Upload
dangthu
View
290
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
MOLEKULARNA MOLEKULARNA BIOLOGIJABIOLOGIJA
Doc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićIInstitut za biologiju i ekologijunstitut za biologiju i ekologijuPPrirodnorirodno--matematički fakultetmatematički fakultet
UUniverzitet u Kragujevcuniverzitet u Kragujevcu
MOLEKULARNA BIOLOGIJAMOLEKULARNA BIOLOGIJACILJ: objašnjenje molekularnih osnova vitalnih procesa; šta je suština života?Početak razvoja MB je 30-tih godina XX veka (M. Delbrik)1953.-1963. godine – “dogmatski period”
Dž. Votson, F. Krik, Ž. MonoPrincip redukcionizma, in vitro eksperimentiDanas – pročitan humani genom; genetičko inženjerstvo; Danas – pročitan humani genom; genetičko inženjerstvo; objasniti molekularne osnove diferencijacije, morfogeneze, transmisije signala, psihičkih i mentalnih funkcijaZa MB bitni: DNK, RNK i proteini
strukturalisti, informacionalistiMB prou čava promet informacija u živim sistemimaBiohemija proučava promet materije i energijeNukleinske kiseline je izolovao F. Mišer 1872G. Mendel – nasledni faktori i principi nasleđivanja
1928 Griffith je objavio podatak o transformaciji bakterija
1944 Avery, MacLeod, i McCarty - DNK genetički material
1952 A. Hershey i M. Chase - dokaz da je DNK genetički material
1953 Watson i Crick su determinisali strukturu DNK
1966 Dešifrovan je genetički kod
1970 Izolovan prvi restrikcioni enzim
1973 Boyer i Cohen su otkrili rekombinantnu DNK tehnologiju
1978 Genetički dobijen humani insulin u E.coli
1980 Patentiran genetički manipulisan organizam
1982 Prve animalne vakcine produkovane rekombinovanom DNK tehnologijom
1988 Opisana (PCR) metoda
1996 Prvi rekombinovani protein eritropoetin pripremljen za proizvodnju
2000 Sekvenciran humani genom
� Grifitov eksperiment � Grifitov eksperiment 1928. godine
Streptococcus pneumonieVirulentni (S) i mutirani
(R) soj.� O. Ejveri 1944. g.Ekstrakti soja S – DNK
virulentni materijal
� Eksperimenti Herši i Čejza, 1952.g.; Bakteriofag T2 i E. coli(nasledni materijal virusa je nukleinska kiselina – DNK)
� Ostali dokazi da je DNK nosilac naslednog materijala (informacija):
� DNK je metabolički stabilna u ćelijama� J. Brachet i T. Caspersson su pokazali da je DNK u
nukleusima svih živih ćelija jedne biološke vrste stalna (stalnost količine)
� A. Mirski i H. Ris su stalnost DNK potvrdili citološkim analizama hromozoma
� J. Watson i F. Crick (1953.) su objavili model sekundarne strukture DNK; DNK ima sposobnost samoodržavanja i podložnost promenama
� Centralna dogma molekularne biologije (Crick, 1956.) –protok genetičke informacije kroz generacije i kroz ćeliju; DNK → RNK → protein
�� DOGMA MB DOGMA MB �� GENETIČKI KODGENETIČKI KOD�� 3 nukleotida (kodon) = 1 aminokis.3 nukleotida (kodon) = 1 aminokis.�� Start kodon AUG (GUG)Start kodon AUG (GUG)�� Stop kodoni UAA, UAG, UGAStop kodoni UAA, UAG, UGA�� Izrođenost, univerzalnostIzrođenost, univerzalnost
STRUKTURA NUKLEINSKIH KISELINAPolinukleotidni lanci
Nukeotid – azotna baza (purini i pirimidini), šećer pentoza (riboza i dezoksiriboza), fosforna kiselina
Nukleozid - azotna baza i šećer vezani N-glikozidnom vezom(adenozin, dezoksiadenozin, guanozin, dezokiguanozin, citidin,
dezoksicitin, uridin i dezoksitimidin)
Nukleotidi su estri nukleozida i fosforne kiseline Nukleozid monofosfati (AMP), -difosfati (ADP), -trifosfati (ATP)
- Formiranje polinukleotidnih lanaca (samo nukleozid monofosfati) nukleinskih kiselina – fosfodiestarska veza između OH grupe na C3 atomu pentoze jednog nukleotida i PO4 grupe na C5 atomu pentoze drugog nukleotida- 5’ kraj polinukleotidnog lanca sa slobodnom PO4 grupom
PRIMARNA STRUKTURA DNK – redosled nukleotida u DNK
slobodnom PO4 grupom- 3’ kraj polinukleotidnog lanca sa slobodnom OH grupom- Okosnica polinukleotidnih lanaca su pentoze i fosforne grupe- DNK omogućava raznovrsnostbioloških vrsta (4 vrste nukleotida u DNK molekulu daju ogroman broj kombinacija u redosledu – 4n)
- DNK lanac od više nukleotida (polinukleotidni lanac)- DNK molekul od dva polinukleotidna lanca- Bazno sparivanje vodoničnim vezama (dvogube u paru A-T, trogube u paru G-C)- Lanci antiparalelni- Čargafova pravila:A/T=1; G/C=1; A+G/T+C=1; G+C/A+T≠1
SEKUNDARNA STRUKTURA DNK
� Votson i Krik, 1953.g., Nature, Nobelova nagrada � DESNOGIRA DVOLAN ČANA ZAVOJNICA� Komplementarnost (purin i pirimidin; A -T, G-C) i
antiparalelnost dva lanca (u odnosu na 5’-3’ orijentaciju)
� Veliki i mali žljeb; r=2 nm; hod zavojnice = 3.4 nm od 10 nukleotida
A B ZA B Z
� A zavojnice – desnogire, 11 b.p. u jednom navoju; dvolančani RNK molekuli, hibridi RNK -DNK
� B zavojnice – desnogire� Z zavojnice – levogire, 12 b.p. u jednom navoju, bogate GC
nukleotidima
DENATURACIJA DNK
� Denaturacija – narušavanje sekundarne strukture DNK.
