Molekularna osnova procesa apoptoze

Ćelijska smrt

• Ćelijska smrt, zajedno sa rastom i diferencijacijom, predstavlja suštinski deo životnog ciklusa ćelije.

• Dnevno, u organizmu čoveka umire do 5% od ukupnog broja ćelija.

• Svaka osoba u toku jedne godine produkuje i uništi ćelijsku masu koja je jednaka težini sopstvenog tela.

• Homeostatska kontrola ćelijskog broja ostvaruje se putem dinamičkog balansa dva suprotna procesa – ćelijske deobe i ćelijske smrti

Apotoza

• 1972. godine

• Kerr

Vrste ćelijske smrti

AKCEDENTALNA ĆELIJSKA SMRT

• Fizički stimulusi (temperatura, visok pritisak,...)

• Hemijski stimulusi (jaki deterdženti, velike promene pH)

• Mehanički stimulusi

• Bez “uključenja” specifične molekularne mašinerije

REGULISANA ĆELIJSKA SMRT

• Uključivanje” specifične molekularne mašinerije

• (Post)embrionalni razvoj, tkivna homestaza, imunski odgovor

• Programirana ćelijska smrt (PCD)

Morfološka podela ćelijske smrti

• Morfološka podela ćelijske smrti neprecizna i “preklapajuća”

• Ćelijska smrt tip I – apoptoza

• Ćelijska smrt tip II – autofagija

• Ćelijska smrt tip III – nekroza

Ćelijska smrt tip III – nekroza

Ćelijska smrt tip II – autofagija

Ćelijska smrt tip I – apoptoza

• Morfološke i biohemijske karakteristike procesa apoptoze

Apoptoza

• Apoptoza je aktivan proces genski regulisane ćelijske autodestrukcije i u većini slučajeva služi homeostatskoj funkciji u fiziološkim uslovima – u održavanju tkivne homeostaze.

Apoptoza tokom embriogeneze

Apoptoza i imunski sistem

Apoptoza

• Porememećaji u procesu apoptoze uočeni u brojnim patološkim stanjima organizma

• Stimulacija ili inhibicija procesa apoptoze

• Starenje povezano sa inhibicijom procesa apoptoze

Apoptoza i maligne bolesti

• Narušavanje tkivne homeostaze

• Inhibicija procesa apoptoze

Stimulacija procesa apoptoze u patološkim stanjima organizma • Kardiovaskularne bolesti

• Infarkt miokarda

• Apoptoza i nekroza

• Virusne infekcije

• HIV virus - progresivno

umiranje CD4+ limfocita T

• Neurodegenerativne bolesti

• Parkinsonova bolest

• Alchajmerova bolest

• Erektivna disfunkcija

Apoptoza

• Evolutivno star fenomen od Arachea do čoveka

• 4.000.000.000 godina

• Asihrona pojava, brz proces, 4 sata

• C. elegans

Apoptoza

• Karakteristične morfološke promene koje se ispoljavaju bez obzira na vrstu tkiva ili okolnosti pod kojim je izazvana.

• Sereotip morfoloških promena bio je osnov za pretpostavku da u osnovi procesa apoptoze pre leže aktivni nego pasivni procesi.

Morfologija procesa apoptoze

Kondenzacijska faza

„Pupljenje“ plazma membrane

Kasna faza apoptoze

Fagocitoza apoptotskih tela

Fagocit

Apoptotska

tela NEKROZA APOPTOZA

Neizmenjena ćelija

Apoptoza versus nekroza Aktivan versus pasivan proces

Apoptoza versus Nekroza

Ćelijska smrt Apoptoza Nekroza

Intezitet impulsa

Slab Jak

Broj ćelija Pojedinačne Ogroman broj

Inflamacija Ne Da

Ožiljak Ne Da

Biohemijske karakteristike apoptoze

Inicijalna fragmentacija molekula DNK u okviru hromtinskih petlji na fragmente

veličine od 50–300 kb

Biohemijske karakteristike apoptoze

• Fragmentacija DNK na fragmente od 180 bp

• Nekrozu karakteriše nasumična fragmentacija molekula DNK

Biohemijske karakteristike apoptoze

• Endonukleaza koja vrši internukleozomalnu fragmentaciju molekula DNK nije još purifikovana i potpuno karakterizovana.

