Monitoring-redovno praćenje fizičko-hemijskih i

bioloških parametara kvaliteta površinskih voda

Površinske vode se koriste u različite antropogene

svrhe- saobraćaj, rekreacija, industrija, poljoprivreda,

proizvodnja vode za piće.

Recipijenti delimično tretiranih i

netretiranih otpadnih voda

Visok nivo fekalnog zagađenja

Prisustvo patogenih mikroorganizama

SANITARNO ZAGAĐENJE

Koncept indikatorskih mikroorganizama:

1.Prirodno pripadaju crevnoj mikroflori toplokrvnih

životinja

2.Prisutni kada su prisutni patogeni, odsutni kada je

uzorak nezagađen

3.Prisutni u većoj količini od patogena

4.Jednako rezistentni kao patogen na stres iz

okruženja i dezinfekciju

5.Nisu sposobni da se umnožavaju u spoljašnjoj

sredini

6.Detektabilni relativno lakim, brzim i jeftinim

metodama

7.Nisu patogeni

Koliformi (Escherichia coli), crevne

enterokoke i Clostridium perfringens

KOLIFORMNE

BAKTERIJE

U spoljašnjoj sredini i crevnom traktu toplokrvnih životinja

Različiti rodovi familije Enterobacteriaceae koji fermentišu

laktozu

Totalni koliformi (TC)- fermentišu laktozu na 37°C.

Fekalni koliformi (FC)- fermentišu laktozu na 44,5°C.

E.coli- najprecizniji indikator

fekalnog zagađenja.

TOTALNI KOLIFORMI

Aerobne i fakultativno anaerobne, Gram negativne,

štapićaste bakterije.

Ne formiraju spore.

Fermentišu laktozu uz produkciju gasa i kiseline (48

h, 37°C).

Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter ...

FEKALNI (TERMOTOLERANTNI)

KOLIFORMI

Podgrupa totalnih koliforma

Direktno povezani sa fekalnim zagađenjem

poreklom od homeoterma

Fermentacija laktoze uz produkciju gasa i

kiseline na povišenim temperaturama (44,5°C)

Echerichia i Klebsiella

E.coli

E.coli

IMViC metoda:

- Indol test: produkcija indola pri

korišćenju triptofana (+)

- Methyl Red test: produkcija kiseline u

medijumu-fermentacija glukoze (+)

- Voges-Proskauer test: prisustvo

acetoina (-)

- Citrat test: sposobnost korišćenja citrata

kao jedinog izvora ugljenika (-)

Najprecizniji indikator fekalnog zagađenja

Najzastupljenija od svih koliformnih bakterija u

crevnoj mikroflori toplokrvnih životinja

METODE DETEKCIJE I KVANTIFIKACIJE

KOLIFORMNIH BAKTERIJA

Široko korišćena metoda

Filteri pora veličine 0,45 µm

Inkubacija na čvrstoj,

selektivnoj podlozi

Broje se karakteristične

kolonije

Colony forming units/100 ml

MEMBRANSKA FILTRACIJA

METODA MEMBRANSKE FILTRACIJE

Eosin methylene blue (EMB)

Selektivne komponente- eosin i methylene blue

Diferncijalna komponenta- laktoza

Inkubacija: 24h, 37°C za totalne koliforme i 44,5°C za fekalne

koliforme.

Totalni koliformi Fekalni koliformi

Jedinica za filtriranje

METODA ENZIMATSKOG RAZLAGANJA

DEFINISANOG SUPSTRATA

E.coli- β-D-glukuronidaza › MUG › 4-metil-umbeliferon

„COLILERT“ metoda: mešavina hromogenog supstrata o-nitrofenil-

β-D-galaktopiranozid (ONPG) i fluorogenog supstrata 4-metil-

umbeliferil- β-D-glukuronid (MUG)