� In vitro denaturacija se postiže visokim T i promenom pH rastvora.
� Absorpcija svetlosti talasne dužine od 260 nm. – Dvolančana zavojnica pokazuje hipohromni
efekat a denaturacijom dolazi do hiperhromnog efekta
– posledica interakcija između azotnih baza, pa se prilikom absorbovanja kvanta svetlosti i pomeranja elektrona jedne baze, modifikuje i elektri čno polje oko susedne.
� Krive topljenja – krive koje pokazuju promenu absorbancije u zavisnosti od temperature.
� Tačka topljenja (Tt) – temperatura na kojoj je porast A260jednak polovini maksimalnog porasta absorbance.
�� Tt zavisi od Tt zavisi od –– Unutrašnjih svojstava DNK (bazni sastav, raspored nukleotida u Unutrašnjih svojstava DNK (bazni sastav, raspored nukleotida u
lancu, procenat pravilno sparenih baza i dužina lanca)lancu, procenat pravilno sparenih baza i dužina lanca)–– Karakteristika rastvora (jonska ja čina, pH, polarnost rastvarača, Karakteristika rastvora (jonska ja čina, pH, polarnost rastvarača,
temperatura)temperatura)
�� Molekul DNK koji ima više GC parova teže se topi od Molekul DNK koji ima više GC parova teže se topi od molekula koji ima više AT parova. molekula koji ima više AT parova.
�� Postupak denaturacije DNKPostupak denaturacije DNK(DNK iz timusa govečeta):(DNK iz timusa govečeta):–– Ekstrahovanoj DNK (koja je rastvorena u SSCu) se dodaje oko Ekstrahovanoj DNK (koja je rastvorena u SSCu) se dodaje oko
2 ml pufera (10 mM Tris2 ml pufera (10 mM Tris--HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) i ostavi HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) i ostavi preko noći na +4 preko noći na +4 00C.C.
–– Ukoliko je potrebno rastvorenu DNK razblažiti SSCom.Ukoliko je potrebno rastvorenu DNK razblažiti SSCom.–– Podeliti rastvorenu DNK u 7 epruveta (po 1 ml). Podeliti rastvorenu DNK u 7 epruveta (po 1 ml). –– Prva epruveta ide na led, a ostale šesPrva epruveta ide na led, a ostale šestt u vodeno kupatilo gde se u vodeno kupatilo gde se
temperatura polako povećava od 40 temperatura polako povećava od 40 00C do 90 C do 90 00C. C. Epr. 2 izvaditi kada T dostigne 40 Epr. 2 izvaditi kada T dostigne 40 00C, C, Epr. 3 na 50 Epr. 3 na 50 00C C Epr. Epr. 44 na 60 na 60 00C C Epr. Epr. 55 na 70 na 70 00C C Epr. 6 na 80 Epr. 6 na 80 00C C Epr. 7 na 90 Epr. 7 na 90 00C. C. –– Epruvete odmah stavljati na led i meriti absorbancu na 260 nm Epruvete odmah stavljati na led i meriti absorbancu na 260 nm
(uklju čujući i kontrolu).(uklju čujući i kontrolu).–– Nacrtati krivu topljenja Nacrtati krivu topljenja ii obeleobeležiti tačku topljenja.žiti tačku topljenja.
�� RenaturacijaRenaturacija –– hibridizacijahibridizacija nukleinskihnukleinskih kiselinakiselina�� PriPri kontaktukontaktu polinukleotidnih lanaca, koji imaju komplem entarne polinukleotidnih lanaca, koji imaju komplementarne
redoslede nuklotida, formiraju se dvolančani hibridni molekuliredoslede nuklotida, formiraju se dvolančani hibridni molekuli�� HHibridi DNKibridi DNK --DNK, DNKDNK, DNK --RNK, RNKRNK, RNK --RNKRNK�� KKoli čina hibrida je mera komplementarnosti lanaca nukleinskih oličina hibrida je mera komplementarnosti lanaca nukleinskih
kiselinakiselina�� MMetode razdvajanja makromolekula (nukleinskih kiselina) u etode razdvajanja makromolekula (nukleinskih kiselina) u
gradijentima gustine elektrolita (CsCl)gradijentima gustine elektrolita (CsCl)�� TTehnike hibridizacije ehnike hibridizacije na membrani na membrani �� HHibridizacija ibridizacija in situin situ