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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
JÚLIO HENRIQUE DE OLIVEIRA
ESTUDO DA ATIVIDADE LARVICIDA E EFEITOS TOXICOLÓGICOS DO EXTRATO BRUTO ETANÓLICO DE Sapindus saponaria L (Sapindaceae) SOBRE Aedes aegypti L. (Diptera, Culicidae)
Orientador: Prof. Dr. Ionizete Garcia da Silva
Dissertação de Mestrado
Goiânia – GO, 2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
JÚLIO HENRIQUE DE OLIVEIRA
ESTUDO DA ATIVIDADE LARVICIDA E EFEITOS TOXICOLÓGICOS DO EXTRATO BRUTO ETANÓLICO DE Sapindus saponaria L (Sapindaceae) SOBRE Aedes aegypti L. (Diptera, Culicidae)
Orientador: Prof. Dr. IONIZETE GARCIA DA SILVA
Dissertação submetida à
CPGMT/IPTSP /UFG como requisito
parcial para obtenção do Grau de
Mestre em Medicina Tropical na
área de concentração em
Parasitologia.
Goiânia – GO, 2005
2
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (GPT/BC/UFG)
Oliveira, Júlio Henrique de. O48e Estudo da atividade larvicida e efeitos toxicológicos do extrato bruto etanólico de Sapindus saponaria L. (Sapinda- ceae) sobre Aedes aegypti L. (Diptera, Culicidae) / Júlio Henrique de Oliveira. - Goiânia, 2005. 48 f. : il. Orientadora: Ionizete Garcia da Silva. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2005. Bibliografia. 1. Aedes aegypti – Controle biológico 2. Aedes Aegypti L. – Combate 3. Sapindus saponaria L. – Larvicida 4. Sapindus saponaria L. – Efeitos toxicológicos 5. Endemias – Controle I. Silva, Ionizete Garcia da .II.Universidade Federal de Goiás. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública. III. Título. CDU:595.771:582.772.4
3
Aos meus pais,
Sebastião Júlio e
Maria Rita
e a toda minha família,
dedico.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus e a todos que de alguma forma colaboraram para a
realização deste trabalho, e, em especial:
ao Dr. Ionizete Garcia da Silva, Professor Titular do Departamento de Microbiologia,
Imunologia, Patologia e Parasitologia (DMIPP), do Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública (IPTSP), da Universidade Federal de Goiás (UFG), pela orientação, ajuda, estímulo,
amizade e compreensão constantes;
à Dra. Heloisa Helena Garcia da Silva, Professora Adjunto do Departamento de
Microbiologia, Imunologia, Patologia e Parasitologia (DMIPP), do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública (IPTSP), da Universidade Federal de Goiás (UFG), pela ajuda,
estímulo, amizade e compreensão constantes;
à Coordenação de Pós-Graduação em Medicina Tropical e ao DMIPP pela oportunidade
oferecida;
à Fundação de Apoio à Pesquisa (FUNAPE) e ao CNPq pelo apoio financeiro
concedido;
a Carmeci Natalina Elias, Técnica de Laboratório da Secretaria de Estado da Saúde de
Goiás/ Fundação Nacional de Saúde-GO e aos amigos Edson de Castro, Girlene Sena de Assis e
Taísia Izabel Vieira, pelo apoio técnico e amizade durante o desenvolvimento deste trabalho;
ao companheiro de graduação, estágio, bolsa, trabalho e de tantos outros momentos Vitor
Chaves Arantes.
5
Sumário
Lista de Figuras ......................................................................................................06
Resumo ..................................................................................................................07
Abstract ..................................................................................................................08
1-Introdução ...........................................................................................................09
1.1-O uso de plantas como medida de combate a insetos.....................................09 1.2-Sapindus saponaria..........................................................................................10 1.3-Dengue.............................................................................................................12
2-Objetivos .............................................................................................................17
2.1-Gerais...............................................................................................................17
2.2-Específicos .......................................................................................................17
3-Materiais e Métodos ............................................................................................18
3.1-Coleta dos frutos e obtenção dos extratos.......................................................18
3.2-Obtenção das larvas ........................................................................................19
3.3-Bioensaios........................................................................................................22
3.4-Testes de toxicidade ........................................................................................23
4-Resultados e Discussão......................................................................................24
5-Referências Bibliográficas...................................................................................25
6-Artigo 1................................................................................................................32
7-Instruções aos Autores - Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical...................................................................................................................49
6
Lista de Figuras
Figura 1. Aspectos de Sapindus saponaria. A - Caule e copa da árvore. B - Frutos e folhas.... .............................................................................. . 11
Figura 2 . Sorotipos circulantes do vírus do dengue por estados do Brasil...................................................................................................12
Figura 3 . Casos notificados do dengue por semana epidemiológica segundo regiões do Brasil..................................................................................13
Figura 4 . A - Alimentação de fêmeas de Aedes aegypti em camundongos presos em tela de nylon. B – Alimentação de machos de Aedes aegypti em absorvente interno feminino embebido em água açucarada...........................................................................................20
Figura 5 . A – Copo de vidro âmbar com papel filtro para oviposição das fêmeas de Aedes aegypti. B - Papel filtro para oviposição com ovos de Aedes aegypti.................................................................................................21
7
Resumo
O surgimento de resistência do Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) com a
diminuição da sua suscetibilidade aos inseticidas sintéticos estimulou
estudos sobre a atividade de plantas como alternativa para o seu controle.
Neste trabalho, foram realizados ensaios biológicos para verificar a
atividade larvicida do extrato bruto etanólico (e.b.e) do fruto de Sapindus
saponaria sobre A. aegypti, em condições de laboratório. O material
botânico foi coletado, dessecado em estufa de ar forçado a 40°C, moído,
percolado a frio em etanol por 72 horas, filtrado, concentrado em
evaporador rotativo e dessecado em uma capela com auxílio de ar quente.
O e.b.e. obtido foi solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO) e a solução
preparada com água destilada. Os bioensaios foram realizados com larvas
de 3º estádio de A. aegypti, em recipientes de vidro, nos quais colocavam-
se 25 mL de solução e 20 larvas. As leituras foram realizadas 24 e 48 horas
após o início do teste. Foram feitas cinco repetições, sendo os controles
realizados com água e DMSO. Pela Análise de Probit, foram interpoladas as
CL50 do e.b.e. da casca e da semente, os quais apresentaram os valores de
53,4 e 56,7 ppm, respectivamente. Testes toxicológicos foram realizados
com o e.b.e. da semente de S. saponaria com camundongos e com coelhos.