• Koliformne bakterije- β-D-galaktozidaza › ONPG › o-nitrofenol

Brže i preciznije dobijanje informacija o distribuciji i sudbini

fekalnih bakterija u akvatičnoj sredini

“COLILERT” METODA

CREVNE

ENTEROKOKE

Normalno prisutne u fekalnom materijalu ljudi i životinja

Rod Enterococcus- oko 30 vrsta , Gram pozitivne bakterije

Formiraju parove ili kratke lance

Fakultativno anaerobne

Visoka tolerancija na različite uslove sredine

Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium

E. galinarum, E. avium, E. hirae, E. durans...

Enterococcus faecium

METODE DETEKCIJE I KVANTIFIKACIJE

ENTEROKOKA / E.faecalis

Dekstrozni teluritni agar (DTA)

Dekstroza- izvor energije za rast

bakterija

Kalijum-telurit- selektivna i

diferencijalna komponenta

Redukcija kalijum telurita- kolonije

crne boje

Inkubacija: 24h, 37°C

CFU/100 ml

MEMBRANSKA FILTRACIJA

„ENTEROLERT“ metoda:

Upotreba supstrata 4-metil-

β-D-glukozid (MUD)

β-glukozidaza

Inkubacija: 18-24h, 37°C

Produkt: 4-metil-

umbeliferon

MUD/SF- minijaturizovana MPN

metoda:

Dehidratisani supstrat MUD na

dnu bunarića

β-glukozidaza

Inkubacija 36-48 h, 44,5°C

Produkt: 4-metil-umbeliferon

METODA ENZIMATSKOG RAZLAGANJA DEFINISANOG

SUPSTRATA

MUD/SF MINIJATURIZOVANA METODA

Clostridium perfringens

G +, štapićasta bakterija, formira

endospore

Striktan anaerob-može preživeti

kratko izlaganje kiseoniku

Najvažnija je vrsta od sulfit-

redukujućih klostridija

Normalno se nalazi u ljudskom i

životinjskom fecesu (oko 0,5 %

fekalne mikroflore)

Crna boja kolonija-reakcija između

sulfida i soli gvožđa

MEMBRANSKA FILTRACIJA

Triptoza predstavlja izvor energije

za rast i razmnožavanje bakterija

Diferencijalne karakteristike se

pripisuju natrijum-metabisulfitu i

gvožđe amonijum citratu.

Cikloserin ima selektivno dejstvo

Inkubacija: 24h, 44,5°C

Broje se svetlo braon, braon i crne

kolonije (promena boje agra).

CFU/100 ml

Nakon filtriranja određenih zapremina uzorka filteri se postvljaju na površinu Triptoza sulfit cikloserin agra (TSC)

ORGANSKO ZAGAĐENJE Hemoorganotrofi- organska materija glavni izvor

energije za rast i razmnožavanje

Autohtone vrste- procena prisustva organskih materija u

vodi (22-27°C)

Alohtone vrste (37°C)

Određivanje ukupnog broja heterotrofa i oligotrofa

Spread-plate metoda na površini YEA i 1/10 YEA

FOSFATAZNA AKTIVNOST• Mikroorganizmi razlažu fosforna organska jedinjenja i

koriste fosfor zahvaljujući prisustvu fofataza

• Povećana koncentracija organske materije indukuje

produkciju ovih enzima

• Nivo fosfatazne aktivnosti oslikava stanje ukupnog

organskog opterećenja vodenih ekosistema

• Indeks Fosfatazne Aktivnosti-srednja vrednost

aktivnosti alkalnih, neutralnih i kiselih fosfataza

• Hidrolitičko cepanje fosforne grupe jedinjenja p-NPP

pod dejstvom enzima

• Nastaju ortofosfat (P) i paranitrofenol (p-NP)

Brojne mikrobiološke metode su našle primenu u rutinskom

monitoringu sanitarnog i ekološkog aspekta zagađenja.

Praćenje mikrobiološkog kvaliteta prirodnih voda neophodno

je radi preuzimanja mera za efikasnije uprvljanje prirodnim

resursima i implementaciju sistema za preradu otpadnih voda

antropogenog porekla.

