 6: Mekousna pastrva ″zlousta″ (S. o. krkensis), (foto Schöffman)

18

Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus Steindachner, 1882

Neretvansku pastrvu danas nalazimo u rijeci Neretvi i njenim pritocima

Buni, Rami, Rakitnici. Nekada je u rijeci Buni mekousna pastrva sačinjavala

99% svih salmonida (Taler, 1952), no danas je ovdje, vrlo ugrožena kao i u

ostalim staništima. U Hrvatskoj je nalazimo u maloj rječici Vrljici pokraj

Imotskog, čiji je izvorišni dio 1971. godine proglašen ihtiološkim rezervatom.

Mekousnu pastrvu lako prepoznajemo po karakterističnom obliku glave

i ispupčenim lubanjskim kostima oko očiju. Njuška joj je izdužena, a usta

mala, mesnata i mekana, sa zubima koji su poprilično pokriveni odebljalom

kožom. Gornjovilična kost dopire do polovine oka. Boja tijela je maslinasta, po

bokovima se preklapaju crne i narančaste točke. Crvene točke su vrlo rijetke

(Vuković i Ivanović, 1971).

Neretvanska mekousna pastrva živi u otvorenim tokovima rijeka, češće

se zadržava na mirnim, dubljim mjestima, a rjeđe u brzacima i bukovima.

Mrijesti se u travnju i svibnju. Mužjaci postaju spolno zreli u četvrtoj odnosno

petoj godini, a ženke nešto kasnije (od pete do sedme godine). Tada ženke

kopaju gnijezda na dubini od 34 cm do 1,4 m, a mužjaci ih čuvaju. Optimalna

temperatura vode za mrijest je od 9,3 do 10,10C. Kosorić i suradnici (1969) su

ispitivali mogućnost umjetne hibridizacije ove vrste, pri tome naglašavaju

optimalnu temperaturu (100C) za umjetni mrijest, pri kojoj je postotak

oplođene ikre najveći.

Usporedbom mekousne pastrve iz Bune sa mekousnim pastrvama

dalmatinskih voda, uočene su mnoga zajednička obilježja, ali i znatan broj

razlika u morfološkim obilježjima, što ukazuje na njihovo zajedničko srodstvo,

ali i na posljedice prostorne i ekološke izolacije.

Slika 7: Neretvanska mekousna pastrva (S. o. oxyrhynchus), (foto Pleško)

19

Salmothymus obtusirostris zetensis Karaman, 1932.

Mekousna pastrva je najugroženija riblja vrsta u Crnoj Gori, naseljava

usko područje od svega 50 km dužine donjeg toka rijeke Zete, kao i njen

zapadni pritok, rijeku Moraču (Marić, 1995).

Rod Salmothymus je monofiletski rod s vrstom mekousnom pastrvom

koja je prema staništu podijeljena u četiri podvrste. Brojni autori su imali

različita mišljenja o odnosima te četiri podvrste.

Mekousna pastrva prvi put je opisana u rijekama Jadru i Vrljici (Heckel,

1851), kao Salar obtusirostris. Steindachner (1882) opisuje mekousnu pastrvu

u rijeci Neretvi, koju radi sličnosti s lipljenom, uvrštava u rod Thymallus, kao

Thymallus microlepis. Kasnije uviđa da se tu radi o rodu Salmo, te mekousna

pastrva iz Neretve dobiva novo ime Trutta obtusirostirs oxyrhnchus po

karakterističnoj šiljatoj njušci. Steindachner također ukazuje na njezinu

sličnost s vrstom Coregonus oxyrhynchus.

Berg (1908) prvi ujedinjuje mekousne pastve u jedan rod

Salmothymus. U rod Salmothymus uvrštena je i endemska pastrva iz

Ohridskog jezera u Makedoniji, belvica Acantholingua (Salmo) ohridana.

Steindachner (1892) je prvi opisao belvicu.

Proučavajući morfološka i ekološka obilježja mekousne pastrve iz

Bune, Janković (1961) ih je usporedila endemskim pastrvama Ohridskog

jezera, letnicom (Salmo letnica Karaman, 1924) i belvicom (Acantholingua

(Salmo) ohridanus Steindacher, 1892). Ona pretpostavlja da su vrste iz

Ohridskog jezera nekada bile u bliskom srodstvu sa vrstama iz dalmatinskih

voda. Međutim, nakon duge odvojenosti, te su vrste dobile posebne

morfološke i ekološke odlike po kojima se danas jasno razlikuju. Stearley i

Smith (1993) na osnovu osteoloških mjerenja tvrde da su S. obtusirostris i A.

ohridanus pripadnici istog roda Salmothymus, pa u taj rod smještaju i vrste

Salmo ishchan i Salmo carpio. Hadžišće (1961) smatra da prema morfološkim

karakteristikama belvica ipak spada u rod Acantholingua. Međutim, nakon

molekularnih analiza (Oakley i Phillips, 1999) za belvicu je utvrđeno da

pripada rodu Salmo. To su potvrdili i Snoj i sur. (2002b), uspoređujući

20

sekvence kontrolne regije i citokroma b sa mtDNA i dijela LDH C*1 gena sa

nuklearne DNA molekule.

Uspoređujući morfološka obilježja mekousne pastrve iz Jadra s onima

iz Bune Heckel i Kner (1857) su uočili značajne razlike u dužini njuške i

sličnosti u dužini gornje vilice (dopire do polovine oka). Broj žbica u svim

perajama je jednak, međutim zapazili su veći broj ljuski u bočnoj liniji kod

mekousne pastrve iz rijeke Bune. Morfološke karakteristike i ponašanje

mekousne pastrve iz Jadra, Krke i Neretve opisao je Karaman (1927). Behnke

(1968) smatra da se Karamanovo poimanje vrste kosi s modernim

taksonomskim pogledima, te da je potrebno napraviti reviziju njegova rada.

Karaman je prvi opisao mekousnu pastrvu u rijeci Zeti koju je nazvao

Trutta obtusirostris, smatrajući da se radi o formi mekousne pastrve koja

obitava u Ohridskom jezeru u Makedoniji Salmo letnica Kraman, 1924. Svoju

tvrdnju Karaman je objasnio time što je Skradarsko jezero, kojemu je rijeka

Zeta pritok, povezano rijekom Bojanom s donjim dijelom rijeke Drima koji je

pritok Ohridskog jezera. Hadžišće je 1962. godine na osnovu sličnih

karakteristika sa rodovima Salmothymus i Acantholingua zaključio da se radi

o novoj vrsti koju je nazvao Salmo zetensis. Karaman (1966) smatra da

mekousna pastrva u rijeci Zeti predstavlja prijelazni oblik između var.

obtusirostris i var. ohridanus, ali naglašava da treba nastaviti ispitivanja kako

bi se među njima utvrdile razlike i sličnosti. Danas mekousna pastrva (S. o.

zetensis) obitava samo u donjem dijelu rijeke Zete i njenom zapadnom

pritoku, rijeci Morači. Radi zagađenja i izlovljavanja spada u jednu od

najugroženijh slatkovodnih riba u Crnoj Gori (Marić, 1995).

Stefanović (1948) se bavi usporedbom mekousne pastrve s azijskim

rodom salmonida Brachymystax, na čiju je sličnost ukazivao i Berg (1923).

Mekousna pastrva iz rijeke Bune i azijska vrsta Brachymystax lenok Pallas

imaju približno jednak broj žbica u perajama. Međutim, mekousna pastrva ima

manji broj ljuski u bočnoj liniji i te nešto širu granicu variranja broja

branhiospina u prvom škržnom luku. Povezuje ih broj slijepih crijeva (oko

100), dužina gornjovilične kosti, koja dopire do polovine oka, te jednako

razdoblje mrijesta - proljeće. Stoga, iznosi pretpostavku o eventualnoj

srodnosti mekousnih pastrva s azijskim salmonidima roda Brachymystax.

21

Dorofeyeva (1989) iznosi filogenetsku hipotezu da rod Salmothymus

nije u vezi sa rodom Brachymystax i ponovo naglašava njegovo mjesto u

skupini Salmo.

Specifičan izgled mekousne pastrve i njena ekološka svojstva iznio je

Taler u nizu članaka (1951, 1952, 1953, 1954). Sistematskim položajem

endemske mekousne pastrve bavio se Stanković (1960). Kosorić i suradnici

(1969) su ispitivali mogućnost umjetnog mrijesta mekousne pastrve iz rijeke

Neretve (subsp. oxyrhinchus). Utvrdili su da je optimalna temperatura za

mrijest 100C jer je pri toj temperaturi postotak oplođene ikre najviši.

Prema pregledu prošlih istraživanja na rodu Salmothymus očito je da

su se morfološke karakteristike kao kriterij za klasifikaciju pokazale

nedovoljnima i nepouzdanima. Stoga je bilo neophodno preispitati filogenetski

odnos i sa gledišta molekularne genetike.

Klasifikacija porodice Salmonidae i intergenerični odnosi unutar nje,

određeni su uglavnom na osnovu morfoloških istraživanja (Stearley i Smith,

1993), no takve analize, iako brojne, u suprotnosti su sa genetičkim

analizama (Phillips i Oakley, 1997). Brojni autori predlažu različite odnose

unutar Salmonidae. Na osnovu osteoloških obilježja (Shaposhinikova, 1975),

porodica Salmonidae podijeljena je u tri podporodice: Salmoninae,

Coregoninae i Thymallinae. U prvoj porodici nalazi se 6, u drugoj 3, a u trećoj

1 rod. Istraživano je 6 rodova: Salvelinus, Hucho, Brachymystax podporodice

Salmoninae i Stenodus, Prosopium i Coregonus podporodice Coregoninae.

Osteološka istraživanja omogućila su da se ustanove njihova taksonomska

obilježja i da se odredi taksonomski položaj u porodici.

Analize na biokemijskom nivou podporodice Salmoninae vršili su

Osinov i Lebedev (2000) na 31 – 37 genskih lokusa kod 21 vrste iz 7 različitih

rodova. Utvrđeno je monofiletsko porijeklo (Oncorhynchus + Parasalmo) i

(Hucho + Brachymystax). U filogenetskom stablu najproblematičniji je bio rod

Parahucho. Točna i opće prihvaćena klasifikacija porodice Salmonidae samo

je djelomično završena i to uglavnom kod dobro proučenih rodova (npr.

Oncorhynchus, Salmo, Salvelinus i Hucho) zahvaljujući ponajprije

molekularnim analizama (Phillips i Oakley, 1997), dok su brojne vrste sa

staništima u Aziji i Balkanskom poluotoku (npr. Brachymystax, Acantholingua,

22

Salmothymus) vrlo slabo proučene, a njihovo sistematsko mjesto je i dalje

upitno (Osinov, 1999).

Slika 8: Četiri osnovne hipoteze za odnose između rodova Brachymystax,

Hucho i Salvelinus: (A) Norden (1961), (B) Kendall i Behnke (1984), (C)

Dorofeyeva (1989) i (D) Stearley i Smith (1993)

Općenito je prihvaćeno da je rod Oncorhynchus najudaljeniji u porodici

Salmoninae, a prate ga rodovi Salmo i Salvelinus. Norden (1961) smatra da je

svaki rod monofiletski, i da se grana zasebno od debla (Slika 8, A). Kendall i

Behnke (1984) smatraju da su sva tri "problematična" roda (Brachymystax,

Hucho i Salvelinus) potekla iz jedne monofiletske grupe (Slika 8, B).

Dorofeyeva (1989) na osnovu osteoloških analiza smatra da su rodovi

Brachymystax, Hucho i Salvelinus potekli s jedne, a rod Salvelinus sa druge

monofiletske strane (Slika 8, C). Stearley i Smith (1993) odvajaju rodove

Brachymystax, Hucho i Salvelinus u dvije zasebne monofiletske grane, pa u

jednu spadaju rodovi Hucho i Salvelinus, a u drugu rod Brachymystax (Slika

8, D).

Tek nakon ulaska molekularne tehnologije u područje istraživanja

sistematike Salmonidae, dobiven je točan i opće prihvaćen položaj spornih

rodova.

23

Sekvencioniranjem hormona rasta (GH2C) Oakley i Phillips (1999)

dokazali su da je rod Braxhymystax napredni predstavnik roda Hucho, te

odbacili hipotezu o Braxhymystaxu kao rodu arhaičnih salmonida.

Slika 9: Brachymystax lenok (foto Schöffman)

Slika 10: Acantholingua ohridana

(http://www.ittiofauna.org/webmuseum/acantholingua_ohridana/index.htm)

Predmet istraživanja Phillipsa i sur. (2000) je sistematsko mjesto roda

Acantholingua. Sekvencioniranjem hormona rasta (GH2C), te dijela

ribosomske DNA (ITSI) i citokroma b na mitohondrijalnoj DNA ustanovili su da

je rod Acantholingua filogenetski vrlo blizu rodu Salmo.

Snoj i sur. (2002b) proučavali su mtDNA (kontrolnu regiju i citokrom b

gen) i nuklearnu DNA (dio laktat dehidrogenaze C1 gena). Na osnovu

sekvencioniranja navedenih dijelova izvedeno je filogenetsko stablo (Slika

11).

24

Slika 11: Sistematika porodice Salmondiae, s posebnim osvrtom na odnose

između rodova Salmothymus, Acantholingua i Salmo, na osnovu

sekvencioniranja kontrolne regije mtDNA i citokroma b, iz nuklearne DNA

(Snoj i sur, 2002)

Kako su se rodovi Salmothymus, Acantholingua i Salmo pokazali jako

bliski, smješteni su u zasebnu skupinu, poput rodova Salvelinus,

Oncorhynchus i ostalih. Upravo taj podatak ukazuje na nepravilnosti prijašnjih

klasifikacija. Blizak odnos između rodova Salmo i Salmothymus potvrđen je i

analizom LDH gena, koji je utvrđen samo kod predstavnika rodova

Salmothymus, Acantholingua i Salmo, što ga čini važnim filogenetskim

markerom.

U narednim istraživanjima filogenetskih odnosa analizirani su LDH i

ITS1 gen (Snoj, 2003), kako bi se odredio točan položaj roda Salmothymus u

Salmo skupini.

25

Slika 12: Sistematika porodice Salmoniae na osnovu sekvencioniranja

kontrolne regije mtDNA, citokorma b, LDH-C1* i ITS1 gena nuklearne DNA

(Snoj, 2003).

Unutar roda Salmo prisutna su tri ogranka; S. salar, S. trutta kompleks

sa S. marmoratus i treći A. ohridana i S. obutusirostris, koji predstavlja

evolucijski prijelaz između Atlantskog lososa i potočne pastrve.

Na osnovu sekvencioniranja kontrolne regije mitohondrijalne DNA

(Snoj i sur., 2002b; Snoj, 2003) utvrđena je bliska veza podvrste

Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus i rodova Salmo i Acantholingua (Slika

12). Filogenetsko drvo proizašlo iz analize mtDNA i nuklearne DNA ukazuje

da su podvrste Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus i Acantholingua

sestrinske vrste, znatno bliže sa S. trutta, nego sa S. salar. Stoga, rodovi

Salmothymus i Acantholingua, smatra autor, predstavljaju posebni ogranak

koji se filogenetski nalazi između S. salar i S. trutta. Ovo otkriće pobija

današnju klasifikaciju roda Salmothymus kao zasebnog roda, i nameće

njegovu reklasifikaciju na razinu vrste unutar roda Salmo.

0.01

Salvelinus fontinalis

Oncorhynchus mykiss

Salmo salar

SSaallmmootthhyymmuuss oobbttuussiirroossttrriiss

Acantholingua ohridana 100

Da

At

Ma

Ad 81

94

100

100

Salmo trutta/ marmoratus complex

Salmo obtusirostris

26

1.1.2. Metode razlikovanja ribljih populacija

Ribe su najbrojnija grupa kralježnjaka sa 24 600 različitih vrsta (Nelson,

1994). Da bi opisali i sistematski odredili različite vrste, sistematičari su razvili

različite metode.

1.1.2.1. Morfološke metode razlikovanja ribljih populacija

Danas postoje brojne metode kojima je moguće odrediti genetsku

strukturu neke populacije. Najstarije, a ipak još uvijek najviše korištene

metode, su klasične morfološke metode, morfometrijske i merističke metode.

Razlozi njihove široke korištenosti su jednostavnost i pristupačnost, a također

i ekonomski značaj. Morfometrija je područje istraživanja gdje se

kvantitativnim analizama opisuje oblik i veličina neke morfološke jedinke ili

karakteristike (Oxnard, 1978). Morfometrijskim metodama utvrđuju se

dimenzije pojedinih dijelova tijela, kao i odnosi među njima. Pri tome je, radi

pouzdanosti usporedbi, potrebno voditi računa o starosti i spolu uspoređivanih

riba. Ovakva klasična metoda odnosa pojedinih tjelesnih dužina pokazala se

posebno prikladnom za utvrđivanje ekoloških utjecaja na morfologiju riba

(Treer i sur., 1995; 2000). Za prikazivanje morfoloških razlika između genetski

bliskih populacija ili taksona riba, bolje rezultate daje metoda vezane mreže

(truss metwork), kojom se mjere elementi oblika, bazirani na linearnim

mjerenjima između homolognih ključnih anatomskih točaka (Delling i sur.

2000). Uz dužine na tijelu riba, morfometrijskim osobinama pripadaju i one

unutar tijela, kao što su npr. dužina probavila, dužina branhiospina, promjer

ikre i dr. Vanjski utjecaji mogu bitno djelovati na morfometrijske osobine, jer

su njihovi heritabiliteti (h2) u pravilu vrlo niski (Tave, 1993). Morfološka

istraživanja, kako ona što se bave vanjskom morfologijom, a tako i ona

osteološka, često su izvor podataka za analizu filogenetskih odnosa pojedinih

vrsta riba (Shaposhnikova, 1975). Zadatak takovih istraživanja je da se utvrdi

stanje određenih karakteristika i njihova učestalost u istraživanim vrstama.

Time je omogućeno utvrđivanje statusa nekih karakteristika u filogenetskom

27

smislu, odnosno da li su one odavno prisutne u populaciji (pleizmorfne) ili su

izvedene (apomorfne), (Hening, 1966).

Za razliku od morfometrijskih osobina, merističke osobine imaju znatno

veći stupanj nasljeđivanja, a time i veću pouzdanost u razlikovanju ribljih

populacija. To su parametri koji se na tijelu riba mogu izbrojiti, kao npr. broj

žbica u perajama, broj ljuski u bočnoj pruzi, iznad i ispod nje, broj kralježaka i

dr. U genetskim istraživanjima posebno značajan u razlikovanju ribljih

populacija pokazao se broj branhiospina (Alegria Hernandez, 1985).

1.1.2.2. Genetičke metode razlikovanja ribljih populacija

Funkcijska jedinica DNA molekule što se pri reprodukciji prenosi sa

roditelja na potomstvo zove se gen. Geni zajedno s faktorima okoline uvjetuju

različita tjelesna obilježja i ponašanja. Različiti oblici pojedinog gena su

alelomorfni geni ili aleli (Stryer, 1995). Složenim uklapanjima molekule DNA i

proteina nastaju kromosomi. Svaki organizam ima karakterističan set

kromosoma koji se zove kariotip. Diploidni organizmi posjeduju dvije kopije

jednog kromosoma, pri čemu je jedan naslijeđen od majke, a drugi od oca. Na

kromosomu se nalazi veliki broj gena. Lokus označava položaj gena na

kromosomu. Tako na svakom lokusu diploidni organizmi imaju dva alela,

jedan je na majčinskom, a drugi na očinskom kromosomu. Homozigoti su oni

organizmi koji imaju jednake alele na lokusima, odnosno jednak slijed

nukleotida na oba alela. Kod heterozigota to nije slučaj (Lewin, 2000).

Molekularni marker je sekvenca na DNA molekuli ili proteinu koja se

može lako detektirati i čije je nasljeđivanje moguće izučavati. Varijabilnost ili

polimorfizam čini molekularni marker korisnim u genetskom razlikovanju

populacija (Ford-Lloyd, 1996).

Molekularna sistematika bavi se razvojem makromolekula i na toj

osnovi rekonstruira povijest gena i organizma, a šire gledano, objašnjava

genetsku različitost (Moritz i Hillis, 1996).

Molekulu DNA nalazimo u jezgri i u mitohondrijima. Kod riba, veličina

nuklearnog genoma kreće se od 0,3 do 4 bilijuna parova baza (Ohno, 1974),

28

a mitohondrijalnog genoma od 14 000 do 20 000 parova baza (Park i Morgan,

1994).

Polimorfizam na DNA razini nastaje kao rezultat točkastih mutacija i

pogreški prilikom replikacije. Istraživanje tih varijacija postalo je moguće

zahvaljujući razvoju tehnika DNA analize, ponajprije otkrićem restrikcijskih

enzima, koji režu molekulu DNA na fragmente, te razvojem lančane reakcije

polimeraze (PCR), koja omogućuje amplifikaciju fragmenta DNA od

minimalnog uzorka.

Metodološka područja molekularne genetike, koja se često u

istraživanjima koriste su: aloenzimi, mitohondrijska DNA i ponavljajuće

sekvence DNA molekule, mikrosateliti.

1.1.2.2.1. Aloenzimi

Sedamdesetih godina u molekularnoj populacijskoj genetici riba glavni

alat bili su enzimi. Razlikovanje alelnih varijanti proteina (aloenzima) pomoću

elektroforeze pokazalo se vrlo uspješno pri istraživanju genetske različitosti.

Aloenzimi kao genetski markeri su vrlo uvjerljivi i relativno se lako koriste,

međutim, potrebno je spomenuti i njihove mane pri korištenju kod nekih ribljih

vrsta. Ponajprije se pojavio problem kada se utvrdilo da je njihova varijabilnost

kod nekih vrsta znatno niska. Osim toga, često se nalaze na vrlo malom

kodirajućem dijelu genoma i teško ih je detektirati elektroforezom. Za

istraživanje tom metodom potreban je veći uzorak tkiva, koji ako se duže čuva

dolazi do njegove degradacije (Carvalho i Hauser, 1994). U ranijim studijama

enzimski lokusi su prvo korišteni kao biokemijski markeri ribogojilišnih linija,

radi otkrivanja i popravljanja rijetkih alela (Utter i Seeb, 1990), tek kasnije i

kao dijagnostika za razlikovanje domaćih od divljih populacija. Osim toga,

enzimski polimorfizam je bio efikasno korišten kao genetski marker pri

određivanju strukture populacija različitih ribljih vrsta. Međutim, javila se

potreba za više polimorfnim markerima pri detektiranju inbridinga u

populacijama, u studijama uspjeha križanja divljih populacija.

29

1.1.2.2.2. Mitohondrijska DNA

Mitohondrijska DNA molekula ima jednostavnu strukturu i organizaciju,

zatvorenog je i kružnog oblika. Vrlo je značajan dio genoma i nalazimo je u

svakoj stanici sa 0.0006% ili 1% ukupne mase stanične DNA (Cables, 2001).

Duga je od 14 do 20 kbp, a sadrži 37 gena, dva ribosomska DNA (rDNA)

gena, 22 transverzna RNA (tRNA) gena i 13 gena što kodiraju proteine

uključene u transport elektrona ili ATP sintezu. Na mtDNA se nalaze dijelovi

za kodiranje nasljednih proteina: citokroma b, tri podjedinice citokrom

oksidaze, tri podjedinice ATP sintetaze i sedam podjedinica NADH

dehidrogenaze. Također sadrži i kontrolnu regiju (engl. D-loop region), dužine

oko 1000 bp sa sekvencama koje djeluju u začetku replikacije i transkripcije

(Harrison, 1989). Dok su geni za rRNA molekule izuzetno konzervativni,

područje kontrolne regije često je podložno promjenama (Shedlock i sur.,

1992). Određeni segmenti kontrolne regije imaju različit stupanj varijabilnosti.

Najbolje je sačuvan njen centralni dio, koji je posebno bogat citozinskim i

gvaninskim bazama, dužine 270 bp (Shedlock i sur., 1992). Velika

varijabilnost kontrolne regije objašnjava se time što jedan od dva lanca

zavojnice biva premješten sintezom novog lanca tijekom replikacije. Kontrolna

regija je kod riba dosta duga i često sadrži tandemski ponavljajuće sekvence.

Mitohondrijska DNA (mtDNA) je izuzetno vrijedan genetski marker u

populacijskoj i evolucijskoj biologiji. Razlog tome je, što je relativno lako

izolirati čiste homologne sekvence, budući da je prisutna sa velikim brojem

kopija - do 1000 po stanici. Jednostavna organizacija, materinsko

nasljeđivanje i odsutnost rekombinacija uz visoki stupanj mutacija, čine

mtDNA idealnim markerom za istraživanje strukture populacija (Zhang i

Hewitt, 1996). Pri promatranju strukture neke populacije, mtDNA je vrlo

korisna, bilo da se radi o razlikama između različitih vrsta (interspecifična

divergenca) ili unutar pojedine vrste (intraspecifična divergenca). MtDNA kao

molekularnim markerom moguće je razlučiti strukturu populacije i pratiti

intraspecifične varijacije pojedinih, geografski odvojenih populacija (Snoj,

1997).

Radi materinskog nasljeđivanja mtDNA replicira se zasebno od

nuklearne DNA, pri čemu samo dio populacije prenosi mtDNA na potomstvo.

30

Mitohondrijalni geni predstavljaju neprekinutu liniju genetske informacije

unatrag do prve ženke ili populacije ženki (Cables, 2001). Zbog haploidnosti

mitohondrijalnog genoma, efektivna veličina populacije za mtDNA je samo

jedna četvrtina nuklerane DNA (Nei i Tajima, 1981). Pri tome ne dolazi do

rekombinacija, kao što je slučaj sa nuklearnom DNA, već se mtDNA prenosi

nepromijenjena na potomstvo. Magoulas i Zouros (1993) navode da

materinsko nasljeđivanje mtDNA nije isključivo, tako u slučajevima

heteroplazmije udaljenih mitohondrijskih linija to nije slučaj. Postotak zamjene

nukleotida u mt DNA je 5 do 10 puta veći nego u nuklearnoj DNA, izmjerena

je vrijednost od 5,7 x 10-8 supstitucija za pojedinačno nukleotidno mjesto za

godinu dana (Brown i sur. 1982). Pretpostavljajući konstantnim stupanj

promjene mtDNA sekvence uz procjenu postojeće različitosti, moguće je

izračunati vrijeme kada su dvije vrste dijelile istog ženskog pretka. Stupanj u

kojem mtDNA akumulira mutacije je 2 – 4% u milijun godina (Lewin, 2000).

Signifikantne razlike mtDNA u različitim geografskim područjima i materinsko

(klonalno) nasljeđivanje čine mtDNA efikasnim genetskim markerom za

proučavanje evolucije, uključujući migracije, introdukcije i ″uska grla″

populacija. Ti markeri uz razlikovanje populacija i identificiranje podrijetla riba,

omogućuju ispitivanje efikasnosti uvođenja pojedinih linija u akvakulturu, a

vrlo su efikasni za kontrolu djelovanja unesenih linija na domaće autohtone

vrste (Li i sur., 1993). Usporedbom mtDNA sa sekvencama koje se prenose

sa oba spola (autosomalni geni) i onima što ih prenose samo mužjaci,

moguće je uočiti znatne razlike u strukturi populacije između mužjaka i ženki,

te ukazati na razlike u njihovoj ekologiji i ponašanju (Harrison, 1996).

Mnoge studije u određivanju stupnja različitosti između i unutar

populacija koriste se tehnikom rezanja mtDNA s restrikcijskim

endonukleazama (engl. restriction fragment length polymorphism – RFLP), pri

čemu se molekula razreže specifičnim restrikcijskim enzimima, a potom se

produkti odvajaju po veličini koristeći gel elektroforezu. Restrikcijska mjesta se

mapiraju, osnosno bilježi se njihova prisutnost ili odsutnost. Korištenje ove

tehnike nije toliko preporučljivo pri određivanju razlika između vrsta i viših

taksonomskih jedinica (Dowling i sur., 1990).

Mitohondrijska DNA regija je dobro proučena kod različitih ribljih vrsta.

Poznavanje i korištenje univerzalnih začetnih nukleotida (engl. primer) za

31

amplifikaciju sekvenci lančanom reakcijom polimeraze, učinilo ju je vrlo

prihvatljivim alatom u molekularnoj genetici kod riba. Područja gdje su

smješteni geni za kodiranje proteina i područje kontrolne regije, pokazala su

se posebno korisnima pri analizi odnosa nedavno odvojenih populacija.

Međutim, ta područja radi pojave višestrukih supstitucija nisu dovoljna pri

analizi viših taksonomskih jedinica, pa se pri takvim istraživanjima koriste

konzervativnija područja poput 12S i 16S ribosomskih RNA gena (Stepien i

Kocher, 1997).

Evolucija mtDNA sekvence je dobro proučena kod riba. Zamjena baza

se događa dosta često, no struktura mtDNA i poredak gena je jako

konzervativan. Budući da se mtDNA prenosi kao jedan gen, treba biti oprezan

pri donošenju zaključaka o čitavoj populaciji, jer se evolucija pojedinog gena

može razlikovati od evolucijskog prosjeka čitavog genoma.

Citokrom b je vjerojatno najbolje proučen gen u mtDNA kod riba. On

ima ulogu u kodiranju proteina važnih u procesu disanja kod staničnog

metabolizma. Citokrom b se vrlo često koristi kod istraživanja strukture i

porijekla ribljih populacija. Tako ga Basely i Bernatchez (2001) koriste uz

mikrosatelite kod jezerske ozimice (Coregonus clupeaformis), a Sušnik i sur.

(2001) proučavaju genetske strukture različitih populacija lipljena (Thymallus

thymallus).

32

1.1.2.2.3. Ponavljajuća DNA

Ponavljajuću DNA molekulu nalazimo u dva oblika; kao raspršenu i kao

tandemski ponavljajuću. Raspršenu ponavljajuću DNA molekulu dijelimo s

obzirom na broj ponavljanja na: duge rasute elemente (LINE) koji su duži od

1000 baza i kratke rasute elemente (SINEs), koji su kraći od 500 baza. Ako je

prisutno mnogo kopija, oko 1000 jedne ponavljajuće jedinice, tada govorimo o

satelitima. Pri manjem broju ponavljanja koristimo termine minisateliti i

mikrosateliti. Minisateliti nisu posebno prihvaćeni u ribarstvu, pa je većina

istraživanja koncentrirana na drugu klasu ponavljajuće DNA, mikrosatelite.

1.1.2.2.3.1. Mikrosateliti

Mikrosateliti su otkriveni u eukariotskim stanicama prije više od

petnaest godina, no njihovo postojanje u početku nije pobuđivalo veći interes

znanstvenika (Jarne i Lagoda, 1996). Tada su nazvani beznačajna DNA

(engl. junk DNA), iako je vrlo brzo otkrivena njihova vrijednost kao genetskih

markera. Termin mikrosateliti odnosi se na najmanje ponavljajuće jedinice.