Biohemijske karakteristike apoptoze

• Umiruće ćeluje daju signal “eat me” kao što je fosfatidil serin (PS) na ćelijskoj površini.

Detekcija apoptotskih ćelija

Molekularna osnova apoptoze

Indukcija procesa apoptoze

• Ekstraćelijski signali i unutarćelijski signali (stres)

Indukcija procesa apoptoze ekstraćelijskim signalima

• Receptori smrti • Familija TNFR (eng. tumour

necrosis factor receptor) • Najistraživaniji FAS-Rc (CD 95)

Indukcija procesa apoptoze ekstraćelijskim signalima

• Fas receptor poseduje domene smrti DD

• Domen smrti sadržajući protein FADD takođe poseduju domene smrti DD

• FADD proteini sadrže i DED (efektorne domene smrti)

• Ovi DED, interaguju sa sebi

homologim DED

enzima kaspaze 8.

• DISC kompleks

(eng. Death Inducing

Signaling Complex)

Indukcija procesa apoptoze unutarćelijskim signalima

• Unutarćelijski signali smrti najčešće se aktiviraju kao odgovor ćelije na prisustvo stresa različite prirode.

Egzekutorna (izvršna) faza procesa apoptoze

• Bez obzira na vrstu stimulusa, ključni događaj tokom procesa apoptoze predstavlja kaskadna reakcija proteolitičke aktivacije enzima cistein proteaza – kaspaza.

Kaspaze

• Kaspaze su aspartat specifične cistein proteaze

• Po svojoj biološkoj ulozi:

• subfamilija inflamatornih kaspaze (kaspaze 13,5,4,1), i

• subfamilija apoptotskih kaspaza (7,3,6,8,10,2,9)

Kaspaze

• Sve kaspaze sintetišu se u formi proenzima (zimogena)

• Poseduju tri domena

- N – terminali prodomen različite dužine

- velika subjedinica od 20 kDa (p20)

- mala subjedinica od 10 kDa (p10)

Kaspaze

• Aktiviraju se proteolitičkim mehanizmom koji prvo razdvaja (na mestu aspartata), veću (p20) od manje (p10) subjedinice.

• U formiranom dimeru p20/p10, dolazi do razdvajanja velike subjedinice (p20) od prodomena.

Kaspaze

• Finiš aktivacije kaspaza predstavlja povezivanje dva heterodimera u aktivni tetramer koji sa dva aktivna mesta svoju proteolitičku aktivnost ispoljavaju na većem broju proteina

Substrati aktiviranih kaspaza

• Proteini jedarne lamine, proteini jedarnog matriksa, različite komponente citoskleta (aktin i aktin vezujući proteini kao što su gelsolin i fodrin), protein Rb, histon H1, protein kinaza C, endonukleaze....

Kaspaze su efektori apoptoze

Prirodni inhibitori apoptoze

• U sisarskim ćelijama dokazano je prisustvo prirodnih inhibitora kaspaza IAP (eng. inhibitors of apoptosis proteins).

Apoptoza izazvana unutarćelijskim signalima nezavisna od kaspaza

• Endonukleaza G (EndoG) i apoptosis-inducing factor (AIF) primarno lokalizovani u mitohondrijama prelaze u jedro i vrši fragmentaciju molekula DNK.

Modulatori apoptoze

INDUKTORI

EFEKTORI

MODULATORI

APOPTOZA

Familija Bcl 2

p53

Protein Bcl 2

• BCL 2 (eng. B-cell leukemia/lymphoma 2) • Bcl 2 je intracelularni, 26kDa težak membranski protein,

lokalizovan u membranama mitohondrija, ER i u spoljašnjoj membrani jedarnog ovoja.