Não foi encontrado efeito tóxico de acordo com as normas brasileiras
vigentes para produtos de origem vegetal.
8
Abstract
The resistance’s arisement of Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) with the
decrease of its susceptibility to the synthetic insecticides has stimulated
studies about the activity of plants as an alternative for its control. In this
research, biological assays were accomplished in order to verify the
larvicidal activity of the crude ethanol extract (c.e.e.) of Sapindus saponaria
in the A. aegypti, in laboratory conditions. The botanical material was
collected, dried in greenhouse of forced air to 40°C, ground, percoleted in
etanol at room temperature for 72 hours, filtrated, concentrated in rotative
evaporator and dried in a fume-hood with hot air supply. The extract was
solved in dimethylsulphoxide (DMSO) and the solutionwere prepared using
distilled water. The bioassays were accomplished with 20 larvaes of 3rd
instar of A. aegypti, in glass containers, with 25 mL solution. Reading of
results ocurred 24 and 48 hours after the beginning of the experiment. Five
repetitions were done and the controls were carried out with water and
DMSO. The LC50 of bark and seeds c.e.e. were established by interpolation
using the Analysis Probit Program and the values were 53.4 and 56.7,
respectively. Toxicological tests were accomplished with seed’s c.e.e. of S.
saponaria with mice and rabbits. Toxic effect was not found in the
experiment, according to the Brazilian norms for products of vegetable
origin.
9
1- Introdução
1.1-O uso de plantas como medida de combate a insetos.
No campo da saúde pública, os mosquitos apresentam-se como
vetores das mais diversas doenças como febre amarela e dengue, além de
causarem vários incômodos que vão desde reações alérgicas locais até
reações sistêmicas (Cheng et al. 2003).O aumento da resistência das mais
variadas espécies de insetos aos inseticidas sintéticos provocado pelo uso
indiscriminado desses, bem como os efeitos deletérios na flora e na fauna,
têm promovido a busca de novas alternativas de combate a esses
artrópodes (Ramos & Valle 2003, Cavalcanti et al. 2004, Silva et al. 2004).
O uso de substâncias naturais como larvicida tem concentrado a atenção de
pesquisadores em diversos países. Extratos brutos, óleos essenciais, bem
como princípios isolados de plantas, têm demonstrado bioatividade em
várias espécies de insetos (Silva et al. 1998b, Pizarro et al. 1999, Cheng et
al. 2003, Silva et al. 2003, Cavalcanti et al. 2004, Harve & Kamath 2004,
Silva et al. 2004, Wandscheer et al. 2004, Luna et al. 2005, Prajapati et al.
2005).
O primeiro trabalho com plantas do Cerrado foi o de Silva et al. (1996)
em que o extrato bruto etanólico (e.b.e.) da casca do caule de Magonia
pubescens L. (Sapindaceae) mostrou ação larvicida sobre Aedes aegypti
em laboratório e, posteriormente, Silva et al. (2003) demonstraram sua
aplicabilidade em campo. Estudos químicos subseqüentes guiados por
bioensaios, evidenciaram a presença de taninos catéquicos como principais
constituintes ativos do e.b.e. de M. pubescens contra o 3º estádio de A.
aegypti (Silva et al. 2004). Isso criou perspectivas de aplicação desse
produto sobre outras espécies de insetos, assim como a pesquisa sobre
plantas pertencentes à mesma família.
10
1.2-Sapindus saponaria
Sapindus saponaria, uma planta pertencente à família Sapindaceae, é
encontrada na extensão da Mata Amazônica até o Cerrado. Possui
característica rústica, sendo utilizada para paisagismo e construção civil.
Floresce nos meses de abril/junho e a maturação dos frutos ocorre de
setembro a outubro. Pode ser caracterizada como árvore de porte médio,
atingindo entre cinco e nove metros de altura, e as folhas são compostas
imparipenadas com sete folíolos glabros, medindo de 10 a 16 cm de
comprimento por três a quatro cm de largura (Fig. 1A e Fig. 1B) (Lorenzi
1992).
O fruto de S. saponaria é utilizado como inseticida e repelente no
meio popular. Boiça et al. (2005) utilizaram extrato aquoso a 10% contra
larvas de Plutella xylostella em couve e obtiveram 100% de mortalidade.
Além disso, alguns estudos demonstram as propriedades bioquímicas
de S. saponaria. Pott & Pott (1994) isolaram saponinas sem caracterizar as
atividades biológicas e Castro et al. (1999) demonstraram a neutralização
hemorrágica induzida pelo veneno da serpente Bothrops asper pelo extrato
das folhas dessa planta. Albiero et al. (2002) estudaram o potencial anti-
úlcera gástrica do extrato das folhas e dos frutos de S. saponaria em ratos
pela diminuição da concentração de ácido clorídrico gástrico.
A grande disponibilidade de S. saponaria no Cerrado, associado a
um número reduzido de investigações sobre essa planta, motivaram
estudos em relação a sua capacidade larvicida contra A. aegypti, o principal
vetor do dengue.
11
Figura 1. Aspectos de Sapindus saponaria. A - Caule e copa da árvore. B - Frutos e folhas.
12
1.3-Dengue
O dengue é hoje um dos principais problemas de saúde pública do
mundo. Cerca de 50 a 100 milhões de pessoas infectam-se anualmente em
todos os continentes, exceto na Europa, e aproximadamente 500 mil
necessitam de hospitalização (Stephenson 2005).
No Brasil, há circulação dos sorotipos 1, 2 e 3 em 24 estados (Fig. 2).
Em 2004, registraram-se mais de 107 mil casos, sendo confirmados 81
casos de febre hemorrágica do dengue (FHD), com 3 óbitos (MS 2005). Na
região Centro-Oeste, o estado de Goiás foi o que apresentou maior número
de casos: 8.552 com 18 ocorrências da FHD.
Figura 2. Sorotipos circulantes do vírus do dengue nos estados do Brasil. (MS 2005)
13
A abrangência dessa doença em todas as regiões deste país (Fig. 3)
deve-se à capacidade de proliferação do seu principal vetor: o A. aegypti.
