Modularea activității microgliale sub influența blocanților canalelor de

sodium în patologia Alzheimer- (NCmicroAD)

Project type PN-II-RU-TE-2014 (UEFISCDI), contract no 161/01.10.2015

Director proiect: Assistant Universitar. Dr. Bogdan Cătălin, Centru de cercetare experimentală a

îmbătrânirii normale și patologice, University of Medicine and Pharmacy of Craiova

Scientific Report (01.10.2015- 30.09.2017)

Rezultatele obținute pentru etapa I (01.10.2015-31.12.2015)

În această primă etapă a proiectului s-au realizat următoarele obiective:

1. S-au achiziționat o parte din echipamentele și consumabilele necesare desfășurării obiectivelor

propuse;

2. S-au finalizat protocoalele de lucru, stabilindu-se dozele care vor fi folosite în cercetarile

ulterioare (5mg/kg corp, 10 mg/kg corp, 20 mg/kg corp și 40 mg/kg corp);

3. S-a realizat baza de date care va fi folosită pentru a centraliza toate rezultatele obținute în cursul acestei cercetări;

4. Membrii contractului au participat la conferința națională a “Societății Naționale de Neuroștiințe”

desfășurată la București, în perioada 29-31 octombrie 2015, pentru a iniția și stabili contacte cu alte centre de cercetare naționale cu care ar putea să inițieze proiecte commune în viitor.

5. Au fost inițiate procedurile de achiziționare a animalelelor transgenice.

Rezultatele obținute pentru etapa II (Anul 2016)

În această primă fază a proiectului, au fost aplicate protocoalele de imagistică create anterior și s-

a realizat achiziționarea imagistică a comportamentului microglial animalele transgenice tratate cu blocante

de sodiu.

Studiile electrofiziologice

În primul rând, studiile de toxicitate au evidențiat o diferență semnificativă, între animalele testate,

a ratei de supraviețuire. Cu o valoare a ceasteia de 100% la animalele control (fig. 1) față de celelalte

animale tratate, la care ratele de supraviețuire au variat de la â 86,66% la 4 ore pentru doza de sub-

terapeutice, la 66,67% pentru cea terapeutică și 53,33% pentru cea supra-terapeutică (p <0,001).

Figura 1. Curbele de supraviețuire. Există o diferență semnificativă de supraviețuire în funcție de

cantitatea de sodiu blocante pe care animalul le primește (p = 0,0007).

Efectul tratamentului blocant de sodiu a fost evaluată folosind o metodă funcțională care evaluează

excitabilitatea nervii motori periferici. Pentru aceasta, s-a folosi un electromiograf la care filtrul de joasă

frecvență va fi stabilit la 10 Hz și cel pentru frecvență înaltă la 5 kHz. Intervalele ce achiziție au fost stabilite

la 100 μs și sensibilitatea canalului la 4 mV per diviziune. Înregistrarea potențialului de acțiune al

componentei motorie (CMAP) s-a facut la nivelul mușchiului lumbrical. A fost necesară o singură stimulare

supramaximală (~1mA) pentru a înregistra CMAP maxim. Amplitudinea tuturor CMAP a fost măsurată de

la bază la vârf. CMAP țintă pentru acest studiu s-a stabilit la 50% din răspunsul maximal. Răspunsul inițial

obținut folosind un stimul de 0,2 ms a fost utilizat drept țintă pentru un răspuns submaximal de aproximativ

50% din cel maximal. Curenții necesari pentru a produce acest răspuns țintă au fost determinți pentru

diferite durate ale stimulului de 0,2, 0,5 și 1 ms, care au fost setate manual. Cronaxia (STDC) s-a calculat

prin ecuația de regresie pentru relația lineară dintre durata stimulului și încărcarea acestuia, în timp ce

pragul reobazic pentru axoni, care contribuie la 50% din CMAP, s-a obținut folosind panta liniei de regresie.

După efectuarea măsurătorilor nu s-a putut identifica nici o diferență semnificativă între grupuri, cu

toate că există o reducere a cronaxiei pentru șoarecii doze supra-terapeutice la 2 și 3 ore (Fig. 2) (p=0,078).