Sastoje se od jednostavnih ponavljajućih sljedova nukleotida, veličine od 2 do

6 parova baza, npr. (TG)n ili (AAT)n i rijetko sadrže više od 70 ponavljajućih

jedinica. Brojni su u eukariotskim genomima, no nalaze se i u prokariota, ali

sa manjom učestalošću. Nalaze se po cijelom genomu, u kodirajućim i u

nekodirajućim regijama. Manji broj ih se nalazi na području centromernih i

telomernih regija (Tautz, 1993). Ipak, izgleda da svaki gen ima jedan

mikrosatelit.

Mikrosateliti su prisutni u genomu svih do sada proučenih organizama.

Genom riba je vrlo bogat tim sekvencama, pa u genomu potočne pastrve

nalazimo od oko 33 000 do 109 000 mikrosatelita (Estoup i sur. 1993). Vrlo su

pogodni za istraživanja, jer se uspješno mogu izolirati iz različitih materijala.

33

Najčešće se izoliraju iz krvi i tkiva riba, ali ih je moguće izolirati i iz dlake, sline

ili izmeta (Constable i sur., 1995). Također se uspješno izoliraju iz suhih ljuski

(Miller i Kapuscinski 1996), i iz otolita (Hutchinson i sur. 1999), te iz vrlo malih

količina biološkog materijala, kao što je arheološki materijal, koji može

sadržavati gotovo razgrađenu DNA (Bruford i sur., 1998). Mogućnost izolacije

mikrosatelita iz vrlo malih dijelova biološkog materijala učinio ih je korisnima

pri istraživanju rijetkih i ugroženih vrsta (Queller i sur., 1993).

Zbog ponavljajućih sljedova nukleotida koje sadrže, mikrosateliti su

izuzetno podložni pogreškama prilikom replikacije DNA. Taj se proces naziva

pogrešno sparivanje iskliznutog lanca (engl. slipped - stand misparing) ili

klizanje (engl. slippage), a dovodi do skraćenja ili produljenja DNA molekule

prilikom replikacije (Schlötterer i Pemberton, 1994). Najčešća mutacija kod

mikrosatelita je promjena od jedne ponavljajuće jedinice. Takav tip mutacija

omogućuje da lokusi evoluiraju procesom tzv. stepenaste mutacije (engl.

Stepwise Mutation Model – SMM). Stupanjski mutacijski model može se

pojaviti u dva podoblika: jednostupanjski (engl. single-step mutation model) i

dvofazni mutacijski model (engl. two-phase mutational model), (Dirienzo i sur.,

1994). U prvom se modelu pretpostavlja da mutacijske promjene dovode do

povećanja ili smanjenja u broju jedne ponavljajuće jedinice, dok drugi model

uključuje jednostupanjski mutacijski model, ali dopušta i mutacije

ponavljajućih jedinica. Slatkin (1995) objašnjava da je mutacija kod tih lokusa

proces s memorijom (tzv. konvergentna priroda memorije), odnosno, da se u

procesu mutacije novi mutant nadovezuje na prethodni alel, pa u tom slučaju

razlika u dužini između alela sadrži informaciju koja ima filogenetičku

vrijednost. Razlika u dužini između dva alela daje informaciju o vremenu koje

je prošlo od kada su ta dva alela dijelila jedan zajednički, ancestralni alel.

34

Slika 13: Stvaranje polimorfizma DNA sekvence pogrešnim sparivanjem baza,

ispadom dijela sekvence

a) Ispad unatrag uzrokuje inserciju

b) Ispad naprijed uzrokuje deleciju (Strachan i Read, 1996)

35

Brzina mutacije mikrosatelita je izuzetno velika. Spontana mutacija za

mikrosatelitske lokuse je 10-2 do 10-4 po generaciji, što je znatno više od

promjena na enzimima od 10-6 po generaciji (Nei, 1987). To dovodi do

promjene u broju ponavljajućih nukleotida, odnosno do produženja ili

skraćenja lanca DNA tijekom replikacije. Mutacije su prisutne i kod

deseterostrukog ponavljanja dinukeotidne sekvence. Stupanj polimorfizma je

razmjeran broju ponavljanja osnovnog motiva. Mutacijski stupanj kod

dinukleotidnih ponavljanja je za 1,5 do 2 puta veći od mutacijskog stupanja

tetranukleotidnih ponavljanja, dok je stupanj mutacije kod tronukleotidnih

ponavljanja, između ova dva (Chakraborty i sur., 1997).

Mikrosatelite dijelimo u tri skupine:

- potpuni mikrosateliti (CACACACACACACACACACA)

- sastavljeni mikrosateliti (CACACACACAGAGAGAGAGA)

- prekinuti mikrosateliti (CACATTCACACATTCATTCA)

Sastavljeni i prekinuti mikrosateliti pokazuju manji stupanj polimorfizma od

potpunih mikrosatelita (Jarne i Lagoda. 1996).

Visoki stupanj polimorfnosti, kodominantnost (heterozigoti se razlikuju

od homozigota) te jednostavan Mendeljevski način nasljeđivanja, čini

mikrosatelite vrlo popularnim molekularnim markerima (Page i Holmes, 1998).

Zahvaljujući njihovom visokom stupnju polimorfizma, ti markeri su se pokazali

korisnima u istraživanju vrsta s malim enzimskim varijacijama kao što je npr.

atlantski losos (Salmo salar), (Gavin i sur. 1996) i jezerska zlatovčica

(Salvelinus alpinus), (Brunner i sur. 1998).

Mikrosateliti su vrlo korisni pri istraživanjima genetske varijacije u

populacijskoj genetici, jer se lako otkivaju pomoću PCR tehnike i jer se razlika

u alelima od samo 1 bp može uočiti na visoko rezolucijskim gelovima (Hansen

i sur., 2001). Lančanu reakciju polimeraze je moguće dobro optimizirati pa je

moguće u jednom procesu amplificirati više različitih lokusa. Mikrosateliti se

često koriste pri određivanju roditeljstva, srodnosti i identifikaciji jedinki

(Queller i sur., 1993). Radi velikog polimorfizma mnogi mikrosateliti

omogućuju uspješnu identifikaciju jedinki i odnosa unutar porodica. To

uključuje veliki broj mikrosatelita (engl. DNA fingerprinting), koji predstavljaju

36

različite genotipove. Ti markeri omogućuju istraživačima da identificiraju

srodstvo i vezu ne samo u prvoj, nego i u daljnjim generacijama, a to

omogućuje analizu reprodukcijskog uspjeha i “fitness” pojedine jedinke

(Crivelli i sur. 2000). Aliah i suradnici (2000) ih koriste pri istraživanju bliskih

linija, kod populacija koje su ugrožene “uskim grlom” (engl. bottlenecks) kao

rezultatom križanja.

Ono što bitno pridonosi popularnosti mikrosatelita kao markera je da su

mikrosatelitski lokusi bliskih vrsta gotovo jednaki, pa je stoga moguće koristiti

iste začetne nukleotide i procedure. Međutim, kod filogenetski udaljenih vrsta

ipak je potrebno ponovno izolirati nove lokuse, jer ne postoje univerzalni

začetni nukleotidi (Schlötterer i Tautz, 1992).

Dužina alela mikrosatelitskog lokusa određuje se umnažanjem

određenog lokusa pomoću lančane reakcije polimerazom (PCR). Međutim,

prije nego što se mikrosatelitski lokus umnoži potrebno je spoznati sljedove

baza koji se nalaze neposredno uz istraživani lokus, tada je moguće napraviti

začetne nukleotide. Za neke životinje postoji veći broj mikrosatelita. Te

podatke je moguće pronaći u literaturi ili u računalnim bazama podataka

(EMBL ili GenBank). Ako za istraživanu vrstu na postoje već otkriveni

mikrosateliti, tada pristupamo analizi izolacija mikrosatelitskih lokusa i njihovih

postranih sljedova (Schlötterer, 1998).

Jedan od problema koji se javlja pri interpretaciji rezultata nakon

elektroforeze je pojava niza odjeljaka (engl. stutter bands), a ne samo jednog

ili dva (ovisno da li se radi o homozigotu ili heterozigotu). Taj problem je

naročito izražen kod dinukleotidnih ponavljanja nukleotida. Obično je odjeljak

najvećeg intenziteta onaj očekivani, no razlike u intenzitetu nisu dovoljne da bi

se sa sigurnošću moglo zaključiti koji je odjeljak ishodišni alel. Nastanak

dodatnih odjeljaka rezultat je klizanja DNA (engl. slippage) za vrijeme PCR

umnažanja in vitro (Schlötterer, 1998).

37

1.1.3. Očuvanje genetske različitosti ribljih populacija

Genetska varijabilnost je osnova biološke evolucije svega živoga, pri

čemu je posebno važna genetska varijabilnost unutar vrste, jer je nužna za

uspješno prilagođavanje promjenama okoliša i za preživljavanje vrste. S

gubitkom genetske različitosti dolaze posljedice različitog stupnja, pri čemu je

najtragičnija ona što dovodi do izumiranja vrste. Biološka različitost je u prirodi

hijerarhično organizirana. Svaki ekosustav se sastoji od velikog broja jedinki

koje su različitim filogenetskim vezama povezane unutar i među vrsta. Osim

toga, i svaka evolucijska linija ima svoj vrsni diverzitet. Često je potrebno

poznavati izvor i način biološke raznolikosti za uspješno očuvanje neke vrste

(Vida, 1994, Sušnik, 2001).

Evolucijski signifikantne jedinke (engl. ESU; Evolutionary Signifacant

Units) su populacija ili skupina populacija koje su reproduktivno izolirane od

drugih populacija iste vrste i predstavljaju važan element u genetskoj

raznolikosti vrste (Waples, 1991). Najprimjerenije za očuvanje bile bi one

vrste koje su autohtone u nekom geografskom području i genetski su što više

udaljene od srodnih vrsta (Maitland, 1995).

Na Konferenciji o biološkoj raznolikosti (Rio de Janeiro, 1992)

zaključeno je da su genetski različite populacije primarne jedinice za

očuvanje, bez obzira na njihov taksonomski status. Stoga se uspješno

očuvanje temelji na genetskim razlikama među jedinicama, bez obzira da li se

radi o vrsti, podvrsti ili o lokalnoj populaciji (Moritz, 1994).

Hibridizacija je međusobno križanje individua iz genetički dalekih

populacija (Rhymer i Simberloff, 1993). Hibridne zone su obično uski prostori

gdje se susreću i mrijeste genetički različite populacije. Za visok postotak

hibridizacije između bliskih ribljih vrsta zaslužno je nekoliko faktora:

• gubitak ili smanjenje prirodnih staništa neke vrste

• povećanje staništa od strane neke vrste

• akvakultura

• introdukcija

• vanjska oplodnja

38

• slab mehanizam izolacije

• nejednaka prisutnost obaju roditelja

• kompeticija za mali mrjestilišni prostor (Campton, 1987).

Hibridizacija je česta pojava u riba. Uočeno je da se hibridizacija u riba

pojavljuje mnogo češće nego u ostalih skupina kralježnjaka, a razlog tome

pripisuje se vrlo čestoj vanjskoj oplodnji. U ribljim populacijama uočeno je

križanje unutar rodova (Avise i Saunders, 1984), kao i između različitih rodova

(Verspoor, 1988). Formiranje hibridnih populacija između prirodnih i unesenih

vrsta je vrlo česta pojava među salmonidima u SAD (Allendorf i Leary, 1988),

kao i u Europi (Jordan i Verspoor, 1993). Vrste koje se u velikom postotku

sastoje od hibrida karakterizira velik broj srodnih oblika sa sličnom ekologijom

i staništima.

Hibridizacija može biti prirodna ili uvjetovana ljudskim faktorom –

antropogena hibridizacija. Često je vrlo teško utvrditi na koji način je do

hibridizacija došlo u nekoj populaciji. Allendorf i suradnici (2001) mogućnost

nastanka hibridizacije razvrstavaju u šest tipova, od kojih se prva tri tipa

odnose na prirodnu hibridizaciju, a ostala tri na antropogenu hibridizaciju:

1. Prirodni tip hibrida Hibrid koji je nastao križanjem u davnoj prošlosti,

a danas je ugrožena vrsta kojoj je potrebna zaštita. Hibridizacija

između ribljih vrsta često je vezana uz prirodne promjene i geološke

događaje. Ledeno doba pleistocena jako je doprinjelo promjeni staništa

brojnih ribljih vrsta i utjecalo na karakteristike i stupanj povezanosti

vodenih područja (Bernachez i Wilson, 1998). Riblje populacije ranije

izolirane ledom, miješale su se prateći povlačenje leda, što je uvelike

omogućilo hibridizaciju.

2. Prirodna introgresija Dvije vrste žive na istom području, razlikuju se

fenotipski i ekološki, no njihova genetska udaljenost je mnogo bliža,

nego što je za očekivati za promatranu vrstu. Stoga dolazi do

povremene hibridizacije između tih dviju vrsta. Populacija nastala

nakon ovakve hibridizacije sadrži i alele od druge vrste, no daljnja

39

hibridizacija ne smanjuje frekvenciju tih alela. Takva introgresija je dio

evolucijskog procesa.

3. Prirodne hibridne zone Široka područja na kojima zajedno žive dvije

populacije, populacija hibrida i populacija njihovih davnih roditelja.

Prirodna selekcija uz stanišne razlike dovela je do održanja roditeljskih

i hibridnih populacija. Općenito, veličina i stabilnost hibridne zone ovisi

o stupnju protoka gena, različitostima između roditelja i hibrida u

genotipskom fitnessu, veličini različitosti genskih frekvencija između

roditeljskih populacija, stupnju populacijske strukture i stupnju

promijene okoliša.

4. Hibridizacija bez introgresije Obuhvaća hibridizaciju između

autohtone i alohtone vrste, no uz slabo preživljavanje hibrida prve

generacije. Osnovni problem u ovom slučaju je gubitak reprodukcijskog

materijala.

5. Uvelike prisutna introgresija Hibridizacija sa introgresijom je uvelike

prisutna tamo gdje se na istom području nalaze dvije vrste koje se

uspješno razmnožavaju. Često se u udaljenim i nepristupačnim

predjelima mogu naći čiste populacije takovih vrsta, pa se u smislu

zaštite i obnavljanja upravo na njih treba koncentrirati.

6. Potpuna hibridizacija populacije Prirodna populacija je jako mala,

ako uopće i postoji. Kad je hibridizacija jednom započela, teško ju je

zaustaviti, naročito kada su hibridi fertilni a razmnožavaju se i

međusobno i sa roditeljima. Nakon nekoliko generacija takvog procesa

dolazi do stvaranja populacije koja se sastoji samo od jedinki hibridnog

porijekla. Tada je potrebno je zaštiti hibride jer je to jedina moguća

opcija ako želimo izbjeći potpuni gubitak vrste.

Problem hibridizacije dugo je bio podcijenjen i slabo prepoznat, pa se

nije na vrijeme spriječilo unošenje novih vrsta u staništa i izmjena prirodnih

staništa, za što se ustanovilo da uvelike doprinosi ovoj pojavi (Allendorf i sur.,

2001). Važnost ljudskog faktora u hibridizaciji i gubitku ribljeg biodiverziteta

danas je jako poznat. Ljudske aktivnosti koje su dovele do promjena u

prirodnom staništu nekih vrsta, što je posljedično dovelo do hibridizacije su:

izgradnja brana i kanala, smanjenje vodenog stupca radi korištenja vode za

40

navodnjavanje poljoprivrednih površina, zagađenje, uklanjanje submerzne

vegetacije. Čovjek je svojim aktivnostima, prenošenjem jedne vrste u prirodno

stanište druge, doprinjeo da se ranije izolirane vrste susretnu i razmnožavaju,

uz to je i smanjenje mrjestilišnog prostora doprinjelo je pojavi hibridizacije.

Međutim, neki hibridi su namjerno stvoreni sa ciljem da se poveća

produktivnost akvakulturnih linija ili mogućnost ulova pri udičarenju (Pipas i

Bulow, 1998; Dowling i Secor, 1997).

Carvalho (1993) uviđa da izolacija pojedinih ribljih populacija radi

nemogućnosti migracija između riječnih sustava, često dovodi do veće

genetske raznolikosti i do prilagođenosti tih populacija za određeno stanište.

Do promjene genetskog sastava populacija dolazi unošenjem genetski

neprimjerenih linija u riječne sustave, kao i njihovim križanjem sa pripadnicima

autohtonih populacija. Unošenje različitih ribljih vrsta u otvorene vode

uglavnom ima za cilj povećanje veličine populacija radi sportskog ribolova.

Mnogo godina se prakticirao unos riba u nova im staništa bez ikakvih

razmišljanja o budućim posljedicama smanjenja biološke raznolikosti.

Unošenjem novih vrsta ili populacija, kod izdvojenih populacija dolazi do

izmjene gena koji su nastali tijekom evolucije kroz milijun godina. Nastavak

takovog procesa vodi ka nenadomjestivom gubitku genetskog identiteta

pojedinih populacija i prema umjetnoj tvorbi jedne "miješane" vrste bez

međupopulacijskih razlika (Avise, 1994). Posljedice toga su gubitak lokalne

genetske populacijske strukture i specifičnih genotipskih kombinacija sa

potencijalnom adaptivnom vrijednošću (Hansen i Loeschcke, 1994). Jedno od

mogućih rješenja za popravak stanja u tim vodama je unošenje autohtonih

jedinki, prethodno umjetno izmriještenih sa ciljem da se poveća broj

autohtonih jedinki. Uz to potrebno je spriječiti unos tuđih gena. Međutim

javljaju se i negativne posljedice pomoćnog unošenja, npr. razmnožavanje u

srodstvu sa čime se smanjuje ukupna genetska raznolikost (Berrebi i sur.,

1999).

Osnovna pravila u vezi očuvanja vrsta i populacija slatkovodnih riba, pri

čemu je najvažnije očuvanje prirodnih ekosistema i genetske strukture

populacija. postavili su Berrebi i sur. (1999). Genetska struktura populacija je

važna u početku procesa zaštite pa prvo određujemo genetski identitet

41

populacije a na osnovi njega određujemo prikladne jedinke za očuvanje. Pri

uzgoju riba s namjerom očuvanja određenih populacija, potrebno je prije

unošenja uzgojenih jedinki proučiti njihove morfološke, ekološke i genetske

osobine.

Meffe (1986) je ujedinio čitav proces koji dovodi do ugroženosti ribljih

populacija, te predlaže neka pravila za upravljanje ugroženim populacijama.

Uzroci koji smanjuju genetsku raznolikost su: mala veličina populacije, efekt

uskog grla, slučajan tok alela, razmnožavanje u srodstvu, umjetna selekcija i

dugotrajno miješanje sa ribogojilišnim linijama. Sva ta djelovanja uzrokuju

povećanje homozigotnosti, gubitak polimorfizma i povećano izražavanje

recesivnih alela, što utječe na smanjenu sposobnost preživljavanja. S

genetskog stajališta, jedino pravilno upravljanje ribljim populacijama mora se

temeljiti na praćenju genetske strukture prirodnih i uzgojenih populacija,

uporabi većeg broja roditeljskih jedinki pri uzgoju, selektivnom razmnožavanju

koje bi spriječilo razmnožavanje u srodstvu, što kraćem vremenu života

potomstva u zatočeništvu i odvojenom uzgoju različitih genetskih linija ili

populacija. Nakon stavljanja uzgojenih jedinki u prirodnu sredinu, potrebno ih

je pratiti genetskim analizama i preko statistike ribolova. Osim identifikacija

populacije, potreban je opis cjelokupnog biološkog kompleksa, koji je nužan

za očuvanje ugroženih jedinki, jer mnoge rijetke i ugrožene životinjske vrste

žive u manjim i izoliranim populacijama (Sušnik, 2001).

Genetika zaštite živih organizama (engl. conservation genetics) bavi se

genetskim istraživanjima rijetkih ili ugroženih vrsta. Proučavajući čimbenike

koji su utjecali na učestalost alela, pokušava se dokučiti evolucijski razvoj

populacije. Takva su saznanja važna za daljnja planiranja gospodarenja

određenom vrstom u svrhu njenog očuvanja, odnosno očuvanja odgovarajuće

genetske raznolikosti (Crivelli i sur., 2000). Genetika zaštite živih organizama

se također bavi istraživanjima u bliskom srodstvu, uspješnošću

razmnožavanja, te općenito istraživanjima genetske raznolikosti (Beaumont i

Bruford, 1999).

Očuvanje prirodnog staništa i genetskog polimorfizma vrlo je važno za

preživljavanje mnogih ugroženih vrsta, kao i onih vrsta čije je prirodno stanište

drastično smanjeno. Stoga je, naročito za ugrožene populacije potrebno

42

očuvati što veći stupanj heterozigotnosti u populaciji, jer je tada veći i postotak

preživljenja. Međutim vrlo često je slučaj upravo suprotan, da ugrožene

populacije imaju vrlo nizak stupanj heterozigotnosti, što je najčešće posljedica

efekta "uskog grla" (Carvalho, 1993).

Veliki problem hibridizacije u riba je to, što je potomstvo hibrida vrlo

često fertilno pa se i dalje normalno razmnožava generacijama. Stoga je vrlo

važno uočiti i prepoznati hibrida, ali i vrlo složeno. Do 1966. godine, u tu svrhu

su se koristile isključivo merističke i morfološke metode. Detekcija hibrida

uporabom morfoloških metoda polazi od pretpostavke da će hibrid fenotipski

izgledati negdje između obaju roditelja (Smith, 1992). Međutim, to često i nije

slučaj, jer hibridi ponekad pokazuju i čitav spektar roditeljskih fenotipova

(Campton, 1987), a ponekad uopće i ne sliče roditeljima. Morfološke značajke

ne omogućavaju otkrivanje da li hibrid pripada prvoj generaciji ili nekoj

daljnjoj.

Korištenje molekularnih markera uvelike olakšava identifikaciju i opis

hibridnih populacija. Korištenje molekularnih markera započelo je s

proteinskom elektroforezom (aloezimima) sredinom šezedestih godina, a

sredinom osamdesetih godina, u tu svrhu koristi se i mtDNA. Današnje

prednosti u molekularnoj tehnologiji, naročito nakon mogućnosti amplifikacije

pomoću lančane reakcije polimerazom, znatno je povećalo broj lokusa koji se

koriste u hibridizaciji. Osim toga, molekularne tehnike su vrlo pogodne za

male ugrožene populacije, jer za istraživanje nije potrebno žrtvovati ribu

(Taberlet, 1999). Perez i sur. (1999) vrlo su uspješno koristili restrikcijski

enzim SacI pri razlikovanju hibrida od čistih roditeljskih linija pastrva i lososa.

No, unatoč velikoj popularnosti molekularnih metoda, morfološke analize su i

dalje uobičajene, najčešće zajedno sa genetskim markerima (Pipas i Bulow,

1998).

Procjena podudarnosti između različitih genetskih markera koji se

koriste u filogeografskim istraživanjima, danas je postala važnim pitanjem

(Avise, 2000), pa se velik broj istraživanja bavi odnosima između populacija.

Oni koriste nekoliko različitih genetskih markera na različitim regijama DNA

molekule (Lu i sur., 2001). Podudarnost različitih molekularnih tehnika

omogućuje točan uvid u evolucijsku povijest vrste, ali je značajno i njihovo

43

nepodudaranje, jer omogućuje bolje razumijevanje evolucijskog procesa i udio

selekcije i hibridizacije (Rieseberg, 1998).

Razpet i suradnici (2003) proučavali su hibride između potočne (Salmo

trutta) i mekousne (Salmo obtusirostis) pastrve u rijeci Neretvi. Između te dvije

vrste u rijeci Neretvi postoje hibridi, a morfološki se razlikuju od roditelja. Koje

lokalni stanovnici ih nazivaju "kosor". Pomoću tehnika mikrosatelita i

sekvencioniranja II introna gena laktat dehidrogenaze i C introna gena

hormona rasta na mtDNA, razdvojili su grupe - potočne pastrve, mekousne

pastrve, njihove hibride. Znatna varijabilnost hibrida navodila je na to da su

hibridi fertilni.

Nekoliko čimbenika treba uzeti u obzir kada se promatra potencijal

hibridne populacije. Jedan od njih je broj preostalih čistih populacija. Što je

manji broj preostalih čistih populacija, potrebna je veća zaštita preostalih

hibridnih populacija.

Mogućnost obnavljanja prvotne populacije bez hibrida najbolje je

moguće onda kad se populacija sastoji od roditelja i hibrida prve generacije.

Tada se uz korištenje većeg broja dijagnostičkih lokusa, odvoje čiste jedinke

od hibrida. Obnavljanje populacije moguće je uz umjetni mrijest.

Primjer negativnog utjecaja unešenih potočnih pastrva, uzgojenih u

ribogojilištu, na prirodnu populaciju glavatice (Salmo trutta marmoratus,

Cuvier 1817) vidljiv je u rijeci Soči u Sloveniji (Snoj, 1997). Uzgojene pastrve

imale su vrlo slab "homing" efekt koji je uzrokovao genetski tok između

reproduktivno izoliranim prirodnim populacijama glavatice i potočne pastrve,

koje su zauzimale različite dijelove riječnog sustava. Situacija je bila znatno

otežana činjenicom da su križanci potočne pastrve i glavatice bili plodni.

Kako bi se očuvala čista glavatica u Sloveniji je razrađen plan za

njezinu zaštitu (Povž i sur., 1996):

• Gospodarenje glavaticom uključuje prekid naseljavanja potočne

pastrve i povećanje izlova križanaca i potočne pastrve iz rijeka

jadranskog sliva.

• Zaštita staništa glavatice, naročito vodotoka sa čistom glavaticom.

44

• Zaštita glavatice, koja bi uključivala očuvanje bioloških i genetskih

obilježja. Osnivanje rezervata sa glavaticom, koja bi se birala na prema

fenotipskim i prema raspoloživim genetskim markerima (Snoj i sur.,

1996; Snoj, 1997; Sušnik i sur., 1997; Berrebi i sur., 2000). Sa

namjerom smanjenja negativnih posljedica unosa uzgojenih glavatica u

njihova prirodna staništa, pastrve se neko vrijeme drže u ribogojilištu,

gdje se pokušavaju imitirati uvjeti što sličniji njihovom prirodnom

staništu. Potomci se prvo smještaju u uzgojne potoke, pri čemu se

svake godine dio matične populacije zamjenjuje sa dijelom potomaka iz

rezervata.

Posljednjih godina hibridizacija je naročito dobila na popularnosti kao

značajna sila u evoluciji (Harrison, 1993), naime vrlo često je moguće hibridnu

zonu promatrati kao jedan "prirodni laboratorij", gdje se mogu promatrati

djelovanja i interakcije evolucijskih sila (Barton i Hewitt, 1989). Hibridi imaju

sposobnost formiranja multi genetskog kompleksa koji u određenim

okolnostima može dovesti do hibridske specijacije. Ipak, mnogo češće

genetske promjene između hibridnih vrsta nisu recipročne, već direktne, gdje

se geni jedne vrste uklope u genom druge vrste, odnosno dolazi do

introgresivne hibridizacije (Mayr, 1963), pri čemu vrlo često hibridi pokazuju

manji fitness od roditelja.

Dugo se smatralo da populacije kod kojih je došlo do hibridizacije sa

genetski različitim pripadnicima drugih populacija, ne bi trebale biti zaštićene,

međutim danas postoje i suprotna mišljenja. Avise (1994) smatra da se

hibridizacija kod većine organizama spontano događa u prirodi, a to bi značilo

da bi vrlo mali broj vrsta trebao biti uvršten u programe zaštite. Stoga Hansen

i Loeschcke (1994) smatraju da se hibridne populacije ne bi trebale isključivati

iz programa zaštite.

Uska distribucija endemskih slatkovodnih riba Mediterana čini ih vrlo

osjetljivim na promjene okoliša. Osnovni razlog ugroženosti i nestanka

endemskih vrsta je uništavanje njihova prirodnoga staništa, a prate ga

organsko i industrijsko onečišćenje.

45

Za mekousnu pastrvu možemo reći da je jedna od najugroženijih

slatkovodnih riba. Područje koje naseljava je poprilično usko, pa njegovo

zagađenje ima drastične posljedice za ovu vrstu. Naglašenom smanjenju

njene brojnosti doprinose i drugi čimbenici:

1. Nekontrolirano unošenje alohtonih vrsta u njena prirodna staništa

(kalifornijska pastrva), kada dolazi do direktne kompeticije u

hranidbenoj niši i do genetičkog onečišćenja (mekousna pastrva se

uspješno križa s potočnom pastrvom na prostoru gdje dijele ista

staništa).

2. Izgradnja pregrada i retencija koje postepeno dovode do zagrijavanja

vode. Temperatura od 20oC je letalna za mekousnu pastrvu.

3. Prekomjerno oduzimanje vode dovodi do smanjenja protoka i brzine

vode, što posebno za ljetnih mjeseci uvjetuje zagrijavanje vode.

Smanjenje brzine vodenog toka ima za posljedicu manju količinu

otopljenog kisika, na što je mekousna pastrva naročito osjetljiva.

Smanjen protok dovodi do nestanka brzica i slapova gdje

jednogodišnje jedinke nalaze zaklon.

4. Organska i druga onečišćenja su posredno i neposredno uzrok

smanjenja populacije. Razgradnjom organske tvari dolazi do povećane

potrošnje kisika, a mekousna pastrva se pokazala vrlo osjetljivom na

smanjenje količine kisika u vodi (Bonacci i sur., 1998).

5. Ribolov, naročito prelov, uzrokuje smanjenje prirodnih populacija, a s

time i inerpopulacijski i intrapopulacijski polimorfizm.

Mogućnost očuvanja ove vrste bila bi ponajprije prestanak unosa

alohtonih kompeticijskih ribljih vrsta, njena potpuna zaštita u smislu izlova,

nemijenjanje i neuništavanje njenih staništa, te uzgoj nasadnog materijala u

ribogojilištima, čije bi se potomstvo unosilo u prirodna staništa mekousne

pastrve. Ponovno obnavljanje uništenih i promijenjenih staništa vrlo je složeno

i zahtijeva velika sredstva.

Zaštita i obnavljanje promijenjenih i uništenih staništa vrlo je važna za

dugoročno očuvanje ugroženih vrsta. Pri tome bi prednost trebale imati one

vode kod kojih utjecaj čovjeka nije prevelik i u kojima još obitava vrsta ili

populacija koju želimo zaštiti. Potreban je potpuni nadzor takovih voda, a sve

46

aktivnosti koje bi negativno djelovale na ugroženu populaciju, treba svesti na

minimum (Sušnik, 2001).