Esse mosquito, juntamente com todos da família Culicidae, constituem o
maior grupo de hematófagos entre os insetos que molestam o homem e
animais, tanto em áreas urbanas quanto rurais (Consoli & Oliveira 1994).
Figura 3. Casos notificados do dengue por semana epidemiológica segundo regiões do Brasil. (MS
2005)
Em algumas áreas da África, o A. aegypti apresenta comportamento
silvestre sendo, por isso, considerado nativo daquele continente.
Provavelmente, esse mosquito apareceu nas Américas por meio das
navegações européias no período das colonizações, quando eram
transportados negros africanos para serem vendidos como escravos em
colônias americanas. Adaptou-se muito bem às condições urbanas,
proliferando em criadouros com água limpa e com pouca poluição,
dispersando-se por todas as regiões do continente, acompanhando a
movimentação humana (Silva et al. 1999, Forattini 2002).
O grande sucesso reprodutivo do A. aegypti em ecótopos artificiais
tem facilitado o adensamento desse mosquito nas cidades situadas na faixa
cosmotropical e a conseqüência é o aumento dramático dos casos do
dengue nos centros urbanos (Consoli & Oliveira 1994, Silva et al. 1999).
Esse mosquito foi considerado erradicado do Brasil nas décadas de
50 e 70, sendo reintroduzido em 1976. A partir de então, as condições
sócio-ambientais propícias possibilitaram a sua dispersão e avanço do
dengue (MS 2004).
Silva et al. (1991a,b) fizeram o primeiro relato do A. aegypti em
Goiânia. Essa cidade tem funcionado como centro de dispersão do
mosquito para outras cidades através da movimentação e deslocamento da
população (Silva et al. 2002).
Como ainda não existe uma vacina pronta para uso na prevenção do
dengue, o combate se restringe às ações contra o vetor, que se concentram
em 4 pontos básicos: saneamento do meio ambiente, ações de educação,
14
comunicação e informação; combate ao vetor com os inseticidas químicos e
biológicos; além de métodos físicos através da destruição de criadouros
potenciais para esse mosquito (FUNASA 2002).
Além dessas ações não serem realizadas adequadamente, outros
fatores atrapalham o combate a esse vetor. O A. aegypti é altamente
antropofílico e cria-se em qualquer tipo de coleção de água límpida em
áreas urbanas (Silva et al. 1998a). Porém, já foi observada uma adaptação
desse mosquito em criadouros artificiais com água poluída (Silva et al.
1999). Os ovos de A. aegypti apresentam uma forte resistência aos
períodos de seca podendo permanecer viáveis por mais de 400 dias fora da
água. Nessa fase de resistência, os ovos podem passar intactos da ação
dos inseticidas, pois estes agem apenas sobre as larvas e adultos (Silva &
Silva 1999). O crescimento da indústria de embalagens descartáveis e a
expansão desorganizada dos centros urbanos, com o grande acúmulo de
lixo inorgânico que servem como criadouros, têm dificultado o controle do A.
aegypti (FUNASA 2002). Por último, o uso de inseticidas sintéticos é a
principal forma de ação para combater esse vetor. Os inseticidas derivados
de produtos naturais já foram muito utilizados até a década de 1940,
quando foram substituídos pelos sintéticos, porém, seu uso indiscriminado e
contínuo promoveu uma resistência a esses produtos (Thavaselvam et al.
1993, Failloux et al. 1994, Macoris et al. 1995, Raw lins 1998, Carvalho &
Silva 2000, Macoris et al. 2003).
Após mais de 30 anos de uso do temephos contra A. aegypti no
sudeste da Ásia, estudos demonstraram a diminuição da sua efetividade
provocada pelo desenvolvimento da resistência nessa espécie de mosquito
(Lee 1984). Paeporn et al. (2003) indentificaram que o mecanismo de
resistência ao temephos ocorre por ação de esterases. Em 1999, a
Fundação Nacional de Saúde iniciou o Programa de Monitoramento da
Resistência a Inseticidas do A. aegypti. No contexto desse programa, vários
pesquisadores trabalharam a fim de identificar localidades que apresentam
cepas resistentes. Nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil,
a suscetibilidade do A. aegypti ao temephos tem diminuído
15
consideravelmente (Carvalho & Silva 2000, Lima et al. 2003, Macoris et al.
2003, Carvalho et al. 2004, Braga et al. 2004). Essa situação aponta para a
necessidade de pesquisas de novos produtos eficazes e mais seguros ao
meio ambiente.
A bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis israelensis (Bti)
apresentou resultados satisfatórios para o controle de A. aegypti, mas ainda
existem ressalvas em relação ao uso em larga escala desse tipo de
controle, considerando principalmente o alto custo (Polanczyk et al. 2003,
Vilarinhos & Monnerat 2004).
Outra forma alternativa de combate ao A. aegypti são os inibidores de
crescimento (IGR’s), que causam modificações fisiológicas e morfológicas
durante o desenvolvimento do inseto, atuando seletivamente ao invés de
intoxicação direta, sendo assim menos tóxicos para mamíferos do que
outros inseticidas. O IGR diflubenzuron foi testado em larvas de todos os
estádios de A. aegypti apresentando resultados eficientes (Martins & Silva
2004).
O uso de plantas como alternativa de controle ao A. aegypti já é uma
constante. Por se tratar de produto natural, sua degradação é mais simples
e não afetam de forma severa, como os inseticidas sintéticos, a fauna e a
flora (Silva et al. 1998b, Pizarro et al. 1999, Cheng et al. 2003, Silva et al.
2003, Cavalcanti et al. 2004, Harve & Kamath 2004, Silva et al. 2004,
Wandscheer et al. 2004, Luna et al. 2005, Prajapati et al. 2005).
Este trabalho teve como finalidade estudar a capacidade larvicida da
S. saponaria, assim como sua toxicidade em mamíferos com o intuito de
utilizar essa planta, bastante encontrada no Cerrado, na formulação de
novos produtos como nova alternativa de controle ao A. aegypti.
16
2-Objetivos
2.1-Gerais
Procurar novas alternativas de controle e/ou combate do A. aegypti
através do estudo de princípios ativos inseticidas de origem botânica,
utilizando os recursos naturais que dispomos na região Centro-Oeste.
