MOLEKÜLER BİYOLOJİDE MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN KULLANILAN YÖNTEMLERYÖNTEMLER 1: 1:

KANDAN DNA İZOLASYONUKANDAN DNA İZOLASYONU

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER YÖNTEMLER

1.1. KANDAN DNA İZOLASYONU KANDAN DNA İZOLASYONU

DNA hücrede serbest bir molekül halinde değildir. DNA hücrede serbest bir molekül halinde değildir. Bazı proteinler (histonlar, histon olmayan proteinler, HMG Bazı proteinler (histonlar, histon olmayan proteinler, HMG proteinler) ve RNA ile bir kompleks halinde bulunur. Virüsler proteinler) ve RNA ile bir kompleks halinde bulunur. Virüsler gibi canlgibi canlıılarda da bir protein klarda da bir protein kııllııffıı içinde yer alır. DNA’nın içinde yer alır. DNA’nın izolasyonu, değiizolasyonu, değişşik organizma gruplarik organizma gruplarıında hatta aynnda hatta aynıı organizma grubu içerisinde farklorganizma grubu içerisinde farklııllııklar gösterse de temelde klar gösterse de temelde üç aüç aşşamadan meydana gelir.amadan meydana gelir.

1.Hücre duvar1.Hücre duvarıınnıın parçalanmasn parçalanmasıı 2.DNA-protein kompleksinin çözülmesi2.DNA-protein kompleksinin çözülmesi 3.DNA’n3.DNA’nıın ortamdaki din ortamdaki diğğer moleküllerden er moleküllerden

ayrayrıılmaslmasıı

Kandan Genomik DNA İzolasyonu Kandan Genomik DNA İzolasyonu

1- 1.5ml.lik tüpe 9001- 1.5ml.lik tüpe 900l Red Blood Cell l Red Blood Cell (RBC) Lysis solüsyonu(RBC) Lysis solüsyonu konur.konur.

2- 300µl tam kan ilave edilir.Oda 2- 300µl tam kan ilave edilir.Oda sıcaklığında 10 kez ters düz edilerek sıcaklığında 10 kez ters düz edilerek 5dk inkübe edilir. Eritrositlerin 5dk inkübe edilir. Eritrositlerin parçalanması sağlanır.Hücrelerin iyi parçalanması sağlanır.Hücrelerin iyi bir şekilde lisize olmaları için bu süre bir şekilde lisize olmaları için bu süre uzatılabilir.uzatılabilir.

3- 14.000 rpm.de 20 3- 14.000 rpm.de 20 san.santrifüjlenir.san.santrifüjlenir.

Kandan Genomik DNA İzolasyonuKandan Genomik DNA İzolasyonu

4- Tüpte lökositlerin oluşturduğu beyaz 4- Tüpte lökositlerin oluşturduğu beyaz pellet (tüpün dibinde) ile 10-20pellet (tüpün dibinde) ile 10-20l residual l residual sıvı kalacak şekilde, kalan parçalanmış sıvı kalacak şekilde, kalan parçalanmış eritrositlerin oluşturduğu supernatant (üst eritrositlerin oluşturduğu supernatant (üst kısım) atılır.Pellet ile sıvının karışması için kısım) atılır.Pellet ile sıvının karışması için 10 san. vortex yapılır.10 san. vortex yapılır.

5- 3005- 300l Cell Lysis solüsyonul Cell Lysis solüsyonu eklenerek eklenerek pipetaj ile karıştırılır.pipetaj ile karıştırılır.

6- 100µl Protein Precipitation solüsyonu6- 100µl Protein Precipitation solüsyonu eklenir.İyice karışması için yüksek hızda 10 eklenir.İyice karışması için yüksek hızda 10 san. vortexlenir.san. vortexlenir.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu Kandan Genomik DNA İzolasyonu 7- 14.000 rpm. de 1dk. santrifüjlenir. Hücrelerin 7- 14.000 rpm. de 1dk. santrifüjlenir. Hücrelerin

parçalanarak, proteinlerin dibe çökmesi sağlanır. parçalanarak, proteinlerin dibe çökmesi sağlanır. Böylece DNA proteinlerden uzaklaştırılmış olur.Böylece DNA proteinlerden uzaklaştırılmış olur.