Filogeografija je znanost koja se bavi geografskim distribucijama

evolucijskih linija i geografskim procesima koji su utjecali na te distribucije sa

osvrtom na različitost između i unutar srodnih vrsta. Filogeografske studije su

uvelike doprinijele razumijevanju evolucijskog procesa u riba (Avise, 2000) i

pomoću njih je poboljšan opis geografskih distribucija, filogenetskih odnosa i

genetskih udaljenosti između evolucijskih linija (Berningham i Moritz, 1998).

Kod filogeografskih istraživanja kao marker najviše je korištena

varijabilnost mtDNA. Razlog tome je njezina brza evolucija i materinsko

prenošenje bez intermolekularne rekombinacije (Avise, 2000). Međutim, zbog

toga što mitohondrijalni genom predstavlja samo mali fragment od ukupnog

povijesnog događaja, studije u kojima je korištena samo mtDNA često su bile

upitne i podvrgavane kritikama (Palumbi i Baker, 1994). Razlog tome je što u

takvim studijama često može doći do pogrešne interpretacije filogenetskih

veza, naročito u slučajevima kad je uključena i hibridizacija sa introgresijom

(Riesberg, 1998).

47

1.1.4. Osnovne postavke populacijske genetike

Znanost koja se bavi promjenama nasljednog materijala unutar

populacije, zove se populacijska genetika. Ona je usko vezna za genotipske

promjene, a zadatak joj je objasniti rasprostranjenost genetskih varijacija, te

objašnjenje porijekla, tijeka i evolucijskog značenja takvih varijacija (Li i

Grauer, 1991).

Kvantitativno određivanje genetskih varijacija moguće je provesti

pomoću frekvencije (učestalosti) alela (p).

p = (2 (AA) + (Aa)) / 2n

Frekvencija (p) bilo kojeg alela (A) jednaka je dvostrukom broju

homozigotnih genotipova tog alela (AA), budući da svaki homozigot nosi iste

dvije kopije alela, uvećanom za broj heterozigotnih genotipova koji sadrže

ovaj alel (Aa), podijeljen sa brojem uzoraka (n), (Nicholas, 1996).

Iz alela nastaju različiti genotipovi, frekvencija genotipova predstavlja

njihovu učestalost. Mjera genetske varijabilnosti je udio heterozigota u nekoj

populaciji. Učestalost alela a označava se kao q, stoga je u populaciji sa dva

alela ukupna suma frekvencija jednaka p + q = 1, jer učestalost alela u

populaciji slijedi binomnu raspodjelu.

Osnovni teorem populacijske genetike je Hardy-Weinbergov zakon

ravnoteže. Početkom prošloga stoljeća (1908. godine), engleski matematičar

Godfrey Hardy i njemački liječnik Wilhelm Weinberg, neovisno jedan o

drugome, objavili su teorijski ogled kojim se mogu predvidjeti učestalosti

genotipova na određenom lokusu. Matematički opisi nastali iz ovih postavki

poznati su pod nazivom Hardy-Weinbergov zakon ravnoteže. Ovaj zakon

predstavlja uvjet pod kojim su učestalosti alela i genotipova u diploidnim

organizmima, iz generacije u generaciju, jednake produktu učestalosti

uočenih alela, a matematički je izražavamo sljedećim odnosom:

Σ pi2 AiAi + Σ 2pipi Ai Aj

i i<j

48

Da bi Hardy-Weinbergov zakon ravnoteže bio valjan slijedeći uvjeti

trebaju biti zadovoljeni: postojanje dovoljno velike populacije, nasumično

sparivanje unutar populacije, isključiti postojanje mutacije, selekcije i

migracije.

Najčešće korišteni test u populacijskoj genetici je χ2 test (Hi kvadrat

test). Njega dobivamo iz podataka o uočenoj (obs) i očekivanoj (exp)

učestalosti genotipova.

χ 2 = S (obs – exp)2 / exp

Hardy-Weinbergov zakon testira se χ 2 testom, nakon određivanja

udjela homozigota (Hom) i heterozigota (Het) prema formuli:

χ 2 = (Homobs – Homexp)2 / Homexp + (Hetobs – Hetexp)

2 / Hetexp

1.1.4.1. Promjene genetskog materijala

Uzrok genetičkim varijacijama su mutacije. Mogućnost nastavljanja

evolucije ovisna je o novonastalim mutacijama koje se uspiju održati u

populaciji, odnosno o tome da svi potomci u narednim generacijama naslijede

mutirani gen. Bez porasta učestalosti, mutacija će imati mali značaj za

evolucijsku povijest neke vrste. Da bi se povećala učestalost mutiranom alelu,

osim same mutacije, moraju se razmotriti i drugi mogući čimbenici, kao što je

prirodna selekcija, genetički "drift", rekombinacija i migracije.

Stabilnost i varijabilnost genetskog materijala tijekom reprodukcije

osiguravaju postojanost vrste, dugoročnu prilagodljivost populacija i biološku

evoluciju. Maksimalna genetička stabilnost prednost je u populacijama koje su

dobro prilagođene na uvijete okoline, no prilagodba na nove selektivne uvijete

zahtijeva određeni stupanj genetičke varijabilnosti u populaciji. Svaka

promjena redoslijeda nukleotida u DNA ili strukture ili broja kromosoma u

stanici naziva se mutacijom. Neke mutacija uzrokuju smrt stanice, dok se

druge ustaljuju i stabilno nasljeđuju iz generacije u generaciju. Takve mutacije

49

mogu ili ostati prikrivene ili uzrokovati vidljive promjene fenotipa, odnosno

organizma. S obzirom na obujam genoma zahvaćenog promjenom, mutacije

mogu biti genske, kromosomske i genomske.

Mutacije mogu uzrokovati različite promijene:

• supstitucije – zamjene jednog nukleotida drugim. Zamjene

nukelotida mogu se podijeliti na tranzicije i transverzije. Pod

tranzicijom se smatra zamjena pirimidinske baze drugom

pirimidinskom bazom ili jednog purina drugim purinom, dok se pod

transverzijom podrazumijeva zamjena pirimidinske baze purinskom

ili purinske pirimidinskom bazom;

• delecije – uklanjanje jednog ili više nukleotida iz molekule DNA;

• insercije - umetanje jednog ili više nukleotida;

• inverzije – rotacija dvolančanog dijela DNA, duljine dvaju ili više

parova baza za 180o.

Prirodna selekcija je proces kod kojeg genetičke varijacije stvaraju

razlike između organizama u njihovoj sposobnosti preživljavanja i uspješnosti

reprodukcije. Genetički drift (engl. random genetic drift) ima važnu ulogu u

evoluciji, no njegov je utjecaj znakovit tek na molekularnoj razini. Slučajni

genetički dirft predstavlja kolebljivost u učestalosti alela (iz generacije u

generaciju) uzrokovanu slučajnim događajima poput slučajnog uzorkovanja

gameta. Stoga i kada bi sve jedinke u populaciji imale jednaku biološku

sposobnost, mijenjanje učestalosti alela bi postojalo radi nasumičnog

združivanja gameta. Genetska struktura populacije mijenja se dolaskom

novog gena u populaciju. Taj proces zove se "tok gena" (engl. gene flow) (Li i

Grauer, 1991).

Prisutnost više alela na određenom lokusu u populaciji gdje se svaki

alel pojavljuje sa "znatnom" frekvencijom, zove se genetički polimorfizam.

"Znatna" je ona frekvencija koja je viša od one stvorene tijekom mutacijskog

procesa. Premda u prirodi svi geni mutiraju većina tih mutacija, vrlo često

nestane pa ih ne uspijemo registrirati. No, ako se promatra populacija u točno

određenom trenutku, ne mogu se otkriti svi aleli već samo oni koji se zadrže u

populaciji kroz dulji period i prisutni su sa "znatnim" frekvencijama. Brojčana

50

granica koja označava "znatnu" frekvenciju i kojom se dogovorno služe

genetičari, je 0,01. Ako se jedan alel javlja s učestalošću većom ili jednakom

0,01 tada predstavlja polimorfizam - u suprotnom ga ne smatramo

polimorfizmom (Ford-Llyoyd, 1996).

Glavni mehanizam za stvaranje polimorfizama kod mikrosatelita je

pogrešno sparivanje baza ispadom dijela sekvence. Ta se pojava događa

kada je normalno sparivanje baza dvaju komplementarnih lanaca DNA

ometeno razmicanjem ponavljajućeg niza na oba lanca, što dovodi do

pogrešnog nizanja ponavljajućih sekvenci. Ovaj se mehanizam naziva i

replikacijski ispad (engl. replication slippage) jer se zbiva tijekom replikacije

kada DNA postaje jednolančana, a svaki lanac služi kao kalup za

polimerizaciju novog komplementa.

51

2. MATERIJAL I METODE RADA

U istraživanje je uključeno 79 primjeraka pastrva: 55 mekousnih i 24

potočne pastrve iz 5 različitih populacija (Tablica 1). Na tri uzorka mekousne

pastrve izvršena su morfometrijska mjerenja. Morfometrijska mjerenja

izvršena su samo na uzorcima koji su uginuli, dva uzorka su nađena u donjem

toku rijeke, a jedan primjerak je uginuo prilikom uzorkovanja, budući da se

radi o osjetljivoj i ugroženoj vrsti.

Većina uzoraka prikupljena je iz rijeka na području Republike Hrvatske,

Jadra, Žrnovnice, Zrmanje i Krke, dok je samo 7 uzoraka mekousne pastrve

prikupljeno iz rijeke Neretve u Bosni i Hercegovini. U rijeci Jadro prikupili smo

19, u rijeci Žrnovnici 29 uzoraka mekousne pastrve. U rijeci Krki prikupljeno je

19 i u rijeci Zrmanji 5 uzoraka potočne pastrve. Sve populacije imaju

karakterističan fenotip, te ih je lako međusobno razlikovati.

Uzorkovanje je izvršeno u razdoblju između 2001. i 2003. godine.

Ribe su hvatane u gornjim tokovima rijeka električnim agregatom

"Sever". Nakon uzimanja uzoraka za molekularnu analizu i mjerenja, puštene

su natrag u vodu. Ribama smo odstranili dio podrepne peraje, oko 0,5 cm2, i

pohranili ih u 96% etanolu do daljnje analize.

52

Tablica 1: Pregled broja uzoraka s obzirom na vrstu, lokalitet i obavljene

analize; mtDNA/MS (analiza mitohondrijske i mikrosatelitske DNA), mtDNA

(analiza mitohondrijske DNA), MS (analiza mikrosatelitske DNA).

Vrsta Lokalitet Morfometrijska

mjerenja mtDNA/MS mtDNA MS Ukupno

Salmo trutta

Krka 13 19 13 45

Zrmanja 5 2 5 12

Salmothymus

obtusirostris

Jadro 3 19 19 19 60

Žrnovnica 19 29 19 67

Neretva 7 7 7 21

Ukupno 3 63 76 63

2. 1. MORFOMETRIJSKE ANALIZE

Prilikom istraživanja na rijeci Jadro, jedan primjerak mekousne pastrve je

uginuo, a dvije mekousne pastrve su nađene uginule u donjim tokovima

rijeke. Na tim uzorcima obavljene su sljedeće morfometrijske analize:

• to totalna dužina tijela. Udaljenost između vrha ustiju i linije koja

spaja krakove repne peraje.

• a1 standardna dužina tijela. Udaljenost između vrha ustiju i točke

od koje počinju žbice repne peraje.

• a dužina do vilice. Udaljenost između vrha ustiju i vrhova srednjih

žbica repne peraje.

• H najveća visina tijela

• â najmanja visina tijela

• u antenalno rastojanje

53

• m antedorzalno rastojanje

• r anteventralno rastojanje

• q udaljenost između prsnih i trbušnih peraja

• t udaljenost između trbušne i podrepne peraje

• p dužina prsne peraje

• s dužina trbušne peraje

• n dužina osnove leđne peraje

• o1 visina prednjeg dijela leđne peraje

• o2 visina zadnjeg dijela leđne peraje

• v dužina osnove podrepne peraje

• x visina podrepne peraje

• z udaljenost između podrepne i osnove repne peraje

• y udaljenost između masne i osnove repne peraje

• y1 dužina repnog stabla

• o0 dužina gornjeg dijela repne peraje

• o01 dužina donjeg dijela repne peraje

• a0 dužina srednjih žbica repne peraje

• b dužina glave. Udaljenost između vrha ustiju i prednje ivice oka.

• ch2 visina glave u zatiljku

• ch1 visina glave u očnom dijelu

• f dužina postokularnog dijela glave

• c uzdužni dijametar oka

• g širina međuočnog prostora

• h dužina gornje vilice. Udaljenost između vrha vilice i zadnje sdfas

adf a vilične točke.

• i širina gornje vilice

• k dužina donje vilice. Udaljenost između vrha donje vilice i zadnje

faasf vilične točke.

• sp.br. broj branhiospina na prvom škržnom luku

• 1.1. broj ljuski u bočnoj liniji

• 1.2. broj redova ljuski od bočne linije do leđne peraje

• 1.3. broj redova ljuski od bočne linije do trbušne peraje

54

• D broj žbica u leđnoj peraji

• V broj žbica u trbušnoj peraji

• P broj žbica u prsnoj peraji

• A broj žbica u podrepnoj peraji

• Vert. S. ukupan broj kralježaka

• Caud. V. broj kaudalnih kralježaka

• App. pyl. broj piloričkih nastavaka

Ukupan broj kralježaka određen je na osnovi rengen fotografije (Slika 14).

Slika 14: Rengen fotografija kostura mekousne pastrve iz rijeke Jadro

55

Statistička obrada morfometrijskih metoda

Za obračunavanje dobivenih morfometrijskih vrijednosti upotrebljena je

varijaciono-statistička metoda sa sljedećim elementima: srednja vrijednost i

standardna devijacija.

Da bi se usporedili s rezultatima od Janković (1961), Behnke (1968) i

Marić (2002), dobiveni podaci su stavljeni u odnos s dužinom vilice i totalnom

dužinom, a mjere na glavi s dužinom glave.

2.2. PREGLED PROBAVILA

Kod tri primjerka mekousne pastrve iz rijeke Jadro, uz morfometrijske

metode, obavili smo i pregled probavila. Pregledom krugova priraštaja (anula)

na ljuskama utvrdili smo starost primjeraka, koja je iznosila od 1 do 3 godine

(Treer i sur., 2003b).

Analiza ishrane izvršena je prema želučanom i crijevnom sadržaju.

Sadržaj probavila izdvojili smo u epruvetu s alkoholom i promatrali

stereomikroskopom.

56

2.3. MOLEKULARNO-GENETSKE ANALIZE

2.3.1. Izolacija DNA

DNA molekulu izolirali smo iz tkiva podrepne peraje na tri različita

načina. Prvi korak u svim postupcima je bio, da smo od pohranjenog dijela

podrepne peraje odrezali manji dio tkiva i oprali ga od alkohola destiliranom

vodom.

Prvi postupak koji smo primjenjivali je tzv. “brza izolacija DNA”

(Bowling i sur., 2000). Radili smo je tako da smo uzorku dodali 50 µl 0,2 M

NaOH, zagrijavali ga na 97ºC 15 minuta, a otopinu zatim smo neutralizirali

dodatkom 50 µl 0,2 M NaCl uz snažno miješanje. Da bi stabilizirali DNA

molekulu, otopini smo dodali 50 µl 1 M Tris-HCl pufera, pH 8,5.

Druga metoda izolacije koju smo koristili je metoda izolacije iz tkiva

pomoću kitova za izolaciju Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega).

Izolaciju smo vršili prema uputama proizvođača.

Treća metoda izolacije DNA molekule koju smo koristili, bila je prema

protokolu White i Densmore (1992). Mali dio tkiva stavili smo preko noći u 200

µl Lysis pufera (1M Tris-HCl, 2M MgCl2, 1M KCl, pH 8,3) i 4 µl Proteinaze K

na 370C. Nakon inkubacije dodali smo jednak volumen fenol/koloroforma u

digestoru, nakon čega je uzorak centrifugiran (14 500 x g/12 min). Gornju

frakciju, u kojoj se nalazi otopljena DNA, smo otpipetirali, pri čemu smo pazili

da ne uzmemo dio bijelog taloga u kojem su se nalazili proteini. U

odpipetiranu frakciju dodali smo jednak volumen koloroforma i ponovili

postupak. Uslijedila je precipitacija sa 2,5 volumena 96% etanola ohlađenog

na -200C, te smo uzorke ostavili pola sata na -200C. Nakon precipitacije

uzorke smo centrifugirali (10 000 x g 10 min), odstranjen je etanol i

precipitacija ponovljena sa 500 µl 70% etanola. Nakon centrifugiranja (10 000

x g 7 min) odstranili smo etanol, a sadržaj posušili do voskaste konzistencije

(do ishlapljenja etanola). Posušenim uzorcima dodali smo 30 µl Milli Q vode,

pri čemu smo otopili DNA. Uzorke smo do analize pohranili na 40C.

57

2.3.2. Provjera uspješnosti izolacije DNA

Uspješnost izolacije DNA provjerili smo na 1% agaroznom gelu u 0,5 x

TBE puferskom sustavu. Na gel smo nanijeli 1,5 µl otopljene DNA. Uzorke

smo vizualizirali pomoću Macrouve UV transilluminatora.

Slika 15: Izolirana DNA iz uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro

2.3.3. Analiza mikrosatelitske DNA

2.3.3.1. Izbor mikrosatelita i začetnih nukleotida

Za populacijsku studiju mekousne pastrve odabrali smo osam

mikrosatelita iz genetske knjižnice salmonidnih vrsta BFRO 001 (Snoj i sur.,

1997; U90327), BFRO 002 (Susnik i sur., 1997; AF005074), Ssa 197 (O’Reilly

i sur., 1996; U43694), SsoSL438 (Slettan, 1995; Z49134), Strutta-24 i Strutta-

58 (Poteaux i sur., 1999; U60225 i U60223), Str591INRA (Presa i Guyomard,

1996; AB001064) i OmyFgt1TUF (Sakamoto i sur., 1994). Naknadno je

odabran i mikrosatelitski lokus nađen u četvrtom intronu LDH-C1* gena

StMS-LDH4, to je lokus koji se pokazao specifičnim za mekousnu pastrvu iz

rijeke Neretve. Začetni nukleotidi korišteni za njegovu amplifikaciju su LDH1-

MSf (5’-TCA TCA AAC ACT CCC CCA ACT GC-3’) i LDH1R (McMeel i sur.,

2001).

58

Tablica 2: Pregled upotrebljenih mikrosatelitskih lokusa. Ime lokusa,

ponavljajuća mu jedinica, broj alela, njihova dužina i nukleotidni slijed

začetnog nukleotida.

Ime lokusa Ponavljajući

motiv

Broj

alela

Veličina

alela

(bp)

Nukleotidni slijed začetnog nukleotida

BFRO 001(1)

(TG)13(AG)4(TG)2-

CATGTGCGAC-

(TG)12

22 200-256 5’ ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3’

5’ CTTACAGCCACCTTTATGCG 3’

BFRO 002(2) (TG)14 3 116-124 5’ ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3’

5’GGAGATAAGAGTCAACGAGGC 3’

Ssa 197(3) (GTGA)+(GT) 18 107-177 5’ GGGTTGAGTAGGGAGGCTTA 3’

5’ TGGCAGGGATTTGACATAAC 3’

Strutta 58(4) GT 38 102-190

5’ AACAATGACTTTCTCTGAC 3’

5’ AAGGACTTGAAGGACGAC 3’

Str 591 INRA(5) CT 22 146-198

5’ CTGGTGGCAGGATTTGA 3’

5’ CACTGTCTTTCGTTCTT 3’

Strutta 24(6) GT 20 171-237

5’ ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3’

5’GGAGATAAGAGTCAACGAGGC 3’

OmyFgt1TUF(7) GT 27 187-263

5'-AGATTTACCCAGCCAGGTAG-3'

5'-CATAGTCTGAACAGGGACAG-3'

SsoSL438(8) GT 7 103-115

5’ GACAACACACAACCAAGGCAC 3’

5’ TTATGCTAGGTCTTTATGCATTGT 3’

(1) Snoj i sur., 1997

(2) Sušnik i sur., 1997

(3) O’Reilly i sur., 1996

(4) Poteaux, 1995

(5) Presa i Guyomard, 1996

(6) Poteaux i sur., 1999

(7) Sakamoto i sur., 1994

(8) Slettan, 1995

59

Fluorescentno označene začetne nukleotide upotrijebili smo za

određivanje dužine mikrosatelitskih lokusa na aparatu ABI PRISMTM 310

(Parkin Elmer). S različitim bojama smo označili po jedan od para začetnih

nukleotida. Istraživanje smo vršili u dvije skupine u prvoj je kao standard

korišten Rox, a začetni nukleotidi su nosili sljedeće boje: BFRO 001 Fam, Str

591 INRA i SsoSL438 Joe, a OmyFgt1TUF i Strutta 58 Tamru. U drugoj

skupini standard je bio Tamra, a začetni nukleotidi su nosili sljedeće boje: Str

24 i LDH Fam, Ssa 197 Tet, a BFRO 002 Hex.

2.3.3.2. Lančana reakcija polimerazom (PCR)

Lančanom reakcijom polimeraze umnožili smo odsječke na molekuli

DNA. Reakcija se odvijala u tri stupnja na različitim temperaturama. U prvom

stupnju pri visokoj temperaturi došlo je do denaturacije dvolančane molekule

DNA. Pri snižavanju temperature začetni nukleotidi su prilegli uz

komplementarna mjesta na molekuli, a uz prisustvo enzima polimeraze došlo

je do sinteze komplementarnog lanca DNA.

U lančanoj reakciji polimeraze za svaki mikrosatelitski lokus pripremili

smo reakcijsku smjesu od 10 µl, sljedećeg sastava:

50 ng genomske DNA

0,5 µM svakog začetnog nukleotida od para

0,2 mM dNTP-a (smjesa četiri nukleotida)

1,5 mM MgCl2

20 mM Tris-HCl

50 mM KCl

0,5 U/µl Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)

Reakcija je provedena u termostatu PTC-100TM Programmable

Thermal Contoller (MJ Research, Inc.). Nakon 3 minute početne denaturacije

pri 95ºC slijedilo je 30 ciklusa jednog od dvaju temperaturnih profila:

60

Za lokuse BFRO 001, Strutta 58, Str 591 INRA, SsoSL438,

OmyFgt1TUF, Strutta 58, Str 24, LDH i Ssa 197

denaturacija 940C, 30 sekunda

prilijeganje 520C, 15 sekunda

Za lokus BFRO 002:

denaturacija 940C, 45 sekunda

prilijeganje 600C, 25 sekunda

Sinteza DNA lanca događala se pri 720C, a reakciju smo završili

hlađenjem na 140C.

2.3.3.3. Elektroforeza na agaroznom gelu

Za određivanje dužine PCR produkata, te za njihovu naknadnu

izolaciju, koristili smo elektroforezu na agaroznom gelu. Koristili smo gelove

različite veličine u različitim elektroforetskim jedinicama (Biorad, LKB-

Pharmacia). Dužina fragmenata, dobivenih nakon PCR reakcije, određena je

uz pomoć DNA markera znanih veličina, od 100 do 10 000 bp (100 bp DNA

ladder i 1 kb DNA ladder, Gibco BRL). Kao pufer korišten je 0,5xTBE (50 mM

Tris, 50 mM borna kiselina, 1 mM EDTA, pH 8,2).

Agarozni gel napravili smo zagrijavanjem određene količine agaroze

(SeaKem LE, Biozym) u 0,5xTBE puferu. Koncentracija agaroznog gela

ovisila je o dužini dobivenih fragmenata. Duži fragmenti se teže kreću kroz

agarozni gel, te su zahtijevali gelove niže koncentracije. Nakon što se smjesa

za gel ohladila na oko 500C dodali smo etidijev bromid u koncentraciji od 0,5

µg/ml, te ga ulili u kalup za gel.

Da bismo pratili kretanje uzoraka u gelu, uzorcima smo prije nanošenja

u gel dodali pufer u odnosu 10:1. Pufer se sastojao od bromfenol modrila

(0,25%), ksilen cianola (0,25%) i 30% glicerola.

61

Elektroforeza se odvijala pri sobnoj temperaturi oko pola sata pri

početnom naponu od 9 V/cm, koji smo kasnije pojačali na 12 V/cm.

Fragmente smo promatrali pod transiluminantnim svjetlom valne dužine 302

nm.

Slika 16: Fragmenti mikrosatelita OmyFgt1TUF na 1,5% agaroznom gelu.

2.3.3.4. Analiza mikrosatelitskih lokusa na ABI PRISMTM 310

Mikrosatelitske lokuse analizirali smo na automatskom sekvenceru ABI

PRISMTM 310 (Perkin Elmer), koji omogućuje automatsko određivanje

nukleotidnih jedinica kao i određivanje dužine i količine fragmenata DNA

molekule.

Uzorke smo pripremili umnožavanjem na PCR-u, gdje smo po jedan

začetni nukelotid od para označili sa fluorescentnom bojom (Fam, Hex,

Tamra, Joe ili Tet). Na jedan µl PCR produkta dodali smo 12 µl deioniziranog

formamida i 0,7 µl standarde veličine, Tamra 350 ili Rox 350. Podizanjem

temperature na 950C došlo je do denaturacije, nakon čega smo uzorke

ohladili na ledu. Denaturirane uzorke smo stavili na ABI PRISMTM 310. Do

elektroforetskog razdvajanja fragmenata došlo je u 47 cm dugoj kapilari sa

gelom POP-4 (Performance Optimized Polymers). Razdvajanje fragmenata

teklo je po principu kapilarne elektroforeze. Laser u aparatu uzbudio je emisiju

fluorescentnih boja, a detektor ih je očitao. Dobiveni podaci su obrađeni na

kompjutoru programom GeneScan 2.1.

62

2.3.3.5. Statistička analiza mikrosatelitskih podataka

Kompjutorski programi GENETIX (Belkhir i sur. 1998) i Fstat (Goudet,

1995) korišteni su pri statističkoj analizi mikosatelitskih podataka. Statističkim

metodama obrađeni su odnosi između jedinki, odnosi jedinki unutar populacija

i odnosi između različitih populacija.

• Za ispitivanje odnosa između pojedinih jedinki služili smo se analizom

glavnih koordinata (engl. correspondence analyses). Jedinke smo prvo

svrstali s obzirom na prisutnost različitih alela. S vrijednošću 0

označena je ona jedinka koja nije imala promatrani alel; s vrijednošću 1

ona jedinka koja je imala prisutan promatrani alel u heterozigotnom

obliku, dok je sa 2 označena ona jedinka kod koje je promatrani alel bio

prisutan u homozigotnom obliku. Daljnjim izračunavanjem veza između

alela pomoću analize glanih kooridanta dobili smo podatke u

višedimenzionalnoj strukturi.

• Za proučavanje jedinki unutar populacije koristili smo dva parametra:

stupanj polimorfizma i ravnotežu genotipova unutar populacije.

Genetski polimorfizam kod svake populacije odredili smo s obzirom na

broj alela na lokusu, stvarnu i očekivanu heterozigotnost.

o stupanj polimorfizma unutar populacije

Izračunali smo frekvencije alela i udio heterozigotnosti.

Očekivanu heterozigotnost smo izračunali iz broja pojedinačnih

alela u populaciji s obzirom na Hardy-Weinbergov zakon

ravnoteže (Nei, 1972). Stvarnu heterozigotnost smo izračunali iz

stvarnog udjela heterozigota u populaciji.

o ravnoteža unutar populacije

Pri ocjeni ravnoteže unutar populacije služili smo se F-

statistikom koja ocjenjuje odstupanje od Hardy-Weinbergovog

zakona ravnoteže (Wright, 1951). Panmiksiju smo mjerili s

63

parametrom FIS (Weir i Cockerham, 1984). Negativna FIS

vrijednost ukazuje na to da je u populaciji stvarna

heterozigotnost manja od očekivane.

• Odnosi između populacija

Razlike između populacija izračunali smo pomoću parametra θ (Wei i

Coockerham, 1984). Parametar θ je ocjena za FST. Prilagođen malim i

nejednako velikim populacijama ili manjem broju populacija.

2.3.4. Analiza LDH gena

2.3.4.1. Sekvencioniranje LDH gena

Začetni nukelotidi Ldhxon3F i Ldhxon4R (McMeel i sur., 2001) su

korišteni za amplifikaciju 440 bp dugog fragmenta gena laktat dehidrogenaze.

Gen laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* sastoji se od egzona 3, dugog 43 bp,

egzona 4, dugog 3,77 bp i introna 3, varijabilne dužine.

Amplifikacija je provedena na termostatu PTC-100TM Programmable

Thermal Contoller (MJ Research, Inc.). Ukupan volumen reakcijske smjese od

20 µl sadržavao je:

100 ng genomske DNA

1 µM svakog začetnog nukleotida od para

0,2 mM dNTP-a (smjesa četiri nukleotida)

1,5 mM MgCl2

20 mM Tris-HCl

50 mM KCl

1 U/µl Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)

64

Uzorci su amplificirani po sljedećem vremensko-temperaturnom okviru:

početnu denaturaciju od 950C, koja je trajala 3 minute, slijedilo je 30 ciklusa

od denaturacije (940C, 30 sekunda), prilijeganja začetnih nukleotida (620C, 30

sekunda) i produženja DNA lanca (720C, 1 minutu).

Amplificirani DNA fragmenti promatrani su na 1,5 % agaroznom gelu, iz

kojeg su izolirani sa QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN), prema uputama

proizvođača.

Reakcije za sekvencioniranje su pripremljene sa BigDye Terminator

Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems), prema uputama proizvođača.

Za sekvencioniranje gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* korišten je začetni

nukleotid Ldhxon3R (McMeel i sur., 2001). Lančana reakcija polimeraze

provedena je na termostatu PTC-100TM Programmable Thermal Contoller (MJ

Research, Inc.) po sljedećem vremensko-temperaturnom okviru: 30

ponavljajućih ciklusa sastojalo se od denaturacije na 960C koja je trajala 10

sekundi, prilijeganja začetnih nukleotida na 500C od 5 sekunda i produžavanje

lanca na 600C od 4 minute.

Nakon sekvencijske reakcije, neupotrebljene fluorescentno označene

dideoksinukleotide i začetne nukleotide, odstranili smo precipitacijom s

natrijevim acetatom. Ukupnom volumenu sekvencijske reakcije dodali smo 2

µl 3 M natrijevog acetata i 50 µl 96 % etanola. Slijedila je inkubacija na ledu,

te centrifugiranje od 20.000 x g 25 minuta. Sediment koji je sadržavao

percipitirane fragmente sekvencijske reakcije oprali smo u 70 % etanolu, te

zatim centrifugirali 5 minuta. Talog smo osušili u vakumskoj centrifugi, te smo

ga zatim razrijedili sa 12 µl TRS (Template Suppression reagent, PE Applied

Biosystem). Uzorke smo denaturirali 2 minute na 950C i ohladili ih na ledu.