2.1-Específicos
• Obter o extrato bruto etanólico do fruto de S. saponaria;
• Testar o efeito larvicida o e.b.e. obtido sobre A. aegypti;
• Verificar a toxicidade do e.b.e. sobre mamíferos.
17
3-Materiais e Métodos
3.1-Coleta dos frutos e obtenção dos extratos
Foram coletados frutos maduros da S. saponaria, em outubro de
2003, na região central da cidade de Goiânia-Goiás e encontram-se
identificados no herbário da Universidade Federal de Goiás sob o número
28528. Esses foram processados no Laboratório de Bioatividade de Plantas
e Entomologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP)
da Universidade Federal de Goiás (UFG). O material foi dessecado em
estufa de ventilação forçada à temperatura de 40ºC, separou-se a casca da
semente e então cada parte foi moída separadamente em moinho elétrico
de facas, até atingirem baixa granulometria. A quantidade de pó obtido da
casca foi aproximadamente duas vezes a quantidade do produto obtido da
semente.
18
O pó foi armazenado em sacos plásticos até o momento da
percolação a frio. Neste procedimento, o pó foi colocado em um béquer com
capacidade para dois litros até o volume aproximado de um litro.
Acrescentou-se etanol até atingir aproximadamente quatro centímetros
acima do produto. A mistura foi deixada em repouso por 72 horas, protegida
da luz por papel alumínio. Após a percolação, o sobrenadante foi filtrado
com papel filtro do tipo coador de café e concentrado em evaporador
rotativo. O extrato bruto etanólico (e.b.e.) obtido, colocado em placas de
vidro, foi dessecado em uma capela de exaustão com auxílio de ar quente,
até completa evaporação do solvente. Estes produtos foram então
armazenados em dessecador até a utilização nos testes de atividade
larvicida.
3.2-Obtenção das larvas
As larvas de A. aegypti foram retiradas de uma criação em alta escala
do Laboratório de Bioatividade de Plantas e Entomologia do IPTSP/UFG,
onde foram criadas de acordo com a metodologia de Silva et al. (1998b).
Nesta metodologia os mosquitos são mantidos numa câmara climatizada a
27 ± 1ºC, umidade relativa de 80 ± 5% e fotofase aproximada de 12 horas.
As fêmeas são alimentadas em camundongos presos numa tela de nylon
(Fig. 4A) e os machos em um absorvente feminino (tipo o.b.) embebido em
solução açucarada (Fig 4B). A oviposição é feita em copos de vidro âmbar
com água e um papel filtro, tipo coador de café em contato com a água,
onde os ovos são postos. Esse papel filtro é trocado diariamente. O papel
retirado com os ovos, depois de seco, é armazenado em sacos plásticos,
formando uma “ovoteca”. Para a obtenção das larvas, o papel filtro é
colocado em uma bacia plástica com água da rede pública de
abastecimento. Após a eclosão, as larvas são alimentadas com ração para
19
gatos, previamente triturada, até alcançarem o 3° estádio. Esta criação
originou-se de mosquitos capturados em Goiânia em 1993, mantida por
gerações sucessivas até o momento (Silva et al. 2003).
20
Figura 4. A - Alimentação de fêmeas de Aedes aegypti em camundongos presos em tela de nylon.
B – Alimentação de machos de Aedes aegypti em absorvente interno feminino embebido em
água açucarada.
21
Figura 5. A – Copo de vidro âmbar com papel filtro para oviposição das fêmeas de Aedes aegypti. B -
Papel filtro para oviposição com ovos de Aedes aegypti.
3.3-Bioensaios
Os bioensaios foram realizados em câmara climatizada com as
mesmas características da câmara de criação. Para obter a solução-mãe,
pesou-se a quantidade do e.b.e. necessária em balança analítica de alta
precisão. O e.b.e. da semente foi pré-solubilizado em 0,6 mL de DMSO
enquanto que, o e.b.e. da casca foi solubilizado diretamente em água,
posteriormente, foi acrescentado água destilada até atingirem o volume de
100 mL. As soluções-mãe foram então diluídas em água destilada até
atingirem as concentrações desejadas: 500, 250, 100 e 50 ppm para a
primeira bateria de testes e 60, 50, 40, 30 e 20 para a segunda. Foram
usados recipientes de vidro nos quais se colocaram 25 mL da solução a ser
testada juntamente com 20 larvas de 3º estádio de A. aegypti. O uso deste
estádio ocorreu devido a sua maior tolerância ou resistência em relação aos
demais (Silva et al. 2003).
22
Foi utilizada a mesma quantidade de larvas para os grupos
controles. Para o controle da solução do e.b.e. da semente utilizou-se água
destilada e DMSO na mesma quantidade usada para solubilizar o e.b.e. e,
para controle da solução do e.b.e. da casca, utilizou-se água destilada pura.
As leituras de mortalidade foram feitas 24 e 48 horas após o início do
experimento. Realizaram-se cinco repetições de cada concentração testada.
3.4-Testes de toxicidade
Foram realizados os seguintes testes de toxicidade de acordo com a
metodologia de Brito (1994): toxicidade oral aguda, irritação primária da pele
e irritação ocular aguda.
Os testes de toxicidade oral aguda foram realizados com quatro
casais de camundongos, pesando em média 25 g. Antes dos testes, os
camundongos ficavam 12 horas em jejum absoluto, em caixa de polietileno
coberta com grade de arame inox, permanecendo dentro dessas até o final
dos experimentos. As caixas foram acondicionadas em salas apropriadas no
biotério do IPTSP, com fotofase natural de aproximadamente 12 horas,
temperatura média cerca de 28 ±3°C e umidade relativa de 70 ±15%.
Utilizaram-se 75 mg do e.b.e. da semente de S. saponaria na dose de 3
g/kg
23
As doses foram administradas, através de uma sonda, diretamente no
esôfago do camundongo. Os animais permaneciam sem alimentação por
duas horas. Depois recebiam água e ração e eram observados diariamente
por duas semanas para avaliação de sintomas de intoxicação aguda. As
observações prosseguiram por dois meses para análise de intoxicação.