8- 1.5ml.lik boş tüpe 300µl %100’lük 8- 1.5ml.lik boş tüpe 300µl %100’lük isopropanol konur.isopropanol konur.

9- DNA’yı içeren supernatant kısmı alınarak 9- DNA’yı içeren supernatant kısmı alınarak isopropanol üzerine ilave edilir.Yavaşça 50 kez isopropanol üzerine ilave edilir.Yavaşça 50 kez ters düz edilerek karıştırılır.İsopropanol kalan ters düz edilerek karıştırılır.İsopropanol kalan maddelerin ve suyun DNA’dan uzaklaşmasını maddelerin ve suyun DNA’dan uzaklaşmasını sağlar. Böylece DNA ipliksi yapıda görünür hale sağlar. Böylece DNA ipliksi yapıda görünür hale gelir.gelir.

10- 14.000 rpm. de 1dk santrifüjlenir ve DNA’nın 10- 14.000 rpm. de 1dk santrifüjlenir ve DNA’nın dibe çökmesi sağlanır.dibe çökmesi sağlanır.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu Kandan Genomik DNA İzolasyonu 11- Supernatant dikkatlice dökülür ve tüpler 11- Supernatant dikkatlice dökülür ve tüpler

kurutma kağıdı üzerinde kurutulur.kurutma kağıdı üzerinde kurutulur. 12- DNA pelletini yıkamak için 300µl %70’lik 12- DNA pelletini yıkamak için 300µl %70’lik

etanol ilave edilip birkaç kez ters çevrilir.etanol ilave edilip birkaç kez ters çevrilir. 13- 14.000 rpm.de 1dk santrifüjlenir.13- 14.000 rpm.de 1dk santrifüjlenir. 14- Etanol dikkatlice dökülür.Tüpler kurutma 14- Etanol dikkatlice dökülür.Tüpler kurutma

kağıdı üzerine ters çevrilerek kurutulur.kağıdı üzerine ters çevrilerek kurutulur. 15- 50µl DNA Hydration solüsyonu15- 50µl DNA Hydration solüsyonu ilave ilave

edilerek ve orta hızda 5 san. vortexlenerek. edilerek ve orta hızda 5 san. vortexlenerek. DNA’nın çözünmesi sağlanırDNA’nın çözünmesi sağlanır

*Hazırlanan DNA aynı gün içinde kullanılacaksa *Hazırlanan DNA aynı gün içinde kullanılacaksa +4ºC’ye konulabilir.Uzun süre saklanabilmesi +4ºC’ye konulabilir.Uzun süre saklanabilmesi için –20 ya da -80ºC’ye konmalıdır.için –20 ya da -80ºC’ye konmalıdır.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu (Fenol-Kloroform Kandan Genomik DNA İzolasyonu (Fenol-Kloroform ekstraksiyon yöntemiyle)ekstraksiyon yöntemiyle)

5- Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, 5- Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, pelletin üzerine Proteinaz K ve Lysis Buffer pelletin üzerine Proteinaz K ve Lysis Buffer eklenir.eklenir.

Lysis Buffer:Lysis Buffer: -%10 SDS:............................... 80µl-%10 SDS:............................... 80µl -10 mg/ml Proteinaz K:..............5µl-10 mg/ml Proteinaz K:..............5µl -NaCl:.......................................90µl-NaCl:.......................................90µl -TE Buffer:.............................500µl ’ye -TE Buffer:.............................500µl ’ye

tamamlayacak miktardatamamlayacak miktarda 6- Karışım, 56ºC’de 90dk inkübasyona 6- Karışım, 56ºC’de 90dk inkübasyona

bırakılır.bırakılır.

Optik Dansite (OD) = 260/280Optik Dansite (OD) = 260/280

~~1.81.8

DNA (DNA (µµg/ml)=260 nm’deki g/ml)=260 nm’deki ODxSulandırım oranıxkatsayı(50)ODxSulandırım oranıxkatsayı(50)