Uzorci su sekvencionirani na ABI Prism 310 automatskom sekvenceru. Za

analizu sekvencioniranja upotrebljen je programski paket DNA Sequencing

Analysis Software 3.0.

65

2.3.4.2. Analiza odsječaka LDH, DNA molekule sa tehnikom RFLP

(Restriction Fragment Lenght Polymophism)

Sekvencioniranjem smo pronašli dijagnostičnu mutaciju na intronu 3

koja je specifična za mekousnu pastrvu, i koju je bilo moguće otkriti s

restrikcijskim enzimom Rsal. Sve uzorke testirali smo sa RFLP analizom i na

taj način razlikovali uzorke koji su imali sekvencu značajnu za mekousnu

pastrvu.

Na umnoženom dijelu nuklearne DNA, LDH dijelu, provjerili smo

polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaje restrikcijski enzim Rsa I.

Restrikcijska endonukleaza Rsa I cijepa produkte na prepoznatljivoj sekvenci

gt/ac.

Restrikcijska smjesa od 15 µl sastojala se od:

300 ng PCR produkta

2 µl 10 X restrikcijskog pufera

10 U restrikcijskog enzima

Reakcijske smjese stavili smo na inkubaciju od 2 sata pri 370C.

66

2.3.5. Analiza mitohondrijske DNA

2.3.5.1. Umnožavanje odsjeka mtDNA s lančanom reakcijom polimeraze

(PCR)

Pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR-a) umnožili smo dio

mitohondrijalne DNA molekule dužine 1200 bp, kontrolnu ili D-loop regiju i

područje citokorma b.

Pri amplifikaciji kontrolne regije mtDNA koristili smo začetne nukleotide:

28r 5’-CACCTTAACTCCCAAAGCTAAG-3’, (Snoj i sur., 2002a)

HN20 5’-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3’, (Bernachez i Danzmann,

1993)

Pri amplifikaciji citokroma b koristili smo začetne nukleotide:

C-Glu 5’-TGACTTGAAAAACCACCGTTGTTA-3’, (Cronin i sur., 1993)

28r 5’-CACCTTAACTCCCAAAGCTAAG-3’, (Snoj i sur., 2002a)

Slika 17: Raspored gena i restrikcijskih mjesta na mitohondrijskoj DNA

molekuli, dužine 166 666 bp, vrste Salmo salar (Hurst i sur., 1999).

67

Reakcijska smjesa od 20 µl sadržavala je :

100 ng genomske DNA

1 µM svakog začetnog nukleotida od para

0,2 mM dNTP-a (smjesa četiri nukleotida)

1,5 mM MgCl2

20 mM Tris-HCl

50 mM KCl

1 U/µl Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)

PCR reakcija je rađena na MJ Research PTC-100 termostatu po

sljedećem vremensko-temperaturnom okviru: početnoj 3 minutnoj denaturaciji

na 940C slijedilo je 30 ciklusa sastavljenih od: denaturacije od 45 sekundi na

940C, prilijeganja začetnih nukleotida od 30 sekundi na 530C i produženja

lanca u vremenu od 1 minute na 720C.

Umnoženi dio DNA molekule promatrali smo na 1,5% agaroznom gelu.

Fragmente iz gela očistili smo koristeći komplet QIAEX II Gel Extaction Kit

(QIAGEN), prema uputama proizvođača.

2.3.5.2. Analiza odsječaka mtDNA molekule sa tehnikom RFLP (Restriction

Fragment Lenght Polymophism)

Na umnoženom dijelu mtDNA, kontrolnoj regiji, provjerili smo

polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaju restrikcijski enzimi.

Upotrijebili smo restrikcijske enzime Alu I i Eco 130 I. Restrikcijska

endonukleaza Alu I cijepa produkte na prepoznatljivoj sekvenci ag/ct, a Eco

130 I na sekvenci c/cttgg. Restrikcijske smjese od 15 µl sadržavale su :

300 ng PCR produkta

2 µl 10 X restrikcijskog pufera

10 U restrikcijskog enzima

Reakcijske smjese stavili smo na inkubaciju od 3 sata pri 370C.

68

2.3.5.3. Sekvencioniranje dijela gena za citokrom b i dijela kontrolne regije

mtDNA molekule

Sekvencioniranje je izvršeno na dva odsječka mtDNA, koja su

prethodno umnožena lančanom reakcijom polimeraze: na 5- kraju gena za

citokrom b i na 5- kraju kontrolne regije.

Za sekvencioniranje smo upotrijebili komplet ABI PRISM dRhodamine

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystem).

Sekvencijska reakcija imala je volumen od 15 µl, a sastav je imala prema

uputama proizvođača. Sekvencijska reakcija izvedena je na termostatu

GeneAmp PCR 2400 (PE Applied Biosystem), a imala je 35 ciklusa sa

sljedećim vremensko-temperaturnim profilom: 30 sekundi na 950C, 15

sekundi na 500C i 4 minute na 600C. Nakon sekvencijske reakcije,

neupotrebljene fluorescentno označene dideoksinukleotide i začetne

nukleotide, odstranili smo precipitacijom s natrijevim acetatom. Za analizu

sekvencioniranja upotrebljen je programski paket DNA Sequencing Analysis

Software 3.0.

2.3.5.4. Analiza produkata sekvencioniranja

Populacijska analiza obavljena je na osnovi frekvencijskog rasporeda

haplotipova pomoću kompjutorskih programa ClustalX (Thompson i sur.,

1994), Mega (Ver. 2.100), (Kumar i sur. 2001) i ARLEQUIN (Ver. 2.000),

(Schneider i sur., 2000).

69

3. REZULTATI

3.1. MORFOLOŠKA OBILJEŽJA MEKOUSNE PASTRVE (S. o.

salonitana)

Vrijednosti morfoloških osobina mekousne pastrve iz rijeke Jadro

prikazane su u tablici 3. Za obračunavanje dobivenih morfometrijskih

vrijednosti upotrebljena je varijaciono-statistička metoda sa sljedećim

elementima: srednja vrijednost i standardna devijacija. Morfološka obilježja

prikazali smo kao proporciju s dužinom vilice i dužinom glave (Janković,

1961).

Tablica 3. Morfometrijska i meristička obilježja mekousne pastrve

(Salmothymus obtusirostis salonitana) iz rijeke Jadro.

Oznake

proporcija

obilježja

x±sd

a1/a 91,29±0,93

u/a 69,44±0,7

m/a 42,41±0,43

r/a 48,23±0,47

q/a 27,48±0,29

t/a 25,19±0,34

p/a 15,25±0,13

s/a 12,64±0,12

n/a 12,04±0,12

o1/a 14,95±0,13

o2/a 6,87±0,07

v/a 12,5±0,17

x/a 12,64±0,18

70

z/a 19,64±0,24

y/a 10,99±0,12

y1/a 32,98±0,37

H/a 22.58±0,33

â/a 8,84±0,08

o0/a 16,76±0,16

o01/a 17,4±0,17

a0/a 8,24±0,09

b/a 21,53±0,19

f/a 11,26±0,1

c/a 4,26±0,01

h/a 8,7±0,08

i/a 7,14±0,06

k/a 10,99±0,06

g/a 6,23±0,01

ch2/a 19,94±0,16

ch1/a 12,36±0,11

â/b 41,06±0,45

a0/b 38,93±0,46

f/b 52,34±0,54

c/b 14,98±0,09

h/b 17,02±0,43

i/b 33,19±0,31

k/b 33,93±0,33

g/b 26,8±0,06

ch2/b 78,72±0,11

ch1/b 57,44±0,59

sp. br. 23,66±0,57

ll 106,66±6,65

D 13±0

71

P 12,66±1,15

V 9±0

A 12±1

Vert. S. 57±0

Caud. V. 23±0

App. pyl. 70±7

Kod tri analizirana primjerka mekousne pastrve ustanovili smo da su

svi mužjaci. Dužina tijela analiziranih primjeraka kretala se od 9,9 do 30,6 cm,

a težina tijela od 4,4 do 290 g. Najveća varijabilnost bila je prisutna u broju

piloričkih nastavaka od 63 do 77.

U tablici 4 prikazane su morformetrijske osobina kod mekousne pastrve

solinke iz rijeke Jadro (S. o. salonitana) i mekousne pastrve iz rijeke Neretve

(S. o. oxyrhynchus). Vrijednosti su prikazane u postotcima u osnosu na

dužinu glave te dužinu tijela, gdje je promatrana dužina vilice kako bi se

podatci usporedili sa onima od Janković (1961).

Tablica 4: Morfometijske osobine kod dviju podvrsta mekousne pastrve

S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus.

S. o. salonitana S. o. oxyrhynchus

Dužina glave u dužini tijela 21-24% 18-24%

Dužina gornje vilice u dužini glave 8% 36-39%

Dužina gornje vilice u dužini tijela 5-11% 24-36%

Širina gornje vilice u dužini tijela 7-8% 2-4%

Širina gornje vilice u dužini glave 34-36% 11-20%

Dužina donje vilice u dužini tijela 7-11% 7-15%

Dužina donje vilice u dužini glave 36-45% 41-64%

Uzdužni dijametar oka u dužini tijela 4-8% 4-9%

Uzdužni dijametar oka u dužini glave 18-32% 21-46%

72

Postkaudalno rastojanje glave prema

dužini tijela 11-12% 8-16%

Postkaudalno rastojanje glave prema

dužini glave 50-52% 43-66%

Antedorzalno rastojanje glave prema

dužini tijela 40-42% 38-49%

Osnova leđene peraje prema dužini tijela 11-12% 9-14%

Osnova podrepne peraje prema dužini

tijela 5-14% 5-9%

Dužina prsne peraje prema dužini tijela 15-17% 15-20%

Dužina trbušne peraje prema dužini tijela 13% 12-15%

Najveća visina tijela prema dužini tijela 21-23% 18-24%

Najmanja visina tijela prema dužini tijela 9% 7-10%

Broj žbica u perajama D III-10 P I-12(14) V I-8

A II(I)-10(11)

D IV-12(10) P I-12 V II-8

A IV-9

Broj ljuski u bočnoj liniji 101-104 102-123

Broj branhiospina na prvom škržnom

luku 23-24 16-31

Broj kralježaka 57 53-70

Broj kaudalnih kralježaka 22-23 21-34

U tablici 5 prikazane su morfometijske osobine mekousne pastrve iz rijeke

Jadro (S. o. salonitana), potočne pastrve (Salmo trutta) (Marić, 2002) i

enemskog salmonida iz Turske Platysalmo platycephalus (Behnke, 1968).

Morfometijske osobine su promatrane kao proporcije sa dužinom glave i sa

totalnom dužinom tijela.

73

Tablica 5: Morfometijske osobine kod mekousne pastrve (S. o.

salonitana), potočne pastrve (Salmo trutta) i Platysalmo platycephalus.

S. o. salonitana Salmo trutta

Platysalmo

platycephalus

Udio standardne dužine

prema dužini tijela 86,91±0,09 89,46±0,95 83,83±0,93

Dužina gornje vilice u

totalnoj dužini tijela 8,28±0,08 11,15±0,15 11,11±0,11

Dužina gornje vilice prema

dužini glave 17,02±0,34 46,71±0,32

Dužina donje vilice prema

totalnoj dužini 7,98±0,05 11,58±0,16

Najveća visina tijela 21,5±0,23 20,93±0,23

Dužina prsne peraje prema

totalnoj dužni tijela 14,52±0,13 15,7±0,05

Dužina trbušne peraje prema

totalnoj dužni tijela 12,03±0,12 12,48±0,03

Dužina leđne peraje prema

totalnoj dužni tijela 11,46±0,12 11,29±0,19

Dužina osnove podrepne

peraje prema totalnoj dužni

tijela

11,9±0,17 8,72±0,13

Dužina glave prema totalnoj

dužini tijela 20,49±0,19 23,78±0,34

Broj branhiospina na prvom

škržnom luku 23,66±0,57 23,33±0,57

Broj ljuski u bočnoj liniji 106,66±6,65 109,66±0,57

Broj redova ljuski od bočne

linije do trbuše peraje 17,33±1,52 17,66±0,57

Broj redova ljuski od bočne

linije do leđne peraje 17±2,64 28,33±0,57

Broj kaudalnih kralježaka 57 58±1

Broj piloričkih nastavaka 57 15,66±0,5

74

3.2. ANALIZA PREHRANE MEKOUSNE PASTRVE (S. o.

salonitana)

Analizu prehrane izvršili smo na tri primjerka mekousne pastrve iz

rijeke Jadro od kojih su dva nađena uginula u donjem toku rijeke, a jedan je

uginuo prilikom uzorkovanja. Vizualno smo utvrdili da se radi o praznom

probavilu kod sva tri primjerka, no unatoč tome, sadržaj probavila je izdvojen

u epruvetu sa alkoholom, i promatran stereomikroskopom. Analizom

želučanog i crijevnog sadržaja ustanovili smo da sva tri primjerka imaju

potpuno prazno probavilo.

75

3.3. ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA

3.3.1. Analiza kontrolne regije mtDNA s tehnikom RFLP

(Restriction Fragment Lenght Polymophism)

Stupanj polimorfizma približno 1200 bp dugog dijela mitohondrijske

DNA koji obuhvaća kontrolnu regiju, proučili smo korištenjem tehnike RFLP.

Izabrane uzorke analizirali smo sa restrikcijskim enzimom Alu I koji je

omogućio nastajanje polimorfnih restrikcijskih fragmenata, te na taj način

prvotno razlikovanje populacija mekousne i potočne pastrve. Uzorkovanje

smo proveli na 7 uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Neretve, 7 uzoraka

mekousne pastrve iz rijeke Jadro, 6 uzoraka mekousne pastrve iz rijeke

Žrnovnice, 5 uzoraka potočne pastrve iz rijeke Krke i 5 uzoraka potočne

pastrve iz rijeke Zrmanje.

Restrikcijski enzim Alu I rezao je uzorke iz populacije mekousne

pastrve iz rijeke Neretve na tri mjesta, stvarajući pri tome četiri odsječka duga

464, 252, 129 i 37 bp, dok je populacije potočne pastrve iz rijeka Krke i

Zrmanje (Jadranska linija), te mekousne pastrve iz rijeka Jadro i Žrnovnice,

rezao na dva mjesta, stvarajući odsječke dužine 563, 464 i 37 bp (Slika 18).

Slika 18: Restrikcija kontrolne regije mtDNA sa restrikcijskim enzimom Alu I,

uzorak 1 - mekousna pastrva iz rijeke Jadro, 2 – mekousna pastrva iz rijeke

Žrnovnice, 3 – potočna pastrva iz rijeke Krke, 4 – potočna pastrva iz rijeke

Zrmanje, 5 – mekousna pastrva iz rijeke Neretve, 6 - 100 kb DNA ladder,

Gibco BRL.

76

3.3.2. Analiza sekvencioniranja mitohondrijalne DNA

3.3.2.1. Sekvencioniranje dijela kontrolne regije

Sekvencioniranje kontrolne regije smo napravili na 12 uzoraka

mekousne pastrve iz rijeke Žrnovnice (ZRN) i 3 iz Jadra (ZRN), na 1 uzorku

potočne pastrve iz rijeke Krke (Krka) i na 2 uzorka potočne pastrve iz rijeke

Zrmanje (ZRM1 i ZRM2AD4). Sekvencionirana kontrolna regija kod populacija

mekousne pastrve iz rijeka Jadra i Žrnovnice bila je jednaka. Na 540 bp

dugom odsječku pronašli smo 1 varijabilno mjesto na osnovu kojeg smo

populaciji mekousne pastrve iz Žrnovnice pripisali novi haplotip, koji smo

nazvali ZRN. Na osnovi polimorfnog mjesta u kontrolnoj regiji mtDNA pronašli

smo novi restrikcijski enzim pomoću kojeg možemo razlikovati populaciju

mekousne pastrve iz Žrnovnice i Jadra (S. o. salonitana) od ostalih populacija.

Analizirane uzorke usporedili smo s populacijama čije se sekvence

nalaze u Gen banci (Tablica 6). Kod potočne pastrve iz rijeke Zrmanje uočili

smo ranije prikazan haplotip Ad4, kojega smo prikazali kao ZRM2AD4.

Na osnovu polimorfizma uočenog pri sekvencioniranju odredili smo

restrikcijski enzim Eco 130 I s kojim specifično određujemo haplotip

mekousne pastrve "solinke". Uzorci mekousne pastrve iz rijeka Jadro i

Žrnovnice imali su jednak, novi haplotip. Uzorke smo izrezali s restrikcijskim

enzimom te smo još jednom potvrdili njihovu različitost od ostalih uzoraka.

Slika 19: Restrikcija kontrolne regije mtDNA restrikcijskim enzimom Eco 130 I.

Linije 1 su uzorci mekousne pastrve iz rijeke Jadro, linije 2 su uzorci

mekousne pastrve iz rijeke Žrnovnice, linije 3 su uzorci potočne pastrve iz

rijeke Krke, linije 4 su uzorci potočne pastrve iz rijeke Zrmanje, linije 5 su

uzorci mekousne pastrve iz rijeke Neretve i linije pod brojem 6 su fragmenti

DNA poznatih veličina (1 kb DNA ladder, Gibco BRL).

77

Tablica 6: Imena vrsta te pristupni brojevi u Gen banci za kontrolnu regiju

mtDNA i gen za citokrom b.

Vrsta/populacija Kontrolna regija mtDNA Gen za citokrom b

Broj u Gen banci

Acantholingua ohridana

(Bell) AF488536 AAF25872

Salmo salar U12143 X76253

Salmothymus

obtusirostris (soxy) AF488535 AF488534

Salmo trutta

Dunavska (Da1) AY260524S1 X7625

Dunavska (Da2) AY185570

Dunavska (Dal1) AY185569

Mediteranska (Me1) AF2347 STMTCTB1

Mediteranska (Me2) STU63890

Atlantska (At) AF498757 X76254

Jadranska (Ad1) AF498756 X76251

Jadranska (Ad3) AY260518S1 STMTCYB4

Jadranska (Ad4) AY260520

Salmo marmoratus (Ma) AF498755 X76251

78

Slika 20: Nukleotidna sekvenca 412 bp dugog segmenta kontrolne regije

mtDNA. Polimorfna mjesta su obojena crvenom bojom i označena brojem.

1 ZRMl TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC ZRM2AD4 TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC Krka TTTTTCAGCTATGTACAATAACAATTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC ŽRN TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC Soxy TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC ************************ *********************************** 2 3 ZRMl TATGTATAATATTACATACTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT ZRM2AD4 TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT Krka TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT ŽRN TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT Soxy TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATGGCATG-TGAGTAGT ****************** ************************** ************** 4 ZRMl ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA ZRM2AD4 ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA Krka ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA ŽRN ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACCCAA Soxy ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA ********************************************************.*** ZRMl GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT ZRM2AD4 GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT Krka GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT ŽRN GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT Soxy GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT ************************************************************ 5 6 7 8 ZRMl GTTATATCAATAAAACTCCACCCAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA ZRM2AD4 GTTATATCAATAAAACTCCACCCAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA Krka GTTATATCAATAAAACTCCACCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA ŽRN GTTATATCAATAAAACTCCATCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA Soxy GTTATATCAATAAACCTCGAGCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA ************** *** * * ************************************* 9 ZRMl TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT ZRM2AD4 TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT Krka TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT ŽRN TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT Soxy TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATTTATCAGTAGGCATACTCTTATT ************************************* ********************** 10 11 12 13 ZRMl GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG ZRM2AD4 GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG Krka GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG ŽRN GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG Soxy GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTA-GCTGCATCTAGTGAACTATTCCTGG ************************** * ****** ***************

79

Tablica 7: Polimorfna mjesta na 5' kraju kontrolne regije mtDNA, koja se odnose na

sekvencionirane uzorke. Brojevi označavaju mjesta u nukleotidnoj sekvenci koja se

odnose na Sliku 20, sa crvenom bojom su označene transverzije.

varijabilna mjesta

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

ZRM1 C C A T A C C C A G T C C

ZRM2AD4 T

Krka T T T

ZRN T C T T

Soxy T G C G G T T - C T A

Odnos između tranzicija i transverzija u kontrolnoj regiji kod haplotipova

mekousne pastrve iz Jadra, potočne pastrve iz Krke i Zrmanje je 4:2. Dok je taj

odnos kod mekousne pastrve iz Neretve 7:5. Srodni odnos između pojedinih

haploptipova određivali smo na osnovu usporedbi haplotipova prema Kimura

dvoparametarskog modela gdje je odnos tranzicija/transverzija jednak 2. Vrijednosti

udaljenosti haplotipova su se kretale od 1,6 do 2,5 (prosječno 0,016 % ± 0,0083).

Vrijednosti udaljenosti haplotipova, te broj polimorfnih mjesta između njih, prikazani

su u Tablici 8.

Tablica 8: Vrijednosti razlika između haplotipova u postotcima, te broj polimorfnih

mjesta između njih u kontrolnoj regiji mtDNA.

haplotip Da1 Da2 Dall soxy Bell At1 ZRM1 ZRM2AD4 Ad3 Ad1 Krka Ma1 ZRN Me1 S.salar

Da1 1 1 10 7 5 7 6 6 5 5 6 6 7 27

Da2 0,2 0 12 9 6 8 7 6 5 5 6 7 8 28

Dall 0,2 0,5 10 6 6 8 7 6 5 5 6 7 8 26

soxy 2,7 3,0 3,0 10 9 12 13 10 9 10 10 11 10 30

Bell 1,7 2,0 1,5 1,7 6 9 6 5 4 3 5 6 7 28

At1 1,2 1,5 1,5 1,7 1,5 7 6 5 3 3 5 6 7 27

ZRM1 1,7 2,0 2,0 2,5 1,7 1,7 1 4 3 4 4 6 6 29

ZRM2AD4 1,5 1,7 1,7 2,2 1,5 1,5 0,2 3 2 3 3 4 5 29

Ad3 1,5 1,7 1,7 2,2 1,5 1,5 0,7 0,5 1 2 2 3 3 28

Ad1 1,2 1,5 1,5 2,0 1,2 1,2 0,5 0,2 0,2 1 1 2 3 27

Krka 1,2 1,5 1,5 2,2 1,0 1,0 0,7 0,5 0,5 0,2 2 3 4 27

Ma1 1,2 1,5 1,5 2,0 1,2 1,2 0,7 0,5 0,5 0,2 0,5 3 4 28

ZRN 1,5 1,7 1,7 2,2 1,5 1,5 1,0 0,7 0,7 0,5 0,7 0,5 5 26

Me1 1,7 2,0 2,0 2,0 1,7 1,7 1,5 1,2 1,2 1,0 1,2 1,0 1,2 30

S. salar 6,7 7,0 6,4 7,2 6,4 7,0 7,2 7,0 7,0 6,7 6,7 6,4 6,4 7,5

80

Kod analiziranih uzoraka na 412 bp dugom odsječku našli smo 33 polimorfna

mjesta, na osnovu kojih smo razlučili različite haplotipove. Uočen je nov

haplotip kod mekousne pastrve iz rijeke Jadro, s mutacijom na mjestu 17,

specifičnoj za taj haplotip (Slika 21).

1 2 3 4 5 6 7 8 TTTTTCAGCT ATGTACAATA ACAACTGTTG TACCTTGCTA ACCCAATGTT ATACTACATC 60 9 10 11 12 TATGTATAAT ATTACATATT ATGTATTTAC CCATATATAT AATATAGCAT G-TGAGTAGT 120 13 14 15 16 17 ACATCATATG TATTATCAAC ATTAGTGAAT TTAACCCCTC ATACATCAGC ACTAACCCAA 180 18 19 20 GGTTTACATA AAGCAAAACA CGTGATAATA ACCAACTAAG TTGTCTTAAC CCGATTAATT 240

21 22 23 24∗ 25 26 GTTATATCAA TAAAACTCCA TCTAACACGG GCTCCGTCTT TACCCACCAA CT-TTCAGCA 300 27 28 29 30 TCAGTCCTGC TTAATGTAGT AAGAACCGAC CAACGATATA TCAGTAGGCA TACTCTTATT 360 31 32 33 34 GATGGTCAGG GACAGATATC GTATTAGGTC GCATCTCGTG AACTATTCCT GG 412

Slika 21: Nukleotidna sekvenca 412 bp dugog fragmenta kontrolne regije

mtDNA mekousne pastrve iz rijeke Jadro. Polimorfna mjesta su obojena

crvenom bojom i označena brojem. Novo polimorfno mjesto prema kojemu

opisujemo novi haplotip je podcrtan i označen zvjezdicom. Mjesto koje reže

restrikcijski enzim Eco 130I označeno je plavom bojom.

Srodne odnose između haplotipova prikazali smo u obliku filogenetskih

stabala. Prvo drvo napravljeno je po metodi "Neighbour-Joining" (NJ). Metoda

izrade filogenetskog drva "Neighbour-Joining" (NJ) temelji se na

udaljenostima (Slika 22). Ova metoda predstavlja pojednostavljenu metodu

"Minimum evolution". Filogenetska drva napravili smo i pomoću metoda

"Minimum evolution" (ME) i s "Maximum parisimony" (MP), koja se temelji na

nukleotidnim mjestima. Međutim, dobivena filogenetska drva se nisu bitno

razlikovala.

81

ZRMl

ZRM2AD4

Ad3

Adl

Krka

Ma1

ZRN

Me1

Soxy

Atl

bell

Dall

Dal

Da2

S.salar

77

84

70

31

30

16

40

20

39

49

53

0.005

Slika 22: Srodni odnosi između haplotipova uključenih u istraživanje prema

kontrolnoj regiji mtDNA, filogenetsko drvo je prikazano s "Neighbour-Joining"

(NJ) metodom (program MEGA). Brojevi uz grananja predstavljaju postotne

vrijednosti grananja od 10 000 ponavljanja.

Pri usporedbi odnosa tranzicija i transverzija mekousne pastrve iz Neretve

(Soxy) i ostalih, uočavamo nepravilnost tog odnosa. Uz nizak bootstrap od 31.

Kontrolna regija je informativna pri odnosima unutar vrsta i nižih taksonomskih

jedinica (npr. unutar roda Salmo), no pri unošenju viših taksomonsih jednica

dolazi do nepravilnosti koje se uočavaju na filogenetskom stablu (položaj

Soxy).

3.3.2.2. Sekvencioniranje dijela gena za citokrom b

Radi mogućih povratnih mutacija u području kontrolne regije mtDNA

kod mekousne pastrve iz Neretve, odnose između istraživanih haplotipova

istražili smo i na osnovu sekvencioniranja gena za citokrom b. Sekvencirali

smo i 276 bp dug segment gena za citokrom b kod jednog uzorka mekousne

pastrve iz rijeke Jadro (ZRN) i kod jednog uzorka mekousne pastrve iz rijeke

Neretve (soxy), te smo ih usporedili sa sekvencama iz genske banke (Tablica

6).

82

Slika 23: Nukleotidna sekvenca 276 bp dugog segmenta gena za citokrom b.

Polimorfna mjesta su obojena crvenom bojom i označena brojem. 1 2 3 Soxy CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTGTGTTTAGCCACCCAAATTCTTACCGGGCTCTTCCTAGC zrn CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTGTGTCTAGCCACCCAAATTCTTACCGGACTCTTCCTAGC Ad1 CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTATGTCTAGCCACCCAAATTCTTACCGGACTCTTCCTAGC ********************* *** ********************** *********** 4 5 Soxy CATACACTACACCTCCGACATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTCTGCCACATTTGCCGAGA zrn CATACACTACACCTCCGATATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTTTGCCACATTTGCCGAGA Ad1 CATACACTACACCTCCGATATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTTTGCCACATTTGCCGAGA ****************** *********************** ***************** 6 Soxy TGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT zrn CGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT Ad1 CGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT *********************************************************** Soxy CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC zrn CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC Ad1 CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC ************************************************************ 7 8 Soxy CTGAAACATCGGAGTCGTACTACTACTTCTCACTAT zrn CTGAAATATCGGAGTCGTACTGCTACTTCTCACTAT Ad1 CTGAAATATCGGAGTCGTACTGCTACTTCTCACTAT ****** ************** **************

Tablica 9: Polimorfna mjesta na genu za citokrom b mtDNA. Brojevi

označavaju mjesta u nukleotidnoj sekvenci koja se odnose na Sliku 23.

varijabilna mjesta

1 2 3 4 5 6 7 8

Soxy G T G C C T C A

ZRN C A T T C T G

Ad1 A C A T T C T G

Odnos između tranzicija i transverzija u sekvenci gena za citokrom b je

5:0 između haplotipova mekousne pastrve iz Jadra, Neretve i potočne pastrve

iz Krke i Zrmanje. Srodni odnos između pojedinih haploptipova određivali smo

na osnovi usporedbi haplotipova prema Kimura dvoparametarskog modela

gdje je odnos tranzicija/transverzija jednak 2. Vrijednosti udaljenosti

haplotipova su se kretale od 0,4 do 3,4 (prosječno 0,018 % ± 0,0012).

Vrijednosti udaljenosti haplotipova, te broj polimorfnih mjesta između njih,

prikazani su u tablici 10.

83

Tablica 10: Vrijednosti razlika između haplotipova u postotcima, te broj

polimorfnih mjesta između njih u genu za citokrom b mtDNA.

Soxy Bel Da1,

Da2

Da ZRN Me2 Me1 Ad34Ma Ad1 At Ssa

Soxy 2 9 9 7 8 9 8 8 7 17

Bel 0,7 11 11 9 10 11 10 10 9 19

Da1,Da2 3,4 4,1 0 2 3 4 3 3 3 15

Da 3,4 4,1 0,0 2 3 4 3 3 3 15

ZRN 2,6 3,4 0,7 0,7 1 2 1 1 2 14

Me2 3,0 3,7 1,1 1,1 0,4 1 2 2 2 13

Me1 3,4 4,1 1,5 1,5 0,7 0,4 3 3 3 14

Ad34Ma 3,0 3,7 1,1 1,1 0,4 0,7 1,1 0 1 13

Ad1 3,0 3,7 1,1 1,1 0,4 0,7 1,1 0,0 1 13

At 2,6 3,4 1,5 1,5 0,7 1,1 1,5 0,4 0,4 12

Ssa 6,5 7,3 6,1 6,1 5,7 5,3 5,7 5,3 5,3 4,9

Kod analiziranih uzoraka na 276 bp dugom odsječku našli smo 23

polimorfna mjesta, na osnovu kojih smo razlučili različite haplotipove. Haplotip

mekousne pastrve iz rijeke Žrnovnice prikazali smo na Slici 24.