Para o teste de irritação primária da pele foi utilizado um casal de
coelhos, com pesos de 1490 g para a fêmea e de 1310 g para o macho. Os
pêlos foram raspados (cortados) em quatro sítios de aproximadamente 2
cm2, sendo dois para tratamento e dois para controle. Após 24 horas, dois
sítios foram escarificados e dois permaneceram com a pele íntegra; em
seguida aplicou-se 0,5 mL do e.b.e. da semente de S. saponaria em um
sítio escarificado e em um sítio são. As áreas foram cobertas com uma gaze
e removida após 24 horas. Realizaram-se as avaliações, de acordo com a
“Tabela de Draize” para reações cutâneas, 24, 48, 72 horas após aplicação
do produto (Brito 1994).
O teste de irritação ocular aguda foi realizado com um casal de
coelhos, com a fêmea pesando 1490 g e o macho 1310 g. Instilou-se 0,1 mL
do e.b.e. da semente de S. saponaria no olho esquerdo e o direito, não
tratado, permaneceu como controle. As pálpebras foram mantidas juntas por
trinta segundos. As observações foram feitas 24, 48, 72 e 96 horas e no
sétimo dia após a aplicação seguindo-se a graduação de intensidade das
reações do método de Draize (Brito 1994).
4-Resultados e Discussão Os resultados estão apresentados no Artigo 1.
24
5-Referências bibliográficas
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25
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Artigo 1
Efeito larvicida e toxicológico do extrato bruto etanólico do fruto de
Sapindus saponaria L (Sapindaceae) sobre Aedes aegypti L
(Diptera:Culicidae)
31
Larvicidal and toxicological effects of the ethanol crude extract of Sapindus saponaria
L (Sapindaceae) in the Aedes aegypti L (Diptera:Culicidae)
Júlio Henrique de Oliveira1, Heloísa Helena Garcia Silva1, Carmeci Natalina Elias1, Ionizete
Garcia Silva1
1Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás - Rua Delenda Rezende de Melo, S/N – Setor Universitário. Caixa Postal 131 - Goiânia – GO CEP 74605-050 – Fone/Fax (62) 3261.2077 – email: [email protected] Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FUNAPE. RESUMO
Foram realizados bioensaios para verificar a atividade larvicida do extrato bruto etanólico
(e.b.e) de Sapindus saponaria sobre Aedes aegypti e efeito tóxico sobre mamíferos, em
condições de laboratório. O material botânico foi coletado, dessecado em estufa de ar
forçado a 40°C, moído, percolado a frio em etanol por 72 horas, filtrado, concentrado em
evaporador rotativo e dessecado em uma capela com auxílio de ar quente. O e.b.e. obtido
foi solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO) e a solução preparada com água destilada.
Foram realizadas cinco repetições de cada teste com 20 larvas de 3º estádio de A. aegypti,
sendo os controles realizados com água e DMSO. As leituras foram realizadas 24 e 48 horas
após o início do teste. As CL50 do e.b.e. da casca e da semente foram, respectivamente, de
53,4 e 56,7 ppm. Testes toxicológicos foram realizados com o e.b.e. da semente em
camundongos e em coelhos, sendo o produto considerado como atóxico.
Palavras-chaves: Larvicida, Sapindus saponaria, Aedes aegypti, Dengue
32
ABSTRACT
Bioassays were accomplished in order to verify the larvicidal activity of the crude ethanol
extract (c.e.e.) of Sapindus saponaria in the Aedes aegypti and toxicological effect in
mammals, in laboratory conditions. The botanical material was collected, dessecated in
greenhouse of forced air to 40°C, ground, percoleted in ethanol at room temperature for 72
hours, filtrated, concentrated in rotative evaporador and dessecated in a fume-hood with
support of hot air. C.e.e. which was obtained was solved in dimethylsulphoxide (DMSO)
and solutions were obtained with distilled water in order to get the desired concentrations.
Five repetitions were carried out. 20 larvae of 3rd stadium of A. aegypti and the controls
were accomplished with water and DMSO. The results were accomplished with 24 and 48
hours after the beginning of the test. The LC50 of c.e.e. from bark and seeds were of 53.4
and 56.7 ppm, respectively. Toxicological tests were accomplished with c.e.e. of the seed
from S. saponaria with mice and with rabbits, and the product was considerated innocuous.
33
Key-words: Larvicidal, Sapindus saponaria, Aedes aegypti, Dengue.
Introdução
34
O dengue apresenta-se como um dos principais problemas de saúde pública do
mundo, acometendo cerca de 50 a 100 milhões de pessoas anualmente em todos os
continentes, exceto na Europa. Sendo que, aproximadamente 500 mil pessoas necessitam de
hospitalização32.
No Brasil, há circulação dos sorotipos 1, 2 e 3 em 24 estados brasileiros. Em 2004
registraram-se mais de 107 mil casos do dengue e foram confirmados 77 casos de febre
hemorrágica do dengue (FHD)20.
A abrangência dessa doença em todas as partes do nosso país deve-se à capacidade
de proliferação do Aedes aegypti nas condições urbanas em recipientes com água limpa e
com pouca poluição, dispersando-se por todas as regiões do continente com a
movimentação humana10 26.
Como ainda não existe uma vacina pronta para uso na prevenção do dengue, o
combate restringe-se às ações antivetoriais com os inseticidas sintéticos e biológicos, além
de métodos físicos através da destruição de criadouros potenciais11.
Os inseticidas derivados de produtos naturais já foram muito utilizados até a década
de 1940, quando foram substituídos pelos sintéticos. O uso contínuo promoveu o
aparecimento de resistência do mosquito a esses produtos 4 5 9 13 16 17 24 25 33.
O uso de substâncias naturais como larvicida tem concentrado a atenção de vários
pesquisadores. Extratos brutos, óleos essenciais, bem como princípios isolados de plantas
têm demonstrado bioatividade para as mais diversas espécies de insetos6 8 12 15 21 23 28 29 30 31
34.
A Sapindus saponaria (Sapindaceae) é encontrada desde a Mata Amazônica até o
Cerrado. É uma planta rústica que é utilizada para paisagismo e construção civil. Floresce
nos meses de abril a junho e a maturação dos frutos ocorre entre setembro e outubro. Pode
ser caracterizada como árvore de porte médio com cinco a nove metros de altura, folhas
compostas imparipenadas com sete folíolos glabros14.
35
O fruto dessa planta é utilizado como inseticida e repelente no meio popular. Boiça
et al. (2005) utilizaram extrato aquoso contra larvas de Plutella xylostella em couve com
bons resultados. Além disso, essa planta é objeto de estudos de várias áreas do
conhecimento a fim de desvendar propriedades de seus constituintes1 7 18 22.