0 1 2 3 4 5 6

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

T im e e v o lu t io n o f r ig h t t ib ia l n e rv e e x ita b ility a fte r s o d iu m c h a n n e l

b lo c k e rs

T im e (h )

Str

en

gh

t-D

ura

tio

n

tim

e c

on

sta

nt

(s

)

S H A M

S u b th e ra p e u tic d o s e o f N a b lo c k e rs

T h e ra p e u tic d o s e o f N a b lo c k e rs

S u p ra th e ra p e u t ic d o s e o f N a b lo c k e rs

Figura 2. Cronaxia. Nici o diferență între grupuri nu s-a putut identifica însă la analiza individual a timpilor

de la administrare, s-au identificat faptul că, la 2 și 3 ore, dozele supra-terapeutice au avut constantele de

timp semnificativ mai mici decât celelalte grupuri

Aceste rezultate sugerează că, dacă există un efect asupra microgliale cel mai probabil va fi la 2-

3 ore după administrarea unei doze mari de blocante ale canalelor de sodiu. Ca atare toate achizițiile de

imagini in vivo au fost efectuate la 2-3 ore după injectarea intraperitoneală de blocante de sodiu. Rezultatele

sunt achiziționate la animale șoareci transgenici care au primit tratamentul menționat.

Testarea reobazei, a CMAP-ului și latenței răspunsului motorului nu a evidențiat nici o diferență a

în experimentul nostru.

Experimentele in vivo transcraniene

Pentru această parte a proiectului de animale transgenice, care exprima o proteina fluorescenta

verde legat la receptorul membranei CX3CR1 microglia (CX3CR1-EGFP) [1], au fost crescute în biobaza

Universității, fiind apoi utilizate în cadrul acestui proiect.

Protocolul de lucru al prezentului studiu este prezentat pe scurt în Fig 3

Figure 3. Protocolul experimental. La aproximativ 2,5 ore după injecție IP, a fost facută o fereastră

craniană plasată deasupra cortexul motor dreapt. Acesta a fost utilizată pentru a achiziționa fiziologia

normală microglia pentru toți șoarecii.

Achiziționarea transcraniană a comportamentului microglia la animalelel tratate cu blocanți ai canalelor de

sodiu.

Înregistrări succesive din aceeași regiune a creierului relevă microgliile desfășoară o mișcare

rapidă și dinamică constând în extinderea sau retragerea proceselor din cadrul parenchimul cerebral. Acest

lucru se observă la toți șoarecii tratați, ne fiind evidențiată nicio diferenta semnificativa între loturi. Toate

corpurile de celule sunt relativ imobile în comparație cu mișcările proceselor celulare (Fig 4).

Microglia din creier intact pare să supravegheze parenchimul din jur, în toate grupurile testate, cu

o viteză medie de aprox 1 µm/min. Nu a existat nicio diferență semnificativă atunci când se compară viteza

de supraveghere a tuturor grupurilor (p> 0,05).

S u rv e y in g m ic r o g lia p ro c e s s s p e e d

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

S h am

S u b th e ra p e u tic

T h e ra p e u tic

S u p ra th e ra p e u tic

Sp

ee

d

m/m

in

Figure 4. Vitezele de supraveghere parenchimalea proceselor microgliale la toate grupurile

tratate.

În timp ce, la majoritatea grupurilor testate viteza de deplasare a proceselor microgliale a crescut,

după leziune, grupul tratat cu doză supra-terapeutice a prezentat o creștere mai mică dar nesemnificativă

(p=0,28) (Fig.5).

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

M ic ro g lia p ro c e s s s p e e d

to w a rd s a n e c ro tic s ite

S h am

S u b th e ra p e u tic

T h e ra p e u tic

S u p ra th e ra p e u tic

Sp

ee

d

m/m

in

Figure 5. Vitezele proceselor microgliale către zona de necroză.

Rezultate

Rezultatele parțiale ale cercetărilor au fost comunicate în cadrul a două conferințe și în un

articol ISI.

Am stability o linie stabilă de animale transgenice care vor fi utilizate în experimente viitoare.

Obiectivele pentru etapa III (01.01.2017-30.09.2017)

Experimentele pe animalele hiper secretoare de beta amiloid

Au fost finalizate cercetarile care evaluează impactul tratamentului cu blocanți de sodiu

asupra modificărilor motilității microgliale la animale cu AD [2, 3] dar și implicațiile acestui

tratament pentru creierul în care apare acumularea de amiloid.