1 2 3 4 5 6 CTTTGGCTCA CTCTTAGGCT TGTGTCTAGC CACCCAAATT CTTACCGGAC TCTTCCTAGC 60 7 8 9 10 11 12 CATACACTAC ACCTCCGATA TCTCAACAGC CTTTTCCTCT GTTTGCCACA TTTGCCGAGA 120 13 14 15 16 CGTTAGCTAC GGCTGACTCA TCCGAAACAT TCACGCTAAC GGAGCATCTT TCTTCTTTAT 180 17 18 19 20 CTGTATTTAT ATACATATCG CCCGAGGACT CTACTATGGT TCCTACCTAT ATAAAGAAAC 240 21 22 23 CTGAAATATC GGAGTCGTAC TGCTACTTCT CACTAT 276

Slika 24: Nukleotidna sekvenca 276 bp dugog fragmenta gena za citokrom b

mekousne pastrve iz rijeke Jadro. Polimorfna mjesta su obojena crvenom

bojom i označena brojem.

84

Da1, Da2

Da

zrn

Me2

Me1

Ad34Ma

Ad1

At

Soxy

Bel

Ssa

99

89

73

53

56

45

48

41

0.005

Slika 25: Srodni odnosi između haplotipova uključenih u istraživanje prema

genu za citokrom b, filogenetsko drvo je prikazano sa "Neighbour-Joining"

(NJ) metodom (program MEGA).

3.3.2.3. Zajednička analiza kontrolne regije mtDNA i gena za citokrom b

Sekvence kontrolne regije i gena za citokrom b mtDNA analizirali smo

zajedno. Nakon analize "Neighbour-Joining" (NJ) metodom dobili smo

filogenetsko drvo (program MEGA) (Slika 26).

Slika 26: Srodni odnosi između haplotipova uključenih u istraživanje prema

kontrolnoj regiji mtDNA i genu za citokrom b. Filogenetsko drvo je prikazano

sa "Neighbour-Joining" (NJ) metodom (program MEGA).

ZRM1

ZRM2AD4

ad3

Ad1

Ma1

zRN

Me1

Da1

Da2

At1

Soxy

bel1

Salmo

98

99

70

52

68

59

44

80

73

0.005

85

Filogenetsko drvo dobiveno spajanjem sekvenci kontrolne regije i gena

za citokrom b prikazuje sličan genetički odnos s onim koji je dobiven prema

sekvenci kontrolne regije. Kod obje analize zasebno, pa tako i kod njihova

udruživanja, vidljivo je da potočna pastrva iz Zrmanje (ZRM1 i ZRM2) ulazi s

ranije istraženim haplotipovima (Ad1 i Ad3) u jadransku liniju pastrva.

Mekousna pastrva iz Žrnovnice S. o. salonitana (ZRN) je znatno bliža

potočnoj, nego mekousnoj pastrvi iz rijeke Neretve (Soxy). Prema kontrolnoj

regiji mekousna pastrva iz Žrnovnice čini poseban ogranak između potočnih

pastrva, a prema citokormu b ona ulazi isti ogranak sa potočnim pastrvama

dunavske linije (Da1, Da2, Da). Udruživanjem obaju istraživanih sekvenci

solinka (ZRN), zauzima poseban ogranak unutar filogenetskih linija potočne

pastrve. Istom analizom mekousna pastrva iz Neretve ulazi u ogranak sa

belvicom Acantholingua ohridana (bel), dok je posve suprotan slučaj kada

njeno mjesto promatramo samo analizom kontrolne regije. Pri analizi

kontrolne regije u populaciji mekousne pastrve iz Neretve odnos između

tranzicija i transverzija odstupao je od uobičajnih, zabilježen je povećan broj

transverzija, stoga analizu te regije na smatramo informativnom pri

istraživanjima između rodova. Za odnose između rodova informativniji prikaz

u filogenetskom stablu daje kombinacija sekvenci kontrolne regije i gena za

citokrom b.

86

3.4. ANALIZA MIKROSATELITSKE DNA

3.4.1. Određivanje veličine mikrosatelita na ABI PRISMTM 310

Pomoću automatskog sekvencera ABI PRISMTM 310 automatski smo

odredili veličinu alela mikrosatelitskih lokusa.

Slika 27: Alelni polimorfizam na lokusima BFRO 001, Str 591 INRA, Strutta 58

i OmyFgt1TUF.

Plavi vrhovi prikazuju alele karakteristične za lokus BFRO 001, zeleni vrhovi

prikazuju alele karakteristične za lokus Str 591 INRA, crni vrhovi prikazuju

alele karakteristične za lokuse Strutta58 i OmyFgt1TUF kod jedinki iz rijeke

Jadro (J15) i rijeke Krke (K8), dok crveni vrhovi prikazuju fragmente DNA

poznate veličine (Tamra 350, Perkin Elmer).

87

3.4.2. Statistička analiza mikrosatelitskih podataka

Kompjutorski program GENETIX (Belkhir i sur. 1998) korišten je pri

statističkoj analizi mikrosatelitskih podataka. Kompjutorski program Fstat

(Goudet, 1995) korišten je za izračunavanje faktora "bogatstva alela", (engl.

allelic richness).

U ovom istraživanju proučili smo 9 mikrosatelitskih lokusa. Alele koje

smo uočili kod proučavanih populacija naveli smo u prilogu 1. U istraživanim

populacijama na lokusu BFRO 001 ima 12 različitih alela, na lokusu BFRO002

ima 8 različitih alela, na lokusu Ssa197 ima 18 različitih alela, na lokusu

Strutta58 ima 17 različitih alela, na lokusu Str591INRA ima 8 različitih alela,

na lokusu Strutta24 ima 15 različitih alela, na lokusu OmyFgt1TUF ima 7

različitih alela, na lokusu SsoSL438 ima 14 različitih alela i na lokusu StMS-

LDH4 ima 7 različitih alela.

Tablica 11: Proučeni lokusi, aleli i njihova prisutnost kod proučavanih

populacija.

Jadro

mekousna

Žrnovnica

mekousna

Neretva

mekousna

Krka

potočna

Zrmanja

potočna

BFRO001

198 0,9211 1,00 0 0 0

202 0,0526 0 0 0 0

206 0 0 1,00 0 0

214 0,0263 0 0 0,0455 0

222 0 0 0 0,3182 0

226 0 0 0 0 0,3000

230 0 0 0 0 0,2000

238 0 0 0 0,0909 0

242 0 0 0 0,3636 0,3000

244 0 0 0 0,0455 0

246 0 0 0 0,1364 0

256 0 0 0 0 0,1000

258 0 0 0 0 0,1000

88

Broj alela 3 1 1 6 5

Faktor

bogatstva alela 1,307 1,000 1,000 2,848 3,133

H exp. 0,1482 0 0 0,7355 0,7600

H n. b. 0,1522 0 0 0,7706 0,8444

H obs. 0,1579 0 0 0,8182 0,8000

Fis -0,0429 -0,0381 -0,0488 -0,0155 -0,0627

BFRO002

116 0 0 0 1,0000 1,0000

125 0,0588 0 0 0 0

131 0 0 0,2143 0 0

133 0 0 0,2143 0 0

135 0 0 0,4286 0 0

137 0 0 0,1429 0 0

140 0,8824 1,0000 0 0 0

145 0,0588 0 0 0 0

Broj alela 3 1 4 1 1

Faktor

bogatstva alela 1.449 1,000 2,776 1,000 1,000

H exp. 0,2145 0 0,7041 0 0

H n. b. 0,2210 0 0,7582 0 0

H obs. 0,1176 0 0,4286 0 0

Fis 0,43284 0,45950 0,48289 0,45223 0,44823

Ssa197

132 0,526 0 0 0,2917 0

136 0 0 0 0,0833 0

137 0 0 0 0 0,2000

141 0,3947 0,4211 0 0 0

145 0,5263 0,5789 0,0714 0 0

150 0 0 0 0,0417 0

154 0 0 0 0,3750 0

155 0 0 0,0714 0,0417 0

158 0 0 0 0,0417 0

159 0 0 0,0714 0 0,3000

163 0 0 0 0 0,3000

167 0 0 0 0 0,1000

171 0 0 0,0714 0 0,1000

175 0 0 0,2857 0 0

179 0 0 0,2857 0 0

89

183 0 0 0,1429 0 0

211 0 0 0 0,0833 0

215 0 0 0 0,0417 0

Broj alela 3 2 7 8 5

Faktor

bogatstva alela 2.146 1,876 3,229 2,937 3,133

H exp. 0,5637 0,4875 0,7959 0,7535 0,7600

H n. b. 0,5789 0,5007 0,8571 0,7862 0,8444

H obs. 0,6316 0,5263 1,0000 0,9167 1,0000

Fis -0,14494 -0,15451 -0,12098 -0,11774 -0,12084

Strutta24

102 0,0263 0 0 0 0

172 0 0 0,0714 0 0

176 0 0 0,6429 0 0

178 0 0 0,2143 0 0

180 0 0 0 0,0833 0

192 0,0263 0 0 0 0

196 0 0 0,0714 0 0

200 0 0 0 0 0,7500

202 0,8684 0,9474 0 0 0

206 0,0789 0,0526 0 0,0417 0

208 0 0 0 0,0417 0

212 0 0 0 0,1250 0

214 0 0 0 0,1667 0,2500

218 0 0 0 0,0417 0

220 0 0 0 0,0833 0

222 0 0 0 0,0417 0

224 0 0 0 0,3750 0

Broj alela 4 2 4 9 2

Faktor

bogatstva alela 1.501 1,202 2,237 3,142 1,786

H exp. 0,2382 0,0997 0,5306 0,7951 0,3750

H n. b. 0,2447 0,1024 0,5714 0,8297 0,4286

H obs. 0,1579 0,1053 0,2857 0,5833 0,5000

Fis 0,26633 0,31957 0,23496 0,26648 0,32150

Strutta58

91 0 0 0,1667 0 0

93 0 0 0,7500 0 0

95 0 0 0,0833 0 0

90

104 0 0 0 0,1364 0

145 0 0 0 0,0455 0

146 0 0 0 0,0455 0

147 0,9474 1,0000 0 0 0

150 0 0 0 0,0455 0

151 0,0263 0 0 0 0

158 0 0 0 0,1364 0

165 0 0 0 0,0455 0

166 0 0 0 0,3636 0

168 0 0 0 0,0455 0

170 0 0 0 0,0909 0

175 0,0263 0 0 0,0455 0

181 0 0 0 0 0,5000

187 0 0 0 0 0,5000

Broj alela 3 1 3 10 2

Faktor

bogatstva alela 1.211 1,000 1,909 3,232 2,000

H exp. 0,1011 0 0,4028 0,8099 0,5000

H n. b. 0,1038 0 0,4394 0,8485 0,6667

H obs. 0,1053 0 0,3333 0,9091 0

Fis 0,08186 0,07281 0,02647 0,29274 -0,01916

Str591INRA

149 0,0556 0 0 0,0417 0

159 0 0 0,1429 0,6250 0

169 0,0278 0 0 0 0

171 0,7778 0,8889 0,7857 0,0833 0

173 0,1389 0,1111 0,0714 0 0

183 0 0 0 0,2083 0

189 0 0 0 0 1,0000

193 0 0 0 0,0417 0

Broj alela 4 2 3 5 1

Faktor

bogatstva alela 1.788 1,390 1,791 2,268 1,000

H exp. 0,3719 0,1975 0,3571 0,5556 0

H n. b. 0,3825 0,2032 0,3846 0,5797 0

H obs. 0,4444 0,2222 0,4286 0,5833 0

Fis -0,05069 -0,08543 -0,08434 -0,13402 -0,09579

OmyFgt1TUF

204 0 0 0 0 0

91

206 1,0000 1,0000 1,0000 0,1250 0

218 0 0 0 0 0

226 0 0 0 0,2500 0

241 0 0 0 0 0,6000

245 0 0 0 0 0,4000

246 0 0 0 0,1250 0

Broj alela 1 1 1 3 2

Faktor

bogatstva alela 1.000 1,000 1,000 2,590 1,924

H exp. 0 0 0 0,6563 0,4800

H n. b. 0 0 0 0,7000 0,5333

H obs. 0 0 0 0,2500 0,4000

Fis 0,51892 0,52009 0,50868 0,20863 0,64360

SsoSL438

96 0 0 0 0,0455 0

98 0 0 0 0,0455 0

104 0 0 0 0,1818 0,1,0000

106 0 0 0 0,5000 0

109 0,0333 0 0 0 0

110 0 0 0 0,0909 0

111 0,0333 0,4000 0,0833 0 0

114 0 0 0 0,1364 0

115 0 0 0,1667 0 0

116 0 0 0,2500 0 0

117 0 0 0,0833 0 0

118 0 0 0,0833 0 0

120 0 0 0,3333 0 0

123 0,6667 0,3667 0 0 0

125 0,2667 0,2333 0 0 0

Broj alela 4 3 6 6 1

Faktor

bogatstva alela 1.992 2,424 3,180 2,780 1,000

H exp. 0,4822 0,6511 0,7778 0,6860 0

H n. b. 0,4989 0,6736 0,8485 0,7186 0

H obs. 0,3333 0,6000 1,0000 0,9091 0

Fis -0,08095 -0,02291 0,06761 0,12770 0,01749

Faktor

bogatstva alela 1.992 2,424 3,180 2,780 1,000

StMSLDH4

92

237 0,9375 1,0000 0,5833 0 0

245 0 0 0,4167 0 0

247 0 0 0 0,1250 0,6000

253 0 0 0 0,5833 0

264 0 0 0 0,0417 0

265 0 0 0 0,2500 0,4000

276 0,0625 0 0 0 0

Broj alela 2 1 2 4 2

Faktor

bogatstva alela 1.238 1,000 1,919 2,296 1,924

H exp. 0,1172 0 0,4861 0,5799 0,4800

H n. b. 0,1210 0 0,5303 0,6051 0,5333

H obs. 0,1250 0 0,5000 0,7500 0,8000

Fis -0,25737 -0,22129 -0,29933 -0,20838 -0,15343

Ukupna H

exp. 0,2486 0,1595 0,4505 0,6191 0,3728

Ukupna H n.

b. 0,2295 0,16454 0,4877 0,6487 0,4279

Ukupna H

obs. 0,2303 0,1615 0,4418 0,6355 0,3889

Ukupna F is 0,10296 0,01846 0,10118 0,02296 0,15493

Prosječan br.

alela po

populaciji

3 1,5 3,4 5,8 2,3

H exp. – očekivana heterozigotnost

H n.b. – očekivana heterozigotnost prilagođena za manje populacije

H obs. – uočena heterozigonost

Udio proučavanih alela po populacijama prikazali smo i grafički (Grafovi

1 do 9).

Na mikrosatelitskom lokusu BFRO001 ima 12 različitih alela (Graf 1).

Alel 198 karakterističan je za populacije mekousne pastrve u Jadru i

Žrnovnici. Jedino kod uzorka J13 nalazi se alel 214 koji je značajan za

potočnu pastrvu u Krki, a kod uzoraka J15 i J17 nalazimo alel 202. Aleli 214,

222, 238, 242, 244 i 246 značajni su za populaciju potočne pastrve u Krki, a

aleli 226, 230 i 242 su značajni za populaciju potočne pastrve u Zrmanji. Alel

206 značajan je za mekousnu pastrvu u Neretvi. Kod mekousne pastrve se ne

pojavljuju aleli duži od 212.

93

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

198

202

212

222

230

242

246

258

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 1: Alelni polimorfizam na lokusu BFRO001

Na lokus BFRO002 ima 8 različitih alela (Graf 2), od kojih su

prevladavali aleli 116 i 142. Alel 140 značajan je za populaciju mekousne

pastrve u Žrnovnici i Jadru, gdje se osim tog alela nalaze i aleli 125 (uzorci

J13 i J17) i 145. Za potočne pastrve u Zrmanji i Krki značajan je alel 116. Za

mekousnu pastrvu u Neretvi značajni su aleli 131, 133, 135 i 137.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,70,8

0,9

1

116 125 131 133 135 137 140 145

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 2: Alelni polimorfizam na lokusu BFRO002

94

Na lokusu Ssa197 ima 18 različitih alela (Graf 3). Za populacije

mekousne pastrve u rijekama Jadru i Žrnovnici značajni su aleli 141 i 145.

Kod uzoraka J15 i J17 u Jadru naišli smo na alel 132, koji je značajan za

potočnu pastrvu u Krki. Za potočnu pastrvu u rijeci Krki značajni su još aleli

137, 154, 159, 183, 211 i 215, a za potočnu pastrvu u rijeci Zrmanji aleli 137,

159, 163, 167 i 171. Aleli 175 i 179 karakteristični su za mekousnu pastrvu u

rijeci Neretvi.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

132

137

145

154

156

159

167

175

183

215

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 3: Alelni polimorfizam na lokusu Ssa197

Na lokusu Strutta24 otkrili smo 15 različitih alela (Graf 4). Alel 202

značajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru i Žrnovnici. Kod tri

uzorka u rijeci Jadro pojavili su se aleli 192 (J15) i 206 (J12, J15 i J17). Kod

populacije potočne pastrve u rijeci Krki, lokus Strutta24 pokazao se vrlo

varijabilnim, s većim brojem različitih alela (180, 206, 208, 212. 214, 218,

220), a s nešto većim postotkom bio je prisutan alel 224). U populaciji potočne

pastrve u Zrmanji, značajni su aleli 200 i 214, dok su za mekousnu pastrvu u

Neretvi, karakteristični aleli 172, 178, 180 i 196.

95

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

172

178

192

200

206

212

218

222

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 4: Alelni polimorfizam na lokusu Strutta24

Na lokusu Strutta58 otkrili smo 17 različitih alela (Graf 5). Alel 147

značajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru i Žrnovnici. Aleli 151

(J15) i 175 (J17) su se pojavili u dva uzorka u rijeci Jadro. Kod populacije

potočne pastrve u rijeci Krki lokus Strutta58 pokazao se vrlo varijabilnim, s

većim brojem različitih alela: 104, 147, 158, 166, 168 i 170. U populaciji

potočne pastrve u Zrmanji značajni su aleli 181 i 187, dok su za mekousnu

pastrvu u Neretvi karakteristični aleli 91, 93 i 95.

0

0,10,20,3

0,40,5

0,60,70,8

0,91

91 95 145

150

158

166

170

181

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 5: Alelni polimorfizam na lokusu Strutta58

96

Na lokusu Str591INRA otkrili smo 8 različitih alela (Graf 6). Alel 171

značajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru, Žrnovnici te u Neretvi,

gdje se uz njega pojavljuju i aleli 190 i 173. Alel 149 se pojavio u dva uzorka

kod mekousne pastrve u rijeci Jadro (J13 i J15). Za potočnu pastrvu u Krki

značajni su aleli 149, 171, 183 i 193, a za potočnu pastrvu u Zrmanji alel 189.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

149 159 169 171 173 183 189 193

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 6: Alelni polimorfizam na lokusu Str591INRA

Na lokusu OmyFgt1TUF otkrili smo 7 različitih alela (Graf 7). Alel 206

značajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru, Žrnovnici te u Neretvi.

Za potočnu pastrvu u Krki značajni su aleli 204, 218, 226 i 245, a za potočnu

pastrvu u Zrmanji aleli 241 i 245. Kod mekousne pastrve se ne pojavljuju aleli

duži od 206.

97

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,70,8

0,9

1

204 206 218 226 241 245 246

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 7: Alelni polimorfizam na lokusu OmyFgt1TUF

Na lokusu SsoSL438 otkrili smo 14 različitih alela (Graf 8). Kod

populacije mekousne pastrve u rijeci Jadro značajni su aleli 123 i 125, a

pojavljuju se i aleli 109 (J13) i 111. Za populaciju mekousne pastrve u

Žrnovnici značajni su aleli 123 i 125, a također se pojavljuje alel 111. Za

populaciju mekousne pastrve u Neretvi značajni su aleli 116 i 120, a pojavljuju

se aleli 111 i 118. Za populaciju potočne pastrve u rijeci Zrmanji značajan je

alel 104, dok se također pojavljuje i alel 106. Aleli 96, 98, 104, 111 i 114 se

pojavljuju u populaciji potočne pastrve u Krki, za nju je značajan i alel 106.

00,1

0,20,30,4

0,50,6

0,70,8

0,91

96 104

109

111

115

117

120

125

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 8: Alelni polimorfizam na lokusu SsoSL438

98

Na lokusu StMSLDH4 otkrili smo 7 različitih alela (Graf 9). Alel 237

značajan je za populacije mekousne pastrve u rijekama Jadro, Žrnovnica i

Neretve, gdje je još prisutan i alel 245. Za potočnu pastrvu u rijeci Zrmanji

značajni su aleli 247 i 265. Ti aleli su značajni i za potočnu pastrvu u rijeci Krki

gdje se uz njih, u većem postotku još pojavljuje i alel 253. Alel 276 pojavljuje

se samo kod uzoraka J13 i J15 u populaciji mekousne pastrve u rijeci Jadro.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,70,8

0,9

1

237 245 247 253 264 265 276

veličina alela

udio

u p

opula

ciji

Jadro mekousna

Žrnovnica mekousna

Krka potočna

Zrmanja potočna

Neretva mekousna

Graf 9: Alelni polimorfizam na lokusu StMSLDH4

99

3.4.2.1. Varijabilnost mikrosatelitskih lokusa kod proučavanih populacija

Prosječan broj alela po lokusu kod pojedinih populacija kretao se od

1,55 kod populacije mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici do 5,88 u populaciji

potočne pastrve u rijeci Krki. U populaciji mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici

našli smo najmanji broj alela. To objašnjavamo s načinom nastanka te

populacije. Populacija mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici nastala je prije 25

godina odvajanjem tridesetak jedinki iz Jadra.

Uočena heterozigotnost po pojedinom lokusu se bitno razlikuje (Tablica

8). Najmanja vrijednost uočene heterozigotnosti (Ho=0,000) nađena je na

većem broju lokusa: na lokusu BFRO001 kod populacija mekousne pastrve iz

rijeka Žrnovnice i Neretve, na lokusu BFRO002 kod populacija mekousne

pastrve iz rijeka Žrnovnice i potočne pastrve iz Krke i Zrmanje, na lokusu

OmyFgt1TUF kod populacija mekousne pastrve iz rijeka Žrnovnice, Jadro i

Neretve i na lokusu StMSLDH4 kod populacije mekousne pastrve iz rijeke

Žrnovnice. Najveća vrijednost uočene heterozigotnosti nađena je na lokusu

Ssa197 kod populacija mekousne pastrve iz rijeke Neretve (Ho=1,000) i

potočne pastrve iz rijeke Zrmanje (Ho=1,000), te na lokusu SsoSL438 u

populaciji mekousne pastrve iz Neretve (Ho=1,000) i potočne pastrve iz Krke

(Ho=0,909).

Pri određivanju odstupanja stvarnih od očekivanih frekvencija

genotipova u populaciji, koji su Hardy-Wenbergovoj ravnoteži potrebno je

naglasiti da je u većini populacija istražen mali broj uzorka.

Pri analizi udjela alela po populacijama uočavamo da se kod tri uzorka

u populaciji mekousne pastrve u rijeci Jadro (J13, J15 i J17), javljaju specifićni

aleli, bliski onima koje nalazimo kod potočne pastrve. Takova pojava navodi

nas da je kod tih uzoraka došlo do mješanja genetskog materijala sa

potočnom pastrvom, odnosno za te uzorke smatramo da su hibridi mekousne

pastrve sa potočnom.

100

3.4.2.2. Analiza glavnih koordinata

Predstavnici svih proučavanih populacija bili su uključeni u analizu

glavnih koordinata. Iz rezultata multivarijantne analize dobili smo matricu s

rasporedom jedinki po osi, iz koje je napravljen dvodimenzionalni graf (Graf

10).

Graf 10: Analiza glavnih koordinata jedinki koje pripadaju različitim

populacijama.

Iz grafa analize glavnih koordinata je vidljivo da jedinke čine dvije

zasebne skupine: u jednu skupinu ulaze populacije mekousnih pastrva, a u

drugu, populacije potočnih pastrva. Tri uzorka mekousne pastrve iz rijeke

Jadro (J13, 15 i J17) pomaknuta su prema potočnoj pastrvi, smatramo da su ti

uzorci hibridi.

U tablici 12 prikazali smo alele pojedinih lokusa koji se javljaju kao

zajednički u populacijama mekousne pastrve u Jadru i Žrnovnici te u

populaciji potočne pastrve u rijeci Krki. U tablici 13 prikazali smo alele koje

dijele populacije mekousne pastrve iz rijeka Jadra, Žrnovnice i Neretve.

101

Tablica 12: Udio pojavljivanja zajedničkih alela u postotcima kod populacija

mekousne pastrve u Jadru i Žrnovnici i u populaciji potočne pastrve u rijeci

Krki.

Jadro mekousna Žrnovnica mekousna Krka potočna

BFRO001 alel 214 0,0263 0 0,0455

Ssa197 alel 132 0,526 0 0,2917

Strutta24 alel 206 0,0789 0,0526 0,0417

Strutta58 alel 175 0,0263 0 0,0455

Str591INRA alel 149 0,0556 0 0,0417

Str591INRA alel 171 0,7778 0,8889 0,0833

OmyFgt1TUF alel

206 1,0000 1,0000 0,1250

Tablica 13: Udio pojavljivanja zajedničkih alela u postotcima za populacije

mekousne pastrve iz rijeka Jadra, Žrnovnice i Neretve.

Jadro mekousna Žrnovnica mekousna Neretva mekousna

Ssa 197 alel 145 0,5263 0,5789 0,0714

Str591INRA alel 171 0,7778 0,8889 0,7857

Str591INRA alel 173 0,1389 0,1111 0,0714

OmyFgt1TUF alel

206 1,0000 1,0000 1,0000

SsoSL438 alel 111 0,0333 0,4000 0,0833

StMSLDH4 alel 237 0,9375 1,0000 0,5833

102

3.4.2.3. Izračunavanje vrijednosti FST

Pomoću kompjutorskog programa GENETIX izračunali smo parametar

θ, gdje je FST vrijednost prilagođena po Weir i Coockerham (1984). Izračunate

FST vrijednosti prikazane su u tablicama 14a i 14b.

Tablica 14a: Vrijednosti FST parametra u istraživanim populacijama.

Žrnovnica

mekousna Krka potočna

Zrmanja

potočna

Neretva

mekousna

Jadro mekousna 0,04626 0,58461 0,71070 0,55623

Žrnovnica

mekousna 0,63975 0,77979 0,62983

Krka potočna 0,32426 0,41067

Zrmanja

potočna 0,53516

Tablica 14b: Vrijednosti FST parametra u istraživanim populacijama, pri čemu

uzorci J13, J15 i J17 nisu bili uvršteni u istraživanje.

Žrnovnica

mekousna Krka potočna

Zrmanja

potočna

Neretva

mekousna

Jadro mekousna 0,04364 0,61893 0,76681 0,61218

Žrnovnica

mekousna 0,63975 0,77979 0,62983

Krka potočna 0,33023 0,41370

Zrmanja

potočna 0,53516

103

3.5. ANALIZA SEKVENCIONIRANJA NUKELARNE DNA

Sekvencioniranjem uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke

Neretve, uočili smo da nema varijabilnih mjesta u sekvenci gena laktat

dehidrogenaze (LDH)-C1* između njih. Analizirane sekvence gena laktat

dehidrogenaze (LDH)-C1*, dužne 440 bp prikazane su na slici 28.

Jadro me_ TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT Neret me_ TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT jadranska_ TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT ************************************************************ Jadro me_ CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT Neret me_ CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT jadranska_ CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT ************************************************************ Jadro me_ CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTAGGATTTCAGAAATTGCTTT Neret me_ CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTAGGATTTCAGAAATTGCTTT jadranska_ CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTGGGATTTCAGAAATTGCTTT **************************************** ******************* Jadro me_ GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCCTTTTCCCCCCCATCTCCCTTTCATACA Neret me_ GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCCTTTTCCCCCCCATCTCCCTTTCATACA jadranska_ GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCC------CCCCCATCTCCCTTTCATACA ********************************* ********************* Jadro me_ CTTCCCCTCTCAGAGAGACTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT Neret me_ CTTCCCCTCTCAGAGAGACTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT jadranska_ CTTCCCCTCTCAGAGAGAGTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT ****************** ***************************************** Jadro me_ CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC Neret me_ CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC jadranska_ CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC ************************************************************ Jadro me_ TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA Neret me_ TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA jadranska_ TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA *********************

Slika 28: Sekvence gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod mekousne

pastrve iz rijeke Jadro (Jadro me), rijeke Neretve (Neret me) i jadranske linije

potočne pastrve. Crvenom bojom su označena varijabilna mjesta. Plavom

bojom su označena mjesta koja prepoznaje restrikcijski enzim Rsa I.

104

3.5.1. Analiza odsječaka gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1*,

DNA molekule s tehnikom RFLP (Restriction Fragment Lenght

Polymophism)

Na umnoženom dijelu nuklearne DNA, genu laktat dehidrogenaze

(LDH)-C1*, provjerili smo polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaje

restrikcijski enzim Rsa I. Restrikcijska endonukleaza Rsa I cijepa produkte na

prepoznatljivoj sekvenci gt/ac (Slika 29).

Potočnu pastrvu (Jadranski oblik) restrikcijski enzim reže na 2 mjesta, na 74

bp i na 240 bp, pri čemu stvara tri odsječka različite dužine: 74, 135 i 166 bp.

Mekousne pastrve restrikcijski enzim Rsa I reže na jednom mjestu, na 74 bp,

pri čemu stvara dva odsječka dužine 74 i 300 bp.

Slika 29: Restrikcija gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* s restrikcijskim

enzimom Rsa I, uzorci 1 i 5 su potočna pastrva, a 2, 3 su mekousna pastrva

iz Jadra, a uzorak 4 je mekousna pastrva iz rijeke Neretve

105

4. RASPRAVA

U području Mediterana obitava veliki broj endemskih slatkovodnih ribljih

vrsta. U zapadnoj Europi riblje populacije su vrlo dobro istražene što nije

slučaj u ovom dijelu Europe. Ovdje nalazimo brojne riblje vrste koje su slabo

opisane, sa sistematikom koja je nedovoljno definirana, a i njihova distribucije

nije sasvim poznata. Stoga je potrebno je napraviti reviziju sistematike brojnih

vrsta i podvrsta riba.

U rijekama jadranskog sliva obitavaju četiri izdvojene populacije

mekousne pastrve, koje se međusobno morfološki razlikuju. Predmet našeg

istraživanja bila je podvrsta mekousne pastrve koja obitava u rijekama Jadru i

Žrnovnici (S. o. salonitana). Opisali smo je i usporedili s podvrstama

mekousne pastrve iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), kao i potočnim

pastrvama (Salmo trutta) iz rijeka Krke i Zrmanje.