A grande disponibilidade de S. saponaria na região do Cerrado somada à falta de
estudos para A. aegypti motivaram estudos em relação a sua capacidade larvicida.
Este trabalho teve como objetivo verificar a atividade larvicida do e.b.e. dos frutos
maduros de S. saponaria sobre A. aegypti, na busca de uma alternativa ao controle desse
mosquito.
Materiais e métodos
Foram coletados frutos maduros de S. saponaria, em outubro de 2003, na região
central da cidade de Goiânia-Goiás e processados no Laboratório de Bioatividade de Plantas
e Entomologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade
Federal de Goiás (UFG). O material foi dessecado em estufa de ventilação forçada à
temperatura de 40 ºC, a casca foi separada da semente, e cada parte moída até baixa
granulometria. A quantidade de pó obtido da casca foi aproximadamente duas vezes a
quantidade do produto obtido da semente.
O pó foi colocado em sacos plásticos até o momento da percolação a frio. Neste
procedimento, o pó foi colocado em um béquer com capacidade para dois litros, até a
metade de seu volume, acrescentando etanol até atingir quatro centímetros acima do
produto. Em seguida, o material foi deixado em repouso por 72 horas, protegido da luz por
papel alumínio. Após a percolação, o sobrenadante foi filtrado com papel filtro do tipo
coador de café e concentrado em evaporador rotativo. O e.b.e. foi colocado em placas de
vidro, dessecado em uma capela de exaustão com auxílio de jato de ar quente, e armazenado
em dessecador até a utilização nos testes.
36
As larvas de A. aegypti foram retiradas de uma criação em alta escala do
laboratório do IPTSP/UFG, onde foram criadas de acordo com metodologia já definida27.
Os bioensaios foram realizados em câmara climatizada similarmente a da criação. O e.b.e.
foi pesado em balança analítica de precisão. O e.b.e. da semente foi solubilizado em 0,6 mL
de dimetilsulfóxido (DMSO) enquanto que, o e.b.e. da casca foi solubilizado diretamente
em água, posteriormente, acrescentou água destilada até atingirem o volume de 100 mL. A
partir dessas soluções, foram feitas diluições para atingirem-se as concentrações a serem
testadas. Foram usados recipientes de vidro com 25 mL da solução teste, na qual foram
adicionadas 20 larvas de 3º estádio. Foi utilizada a mesma quantidade de larvas para os
grupos controle. Para controle da solução do e.b.e. da semente utilizou-se água destilada e
DMSO na mesma quantidade usada para solubilizar o e.b.e.. Já para controle da solução do
e.b.e. da casca, utilizou-se água destilada pura.
As leituras de mortalidade foram feitas com 24 e 48 horas após o início do
experimento. Cada teste foi repetido cinco vezes. As larvas eram consideradas mortas
quando havia perda total dos movimentos, com escurecimento do corpo e cápsula cefálica30.
Foram realizados testes de toxicidade, de acordo com metodologia já existente3,
para toxicidade oral aguda, irritação primária da pele e irritação ocular aguda. A toxicidade
oral aguda foi testada em quatro casais de camundongos, pesando em média 25 g com 12 h
em jejum absoluto, acondicionados em salas apropriadas no biotério do IPTSP, com
fotofase natural de aproximadamente 12 horas, temperatura de 28 ±3 °C e umidade relativa
de 70 ±15 %. Utilizou-se 75 mg do e.b.e. da semente de S. saponaria na dose de 3 g/kg.
As doses foram administradas, através de uma sonda, diretamente no esôfago do
camundongo. Os animais permaneciam sem alimentação por duas horas. Depois recebiam
água e ração e eram observados diariamente por duas semanas para avaliação de sintomas
de intoxicação aguda. As observações prosseguiram por dois meses para análise de
intoxicação3.
37
A irritação primária da pele foi testada em um casal de coelhos, com pesos de 1310
g e 1490 g, respectivamente para o macho e para fêmea. Os pelos foram raspados em quatro
sítios de aproximadamente 2 cm2, sendo dois para tratamento e dois para controle. Após 24
horas, dois sítios foram escarificados e dois permaneceram com a pele íntegra; em seguida
aplicou-se 0,5 mL do e.b.e. da semente de S. saponaria em um sítio escarificado e em um
sítio são. As áreas foram cobertas com uma gaze para evitar que o animal removesse o
material e removida após 24 horas. As avaliações ocorreram de acordo com a “Tabela de
Draize” para reações cutâneas 24, 48 e 72 horas após aplicação do produto3.
A irritação ocular aguda foi testada em um casal de coelhos, com 1490 g e 1310 g
para a fêmea e o macho, respectivamente. Instilou-se 0,1 mL do e.b.e. da semente de S.
saponaria no olho esquerdo e o direito, não tratado, permaneceu como controle. As
pálpebras foram mantidas juntas por trinta segundos. As observações foram feitas 24, 48, 72
e 96 horas e no sétimo dia após a aplicação seguindo-se a graduação de intensidade das
reações do método de Draize3.
Resultados e Discussão
O e.b.e. da semente apresentou aspecto oleoso de baixa viscosidade, de cor amarelo
claro, e solubilização incompleta em água destilada e também em DMSO, ficando pequenas
gotículas de óleo na superfície que desaparecem após intensa agitação, formando uma
solução de aspecto leitoso. Já o e.b.e. da casca apresentou um aspecto espesso, semelhante a
graxa, de cor amarelo-âmbar; solubilizou-se completamente em água destilada, dando
origem a uma solução de aspecto levemente leitoso com formação de espuma.
Os primeiros bioensaios foram realizados a partir de uma solução mãe a 500 ppm
dos dois extratos e, posteriormente, a partir de uma solução mãe a 250 ppm. Os resultados
obtidos são apresentados na Tabela 1 e Figs. 1 e 2.
38
As CL50 encontradas foram 53,4 ppm e 56,7 ppm, respectivamente, para o e.b.e. da
casca e da semente. Esses resultados dão perspectivas para estudos subseqüentes de
fracionamento para conhecimento do princípio ativo guiados por bioensaios com o A.
aegypti.
Estudo com o extrato aquoso do fruto de S. saponaria contra Plutella xylostela em
couve obteve 100% de mortalidade no primeiro dia de observação demonstrando seu
potencial larvicida3.