Asa cum am precizat, pentru această etapă a studiului au fost folosite animale dublu

transgenice care au coexprimat atât proteină florescentă în spectrul verde la nivelul mebranelor

microgliale, cât și o mutație care permite supra producerea de beta amiloid la nivelul cortexului.

Experimentele in vivo transcraniene în prezența blocanților de Na+

Deși majoritatea leziunilor induse au fost în vecinătatea unor agregate de beta

amyioid, inconjurate de celule microgliale, nu s-a putut detecta o reacție celulară a

microgliilor din jurul acestora, arătănd că detecția acestor cellule de leziuni necrotice noi

este blocată la nivel molecular. Interesant este că în urma analizei dinamicii exploratorii

celulare a proceselor microgliale în lipsa unei leziuni necrotice induse, nu s-a putut

determina nicio diferentă fată de normal (p=0.15) (fig 6); ne fiind înregistrate diferențe în

analiza variabilitășii vitezelor celulare individuale (p=0.37).

M ic ro g lia p r o c e s s s p e e d in th e

A m y lo id g ro u p

S u r v e yin g s ta te Ac t iv a te d s ta te

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

Sp

ee

d

m/m

in

Fig 6. Dinamica proceselor celulare la soarecii cu AD în timpul proceselor

de explorare a parenchimului și pentru limitarea unor leziuni acute.

Au fost încheiate stidiile de exicitabilitate pe animale tinere și bătrâne care au primit

blocante ale canalelor de sodiu ca un tratament potential al disfunctiei microglia în etapele

incipiente AD.

Nu au fost evidențiate diferențe între animalele cu AD tratate și netratate cu

blocanți de Na din punct de vedere al vitezelor proceselor celulare, în lipsa unui factor

perturbator (fig. 7).

Y o u n g O ld

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

S u rv e y in g m ic ro g lia p ro c e s s s p e e d

Sp

ee

d

m/m

in

N o rm a l A P P A P P + N a B lo c k

Fig 7. Dinamica proceselor celulare la soarecii de diferite vârste secteroare de

amyloid în timpul proceselor de explorare a parenchimului și pentru limitarea unor leziuni acute

Nu au fost evidențiate diferențe între animalele cu AD tratate și netratate cu

blocanți de Na din punct de vedere al vitezelor proceselor celulare În prezența unui factor

perturbator (fig. 8).

Y o u n g O ld

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

M ic ro g lia p ro c e s s s p e e d to w a rd s

a n e c ro t ic s ite

Sp

ee

d

m/m

in

N o rm a l A P P A P P + N a B lo c k

Fig 8. Vitezele proceselor microgliale către zona de necroză la soarecii de diferite vârste

sectetanți de amyloid.

Monitorizarea electroencefalografică

Acest lucru a permis o monitorizare adițională a activității neuronale în blocantilor

de sodiu la animalele secretamte de amiloid (fig, 9), fiind extrem de recent raportat faptul

ca animalelel transgenice utilizate în cadrul acestor exxperimente sunt susceptibile

crizelor de epilepsie [4].

Fig 9. Exemple de trasee EEG la animalelel tratate (A) și netratate (B) achizziționate imadiat după sesiunile de achiziție de imagini transcranian.

Bibliografie 1. Jung S, Aliberti J, Graemmel P, Sunshine MJ, Kreutzberg GW, Sher A, Littman DR: Analysis of

fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol 2000, 20:4106-4114.

2. Jankowsky JL, Fadale DJ, Anderson J, Xu GM, Gonzales V, Jenkins NA, Copeland NG, Lee MK, Younkin LH, Wagner SL, et al: Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Hum Mol Genet 2004, 13:159-170.

3. Jankowsky JL, Slunt HH, Gonzales V, Savonenko AV, Wen JC, Jenkins NA, Copeland NG, Younkin LH, Lester HA, Younkin SG, Borchelt DR: Persistent amyloidosis following suppression of Abeta production in a transgenic model of Alzheimer disease. PLoS Med 2005, 2:e355.

4. Papazoglou A, Soos J, Lundt A, Wormuth C, Ginde VR, Muller R, Henseler C, Broich K, Xie K, Haenisch B, et al: Motor Cortex Theta and Gamma Architecture in Young Adult APPswePS1dE9 Alzheimer Mice. PLoS One 2017, 12:e0169654.