Osnovni cilj našeg rada je pronaći i opisati genetske razlike između

mekousnih pastrva S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus i potočne pastrve

(Salmo trutta). Stoga smo prikupili uzorke od tri populacije mekousne pastrve

koje obitavaju u rijekama jadranskog sliva, te od dvije populacije potočne

pastrve, koje pripadaju jadranskim linijama pastrva (Bernatchez, 2001). U

ovom radu željeli smo napraviti i usporedbu s podvrstom mekousne pastrve iz

rijeke Krke (S. o. krkensis), ali prilikom uzorkovanja nismo uočili niti jedan

primjerak.

Sadašnje populacije mekousnih pastrva su vrlo male i neprestano

bivaju ugrožene s mnogo čimbenika stoga je analiziran mali broj uzoraka.

Svjesni smo da zaključci izvedeni nakon analize malog broja uzoraka nisu

statistički opravdani, no unatoč tome, oni su zanimljivi i temelj su novim

raspravama i istraživanjima. Dobivene rezultate stavili smo u odnos s ranije

istraženim linijama i vrstama pastrva, u oblik filogenetskog stabla.

106

4.1. Morfološke analize

Jedna od osnovnih karakteristika Salmonida je fenotipska plastičnost.

Njihove predstavnike nalazimo u velikom broju varijacija boje tijela, merističkih

obilježja, izbora hrane, rasta, ponašanja i razmnožavanja. Te varijacije su

najčešće ekološki uvjetovane, kao što je slučaj kod ekoloških oblika potočne

pastrve S. trutta gdje razlikujemo potočni, jezerski i morski oblik. No, one

mogu biti i rezultat životne specijacije ili mogu biti genetski uvjetovane.

Genetski uvjetovane morfološke razlike uočene su kod nekih predstavnika

roda Salmo, kod S. marmoratus, S. carpio, S. ferox (Kottelat, 1997).

Na osnovu morfoloških i morfometrijskih obilježja mekousne pastrve su

podijeljene u četiri podvrste, pa smo naše istraživanje započeli usporedbom

morfoloških obilježja mekousne pastrve iz rijeke Jadro (S. o. salonitana) i

mekousne pastrve iz rijeke Bune (S. o. oxyrhynchus), sa potočnom pastrvom

jadranskog sliva (S. trutta).

Na osnovu morfometrijskih izmjera tri primjerka mekousne pastrve iz

rijeke Jadro (S. o. salonitana), možemo dati njezin kratak opis.

Oblik tijela mekousne pastrve iz rijeke Jadro vrlo je sličan potočnoj

pastrvi. Masna peraja postoji, repna peraja je u sredini dosta usječena sa

izraženim vrhovima. Na tijelu se nalaze crne pjege nepravilnog oblika koje su

raspoređene uglavnom sa bočne strane i to na prostoru od glave do kraja

leđne peraje. Crvene pjege su rjeđe, no one su veće i protežu se često po

čitavom tijelu. Peraje nisu pigmentirane, osim leđne peraje na kojoj nalazimo

tragove crvenih i crnih točaka.

Mekousna pastrva ime je dobila po karakterističnom izgledu glave,

odnosno usta, karakterizira je zaobljena njuška, mala i mesnata usta, a

gornjovilične kosti su joj kratke i široke.

Morfološka obilježja mekousne pastrve iz rijeke Jadro (S. o. salonitana)

usporedili smo s mjerenjima koja su obavljena na mekousnoj pastrvi iz rijeke

Neretve (S. o. oxyrhynchus), (Janković, 1961).

Morfometrijske oznake koje su imale vrlo slične vrijednosti kod dviju

podvrsta mekousne pastrve S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus su: dužina

107

glave, dužina donje vilice, uzdužni dijametar oka, dužina osnove leđene i

podrepne peraje, dužina prsne i trbušne peraje, zatim najveća i najmanja

visina tijela. Izuzetnu sličnost u nekim morfološkim osobinama objašnjavamo

sličnim uvjetima staništa u kojima obitavaju obje podvrste, stoga se i

parametri u kojima su S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus bliske odnose na

one osobine na koje najveći utjecaj ima njihov način života (obje vrste

obitavaju u brzim tekućicama).

Međutim u nekim morfometijskim oznakama postoje signifikantne

razlike između dviju promatranih podvrsta, a to su ponajprije dužina i širina

gornje vilice. Gornja vilica koja prelazi preko donje je karakteristika podvrste

mekousne pastrve S. o. oxyrhynchus, dok su jako zaobljene vilice značajka

mekousne pastrve S. o. salonitana. Mnogo veća razlika kod promatranih

podvrsta uočena je pregledom merističkih osobina. Merističke osobine se

znatno slabije mijenjaju u nekoj populaciji pod utjecajem različitih ekoloških

uvjeta, odnosno posjeduju veći heritabilitet (Treer i sur., 1995). Na promjenu

merističkih osobina utjecaj ima genetski faktor. Bitnu razliku između S. o.

salonitana i S. o. oxyrhynchus uočili smo u broju žbica u perajama, broju ljuski

u bočnoj liniji, broju branhiospina na prvom škržnom luku te broju kaudalnih

kralježaka. Stoga možemo pretpostaviti da su ove dvije podvrste nekada bile

u znatno bližem srodstvu, no uslijed duge geografske izolacije i

prilagođavanja na specifične uvijete staništa, te radi utjecaja hibridizacije sa

potočnom pastrvom dobile su posebne morfološke i ekološke osobine koje ih

danas jasno razlikuju.

Morfološke vrijednosti kod S. o. salonitana prikazali smo i u odnosu na

totalnu dužinu tijela, da bismo je mogli usporediti sa potočnom pastrvom

jadranske linije S. trutta (Marić, 2002) i sa endemskim salmonidom

Platysalmo platycephalus iz Turske (Behnke, 1968).

Dužina i širina vilica su morfometrijske oznake koje su u najvećoj mjeri

odstupale kod dviju podvrsta mekousne pastrve između S. o. salonitana i S.

o. oxyrhynchus, no te su vrijednosti vrlo slične kod S. o. salonitana i potočne

pastrve S. trutta. Potočna pastva je relativno mlada vrsta na ovim prostorima,

činjenica što S. o. salonitana dijeli sa njom neke fizičke osobine vodi nas

prema zaključcima o njihovoj mogućoj povezanosti tijekom evolucije.

108

Platysalmo platycephalus je endemski salmonid sa uskim staništem na

jugu Turske. Sa mekusnom pastrvom S. o. salonitana dijeli neke sličnosti kao

npr. najveća visina tijela, dužina prsne, trbušne, leđne i podrepne peraje. Kod

nekih merističkih osobina veliki sličnost pokazuju u broju branhiospina na

prvom škržnom luku, broju ljuski u bočnoj liniji, broju redova ljuski od bočne

linije do trbuše peraje te broju kaudalnih kralježaka, no signifikantno se

razlikuju u broju piloričkih nastavaka (P. platycephalus (15,66±0,57),

mekousna pastrva (57)).

Morfološku različitost podvrsta roda Salmothymus koji obitavaju u

rijekama jadranskog sliva, možemo usporediti s primjerom različitih ekotipova

vrste Coregonus clupeaformis koja obitava u jezerima bazena rijeke St. John

u Sjevernoj Americi (Lu i sur., 2001). Postojanje različitih ekotipova kod tih

populacija, može biti rezultat od oboje; sekundarnog kontakta između rodova

udaljenih kroz ledeno doba ili početnog razvoja kod jedne populacije

(Bernatchez i Dodson, 1991). Lu i Bernatchez (1999) smatraju da su razlike

između staništa, jezera, bitno utjecale na morfološku specijaciju ekotipova.

Stoga smatraju da stanišne razlike između različitih jezera imaju gotovo

jednako važnu ulogu u nastanku različitih ekotipova i njihovog stupnja

različitosti, kao i sekundarni kontakt između udaljenih evolucijskih linija.

Pronalazak jezera koja su u ledeno doba nastanile dvije različite linije, iako

danas u njima nalazimo samo jedan ekotip, predstavljaju hibridnu populaciju.

Radi dugotrajne izoliranosti u različitim staništima, procesom

specijacije došlo je do nastajanja različitih morfoloških oblika mekousne

pastrve, koju smo danas odvojili kao podvrste. S. o. salonitana morfološki se

znatno razlikuje od S. o. oxyrhynchus, a više je slična potočnoj pastrvi.

Međutim obje podvrste imaju isto razdoblje mrijesta (proljetni mrijest), što ih

razlikuje od potočne pastrve koja ima zimski mrijest. S obzirom na njenu

sličnost sa oboje S. o. oxyrhynchus i S. trutta bilo je interesantno istražiti i

njihov odnos na molekularnoj razini.

109

4.2. Prehrana mekousne pastrve iz rijeke Jadro

Analizu prehrane izvršili smo na tri primjerka mekousne pastrve iz

rijeke Jadro od kojih su dva nađena uginula u donjem toku rijeke, a jedan je

uginuo prilikom uzorkovanja. Analizom želučanog i crijevnog sadržaja

ustanovili smo da sva tri primjerka imaju potpuno prazno probavilo. Prazno

probavilo kod ovih primjeraka je razumljivo jer se ribe često prestaju hraniti

ako postoji neki zdravstveni problem.

4.3. Analiza molekularno-genetskih podataka

Analizirali smo varijabilnost dviju regija mitohondrijske DNA,

nekodirajuće kontrolne regije i kodirajuće regije gena za citokrom b.

Analizu mitohondrijske DNA započeli smo restrikcijom kontrolne regije

s restrikcijskim enzimom Alu I. Rezanje 1200 bp dugog segmenta omogućilo

je nastajanje polimorfnih restrikcijskih fragmenata, što je omogućilo prvotno

razlikovanje populacija mekousne i potočne pastrve. Analizom sa

restrikcijskim enzimom uočili smo razliku između podvrste S. o. oxyrhynchus i

ostalih, podvrste S. o. salonitana i vrste S. trutta. Kako ne postoji restrikcijski

enzim koji bi prepoznao populaciju S. o. salonitana, za tipiziranje iste, koristili

smo složeniju metodu sekvencioniranja.

Daljnju analizu proveli smo sekvencioniranjem dijela kontrolne regije od

540 bp. Unutar sekvencioniranog dijela našli smo 13 varijabilnih mjesta, što

znači da na svaka 41,5 nukleotida dolazi jedno varijabilno mjesto. Osim

podataka o zastupljenosti pojedinih mutacija koje smo dobili od naših

uzoraka, također smo koristili i podatke iz literature (GenBanka), pomoću kojih

smo željeli približiti što realnijem broju postojećih genetskih varijanti. Osim

naših uzoraka mekousne pastrve i potočne pastrve jadranskog tipa, prikazali

smo i Salmo salar, Acantholingua ohridana te potočne pastrve dunavskog,

mediteranskog i atlantskog tipa. Kad smo u analizu uključili ranije analizirane

haplotipove iz literature (Tablica 6), varijabilnost se znatno povećala. Uočili

110

smo 35 varijabilnih mjesta, što znači da na svaka 15,4 nukleotida dolazi jedno

varijabilno mjesto.

Prilikom sekvencioniranja kontrolne regije uočili smo 5 različitih

haplotipova (Zrm1, Zrm2Ad4, Krka, ZRN, Soxy), a pri sekvencioniranju gena

za citokrom mtDNA b 3 haplotipa (Ad1, ZRN i Soxy). Uzrok većeg broja

haplotipova pri sekvencioniranju kontrolne regije je veća varijabilnost te

sekvence u odnosu na gen za citokrom b. Analiziranjem istog područja kod

potočnih pastrva iz rijeka Krke i Zrmanje uočili smo da one pripadaju haplotipu

pastrva jadranske filogenetske linije (Bernatchez i sur., 1992). Sekvence

potočne pastrve iz rijeke Zrmanje su se međusobno razlikovale u 1 bp, te smo

kod njih opisali dva različita haplotipa Zrm1 i Zrm2Ad4, koji su se međusobno

razlikovali radi tranzicije između timina i citozina. To polimorfno mjesto

vjerojatno predstavlja jednu od vrućih točaka (engl. hot spot), pa su istovrsne

tranzicije prisutne na više haplotipova, bez obzira na njihov geografski izvor.

Pri sekvencioniranju gena za citokrom b kod tih uzoraka nisu uočene

varijabilnosti.

Sekvencioniranjem uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i Žrnovnice

ustanovili smo da uzorci dijele isti haplotip. Populacija mekousne pastve u

rijeci Žrnovnici je nastala odvajanjem dijela jedinki iz Jadra prije 25 godina,

stoga nas nije iznenadilo što te populacije imaju jednak haplotip. Haplotip koji

smo opisali kod ovih populacija nazvali smo ZRN. Haplotip ZRN je prvi

genetski marker koji opisuje populaciju mekousne pastrve iz rijeka Jadro i

Žrnovnice. Novi haplotip se razlikuje od ostalih po dodatnoj tranziciji T→C na

261 bp sekvencioniranog dijela.

Sekvencioniranjem dijela kontrolne regije mtDNA kod mekousne

pastrve iz Neretve (S. o. oxyrhynchus), uočili smo ranije opisan haplotip –

soxy (Snoj i sur., 2002b). Iako su supstitucije tipa G↔C transverzija poprilično

rijetke, takve dvije supstitucije su prisutne kod haplotipa soxy u kontrolnoj

regiji. Radi složenosti nastanka takovih supstitucija, većina ih je vjerojatno

posljedica mnogostrukih supstitucija jednom mjestu (npr. G→A→C). Za

haplotip soxy na kontrolnoj regiji su značajne još tri transverzije: A→G, A→T i

C→A, dok kod gena za citokrom b, transverzije nisu prisutne.

111

Kontrolna regija je vrlo varijabilna kod pastrvskih populacija.

Bernatchez i suradnici (1992) su kod 24 istražene populacije uočili 12 različitih

haplotipova, gdje je prosječan broj supstitucija iznosio 2,4%. Prosječan broj

supstitucija nukleotida između haplotipova mekousne pastrve iz Neretve i

Jadra iznosio je 2,2%. U kontrolnoj regiji kod mekousne pastrve (S. o.

salonitana) nismo uočili delecije i insercije koje su značajne za neke

haplotipove u kontrolnoj regiji kod mekousne pastrve iz Neretve (S. o.

oxyrhynchus) (Snoj, 1997). Haplotip soxy karakterizira delecija gvanina u

kontrolnoj regiji.

Kod vrsta koje pripadaju istom rodu, uočili smo manji broj tranzicija s

obzirom na transverzije. Točkaste delecije unutar vrsta nismo opazili, no našli

smo ih između rodova (jednu između S. o. oxyrhynchus i potočne pastrve), te

između porodica unutar podreda Salmonoidae (jednu između atlantskog

lososa i pastrve).

Berantchez i suradnici (1992) uočavaju da postoje razlike između

prirode nukleotidnih supstitucija kod potočne pastrve i sisavaca na mtDNA.

Opće je poznato da tranzicije uvelike nadmašuju transverzije (10:1) u

kontrolnoj regiji sisavaca, no u njihovoj studiji taj odnos je bio znatno manji.

Na osnovu toga, oni zaključuju da postoje bitne razlike u procesu mutacija

između sisavaca i riba.

Odnos između tranzicija i transverzija u kontrolnoj regiji mtDNA iznosio

je 4:2, taj odnos je za salmonide sličan; za lipljena (Sušnik, 2001) je 14:7, za

pastrvu (Bernatchez i sur., 1992) 17:6. Međutim kod većine kralježnjaka u tom

odnosu tranzicije prevladavaju u mnogo većem postotku, čak do 32 puta pred

transverzijama (Moritz i sur., 1987).

Velika varijabilnost značajna je za 5'-kraj gena za citokrom b kod

promatranih populacija, gdje smo na 276 bp dugom odsječku pronašli 8

varijabilnih mjesta, što prosječno iznosi jedno varijabilno mjesto na svakih

34,5 nukleotida. Između podvrsta mekousne pastrve broj supstitucija na

nukleotidu između para haplotipova iznosio je 0,026, što je mnogo više nego

što su uočili drugi autori (0,015 kod lipljena (Sušnik. 2001)). Svih 8 varijabilnih

mjesta na genu za citokrom b kod sekvencioniranih jedinki su transverzije.

Broj tranzicija i transverzija između dvaju nukleotida ovisi o srodnosti

organizama kojima nukleotidne sekvence pripadaju. Što su organizmi u užoj

112

vezi to su razlike između sekvenci manje, a prilikom supstitucije prevladavaju

tranzicije nad transverzijama. Kod viših taksonomskih skupina odnos između

tranzicija i transverzija se smanjuje.

Mutacije koje nalazimo na nekodirajućem dijelu mtDNA, kontrolnoj

regiji, pripadaju većinom točkastim mutacijama, koje nastaju kao rezultat

supstitucije, delecije ili insercije. Razlog takvim mutacijama je proces

pogrešnog spajanja nukleotida prilikom replikacije. Mehanizam za uklanjanje

pogrešno sparenih nukleotida zaslužan je za popravljanje takovih mjesta u

molekuli, on prepoznaje i izrezuje nukleotide prilikom polimerizacije i ligacije

novog lanca (Lewin, 2000). Međutim, postojeći mehanizmi nisu uvijek

uspješni, pa se neke mutacije zadrže u genomu i dalje prenose na potomstvo.

Kod greški koje nastaju prilikom pogrešnog sparivanja nukleotida,

prevladavaju supstitucije, npr. na adenin se umjesto timina (pirimidin) veže

citozin (pirimidin), ili gvanin ili adenin (purin), no zamjena pirimidina

pirimidinom uzrokuje manju steričku konformaciju nego druge zamjene. Kod

nekodirajućih regija DNA tranzicijske supstitucije prevladavaju nad

transverzijskima. Supstitucije su češće od delecija ili insercija, a među

supstitucijama tranzicije su teoretski dva puta češće od transverzija. Unutar

tranzicija prevladavaju supstitucija C→T. Stoga je pri ocjenjivanju različitosti

nekog para u sekvenci DNA potrebno ocijeniti određeni tip mutacija (Irwin i

sur., 1991). Osim ocjene tipa mutacija potrebno je imati u vidu da li se redi o

pojedinačnoj, višekratnoj, usporednoj, istovremenoj, konvergentnoj ili

povratnoj supstituciji. Što je stupanj različitosti između dvije nukleotidne

sekvence manji, mogućnost da dođe na određenom mjestu do više

supstitucija je gotovo zanemariva, broj uočenih supstitucija između takovih

dviju sekvenci bi trebao koincidirati sa stvarnim brojem supstitucija. Suprotan

je slučaj kad postoji velika razlika između sekvenci, uočeni broj razlika je

manji od stvarnog broja, što je posljedica višekratnih supstitucija na istom

mjestu (Snoj, 1997).

113

Za filogenetsku analizu prikazali smo odnose na osnovu kontrolne

regije, gena za citokrom b, te zajednički prikaz udruženih sekvenci kontrolne

regije i gena za citokrom b.

Filogenetsko drvo dobiveno spajanjem sekvenci kontrolne regije i gena

za citokrom b prikazuje sličan genetički odnos s onim koji je dobiven prema

sekvenci kontrolne regije. Potočna pastrva iz Zrmanje (ZRM1 i ZRM2) ulazi u

isti ogranak s ranije istraženim haplotipovima Ad1 i Ad3 u jadransku liniju

pastrva. Mekousna pastrva iz Žrnovnice S. o. salonitana (ZRN) se pokazala

znatno bliža potočnoj, nego mekousnoj pastrvi iz rijeke Neretve (Soxy).

Prema kontrolnoj regiji mekousna pastrva iz Žrnovnice čini poseban ogranak

između potočnih pastrva, a prema citokormu b ona ulazi isti ogranak sa

potočnim pastrvama dunavske linije (Da1, Da2, Da). Udruživanjem obaju

istraživanih sekvenci, solinka (ZRN), zauzima poseban ogranak unutar

filogenetskih linija potočne pastrve. Istom analizom mekousna pastrva iz

Neretve ulazi u ogranak sa belvicom (bel), dok je posve suprotan slučaj kada

njeno mjesto promatramo samo analizom kontrolne regije. Pri analizi

kontrolne regije u populaciji mekousne pastrve iz Neretve odnos između

tranzicija i transverzija odstupao je od uobičajnih, zabilježen je povećan broj

transverzija, stoga analizu te regije na smatramo informativnom pri

istraživanjima između rodova. Za odnose između rodova informativniji prikaz

u filogenetskom stablu daje kombinacija sekvenci kontrolne regije i gena za

citokrom b.

Na osnovu podataka od citokroma b i kontrolne regije, podvrste S. o.

salonitana i S. o. oxyrhynchus, znatno se razlikuju, no sa druge strane S. o.

salonitana pokazuje izuzetnu sličnost sa populacijom S. trutta (Jadranske

filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. Sa obzirom na

te rezultate S. o. salonitana bila bi smještena sa S. trutta kao njezina posebna

linija. Sekvencioniranjem gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod uzoraka

mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke Neretve, uočili smo da nema

varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci između njih, odnosno nađena je

100% identičnost nukleotida. Takav konflikt između podataka dobivenih od

mtDNA i nuklearne DNA je ranije zabilježen kod salmonidnih riba (Bernatchez

i sur., 1995; Wilson i Hebert, 1993), što je moguće da u ovom slučaju ukazuje

na polifiletsko porijeklo podvrste S. o. salonitana.

114

Filogenetsko drvo pokazuje grananja populacija s obzirom na

geografsko mjesto. Uočili smo grupiranje populacija iz istog poriječja. Potočne

pastrve iz Krke pripadaju pastrvama jadranske linije, što se može objasniti

njihovom vezom u prošlosti.

Današnja raširenost slatkovodnih riba povezana je s paleogeografskim

događajima u zemljinoj prošlosti, koji su utjecali na hidrografske sustave. Za

vrijeme mlađeg i srednjeg miocena, prvotno more Tethys se razdijelilo na dva

morska bazena: na Sredozemno more i Paratethys more. Djelovanjem

geoloških događaja došlo je do otvaranja Gibraltarskih vrata i ulaska slane

vode, te Sredozemno i Paratethys more postaju slana mora. Taj događaj bio

je poguban za slatkovodne ribe, koje su živjele u Paratethys moru još od

razdoblja srednjeg miocena. U kratkom vremenu došlo je do nestanka,

vjerojatno, jedne od najbogatijih slatkovodnih fauna. Razdoblje pleistocena

označava više ledenih doba, čije su se posljedice osjetile i u kolebanju razine

oceana. Najveće sniženje razine Sredozemnog mora dogodilo se u zadnjem

Würmskom ledenom dobu prije 15000 do 18000 godina. Posljedica sniženja

razine mora je povećanje Padskog porječja sve do rijeke Krke. Sve zemlje

centralne Europe bile su prožete mrežom riječnih sustava (Sušnik, 2001).

U to vrijeme većinu područja koje danas zauzima Jadransko more,

prekrivalo je kopno. Upravo tada, postojala je veza između slivova rijeka

talijanskog područja sa rijekama Jadranskog poriječja (Apostolidis i sur.,

1996). Za vrijeme pleistocena došlo je do otapanja velike količine leda,

zaostalog iz ledenog doba, koje je doprinijelo znatnoj promjeni zemljine

površine na prostoru današnjeg Jadranskog mora (Steinenger i Rogl, 1984).

Pod utjecajem geoloških promjena došlo je i do mijenjanja staništa u kojima

su obitavale tadašnje populacije pastrva. Geološki procesi su doveli do

odvajanja prvotnih populacija u staništa koja su međusobno razdvojena

nepremostivim barijerama. Različiti uvjeti u novim staništima doveli su do

njihove diferencijacije i do stvaranja skupina koje postoje i danas.

Potočna pastrva jadranske linije (Ad haplotip) opisana je prema obliku

pastrva koje naseljavaju Ohridsko jezero i neke talijanske i francuske rijeke

koje se ulijevaju u Jadransko more (Bernactchez i sur., 1992). Potočna

pastrva danas zauzima ista staništa kao i mekousna, no ona je zauzela ove

prostore znatno kasnije. Stoga smatramo da je podvrsta S. o. salonitana

115

nastala kao posljedica davne hibridizacije početnog oblika S. o. oxyrhynchus i

naprednije S. trutta, koja je kolonizirala rijeke Jadranskog sliva mnogo kasnije.

Takva introgresija, karakterizirana sa zapljenom mtDNA je rijedak, ali

već opisan fenomen kod nekih salmonida. On je dio prirodnog evolucijskog

procesa. Zaštitu takve vrste nipošto ne treba isključiti radi toga što je nastala

takovom vrstom hibridizacije (Allendorf i sur., 2001)

Radi ispitivanja podudaranja evolucijske dinamike mitohondrijske i

nuklearne DNA, genetsku strukturu populacija odredili smo i pomoću

koeficijenta Fst koji se temelji na frekvencijskoj distribuciji alela. Pomoću te

vrijednosti uočili smo da se neke proučavane populacije međusobno znatno

ne razlikuju. To se posebno odnosi na populaciju mekousne pastrve "solinke"

koja je translokacijom iz rijeke Jadro zauzela novo stanište u rijeci Žrnovnici.

Stoga je niska Fst vrijednost od 0.04626 između populacija mekousne pastrve

iz rijeka Jadro i Žrnovnice bila za očekivati. Manja razlika između populacija je

posljedica razlika u frekvencijskoj distribuciji alela. Analizirane populacije

karakterizira sličnost njihova staništa, sve žive u uskom životnom prostoru u

kojem vrlo lako, slučajnim tokom gena, dolazi do fiksacije određenih alela u

populaciji. Ta pojava vodi ka monomorfnosti genotipova iz koje proizlazi efekt

uskog grla. U ribljim populacijama koje žive na uskom životnom prostoru,

efekt uskog grla je vrlo česta pojava. Za populaciju mekousne pastrve u rijeci

Žrnovnici značajan je i mali broj alela po pojedinom mikosatelitskom lokusu,

pa je na čak pet alela (BFRO001, BFRO002, Strutta58, OmyFgt1TUF i

StMSLDH4) cijela populacija monomorfna. Mali genetski polimorfizam ove

populacije stoga je vjerojatno je posljedica višekratnog efekta uskog grla.

Mala heterozigotnost nas je navela na zaključak da ta populacija nije u

ravnoteži. Razlog neravnoteže te populacije ne vidimo u migraciji jedinki,

budući da kod te populacije nismo našli veći udio tuđih alela, poput populacije

mekousne pastrve iz Jadra. Uzrok neravnoteže moguć je u tome što je u tom

specifičnom okruženju, u procesu selekcije, došlo do favoriziranja

homozigota. Budući da se radi o malom staništu u kojem boravi mala riblja

populacija, prilikom izlova obuhvatili smo čitavo stanište. Stoga razlog

neravnoteže ne vidimo u obuhvaćanju samo dijela uzorka. Smatramo da je

116

manjak polimorfizma u populaciji mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici

posljedica rekolonizacije sa populacijom male efektivne veličine.

Razlog za veliku monomorfnost unutar pojedinih populacija i relativno

veliku polimorfnost između nekih populacija je mali broj jedinki u uzorku i

izoliranost između populacija. Broj jedinki u populaciji u prirodnom staništu je

bio izuzetno nizak, izuzev populacije mekosne pastrve u rijeci Neretvi i

njezinim pritocima. Kako su promatrane populacije živjele u različitim

okolišima, na njih su djelovali različiti selekcijski događaji i slučajni tokovi

gena, sve je to dovelo do veće razlike između njih.

Pratili smo introgresiju, s obzirom na proučavane lokuse, potočne

pastrve i mekousne pastrve iz Neretve na populacije mekousnih pastrva u

rijekama Jadro i Žrnovnica. Rezultate analize glavnih koordinata prikazali smo

grafički. Istraživane populacije razdvojile su se na dvije strane: na jednoj

strani su bile mekousne, a na drugoj potočne pastrve. Populacije mekousnih

pastrva iz Jadra i Žrnovnice su se uvelike preklapale. Pregledom njihovih

alela, uočili smo da te populacije imaju znatan broj zajedničkih alela. Da

bismo utvrdili vezu mekousne pastrve iz Jadra, odnosno Žrnovnice i potočne

pastrve iz Krke, promatrali smo njihove zajedničke alele. Uočili smo da one

dijele 8 alela na 5 različitih lokusa (Tablica 12). Većina od tih zajedničkih alela

bila je prisutna samo kod populacije mekousne pastrve iz rijeke Jadro.

Pregledom grafičkog rezultata analize glavnih kooridnati (Graf 10) mogu se

jasno uočiti 3 uzorka mekousne pastrve iz rijeke Jadro koja su pomaknuta

prema populaciji potočne pastrve iz rijeke Krke. Upravo ti uzorci, (J13, J15,

J17) smatramo da su hibridi između mekousne i potočne pastrve. Ti uzorci

imali su jedan alel od solinke, a drugi alel od potočne pastrve, koji su bili

raspoređeni na osam od devet analiziranih mikrosatelitskih lokusa. Radi

specifične distribucije hibridnih genotipova prema kojima je preostali dio

analizirane populacije solinke iz Jadra i Žrnovnice homogen, dokaz je da ta tri

uzorka predstavljaju posljedicu nedavnog križanja solinke sa potočnom

pastrvom. Smatramo da u ovom staništu solinka ima prednost u opstanku

pred potočnom pastrvom i njihovim hibridima, kao u prilog tome navodimo

podatak o električnom ribolovu 1998. godine (Aničić, usmeno priopćenje)

kada su u rijeci Jadro zabilježena 3 primjerka potočne pastrve, a 2003. godine

nije nađen niti jedan primjerak potočne pastrve. Mogućnost fiziološke

117

hibridizacije potvrdio je i Kosorić (usmeno priopćenje), on je na pastrvskom

uzgajalištu vršio hibridizacijske pokuse mekousne S. o. oxyrhynchus i potočne

pastrve koji su rezultirali tvorbom hibrida, danas znanih od lokalnog

stanovništva pod imenom kosor. Taj podatak govori nam da ne postoji jaka

barijera koja bi spriječila križanje mekousne i potočne pastrve. Ovo je

izuzetno bitan podatak pri planiranju zaštite solinke, stoga smatramo da je za

uspješnu rehabilitaciju ove ugrožene vrste potrebno hitno zaustaviti svako

unošenje potočne pastrve u njena staništa.

Analizom Fst vrijednosti između istraživanih populacija, kada smo

izuzeli 3 uzorka za koje smatramo da su hibridi populacije mekousne pastrve

iz Jadra i Žrnovnice pokazale su se još bližima 0,04364. Najveću udaljenost

pokazale su populacije mekousne pastrve iz Jadra i Žrnovnice s potočnom

pastrvom Fst=0.76681, odnosno 0.77979. Koeficijent Fst je pokazivao manju

vrijednost između populacija potočnih pastrva iz Krke i Zrmanje Fst=0.32426,

a njegova vrijednost iznosila je 0.41067 između populacija mekousne pastrve

iz Neretve i potočne iz Krke, odnosno 0.53516 s potočnom iz Zrmanje.