De acordo com experimentos realizados30 a CL50 da solução do e.b.e. da casca do
caule de Magonia pubescens para o 3° estádio de A. aegypti é de 750 ppm. No entanto,
apesar de terem sido utilizadas partes diferentes das plantas, S. saponaria apresentou
atividade larvicida consideravelmente superior à planta citada, com concentrações letais
menores.
Estudos mostraram a atividade do extrato bruto desidratado e de frações contendo
saponina da Agave sisalana e encontraram atividade larvicida sobre o A. aegypti, com CL50
de 322 e 204 ppm, respectivamente, para o extrato e a fração21. Foi isolada saponina de S.
saponaria sem que fosse testada como larvicida22. O e.b.e. das partes estudadas de S.
saponaria apresentou CL50 menor do que dos trabalhos com frações de saponina isolada.
Isso sugere que a bioatividade não advém apenas da saponina, mas que há mais substâncias
bioativas, ou ainda, a interação entre elas.
Ressalta-se que o e.b.e. da casca do fruto é hidrossolúvel o que possibilitou uma
manipulação mais simples e com menores custos.
No teste de toxicologia oral aguda em camundongos não houve registro de morte,
nem sinais de intoxicação aguda, como ataxia, paralisia muscular, sialorréia contínua ou
perda de controle dos esfíncteres. O comportamento dos animais foi normal e não se
encontravam agitados, tensos ou latentes.
39
Os testes de irritação primária da pele não apresentaram formação de nenhum tipo
de eritema ou edema. Aqueles de irritação ocular aguda não apresentaram qualquer sinal de
irritação da mucosa, quando avaliados pelos parâmetros: ocorrência de hiperemia, secreção
ou quimose na conjuntiva, área ou opacidade da córnea, e inflamação da íris. Não houve
irritação de conjuntiva. A íris mostrou-se normal, com pupilas isofotorreagentes, e a córnea,
sem ulceração, com coloração normal e sem opacidade.
Os resultados do efeito larvicida obtidos com o e.b.e. de ambas as partes do fruto de
S. saponaria quando comparados com os resultados de outras plantas podem ser
considerados promissores, abrindo perspectiva para estudos subseqüentes de isolamento do
princípio ativo.
Os resultados dos testes de toxicidade analisados de acordo com as Normas para
Estudo da Toxicidade de Produtos Fitoterápicos19 indicam que o produto testado neste
trabalho é considerado atóxico.
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Tabela 1. Suscetibilidade de larvas de 3º estádio de Aedes aegypti ao extrato bruto
etanólico (e.b.e.) de Sapindus saponaria após 48 horas de exposição. (n = 100 larvas)
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E. B. E. CL50 (ppm)
IC 95%
Casca 53,4
48,9 – 59,9
Semente 56,7
52,9 – 65,1
CL50 – Concentração letal que causa mortalidade de 50% das larvas.
IC 95% – Intervalo de confiança com probabilidade de 95%.
ppm – parte por milhão.
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Figura 1 Mortalidade de larvas de 3° estádio de Aedes aegypti submetidas ao extrato bruto
etanólico da casca e da semente de Sapindus saponaria, com leituras em 48 horas, em
condições de laboratório (Solução mãe de 500 ppm).
Figura 2. Mortalidade de larvas de 3° estádio de Aedes aegypti, submetidas ao extrato bruto
etanólico da casca e da semente de Sapindus saponaria com leituras em 48 horas, em
condições de laboratório (Solução mãe de 250 ppm).
Instruções aos autores
Objetivo e política editorial
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A Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical destina-se à publicação de trabalhos científicos relacionados às doenças infecciosas e parasitárias, medicina preventiva, saúde pública e assuntos correlatos. A revista tem periodicidade bimestral e aceitará trabalhos de pesquisadores brasileiros ou estrangeiros desde que obedeçam às normas e que sejam aprovados pelos relatores indicados pelos Editores. 1. Além de Artigos, a revista publica Comunicações para a divulgação de resultados de ensaios terapêuticos, notas prévias, relatórios técnicos, relatos de casos, cartas ao editor, fatos históricos, resenhas bibliográficas e resumos de teses. Artigos de revisão e editoriais serão publicados por solicitação do Corpo Editorial. 2. Os trabalhos devem ser originais e inéditos, digitados em espaço duplo, deixando margem de 3 cm à esquerda e remetidos em três vias ao endereço abaixo, sendo uma a original. Após revisão, pede-se que os trabalhos sejam enviados em disquete, devidamente acompanhados de uma cÓpia impressa da versão revisada.
Preparação de originais
3. Normas para enviar trabalhos, após revisão, em meio eletrônico; obedecer os seguintes requisitos:
a) podem ser utilizados disquetes MS-DOS compatíveis nos formatos 3 1/2" ou 5 1/4". Disquetes de Macintosh no formato 3 1/2" também serão aceitos. Elimine dos disquetes todos os arquivos não pertinentes ao artigo enviado. Escreva na etiqueta do disquete: título do artigo, nome do autor, nome do arquivo, editor de texto utilizado e nome dos arquivos acessórios (folhas de estilos, gráficos, tabelas etc);
b) envie artigos compatíveis com os seguintes processadores de texto: Word para Windows (versão 6.0 ou anterior), Word para Mac (versão 6.0 ou anterior), outros formatos podem ser aceitos mediante consulta prévia. Nunca envie artigos em formato ASCII (só texto/"text only");
c) ao redigir o texto, o comando de retorno de linha ("Enter") deve ser utilizado exclusivamente no final dos parágrafos. Não adicione espaços extras ou "tabs" ao texto para obter recuo da primeira linha ou centralização de títulos na página. Tampouco retornos ("enters") adicionais para espaçar os parágrafos. Para obter esses efeitos, utilize apenas os comandos de formatação de parágrafo, disponíveis em todos os editores de texto acima;
d) podem ser incluídas tabelas, desde que montadas no próprio editor de texto. Observações e notas de rodapé devem ser, preferencialmente, colocadas após o final do artigo, devidamente numeradas e referenciadas;
e) ilustrações, tabelas e gráficos produzidos em outros programas e "importados" para inclusão no texto devem ser enviados em arquivos anexos, em formatos universais de fácil compatibilidade (TIFF, BMP, PICT, GIF etc). Evite formatos não-padronizados (EPS, WMF etc) e arquivos que só podem ser abertos por programas específicos. De qualquer forma, envie sempre uma cópia bem impressa do gráfico, tabela ou ilustração para eventual reprodução.