Protein Bax

• Kao ko-imunoprecipitat proteina Bcl 2, prvo otkriveni homolog bio je protein Bax (eng. Bcl 2 - associated X).

• 21 kDa težak protein pretežno lociran u citoplazmi.

• Kod čoveka do sada je otkriveno 25 članova familije Bcl 2.

Bcl 2 famiija proteina

• Svi članovi familije proteina Bcl 2 sadrže najmanje 1 od 4 visoko konzervirana Bcl 2 homologa domena - BH domeni.

• Većina antiapoptotskih članova familije proteina Bcl 2, sadrže sva četiri homologa domena (BH1-BH4).

• Proapoptotski članovi su raspoređeni u dve subfamilije – Bax subfamilija (Bax i Bak) i “BH3 – only proteins”

BH domeni

• Bcl 2 homologi domeni odgovorni su za procese homodimerizacije i heterodimerizacije članova Bcl 2 familije proteina.

• Zahvaljujući ovim domenima, heterodimere formiraju i proteini sa suprotnim dejstvom na proces apoptoze.

Protein Bax

• Homodimeri Bax-a formiraju kanale na membrani mitohondrije.

• Ovu osobinu imaju i neki drugi članovi familije proteina Bcl 2 kao što je protein Bak.

• Bax i Bak zbog sposobnosti formiranja kanala spadaju u proapototske članove Bcl 2 familije proteina.

Apoptozom

• Citohrom C - ključni aktivator izvršne faze procesa apoptoze (Apaf 2)

• Adapterski protein Apaf 1 (eng. apoptotic protease activating factor 1)

• Prokaspaza 9 – Apaf 3

Apoptozom

• Proteinsku interakciju Apaf 1 i Apaf 3 molekula omogućuju njihove homologe sekvence nazvane CARD (eng. caspase recruitment domains).

• U odsustvu citohroma C, interakcija je blokirana strukturnom konformacijom molekula Apaf 1.

Protein Bcl 2

• Biološka uloga proteina Bcl 2 je heterodimerizaciona inaktivacija formiranja dimera proteina Bax

Protein Bcl-X

• Alternativnom obradom primarnog transkripta ovog gena moguće je dobiti 2 različita molekula iRNK.

• Protein Bcl-Xl je strukturno i funkcionalno sličan proteinu Bcl 2 (antiapototski).

• Protein Bcl-Xs u heterodimernoj kombinaciji sa proteinom Bcl 2 funkcioniše kao dominantni inhibitor ovog proteina (proapototski).

Protein Bad

• Protein Bad, kao i neki drugi proapoptotski članovi Bcl 2 familije proteina (NOXA, npr.) svoje biološko dejstvo ispoljavaju heterodimerizacionom inaktivacijom antiapoptotskih članova iste familije (Bcl 2, Bcl-Xl,...).

Ćelijski reostat

Protein p53

• Otkriven 1979.g. kao ko-imunoprecipitat T Ag u SV 40 transformišućim ćelijama

• 10 godina smatran onkogenom

• 1993. godine časopis SCIENCE “Molecule of the Year”

Gen TP 53

• Gena 20 kb dug na 17. hr od 11 egzona

• Poseduje tri promotora – jedan uzvodno od prvog egzona, drugi koji se nalazi u okviru prvog introna i treći u okviru introna 4.

• Preko 15 regulatornih proteina transkripcije reguliše ekpresiju gena p53.

Protein p53

• Regulatorni protein transkripcije

• 375ak; 53kDa

• Aktivacija se ili fosforilacijom ili raskidanjem heterodimera sa proteinom Mdm 2 (E3 Ubikvitin logaza)

Uloga proteina p53 u procesu apoptoze

• Učestvuje u regulaciji ekspresije proapototskih gen (PUMA, NOXA, Bax, itd...)

• Direktna interakcija sa proteinom Bcl-Xl favorizuje homodimerizaciju proteina Bax.

Sledi... Molekularna biologija maligne ćelije