Mekousna pastrva iz rijeke Jadro dijeli s mekousnom pastrvom iz rijeke

Neretve 6 alela na 5 različitih lokusa, a s potočnom pastrvom također dijeli 7

alela na 6 različitih lokusa. To nam također ukazuje na to da je S. o.

salonitana polifiletska vrsta, nastala kao produkt introgresije između S. o.

oxyrhynchus iz rijeke Neretve i potočne pastrve autohtone za jadranski riječni

sustav. Zajedničke alele kod tih populacija tumačimo kao posljedicu

istosmjernih mutacija, te kao ostatak zajedničkog davnog polimorfizma.

Razliku između istraživanih populacija, odnosno intrapopulacijski

polimorfizam, prikazali smo i ocjenom heterozigotnosti. S obzirom na općenito

izuzetno veliku heterozigotnost kod mikrosatelitskih lokusa, heterozigotnost

mikrosatelitskih lokusa kod populacija mekousne pastrve, bila je razmjerno

niska, dok je kod populacija potočne pastrve ona bila ipak nešto viša (Tablica

12). Odnos očekivane i stvarne heterozigotnosti po lokusu kod pojedinih

populacija (mekousna pastrva u Jadru i Žrnovnici) ukazuje na znatan broj

homozigota u tim populacijama. Pomanjkanje heterozigotnosti kod tih

populacija objašnjavamo efektom uskog grla i sa parenjem u srodstvu.

Vjerujemo da je mali broj uzoraka kod pojedinih populacija utjecao na

118

frekvencijsku distribuciju alela, naročito radi moguće prisutnosti rijetkih alela

koje radi malog uzorka nismo mogli uočiti ili smo njihovu frekvenciju

precijenili.

Radi visokog stupnja mutacije mikrosatelita, interpretacija rezultata

analize mikrosatelitskih lokusa ne može biti apsolutno sigurna. Rezultati

analize ukazuju na upotrebljivost mikrosatelitskih lokusa pri analizi

razlikovanja populacija i otkivanju hibrida kod pastrvskih populacija.

Prilikom vrednovanja mitohondrijskih genotipova treba imati na umu

princip njihova nasljeđivanja. Čitav mitohondrijski genom nasljeđuje se po

majci, te stoga ništa ne govori o porijeklu oca. Prilikom unosa potočne pastrve

u novo stanište, njezin potpuni utjecaj na postojeću populaciju može se vidjeti

preko nuklearne DNA, preko mikrosatelita, dok mtDNA ima manji utjecaj, što

se naročito odražava prilikom unosa mužjaka potočne pastrve.

119

5. ZAKLJUČCI

Osnovne zaključke našeg rada iznosimo u nekoliko glavnih točaka.

Rijeke Jadro i Žrnovnica stanište su endemske mekousne pastrve (S.

o. salonitana), koja se odlikuje nizom morfoloških obilježja, među kojima se

ističu zaobljena njuška, mala i mesnata usta, te kratke i široke gornjovilične

kosti.

Uspoređujući morfološka obilježja mekousne pastrve iz rijeke Jadro s

mekousnom pastrvom iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), uočili smo mnoge

zajednička obilježja, ali i niz vidljivih razlika koje ukazuju na njihovo zajedničko

srodstvo i na posljedice prostorne i ekološke izolacije. Prilikom usporedbi

morfoloških obilježja uočili smo bitne razlike u dužini vilice, koja je izraženija i

duža kod S. o. oxyrhynchus, a kod S. o. salonitana gornja vilica je šira.

Samtramo da su ove dvije podvrste nekada bile u znatno bližem srodstvu, no

uslijed duge geografske izolacije i prilagođavanja na specifićne uvijete

staništa dobile su posebne morfološke i ekološke osobine koje ih danas jasno

razlikuju.

Potočna pastva je relativno mlada vrsta na ovim prostorima, činjenica

što S. o. salonitana dijeli sa njom neke fizičke osobine vodi nas prema

zaključcima o njihovoj mogućoj povezanosti tijekom evolucije.

Prilikom usporedbe morfoloških osobina sa endemskim salmonidom

Platysalmo platycephalus iz Turske (Behnke, 1968), jasno je izražena razlika

u promatranim morfometrijskim osobinama, posebno u broju piloričkih

nastavaka. Sve to ukazuje na činjenicu da mekousna pastrva i Platysalmo

platycephalus iz Turske predstavljaju posebne vrste endemičnih salmonida.

120

Pomoću genetskih markera pokušali smo definirati strukturu populacije

endemske mekousne pastrve iz rijeka Jadro i Žrnovnice (S. o. salonitana).

Analizom uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i Žrnovnice ustanovili smo

da uzorci dijele isti haplotip (ZRN), što nije neobično budući da je populacija

mekousne pastve u rijeci Žrnovnici je nastala odvajanjem dijela jedinki iz

Jadra prije 25 godina. Haplotip ZRN je prvi genetski marker koji opisuje

populaciju mekousne pastrve solinke iz rijeka Jadro i Žrnovnice.

Genetsku strukturu populacija odredili smo pomoću koeficijenta Fst.

Pomoću te vrijednosti uočili smo da se populacije iz rijeka Jadro i Žrnovnice

međusobno znatno ne razlikuju. Manja razlika između populacija je posljedica

razlika u frekvencijskoj distribuciji alela. Uzrok neravnoteže vidimo u tome što

je u tom specifičnom okruženju u procesu selekcije došlo do favoriziranja

homozigota. Stoga smatramo da je manjak polimorfizma u populaciji

mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici posljedica rekolonizacije s populacijom

male efektivne veličine.

Analizom mikrosatelitiskih lokusa uočeno je da populacije mekousnih

pastrva iz Jadra i Žrnovnice imaju određen broj zajedničkih alela s potočnom

pastrvom. Analizom su utvrđena tri uzorka mekousne pastrve (J13, J15 i J17)

iz rijeke Jadro koja dijele zajedničke alele s potočnom pastrvom. Smatramo

da su upravo ti uzorci hibridi između mekousne i potočne pastrve. Radi

specifične distribucije hibridnih genotipova prema kojima je preostali dio

analizirane populacije solinke iz Jadra i Žrnovnice homogen, smatramo da ta

tri uzorka predstavljaju posljedicu nedavnog križanja solinke sa potočnom

pastrvom.

Postojanje hibrida govori nam da ne postoji jaka reprodukcijska barijera

koja bi spriječila križanje mekousne i potočne pastrve što je izuzetno bitnan

podatak pri planiranju zaštite mekousne pastrve solinke. Smatramo da je za

uspješnu rehabilitaciju ove ugrožene vrste potrebno hitno zaustaviti svako

unošenje potočne pastrve u njena staništa, u protivnom je moguće da dođe

do izumiranja ove reliktne vrste.

Aleli koji su značajni za populacije mekousne pastrve u Jadru i

Žrnovnici pronašli smo u populaciji mekousne pastrve u rijeci Neretvi.

121

Zajedničke alele kod tih populacija tumačimo kao posljedicu davne

introgresije.

Analizirajući podvrstu S. o. salonitana, rezultati bazirani na

mitohondrijskoj DNA razlikuju se od onih dobivenih analizom nuklearne DNA.

Na osnovi podataka sekvencioniranja od citokroma b i kontrolne regije,

podvrste S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus znatno se razlikuju. S druge

strane, S. o. salonitana pokazuje izuzetnu sličnost s populacijom S. trutta

(jadranske filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. S

obzirom na te rezultate, S. o. salonitana bi bila smještena s S. trutta kao

njezina posebna linija.

Analizom nuklearne DNA, sekvencioniranjem gena laktat

dehidrogenaze (LDH)-C1*, kod uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz

rijeke Neretve uočili smo da nema varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci,

odnosno, nađena je 100% identičnost nukleotida.

Takav konflikt između podataka dobivenih od mtDNA i nuklearne DNA

je ranije zabilježen kod salmonidnih riba (Bernatchez i sur., 1995; Wilson i

Hebert, 1993), što bi u ovom slučaju moglo ukazivati na polifiletsko porijeklo

podvrste S. o. salonitana. Stoga smatramo da je solinka prirodna hibridna

vrsta, koja je nastala kao posljedica davne hibridizacije izvornog oblika

mekousne pastrve (S. obtusirostris oxyrhynchus) s naprednijom potočnom

pastrvom, koja je mnogo kasnije kolonizirala rijeke jadranskog sliva.

122

6. LITERATURA

1. Aganović, M. (1979): Salmonidne vrste riba i njihov uzgoj. IGKRO

Svjetlost, Sarajevo.

2. Alegria Hernandez V. (1985): A contribution to the study of

heterogeneity of the Adriatic sardine (Sardina pilchardus Walb.)

population. Acta Adriatica, 26: 109-122.

3. Aliah R. S., Sato S., Taniguchi N. (2000): An Evaluation fo Genetic

Variability in Nishikigoi, Cyprinus carpio, Stocks from Niigata

Prefecture, Based on Microsatellite DNA Markers. Suisanzishoku.

48(1): 25-31.

4. Allendorf, F. W., Leary, R. F. (1988): Conservation and distribution of

genetic variation in a polytypic species: the cutthroat trout.

Conservation Biology, 2: 170-184.

5. Allendorf, F. W., Leary, R. F., Spruell, P., Wenburg, J. K. (2001): The

problems with hybrids: setting conservation guidelines. Trends in

Ecology and Evolution, 16 (11): 613-622.

6. Allendorf, F. W., Thorgaard, G. H. (1984): Tetraploidy and the evolution

of salmonid fishes. Evolutionary Genetics of Fishes, B. J. Turner,

Plenum Press, New York, str.: 1-53.

7. Apostolidis, A., Karakousis, Y., Rryantaphyllidis, C. (1996): Genetic

divergence and phylogenetic relationships among Salmo trutta L.

(brown trout) populations from Greece and other European countries.

Heredity, 76: 551-560.

8. Avise, J. C. (1994): Molecular markers, natural history and evoluton.

Chapman & Hall, Inc., New York.

9. Avise, J. C. (2000): Phylogeography. The History and Formation of

Species. Harvard University Press, Cambridge, MA.

10. Avise, J. C., Saunders, N. C. (1984): Hybridization and introgression

among species of sunfish (Lepomis): analysis by mitochondrial DNA

and allozyme markers. Genetics, 108: 237-255.

11. Barton, N. H., Hewitt, G. M. (1989): Adaptation, speciation and hybrid

zones. Nature, 341: 497-503.

123

12. Beaumont, M. A., Bruford, M. W. (1999): Microsatellites in conservation

genetics. U: Microsatellites: Evolution and Applications. (Goldstein, D.

B., Schlötterer, C., urednici). Oxford University Press. str.: 165 – 182.

13. Behnke, R. J. (1968): A new subgenus and species of truout:

Platysalmo platycephalus from southcentral Turkey with comments on

the classification of the subfamily Salmoninae. Mitt. Hmbg. Zool. Mus.

Inst., 66: 1 – 15.

14. Behnke, R. J. (1986): Brown trout. Trout, 27: 42 – 47.

15. Belkhir, K., Borsa, P., Goudet, J., Chikhi, L., Bonhomme, F. (1998):

GENETIX, logiciel sous Wimdows TM pour la genetique des

populations. Laboratoire Genome et Populations, CNRS UPR 9060,

University Montpellier II.

16. Berg, L. S. (1908) Vorläufige Bemerkungen über die europäisch-

asiatischen Samoniden, insvesondere die Gattung Thymallus.

Annuaire du Musée Uoologieque de l'Academie Imperiale des

Sciences de St. Petersbourg 12: 500 – 514.

17. Bernatcherz, L., Guyomard, R., Bonhomme, F. (1992): DNA sequence

variation of the mitochondrial control region among geographically and

morphologically remote European brown trout Salmo trutta populations.

Molecular Ecology 1: 161 – 173.

18. Bernatchez, L. (2001) The evolutionary history of brown trout (Salmo

trutta L.) interred from phlylogenetic, nested clade, and mismatch

analyses of mitochondrial DNA variation, Evolution, 55 (2): 351 – 379.

19. Bernatchez, L., Danzmann, R. G. (1993): Congruence in control-region

sequence and restriction-site variation in mitochondrial DNA of brook

charr (Salvelinus fontinalis Mitchill). Molecular Biology and Evolution,

10: 1002 – 1014.

20. Bernatchez, L., Dodson, J. J. (1991): Phylogeographic structure in

mitochondrial DNA of the Lake whitefish (Coregonus clupeaformis) and

its relation to Pleistocene glaciations. Evolution, 45: 1016-1035.

21. Bernatchez, L., Glemet, H., Wilson, C.,C., Danzmann, R.,G. (1995):

Introgression and fixation of arctic char (Salvelinus alpinus)

mitochondrial genome in an allopatric population of brook trout

124

(Salvelinus fontinalis). Canadian Journal of Fisheries & Aquatic

Sciences 52, 1: 179-185.

22. Bernatchez, L., Wilson,C. C. (1998): Comparative phylogeography of

Neoarctic and Paleoarctic fish. Molecular ecology, 7: 431-452.

23. Berrebi, P., Duguid, A., Garcia-Marin, J. L., Guyomard, R., Ferguson

A., Hansen, M. M., Hindar, K., Koljonene, M. L., Laikre, L., Largiarder,

C., Martinez, P., Nielsen, E. E., Palm, S., Ruzzante, D., Ryman, N.,

Trianaphyllidis, C. (1999): Conservation genetic management of brown

trout (Salmo trutta) in Europe. (Second draft).

24. Berrebi, P., Povž, M., Jesenšek, D., Cattaneo-Berrebi, G., Crivelli, A. J.

(2000): The genetic diversity of native, stocked and hybrid populations

of marble trout in the Soča river, Slovenia. Heredity, 85 (3): 277-287.

25. Bianco, P. G. (1990): Potential role of the palaeohistory of the

Mediterranean and Paratethys basins on the early dispersal of Euro-

Mediterranean freshwater fishes. Ichtyoi. Explor. Freshwaters, 1 (2):

167 – 184.

26. Bianco, P. G., Knežević, B. (1987): The Leuciscus cephalus complex

(Pisces, Cyprinideae) in western Balcanic area. Proc. V Congr. Eur.

Ichthyol., Stockholm 1985, 49 – 55.

27. Bonacci, O., Kerovec, M., Roje Bonacci, T., Mrakovčić, M., Plenković

Moraj, A. (1998): Ecologically acceptable flows definition for the

Žrnovnica river (Croatia). Regulated Rivers - Research & Management,

14: 245-356.

28. Bowling, A. T., Del Valle, A., Bowling, M. (2000). A pedigree-based

study of mitochondiral D-loop DNA sequence variation among Arabian

horses. Animal Genetics, 31: 1 – 7.

29. Brown, W. M., George, M. J., Wilson, A. C. (1979): Rapid evolution of

animal mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy od

Scinces, USA, 76: 1967 – 1971.

30. Brown, W. M., Prager, E. M:, Wang, A., Wilson, A. C. (1982):

Mitochondrial DNA sequences of primates: Tempo and mode of

evolution. Jurnal of Molecular Evolution, 18: 225 – 239.

125

31. Bruford, M. W., Ciofi, C., Funk., S. M. (1998): Characteristics of

Microsatellites. U: Molecular Tools for Screening Biodiversity (Karp, A.,

Isaac, P. G., Ingram, D. S., urednici). Chapman & Hall, str.: 202 – 205.

32. Brunner P. C., Douglas M. R., Bernatchez L. (1998). Microsatellite and

mitochondrial DNA assessment of population structure and stocking

effects in Arctic charr Salvelinus alpinous (Teleostei, Salmomidae) from

Central Alpine lakes. Molecular Ecology. 7: 209-223.

33. Cables, L. (2001): Mitochondria. Horsepower. alsalkjlkjčlkjčlkjčlkjsalkjlj

http://homepages.ihug.co.nz/~lcables/mitochondria.htm

34. Campton, D. E. (1987): Natural hybridization and introgression in

fishes: Methods of detection and genetic interpretations. U: Population

Genetics and Fishery Management (Ryman, N., Utter, F., urednici).

Universety of Washington Press, Inc. Ann Arbor, MI: 242-258.

35. Carvalho, G. R. (1993): Evolutionary aspects of fish distribution:

genetic variability and adaptation. J. Fish Biol., 43: 53-73.

36. Carvalho, G. R., Hauser, L. (1998): Advances in the molecular analysis

of fish population structure. Ital. J. Zool., 65: 21-33

37. Chakraborty, R., Kimmel, M., Stivers, D. N., Davison, L. J., Deka, R.

(1997): Relative mutation rates at di-, tri-, and tetranucleotide

microsatellite loci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1041 – 1046.

38. Constable, J. J., Packer, C., Collins, D. A., Pusey, A. E. (1995):

Nuclear DNA from primate dung. Nature: 373 - 393.

39. Crivelli A., Poizat G., Berrebi P., Jesensek D., Rubin J. F. (2000).

Conservation biology applied to fish: The example of a project for

rehabilitating the marble trout (Salmo marmoratus) in Slovenia.

Cybium. 24(3): 211-230.

40. Crivelli, A. J. (1996): The freshwater fish enedmic to the northern

Mediterranean region. Le Sambuc, Arles, France.

41. Cronin, M. A., Spearman, W. J., Wilmot, R. L. (1993): Mitochondrial

variation in Chinook (Oncorhynchus tsawytscha) and Chum salmon (O.

keta) detected by restriction enzyme analysis of Polymeraze Chain

Reaction (PCR) products. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic

Sciences, 50: 708 – 715.

126

42. Delling B., Crivelli A. J., Rubin J-F., Berrebi P. (2000): Morphological

variation in hybrids between Salmo marmoratus and alien Salmo

species in the Volaria stream, Soca River Basin, Slovenia. Journal of

Fish Biology. 57: 1199-1212.

43. Dirienzo, A., Peterson, A. C., Garza, J. C., Valdes, A. M., Slatkin, M.,

Freimer, N. B. (1994): Mutational processes of simple-sequence repeat

loci in human populations. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America. 91(8): 3166-3170.

44. Domanico, M. J., Phillip, R. B., Oakley, T. H. (1997): Phylogenetic

analysis of the Pacific salmon (genus Oncorhynchus) using nuclear

and mitochondrial DNA sequences. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 54:

1865–1872.

45. Dowling, T. E., Moritz., C., Palmer, J. D. (1990): Nucleic acids. II.

Restriction site analysis. U: Molecular Systematics, (Heillis,D. M.,

Moritz, C, urednici), Sinauer Associates, Sunderland, MA, str.: 25–317.

46. Dowling, T. E., Secor, C. L. (1997): The role of hybridization and

introgression in the diversification of animals. Annu. Rev. Ecol. Syst.,

28: 593 – 619.

47. Drofejeva, E. A. (1989): The basic principles of classification and

phylogeny of the salmonid fishes (Salmoniformes: Salmonoidesi:

Salmonidae). Biology and phylogeny of fishes, St. Perersburg, USSR

Academy od Sciences: 5 – 16.

48. Economidis P. S., Banarescu P. M. (1991). The Distribution and Origin

of Freshwater Fishes on the Balkan Peninsula, Especially in Greece.

Int. Revue. Ges. Hydrobiol. 76: 257 – 283.

49. Estoup A., Presa P., Krieg F., Vaiman D., Guyomard R. (1993). (CT)n

and (GT)n microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo

trutta L. (brown trout). Heredity. 71: 488 - 496.

50. Ford-Llyoyd, G. (1996): Measuring genetic variation using molecular

markers. University of Birmingham, Kevin Painting, IPGRI, Rome.

51. Gavin P., Taggart J., Ferguson A., O’Farrell M., Cross T. (1996).

Population genetics of Atalntic salmon (Salmo salar) in the River

Shannon system in Ireland. Canadian Jounal of Fisheries Sciences.

53: 1933-1942.

127

52. Giuffra, E., Guyomard, R., Forneris, G. (1996): Phylogenetic

relationships and introgression patterns between incipient parapatric

species of Italian Brown trout (Salmo trutta l. complex). Molecular

Ecology, 5 (2): 207-220.

53. Glubokovsky, M. K. (1995) Evolutionary Biology of Salmonid Fishes.

Nauka, Moscow.

54. Goudet, J. (1995): FSTAT (vers. 1.2): a computer program to calculate

F-statistic. J. Hered.: 485-486.

55. Hadžišće, S. (1962): Ka poznavanju roda Salmothymus Berg. Izdanija,

T. III, 2, Specijalno izdanje, Skoplje.

56. Hansen, M. M., Ruzzante, D. E., Nielsen, E. E., Mansberg, K. L. D.

(2001): Brown trout (Salmo trutta) stocking impact assessment using

microsatellite DNA markers. Ecological Appliocations, 11 (1): 148 –

160.

57. Harrison, G. (1989): Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in

population and evolution biology. Tree, 4 (1): 6 – 12.

58. Harrison, R. G. (1993): Hybrid zones and the evolutionary process.

Oxford University Press, New York.

59. Heckel, J. J. (1851): Bericht einer ichtyologischen Reise. II. Beiträge zr

den Gattungen Salmo, Fario, Salar, Coregonus, Chondrostoma und

Telestes. Sitzungsbarrichte der Akademie der Wissenschoften. Wien:

347 – 390.

60. Heckel, J., Kner, R. (1857): Die Süsswasserfische der

Österreichischen Monarchie. Wien.

61. Hening, W. (1966): Phylogenetic systematics. Univ. Illinois Pres,

Urbana, str.: 263.

62. Hurst, C. D., Bartlett, S. E., Davidson, W. S., Bruce, I. J. (1999): The

complete mitochondrial sequence of the Atlantic salmon, Salmo salar.

Gene, 239: 237 – 242.

63. Hutchinson W. F., Carvalho G. R., Rogers F. I. (1999): A non–

destuctive technique for the recovery of DNA from dried fish otoliths for

subsequent molecular genetic analysis. Molecular Ecology, 8: 893 -

894.

128

64. Irwin, D. M., Kocher, T. D., Wilson, A. C. (1991): Evolution of the

cytochrome b gene of mammals. J. Fish Biol., 35: 687-701.

65. Janković, D. (1961): Taksonomska i ekološka ispitivanja na mekousnoj

pastrmci iz reke Bune. Biološki institut NR Srbije. Zbornik radova,

Knjiga 5. Beograd, Naučno delo: 3 – 31.

66. Jarne, P., Lagoda, P. J. L. (1996): Microsatellites, from molecules to

populations and beck. Trends in Ecology and Evolution. 11/10: 424 –

429.

67. Johnson, G. D., Patterson, C. (1996): Relationship of lower

euteleostean fishes. U: Interrelations of Fishes (Stiassny, M. L. J.,

Parenti, L. R., Johnson, G. D., urednici). Academic Press, San Diego:

251-332.

68. Jordan, W. C., Verspoor, E. (1993): Incidence of natural hybrids

produce gynogens and triploids when backcrossed to male Atlantic

salmon. Aquaculture, 57: 245-358.

69. Karaman, M. (1966): Beitrag zur Kenntnis der Salmoniden

Südeuropas. Hydrobiologia, XXVIII, Fasc.1.

70. Karaman, S. (1927): Salmonidi Balkana. Glasnik Skopskog Naučnog

Društva, Skoplje.

71. Kendall, A. W., Behnke, R. J. (1984): Salmonidae: Development and

relationship. U: Ontogeny and Systematics of Fishes (urednik: Moser,

H. G.). Am. Soc. Ichthyol. Herpetol. Spec. Publ. 1, str.: 142-149.

72. Kosorić, Đ., Vuković, T. (1969): Ispitivanje mogućnosti hibridizacije

salmonidnih vrsta sliva Neretve. Ichtylogia, vol. 1, 1, Beograd.

73. Kumar, S., Tamura, K., Jakobsen, I. B., Nei, M. (2001) MEGA2:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis software, Bioinformatics.

74. Lewin, B. (2000): Genes VII. Oxford University Press, University of

Oxford, Oxford, United Kindom.

75. Li, W. H., Grauer, D. (1991): Fundamentals of Molecular Evolutin.

Sinauer Associates, Sunderland, MA.

76. Lu, G., Basley, D. J., Bernatchez, L. (2001): Contrasting patterns of

mitochondrial DNA and microsatellite introgresive hybridization

129

between lineages of lake whitefish (Coregonus clupeaformis);

relevance for speciatin. Molecular Ecology, 10: 965-985.

77. Lu, G., Bernatchez, L. (1999): Correlated trophic specialization and

genetic divergence in sympatic lake whitefish ecotypes (Coregonus

clupeaformis): support for the ecological speciation hypothesis.

Evolution, 53: 1491-1505.

78. Magoulas, A., Zouros, E. (1993): Restriction-site heteroplasmy in

anchovy (Engraulis encrasiocholus) indicates incidental biparental

inheritance of mitochondrial DNA. Mol. Biol. Evol. 10 (2): 319 – 325.

79. Maitland, P. S. (1995): The conservation of freshwater fish: past and

present experience. Biological Conservation, 72: 259-270.

80. Marić, D. (1995): Endemic fish species of Montenegro. Biological

Conservation 72: 187 - 194.

81. Marić, S. (2002): Morfološki varijabiliteti pastrmki (subfamilija

Salmoninae) – značaj za biološku konzervaciju. Magistarski rad,

Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

82. Mayr, E. (1963): Animal species and evolution. Harward University

Press, Cambridge.

83. McMeel, O. M., Hoey, E. M., Ferguson, A. (2001): Partial nucleotide

sequences, and routine typing by polymerase chain reaction-restriction

fragment length polymorphism, of the brown trout (Salmo trutta) lactate

dehydrogenase, LDH-C1 *90 and *100 alleles. Molecular Ecology, 10:

29 – 34.

84. McMillan, M., Wilcove, D. (1994): Gone but not forgotten: Why have

species protected by Endangered Species Act become extinct?

Endangered Species Update, 11: 5-6.

85. Meffe, G. K. (1986): Conservation genetics and the management of

endangered fishes. Fisheries, 11: 14-23.

86. Miller, L. M., Kapuscinski, A R. (1996): Microsatellite DNA Markers

Reveal New Levels of Genetic Variation in Northen Pike. Transactions

of the American Fisheries Society, 125: 971 - 977.

130

87. Moritz, C. (1994): Applications of mitochondrial DNA analysis in

conservation: a critical review. Molecular Ecology, 3: 401-411.

88. Moritz, C., Dowling, T. E., Brown, W. M. (1987): Evolution of animal

mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics.

Annu. Rev. Ecol. Syst., 18: 269-292.

89. Moritz, C., Hillis, D. M. (1996): Molecular Systematics: Context and

Controverses. U: Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, str. 1-

13.

90. Mrakovčić, M., Kerovec, M. (1997): Slatkovodne ribe i kružnouste

Hrvatske. Športski ribolov, 2: 14-16.

91. Mrakovčić, M., Mišetić, S., (1989): Status, distribution and conservation

of the salmonid Salmothymus obtusirostris (Heckel) and the cyprind

Aulopyge hugeli (Heckel) in Yugoslavia. Journal of fish biology, 37A:

241 – 242.

92. Mrakovčić, M., Mišetić, S., Povž, M. (1995): Status od freshwater fish in

Croatian Adriatic river system. Biological Conservation, 72: 179 – 185.

93. Neave, F. (1958): The orgin and speciation of Oncorhynchus.

Transactions of the Royal Society of Canada, Series 3, 52, (5): 25 –

49.

94. Nei, M. (1972): Genetic distance between populations. American

Naturalist, 106: 283-292.

95. Nei, M. (1987): Molecular Evolutionary Genetic. Columbia University

Press, New York.

96. Nei, M., Tajima, F. (1981): DNA polymorphism detectable by restriction

endonucleases. Genetics, 105: 207-217.

97. Nicholas, F. W. (1996): Introduction to Veterinary Genetics. Oxford

University Press.

98. Norden, C. R. (1961): Comparative osteology of representative

salmonid fishes, with particular reference to the grayling (Thymallus

arcticus) and its phylogeny. J. Fish. Res. Bd. Can., 8: 679-791.

99. O’Reilly, P. T., Hamilton, L. C., McConnell, S. K., Wright, J. M. (1996).

Rapid analysis of gnenetic variation in Atlantic salmon (Salmo salar) by

131

PCR mutiplexing of dinucleotide and tetranucleotide microsatellites.

Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 53: 2292-2298.

100. Oakley, T. H., Phillips, R. B. (1999): Phylogeny of salmonine fishes

based on growth hormone introns: Atlantic (Salmo) and Pacific

(Oncorhynchus) salmon are not sister taxa. Molecular Phylogenetics

and Evolution, 11: 381 – 393.

101. Ohno, S. (1970): Evolution by Gene Duplication. Springer Verlang,

Berlin

102. Ohno, S. (1974): Chordata 1: Protochordata. Cyclostomata, and

Pisces. Animal Cytogenetics, Gebruder – Borntrage, Berlin, 4: 1 – 92.

103. Osinov, A. G. (1999): Salmonid fishes of the genera Salmo, Parasalmo

and Oncorhynchus: genetic divergence, phylogeny, and classification.

Journal of Ichthyology, 39: 571 – 587.

104. Osinov, A. G., Lebedev, V. S. (2000): Genetic divergece and

phylogeny of the Salmoninae based on allozyme data. Journal of Fish

Biology, 57: 354-381.

105. Oxnard, C. E. (1078): One biologist’s view of morphometrics. Ann. Rev.

Ecol. Syst., 9: 219-214.

106. Page, R. D. M., Holmes, E. C. (1998): Molecular evolution, A

Phylogenetic Approach. Blackwell Science, Oxford.

107. Palumbi, S. R., Baker, C. S. (1994): Contrasting population structure

form nuclear intron sequences and mtDNA of humpback whales.

Molecular Biology and Evolution, 11: 426-435.

108. Park, L. K:, Morgan, P. (1994): Developments in molecular genetic

technique in fisheries. Review of Fish Biology and Fisheries, 4: 272 –

279.

109. Perez, J., Martinez, J. L., Moran, P., Beall, E., Garcia-Vazquez, E.

(1999): Indentification of Atlantic salmon x brown trout hybrids with a

nuclear marker useful for evolutionary studies. Journal of Fish Biology,

54: 460-464.

110. Phillips, R. P., Oakley, T. H. (1997): Phylogenic relationship among the

Salmonidae Based on Nuclear and Mitochondrial DNA Sequences.

132

Molecular systematics of fishes, San Diego, Academic Press: 145 –

162.

111. Phillips, R.,B., Matsuoka, M., P., Konon, I., Reed, K, M. (2000):

Phylogenetic analysis of mitochondrial and nuclear sequences

supports inclusion of Acantholingua ohridana in the genus Salmo.

Copeia, 2: 546-550.

112. Pipas, J. C., Bulow, F. J. (1998): Hybridization between redeye bass

and smallmouth bass in Tennessee Streams. Tran. Am. Fish. Soc,

127: 141-146.