4. Os trabalhos devem ser redigidos preferencialmente em português, embora sejam também aceitos trabalhos em inglês e espanhol. A linguagem deve ser clara e precisa, e o texto conciso normalmente não ultrapassando 12 páginas digitadas para Artigos e 6 para Comunicações.
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5. A seguinte seqüência deve ser observada:
a) título original e traduzido e nome dos autores em letras minúsculas. No rodapé, instituição onde foi realizado o trabalho, filiação dos autores, quando for o caso, órgão financiador e o endereço completo para correspondência, inclusive telefone, fax e e-mail;
b) resumo: máximo de 150 palavras para os artigos e 50 para as comunicações e relatos de casos. Deve ser informativo e não indicativo, apresentando o objetivo do trabalho, como foi realizado, os resultados alcançados e a conclusão. Não usar abreviaturas ou citações bibliográficas. Citar 4 ou 5 palavras-chave, que expressem com precisão o conteúdo do trabalho;
c) abstract: inserido logo após o resumo, deve ser a tradução fiel do mesmo, seguido pelas palavras-chaves;
d) introdução: clara, objetiva, contendo informações que justifiquem o trabalho, restringindo as citações ao necessário;
e) material e métodos: descrição concisa, sem omitir o essencial para a compreensão e reprodução do trabalho. Métodos e técnicas já estabelecidos devem ser referidos por citação;
f) resultados: sempre que necessário devem ser acompanhados por tabelas, figuras ou outras ilustrações, auto-explicativas. Texto e documentação devem ser complementares. Quando aplicáveis, os dados deverão ser submetidos à análise estatística. O conteúdo deve ser informativo, não interpretativo; g) discussão: limitar aos resultados obtidos e conter somente as referências necessárias. O conteúdo deve ser interpretativo e as hipóteses e especulações formuladas com base nos achados;
h) agradecimentos: limitados ao indispensável;
i) referências bibliográficas: digitadas em minúsculas, sem ponto entre as abreviaturas, em espaço duplo, numeradas e organizadas em ordem alfabética pelo último sobrenome do autor; citar todos os autores de cada referência. Quando houver mais de uma citação do mesmo autor, seguir a ordem cronológica. As citações devem ser referidas no texto pelos respectivos números, acima da palavra correspondente, sem vírgula e sem parênteses; na lista de referências, deve seguir o seguinte estilo e pontuação:
Artigos em periódicos (os títulos dos periódicos devem aparecer por extenso): Coura JR, Conceição MJ. Estudo comparativo dos métodos de Lutz, Kato e Simões Barbosa no diagnóstico da esquistossomose mansoni. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 8:153-158, 1974.
Livros: Chandra RK, Newberne PM. Nutrition, immunity and infection: machanisms of interactions. Plenum, New York, 1977.
Capítulos de livros:
Fulton JD. Diagnosis of protozoal diseases. In: Gell PGH, Coombs RRA (ed) Clinical aspects of immunology, 2nd edtition, Blackwell, Oxford, p.133-136, 1968. Resumos de congressos:
Daher RH, Almeida Netto JC, Pereira LIA. Disfunção hepática na malária grave. Estudo de 161 casos. In: Resumos do XXXI Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Brasília p.16, 1995.
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Teses: Tavares W. Contaminação do solo do Estado do Rio de Janeiro pelo Clostridium tetani. Contribuição ao conhecimento da distribuição natural do bacilo tetânico. Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 1975. Somente deverão ser citados os trabalhos publicados. Dados não publicados ou comunicações pessoais devem ser referidos no texto da seguinte forma: (AB Figueiredo: comunicação pessoal, 1980) e (CD Dias, EF Oliveira: dados não publicados). 6. Tabelas: numeradas em algarismos arábicos e dotadas de título descritivo conciso. Manter seu número ao mínimo necessário e lembrar que tabelas muito grandes são difíceis de serem lidas. Devem ser digitadas em espaço duplo em folhas separadas, sem linhas verticais e as unidades referidas no título de cada coluna. Todos os dados das tabelas, inclusive o título, devem ser em minúsculas, exceto as siglas.
7. Ilustrações: de boa qualidade e numeradas consecutivamente em algarismos arábicos. Além das fotografias, os gráficos, quadros etc. devem ser referidos no texto como Figuras. Anotar no verso com lápis o número da figura e o nome do autor e trabalho. Listar as legendas numeradas com os respectivos símbolos e convenções em folha separada e em espaço duplo. O número de ilustrações deve ser restrito ao mínimo necessário.
8. Comitê de ética: no trabalho de pesquisa envolvendo seres humanos, deverá constar o nome do Comitê de Ética que o aprovou.
9. Permissão dos autores: anexar carta com o ciente de todos os autores concordando com a publicação.3. Normas para enviar trabalhos, após revisão, em meio eletrônico; obedecer os seguintes requisitos:
a) podem ser utilizados disquetes MS-DOS compatíveis nos formatos 3 1/2" ou 5 1/4". Disquetes de Macintosh no formato 3 1/2" também serão aceitos. Elimine dos disquetes todos os arquivos não pertinentes ao artigo enviado. Escreva na etiqueta do disquete: título do artigo, nome do autor, nome do arquivo, editor de texto utilizado e nome dos arquivos acessórios (folhas de estilos, gráficos, tabelas etc); b) envie artigos compatíveis com os seguintes processadores de texto: Word para Windows (versão 6.0 ou anterior), Word para Mac (versão 6.0 ou anterior), outros formatos podem ser aceitos mediante consulta prévia. Nunca envie artigos em formato ASCII (só texto/"text only");
c) ao redigir o texto, o comando de retorno de linha ("Enter") deve ser utilizado exclusivamente no final dos parágrafos. Não adicione espaços extras ou "tabs" ao texto para obter recuo da primeira linha ou centralização de títulos na página. Tampouco retornos ("enters") adicionais para espaçar os parágrafos. Para obter esses efeitos, utilize apenas os comandos de formatação de parágrafo, disponíveis em todos os editores de texto acima;
d) podem ser incluídas tabelas, desde que montadas no próprio editor de texto. Observações e notas de rodapé devem ser, preferencialmente, colocadas após o final do artigo, devidamente numeradas e referenciadas.
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