113. Popović, J. (1985): Zaštitimo naše endemične vrste riba. Ribarstvo

Jugoslavije, 40: 92-93.

114. Poteaux, C. (1995): Interactions Genetiques entre formes sauvages et

formes domestiques chez la truite commune (Salmo trutta fario L.).

Dokt. Dis, Universite Montpellier II, Montpellier: 110.

115. Poteaux, C., Bonhomme, F., Berrebi, P. (1999): Microsatellite

polymorphism and genetic impact of restocking in Mediterranean

brown trout (Salmo trutta L.). Heredity, 82 (6): 645-653.

116. Povž, M., Jesenšek, D., Berrebi, P., Crivelli, A. J. (1996): Soška pastrv

Salmo trutta marmoratus, Cuvier 1817, v porečju Soče v Sloveniji.

Zaštitni nacrt.

117. Presa, P. i Guyomard, R. (1996): Conservation of microsatellites in

three species of salmonids. Journal of Fish Biology, 49: 1326 – 1329.

118. Queller, D. C., Strassmann, J. E., Hughes, C. R. (1993): Microsatellites

and kinship. Trends in Ecology and Evolution, 8/8: 285 – 288.

119. Razpet, A., Jug, T., Sušnik, S., Dovč, P., Snoj, A. (2003): Molecular

evidence of natural hybridisation between Salmo obtusirostirs and

Salmo trutta in the river Neretva. 3rd congress of the genetic society of

Slovenia, Bled, 31. svibanj – 4. lipanj, 2003, Zbornik sažetaka: 54-55.

120. Rhymer, J. M., Simberloff, D. (1993): Hiybids and hybrid zones:

historical perspective. U: Hybrid Zones and the Evolutionary Process

(Harrison, R. G., urednik). Oxford University Press, str.: 3-12.

121. Rice, W. R. (1989): Analyzing tables of statistical tests. Evolution, 43:

223-225.

133

122. Rieseberg, L, H. (1998): Moelcular ecology of hybridization. U:

Advances in Molecular Ecology (urednik: Carvalho, G. R.). IOS Press,

Amsterdam, str.: 243-265.

123. Sakamoto, T., Okamoto, N., Ikeda, Y., Nakamura, Y., Sato, T. (1994):

Dinucleotide-repeat polymorphism in DNA of rainbow trout and its

application in fisheries science. Journal of Fish Biology, 44: 1093-1096.

124. Saunders, R. L., Schom, C. B. (1985): Importance of the vaiation in the

life history parameters of atlantic salmon (Salmo salar). Canadian

Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 42: 625-618.

125. Schlötterer, C. (1998): Microsatellites. U: Molecular Genetic Analysis of

Populations, 2. izd. (Hoelzel, A. R., urednik). Oxford University Press.

str.: 237 – 261.

126. Schlötterer, C., Pemberton, J. (1994): Molecular Ecology and

Evolution: Approaches and Applications, Birkhauer Verlag Basel,

Switzerland, str.: 203 – 113.

127. Schlötterer, C., Tautz, D. (1992): Slippage synthesis of simple

sequence DNA. Nucleic Acids Research 20: 211 – 215.

128. Schmidt, D. Y. (1947): Migrations of Fishes. USSR Academy of

Sciences, Leningrad.

129. Schneider, S., Roessli, D., Excoffier, L. (2000): Arlequin ver. 2.000: A

software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry

Laboratory, University of Geneva, Switzerland.

130. Shaposhnikova, G. C. (1975): Systematics relation of some

representatives of the familiy Salmonidae. Ichthyologia, 7 (1): 61-70.

131. Shedlock, A. M., Parker, J. D., Crispin, D. A., Pietsch, T. W., Burmer,

G. C. (1992): Evolution of the salmonid mitochondrial control region.

Molecular phylogenetics and evolution, 1, 3: 179 – 192.

132. Simon, R. C., (1963): Chromosome morphology and species evolution

in the five North American species of Pacific salmon (Oncorhynchus).

Jour. Morphol. 112 (1): 77-95.

133. Slatkin, M. (1995): A measure of population subdivision based on

microsatellite allele frequencies. Genetics, 139 (3): 1463.

134. Slettan, A. (1995): GenBank Acc. no. Z49134.

134

135. Smith, G. R. (1992): Introgression in fishes – significance for

paleontology, cladistics, and evolutionary rates. Syst. Biol., 41: 41-57.

136. Smith, G. R., Swirydczuk, K., Kimmel, P. G., Wilkinson, B. H. (1982):

Fish biostratiography of late Miocene to Pleistocene sediments of the

western Snake River plain, Idaho. Cenizoc Geology of Idaho. IBMG

Bulletin 26, str.: 519 – 541.

137. Snoj, A. (1997): Molekularno biološka karakterizacija soške postrvi

(Salmo marmoratus, Cuvier 1817). Dokt. Dis, Domžale, Oddelek za

zootehniko: 7 – 9.

138. Snoj, A. (2001): Preservation biology: a case of preserving Marble

trout. Winter School in Molecular Genetics, Lecture notes.

139. Snoj, A. (2003): Molecular phylogeny of "arhaic trouts" and their

taxonomic classification. 3rd congress of the genetic society of

Slovenia, Bled, 31. svibanj – 4. lipanj, 2003, Zbornik sažetaka: 73-74.

140. Snoj, A., Marčeta, B., Sušnik ,S., Melkič, E., Meglič, V., Dovč, P.

(2002a): The taxonomic status of the sea trout from the north Adriatic

Sea, as revealed by mitochondrial and nuclear DNA analysis. Journal

of Biogeography, 29: 1179-1185.

141. Snoj, A., Melkič, E., Sušnik, S., Muhamedagić, S., Dovč, P. (2002b):

DNA phylogeny supports revised classification of Salmothymus

obtusirostris. Biological Journal of the Linnean Society, 77: 399 – 411.

142. Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. (1996): A set of new microstellite DNA

markers for Salmo marmoratus (Cuvire, 1817). Procedding of the 3rd

International Conference, Life Sciences 1996, Slovenija: 93-94.

143. Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. (1997): The first microsattelite DNA

marker for marble trout, BFRO001. Journal of Animal Sciences, 75:

1983.

144. Štambuk-Giljanovic, N. (2002.): Vode Cetine i njezina porječja.

Biblioteka Zavoda za javno zdravstvo Županije splitsko-dalmatinske,

Split.

145. Stanković, S. (1960): The Balkan lake Ohrid and its living world.

Monographiae biologicaea, 9, Den Haag.

135

146. Stearley, R. F., Smith, G. R. (1993): Phylogeny of the pacific trout and

salmons (Oncorhynchus) and genera of the family Salmonidae.

Transaction of the American Ficheries Society, 122: 1 – 33.

147. Stefanović, D. (1948): Rasna i ekološka ispitivanja na ohridskim

salmonidima. Srpska Akad. Nauka. Kn. CXXXIX. Beograd.

148. Steindachner, F. (1882): Ichthyologische Beiträge (XII). Akad. Der

Wissenschaften, LXXXVI, Band I, Heft II: 75-78. Wien.

149. Stepien, C. A., Kocher, T. D. (1997): Molecul and morphology in studes

of fish evolution. U: Molecular systematics of fishes, (Kocher, T. D.,

Stepien, C. A., urednici), Academic Press, str.: 1 – 11.

150. Strachan, T., Read, A. P. (1996): Human Molecular Genetics. Bios

Scientific Publication, Oxford.

151. Stryer, L. (1995): Biochemistry, 4 th Ed Rerrman, New York.

152. Sušnik, S. (2001): Polimorfize kromosomske in mitohondrijske DNA

lipna (Thymallus thymallus) in filogenetski odnosi med njegovimi

geografsko ločenim populacijami. Dokt. Dis, Domžale, Oddelek za

zootehniko: 13–15.

153. Sušnik, S., Snoj, A., Dovč, P. (2001): Evolutionary distinctness of

grayling (Thymallus thymallus) inhabiting the Adriatic river system, as

based on mtDNA variation. Biological Journal of the Linnean Society,

74: 375-385.

154. Sušnik, S., Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. (1997): The microsatellite

marker (BFRO002) characteristic for different geographically remote

brown trout, Salmo trutta L., populations. Animal Genetics, 28: 370-

383.

155. Svärdson, G. (1945): Chromosome studies on Salmonidae. Report of

the institute of Freshwater Fisheries Research, Drottningholm 23: 1 –

151.

156. Taberlet, P. (1999): Noninvasive genetic sampling: look before you

leap. Trend Ecol. Evol., 14: 323-327.

157. Taler, Z. (1951): Mekousne. Slatkovodno ribarstvo Jugoslavije, 3: 60 -

64.

158. Taler, Z. (1952): Problem reke Bune. Ribarstvo Jugoslavije. 7: 11-12.

136

159. Taler, Z. (1953): Znamenite i osobite ribe u Bosni i Hercegovini.

Ribarski list, 28: 4.

160. Taler, Z. (1954): Mekousna. Ribarski list, 29: 1.

161. Tave D. (1993): Genetics for Fish Hatchery Managers. AVI Book, New

York, str.: 415.

162. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins,

D. G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for

multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic

Acids Research, 24: 4876-4882.

163. Treer, T., Aničić, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003a): Note on the

growth of endemic soft-muzzled trout Salmothymus obtusirostris

translocated into a Dalmatian river. Biologia, Bratislava, Section

Zoology, 58 (5): 999-1001.

164. Treer, T., Aničić, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003b): Growth and

condition of endemic trout Salmothymus obutusirostris in a Dalmatian

river Jadro. 4th World Fisheries Conference, Vancouver.

165. Treer, T., Safner, R., Aničić, I., Kolak, A., Dražić, M. (2000):

Morphological variation among four strains of common carp Cyprinus

carpio in Croatia. Folia Zoologica 49 (1): 69 – 74.

166. Treer, T., Safner, R., Aničić, I., Lovrinov, M. (1995): Ribarstvo,

Nakladni zavod Globus, Zagreb.

167. Utter, F. M., Seeb, J. E. (1990): Genetic marking of fishes: overview

focusing on protein variation. American Fisheries Society Symposium,

7: 426 – 438.

168. Verspoor, E. (1988): Widespread hybridization between Atlantic

salmon, Salmo salar and brown trout, Salmo trutta, in eastern

Newfoundland. Journal of Fish Biology, 32: 327-334.

169. Vida, G. (1994): Global issues of genetic diversity. U: Conservation

genetics (urednici: Loeschecke, V., Tomiukm J., Jain, S. K.).

Birkhauser Verlag.

170. Vladykov, V. D. (1963): A review of salmonid genera and their broad

geographical distribution. Transactions of the Royal Society of Canada,

Series IV, Section III, 1: 459 – 504.

137

171. Vuković, T., Ivanović, B. (1971): Slatkovodne ribe Jugoslavije

(Freshwater fish of Yugoslavia). Zemaljski muzej BIH, Sarajevo, str.:

115.

172. Waples, R. S. (1991): Genetic risk associated with supplementation of

Pacific salmonids: Captive brodstock programs. Canadian Journal of

Fisheries and Aquatic Sciences, 51: 310-329.

173. Weir, B. S., Cockerham, C. C. (1984): Estimating F-statistics for the

analysis of population structure. Evolution, 38: 1358-1370.

174. Wheeler, A. (1992): Freshwater fishes of Britain and Europe. Rainbow

Books, London: 54 - 55.

175. White, P. S., Densmore, III L. D. (1992): Mitochondrial DNA isolation.

V: A molecular genetic analysis of population. A practical approach.

New York, Oxford University press, str.: 37 – 43.

176. Wilson, C. C., Hebert, P. D. N. (1993): Natural hybridization between

arctic charr (Salvelinus alpinus) and lake trout (S. namaycush) in the

canadian arctic. Canadian Journal of Fisheries & Aquatic Sciences, 50,

12: 2652-2658.

177. Wright, S. (1951): The genetical structure of populations. Annals of

Eugenics, 15: 323-354.

178. Zhang, D., Hewitt, G. (1996): Nuclear integrations: challenges for

mitochondrial DNA markers. Tree, 11, 6: 247 – 252.

138

7. SAŽETAK

Mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostris salonitana) je endemska

pastrva sa izvornim staništem u rijeci Jadro, pokraj Splita. Dio populacije

naknadno je prebačen i u rijeku Žrnovnicu, gdje i danas obitava. Pripada u

porodicu Salmonidae. Kao i ostale podvrste roda Salmothymus, ograničena je

na usko područje rasprostranjenja, te i najmanji utjecaji na njeno stanište

imaju veliko djelovanje na malu populaciju.

Budući da je osnovni cilj našeg rada bio pronaći i opisati genetske

razlike između mekousnih pastrva S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus i

potočne pastrve (Salmo trutta), prikupili smo uzorke triju populacija mekousne

pastrve koje obitavaju u rijekama jadranskog sliva (Jadro, Žrnovnica i

Neretva), te dviju populacija potočne pastrve, koje pripadaju jadranskim

linijama pastrva (Krka i Zrmanja).

Sadašnje populacije mekousnih pastrva su vrlo male i neprestano

bivaju ugrožene od mnogih faktora. Zbog toga smo mogli analizirati mali broj

uzoraka. Svjesni smo da zaključci izvedeni nakon analize malog broja

uzoraka nisu statistički opravdani, no unatoč tome, oni su zanimljivi i temelj su

za nove rasprave i istraživanja. Dobivene rezultate stavili smo u odnos s

ranije istraženim linijama i vrstama pastrva, u oblik filogenetskog stabla.

Na području gdje zajedno žive često je postojanje hibrida između

potočne i mekousne pastrve. Prepoznati hibride vrlo je teško, stoga su uz

morfološke, korištene i molekularne metode razlikovanja populacija.

Uspoređujući morfološke osobine mekousne pastrve iz rijeke Jadro s

mekousnom pastrvom iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), uočili smo mnoge

zajedničke osobine i niz vidnih razlika. To ukazuje na njihovo zajedničko

srodstvo, kao i na posljedice prostorne i ekološke izolacije.

139

Pomoću genetskih markera i statističke analize pokušali smo definirati

strukturu populacije endemske mekousne pastrve iz rijeka Jadro i Žrnovnice

(S. o. salonitana).

Razlikovanje genetske varijabilnosti provedeno je na nivou

deoksiribonukleinske kiseline (DNA), pri čemu su upotrebljena dva različita

genetska sistema: mitohondrijska DNA, koja je jedan od najprimjenjenijih

alata za molekularno genetske i populacijske studije, te mikrosatelitska DNA,

koja zbog svoje lokusne specifične hipervarijabilnosti predstavlja odličan

molekularni alat, sa kojim je moguće utvrditi razlike na nivou roda, ali i nižih

taksonomskih jedinca.

Analizom uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i Žrnovnice, ustanovili smo

da uzorci dijele isti haplotip (ZRN), što je razumljivo budući da je populacija

mekousne pastve u rijeci Žrnovnici nastala odvajanjem dijela jedinki iz Jadra

prije 25 godina. Haplotip ZRN je prvi genetski marker koji opisuje populaciju

mekousne pastrve iz rijeka Jadro i Žrnovnice.

Populacije iz rijeka Jadro i Žrnovnice međusobno se znatno ne

razlikuju, a manjak polimorfizma u populaciji mekousne pastrve u rijeci

Žrnovnici posljedica je rekolonizacije s populacijom male efektivne veličine.

Analizom mikrosatelitiskih lokusa uočeno je da populacije mekousnih

pastrva iz Jadra i Žrnovnice imaju određen broj zajedničkih alela s potočnom

pastrvom. Analizom su utvrđena tri uzorka mekousne pastrve iz rijeke Jadro,

koja dijele zajedničke alele s potočnom pastrvom. Upravo ti uzorci smatramo

da su hibridi između mekousne i potočne pastrve.

Alele koji su značajni za populacije mekousne pastrve u Jadru i

Žrnovnici pronašli smo u populaciji mekousne pastrve u rijeci Neretvi.

Zajedničke alele kod tih populacija tumačimo kao posljedicu istosmjernih

mutacija, te kao ostatak zajedničkog, davnog polimorfizma.

Analizirajući podvrstu S. o. salonitana, rezultati bazirani na

mitohondrijskoj DNA razlikuju se od onih dobivenih analizom nuklearne DNA.

140

Na osnovu podataka sekvencioniranja od citokroma b i kontrolne regije,

podvrste S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus, znatno se razlikuju, no sa druge

strane S. o. salonitana pokazuje izuzetnu sličnost sa populacijom S. trutta

(jadranske filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. Sa

obzirom na te rezultate S. o. salonitana bila bi smještena sa S. trutta kao

njezina posebna linija.

Sekvencioniranjem gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod uzoraka

mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke Neretve, uočili smo da nema

varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci između njih, odnosno nađena je

100% identičnost nukleotida. Takav konflikt između podataka dobivenih od

mtDNA i nuklearne DNA je ranije zabilježen kod salmonidnih riba, što je

moguće da u ovom slučaju ukazuje na polifiletsko porijeklo podvrste S. o.

salonitana. Smatramo da je podvrsta S. o. salonitana vjerojatno nastala kao

posljedica davne hibridizacije početnog oblika S. o. oxyrhynchus i naprednije

S. trutta, koja je kolonizirala rijeke Jadranskog sliva mnogo kasnije.

141

8. SUMMARY

Endemic soft-muzzled trout (Salmothymus obtusirostris salonitana) inhabit

the Jadro River, near Split. Part of the population has been translocated to the

Žrnovnica River and belongs to the Salmonidae family, genus Salmothymus.

It has a very restricted distribution, so any interference with its habitat has a

negative influence on this small population.

The objective of our work was to find and describe genetic differences

between soft-muzzled trout (S. o. salonitana and S. o. oxyrhynchus) and

brown trout (Salmo trutta). Therefore, we collected samples of three

populations of soft-muzzled trout that inhabit the Adriatic rivers (Jadro,

Žrnovnica and Neretva), and two populations of brown trout (Krka and

Zrmanja).

Because the populations of soft-muzzled trout are very small and are

endangered by many factors, we were able to analyze only a small number of

samples. Hence, we are aware that our conclusions are not statistically

significant, but despite that, the results are interesting and may serve as a

base for new discussions and research. We have compared our results with

literature data from other authors in the phylogenetic tree form.

Hybrids are common in the area where brown and soft-muzzled trout

live together. It is very difficult to recognize them, so in addition to

morphological methods we have also used molecular methods to distinguish

populations.

In comparing morphological characteristics of soft-muzzled trout from

the Jadro River and soft-muzzled trout from the Neretva River (S. o.

oxyrhynchus), we have found many similarities but also many differences.

This is the result of their mutual relationship and also the result of the area

they cover in terms of space and ecological isolation.

We used genetic markers and statistical analysis to define the

population structure of soft-muzzled trout (S. o. salonitana) found in the Jadro

and Žrnovnica Rivers.

Distinction of genetic variability has been done at the DNA level. We

have used two different genetic systems: mitochondrial DNA (one of the most

142

useful tools for molecular-genetic and population studies), and microsatellite

DNA, (which, because of its locus specific hyper variability is an excellent

molecular tool for determining differences at the general level as well as on

smaller taxon units).

In analyzing S. o. salonitana samples from the Jadro and Žrnovnica

Rivers we have learned that those samples share the same haplotype (ZRN).

This is understandable because soft-muzzled trout populations from the

Žrnovnica River are the result of separation from a part of the population from

the Jadro River 25 years ago. Haplotype ZRN is the first genetic marker that

describes the population of soft-muzzled trout population from the Jadro and

Žrnovnica Rivers.

There are no significant differences between the populations of soft-

muzzled trout from the Jadro River and those from the Žrnovnica River. The

lack of polymorphism in soft-muzzled trout populations from the Žrnovnica

River is the result of recolonization with small-sized but effective populations.

By analyzing microsatellite locuses, we have determined the number of

shared alleles between the soft-muzzled trout populations from the Jadro and

Žrnovnica Rivers and the brown trout population. The samples with shared

alleles are the hybrids between the soft-muzzled and the brown trout. We

concluded that the presence of mutual alleles was the result of an crossing

between these two species and of mutual mutation.

The important alleles for soft-muzzled trout populations from the Jadro

and Žrnovnica Rivers have also been found in soft-muzzled trout populations

from the Neretva River. We believe the shared alleles from those populations

result from mutual mutations and from the remains of mutual, ancient

polymorphism.

While analyzing the subspecies S. o. salonitana, the results based on

mitochondrial DNA proved to be different from those obtained from nuclear

DNA.

The results of cytochrome b gene and control region of mtDNA

sequencing showed that there are many differences between the subspecies

S. o. salonitana and S. o. oxyrhynchus. On the other hand, S. o. salonitana

shows great similarity with S. trutta population (Adriatic phylogenetic line)

which as Salmothymus, inhabits the same river.

143

Those results taken into consideration, S. o. salonitana should be

positioned with S. trutta as its special line.

Sequencing (LDH)-C1* gene in the samples from the Jadro and

Neretva Rivers, the analyzed sequence showed no variable spots; moreover,

a 100% nucleotide identity was found.

This data conflict between mtDNA and nuclear DNA was documented

previously with salmonid fishes. It is possible that in this case it reflects the

polyphyletic origin of subspecies S. o. salonitana. We think that the

subspecies S. o. salonitana was the result of an ancient hybridisation of the

initial form of S. o. oxyrhynchus and advanced S. trutta that colonized the

Adriatic rivers much later.

144

9. ŽIVOTOPIS

Tea Odak rođena je 28. 12. 1974. godine u Splitu, gdje je završila osnovnu

i srednju školu. Godine 1993. upisala se na Agronomski fakultet u Zagrebu,

gdje je 2000. obranila diplomski rad.

Od 2000. stalno je zaposlena na Zavodu za ribarstvo, pčelarstvo i

specijalnu zoologiju pri Agronomskom fakultetu, gdje upisuje i poslijediplomski

studij iz Ribarstva.

Kao asistent aktivno sudjeluje u nastavi na predmetima zoologije,

hidroekologije, ihtiologije, ribarstva i lovstva.

Posjetila je mnoge znanstvene institucije u Češkoj, Mađarskoj, Poljskoj,

Sloveniji i Kini, sudjelovala je na stručnim i znanstvenim skupovima.

145

Popis radova:

Odak, T., Treer, T. (2000): Pregled istraživanja vodenih makrofita u

Hrvatskoj. Ribarstvo, 58 (3), 101-109.

Safner R., Treer T., Aničić M., Piria M., Odak T. (2001): Ribolovno-

gospodarska osnova ŠRU ZRD Zagreb. Agronomski fakultet, Zagreb, 38.

Piria, M., Treer, T., Safner, R., Aničić, I. & Odak, T. (2001): Metodika

istraživanja prirodne prehrane slatkovodnih riba. 37. znanstveni skup

Hrvatskih agronoma. Opatija, 19.-23. veljače, 2001. Zbornik sažetaka.

Piria, M., Treer, T., Safner, R., Aničić, I. & Odak, T. (2001): Metodika

istraživanja prirodne prehrane slatkovodnih riba. Ribarstvo, 59 (1), 9-23.

Treer, T., Odak, T., Safner, R., Aničić, I., Piria, M. & Kolak, A. (2001):

Biološka raznolikost u hrvatskom slatkovodnom ribarstvu. HAZU, Biološka

raznolikost u stočarstvu republike Hrvatske, 18.-19. rujna, Zbornik radova,

131-139.

Odak, T., Treer, T., Aničić, I., Safner, R. & Piria, M. (2002): The use of

molecular methods in fisheries. I. Hrvatski kongres za molekularne

bioznanosti uz međunarodno sudjelovanje, 9.-13 June, Opatija, Zbornik

sažetaka.

Odak, T., Treer, T., Aničić, I., Safner, R., Piria, M. (2002): Primjena

molekularnih metoda u ribarstvu. Ribarstvo, 60 (3), 116-126.

Treer, T., Safner, R., Aničić, I., Piria, M. & Odak, T. (2002): The introduction

of the fish from the Danube area into the Mediterranean Vransko lake,

Croatia. EIFAC, Symposium on inland fisheries management and the

aquatic environment “The Effect of Fisheries Management on Freshwater

Ecosystems”. Windermere, United Kingdom, 12-15 June.

Debeljak, Lj., Fašaić, K., Odak, T. (2002): Djelovanje vodnih makrofita na

proizvodnju šarana. III. Nacionalno znanstveno-stručno savjetovanje s

međunarodnim sudjelovanjem, 20.-21. lipnja, 2002., Bizovac, Zbornik

sažetaka.

146

Snoj, A., Sušnik, S., Odak, T., Safner, R., Dovč, P. (2003): Phylogenetic

relationship between two subspecies of soft-mouth trout: Salmothymus

obtusirostris oxyrhynchus and S. obtusirostris salonitana. Plant and

genomes XI conference, 11.-15. Siječanj, 2003., San Diego, CA, Zbornik

sažetaka.

Odak, T., Treer, T., Safner, R., Aničić, I., Piria, M. (2003): Mekousna pastrva

(Salmothymus obtusirostris salonitana) u rijeci Žrnovnici. 38. znanstveni

skup Hrvatskih agronoma. Opatija, 19.-21. veljače, 2001., Zbornik

sažetaka.

Treer, T., Varga, B., Safner, R., Aničić, I., Piria, M., Odak, T. (2003): Growth

of the common carp (Cyprinus carpio) introduced into the Mediterranean

Vransko Lake. J. Appl. Ichthyol., 19, 1-5.

Debeljak, Lj., Fašaić. K., Odak, T. (2003): Relations between the

developmnet of submersed macrophytes and carp production in fishponds.

Bulletin VURH Vodnany, 4, 175-180.

Bakota, R., Treer, T., Odak, T., Mrakovčić, M., Čaleta, M. (2003): Struktura i

kondicija ihtiofaune Lonjskog polja. Ribarstvo, 61 (1), 17-26.

Treer T., Aničić I., Safner R., Odak T., Piria M. (2003): Note on the growth of

endemic soft-muzzled trout Salmothymus obtusirostris translocated into a

Dalmatian river. Biologia, Bratislava, Section Zoology, 58 (5): 999-1001.

Treer, T., Aničić, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003): Growth and

condition of endemic trout Salmothymus obutusirostris in a Dalmatian river

Jadro. 4th World Fisheries Conference, Vancouver.

Treer, T., Opačak, A., Aničić, I., Safner, R., Piria, M., Odak, T. (2003): Growth

of bream, Abramis brama, in the Croatian section of the Danube. Czech J.

Anim. Sci., 48 (6), 251-256.

147

10. PRILOG

Prilog 1: Pregled mikrosatelitskih lokusa BFRO001, BFRO002, Ssa197,

Strutta24, Str591INRA, Strutta58, OmyFgt1TUF, SsoSL438 i StMS-LDH4.

Sa zvjezdicom su označeni uzorci na kojima su vršena morfometrijska

istraživanja.

BFRO001 BFRO002 Ssa197 Strutta24 Str591INRA Strutta58 OmyFgt1TUF SsoSL438

StMS-

LDH4

Jadro mekousna

J2 198/198 140/140 141/145 202/202 169/171 147/147 123/125 237/237

J3* 198/198 140/140 141/141 202/202 171/171 147/147 206/206 123/125 237/237

J4 198/198 140/140 141/141 202/202 171/171 147/147 206/206 237/237

J5 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 123/123 237/237

J6 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 237/237

J7* 198/198 140/140 145/145 202/202 171/173 147/147 206/206 123/123

J8 198/198 145/145 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 125/125 237/237

J9 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 237/237

J10 198/198 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/125 237/237

J11* 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 123/123 237/237

J12 198/198 140/140 145/145 202/206 171/173 147/147 206/206 123/123 237/237

J13 198/214 125/140 141/145 202/202 149/171 147/147 206/206 109/125 237/276

J14 198/198 140/140 145/145 202/202 147/147 206/206 125/125 237/237

J15 198/202 140/140 132/145 192/206 149/171 147/151 206/206 123/123 237/276

J16 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/123 237/237

J17 198/202 125/140 132/145 202/206 171/171 147/175 206/206 123/123 237/237

J18 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/123 237/237

Žrnovnica mekousna

Ž1 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/123 237/237

Ž4 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/123 237/237

Ž5 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 123/123 237/237

Ž6 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 111/123 237/237

Ž7 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 237/237

Ž9 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/111 237/237

Ž11 198/198 140/140 141/141 202/202 171/173 147/147 206/206 237/237

Ž12 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/125 237/237

Ž13 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/123 237/237

Ž14 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/111 237/237

Ž15 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/125 237/237

Ž17 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/123 237/237

Ž19 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/125 237/237

Ž20 198/198 140/140 141/145 202/206 171/171 147/147 206/206 111/125 237/237

Ž21 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/125 237/237

Ž22 198/198 140/140 145/145 202/206 171/171 147/147 206/206 125/125 237/237

Ž23 198/198 140/140 141/141 202/202 171/171 147/147 206/206 111/123 237/237 Krka potočna

K1 214/244 116/116 132/132 180/212 159/159 158/166 226/245 104/106 253/265

148

K2 238/242 116/116 132/154 208/224 159/171 166/168 104/106 253/253

K3 222/246 116/116 137/154 224/224 159/159 166/170 106/109 247/253

K4 222/242 116/116 132/154 212/218 159/183 158/166 218/226 96/106 253/253

K5 222/238 116/116 150/154 212/224 159/159 104/170 226/226 106/114 253/265

K6 242/242 116/116 154/159 224/224 171/183 166/166 226/226 247/253

K7 222/242 116/116 132/154 180/224 159/159 104/158 204/204 106/114 247/265

K8 222/246 116/116 154/211 220/220 183/193 145/166 218/226 106/109 253/265

K11 242/242 116/116 137/154 206/214 159/183 151/166 226/226 106/106 253/265

Krkic 2 222/242 116/116 132/156 214/222 149/159 145/175 104/114 253/253

Krkic 3 222/246 132/215 214/214 159/183 104/166 218/218 98/106 253/265

Zrmanja potočna

Zrm1 226/256 116/116 137/163 200/214 189/189 187/187 241/241 104/104 247/265

Zrm2 230/258 116/116 159/171 200/214 189/189 181/181 241/241 104/104 247/265

Zrm4 226/230 116/116 159/167 200/200 189/189 245/245 104/104 247/265

Zrm6 226/242 116/116 159/163 200/200 189/189 241/245 104/104 247/265

Neretva mekousna

MP3 206/206 131/131 155/175 176/176 171/171 93/93 206/206 116/120 237/237

MP6 206/206 135/135 175/179 176/176 159/171 91/95 206/206 116/120 237/245

MP8 206/206 133/137 159/179 176/196 171/173 206/206 118/120 245/245

MP9 206/206 133/137 145/175 176/176 159/171 91/93 206/206 116/120 237/245

MP12 206/206 131/133 175/183 176/176 171/171 93/93 206/206 237/237

MP13 206/206 135/135 179/183 172/178 171/171 93/93 206/206 111/116 237/245