Mikrobiološki aspekti vode za piće

Higijenski ispravna voda za piće je ona koja odgovara upogledu mikrobioloških, fizičko-hemijskih i hemijskihosobina a kvalitet pojedinih parametara je propisanPravilnikom

Najznačjniji zagđivači vode za piće su mikroorganizmihumanog porekla: indikatori fekalnog zagađenja (E.coli idruge fekalne koliforme, S.faecalis, S.faecium, Proteussp.), sulfitoredukujuće klostridije (C.perfigens)

Voda za piće ne sme da sadrži bakterije iz rodova:Salmonella, Shigella, Vibrio cholere, Yersiniaeneterocolitica, Campilobacter jejuni; viruse –adenovirus, enterovirusi, virusi hepatitisa, Rotavirus i dr;niti crevne Protozoa, crevne Helminthes.

Količina površinske vode dostupne čoveku se nemenja, ali njen kvalitet stalno opada.

Na osnovu mikrobiološkog sastava, temperature,prisustva metala, fosfata, nitrata, sulfata unedozvoljenim količinama, zatim na osnovu mirisa,bistrine tj. zamućenosti i još mnogo drugih parametarase određuje i prati kvalitet vode, ispituje kapacitetsamoprečišćavanja tokova, mogućnost korišćenja vodeza vodosnabdevanje, navodnjavanje, rekreaciju itd.

Na osnovu svih navedenih kriterijuma, izdvajaju se četiri osnovne klase vode:

I klasa

• voda koja se koristi za piće i u prehrambenoj industriji.

II klasa

• voda koja se koristi za kupanje, rekreaciju, sportove na vodi, a može se koristiti i za vodosnabdevanje i u prehrambenoj industriji, ali uz dodatnu obradu.

III klasa

• voda koja se može koristiti za navodnjavanje i u svim ostalim granama industrije, osim u prehrambenoj.

IV klasa

• Vode koje se mogu upotrebljavati isključivo nakon posebnih obrada.

Mikrobiološki indeks za procenu kvaliteta površinskih voda : mWQI

Kvalitet površinskih voda predstavlja značajan problem za zaštitu životnesredine, naročito u pogledu vodenih resursa.

Više od 50% stanovništva na zemlji nema dovoljno vode zadovoljavajućegkvaliteta.

Procena kvaliteta vode u našoj zemlji nije regulisana zakonskimregulativama.

Uglavnom sanitarni pokazatelji kvaliteta vode.

U pitanju je jedan od predloga za kriterijum za procenu kvaliteta vode pomikrobiološkim parametrima (mWQI) na osnovu komparacije sa WQImetodom.

Poenta je da se svi rezultati dobijeni mikrobiološkim analizama većegbroja parametara zbirno vrednuju.

Tako se praćenje vode sa higijensko-epidemiološkog stanovišta proširujena praćenje kvaliteta vode sa mikrobiološki-ekološkog aspekta, što semože definisati kao mWQI ( Petrović et al. 1998.).

Na osnovu klasifikacije za procenu stanja vode baziranojna svakom biološkom parametru posebno, formiran jepredlog kriterijuma za klasifikaciju voda dat utabeli 1. (vrednost intervala parametara po klasamavode) :

Parametar I klasa II klasa III klasa IV klasa

T 0 do 3.500.000 3.500.000 do

6.000.000

6.000.000 do

10.000.000

>10.000.000

H 0 do 500 500 do 10. 000 10.000 do 100.000 >100.000

E. coli 0 do 100 100 do 5000 5.000 do 10.000 >10.000

Ifa 0,01 do 1 1 do 5 5 do 7,5 7,5 do 50

Hlorofil a 0 do 3 3 do 20 20 do 100 100 do 1000

Formirana je matrica koja definiše meru pripadnosti ispitivanog uzorka svakojod četiri klase kvaliteta vode.

Matrica je formirana na osnovu pripadnosti svakog merenog parametraintervalima koji su definisani matricom i to tako da ako se merena vrednostnalazi u intervalu definisanom za datu klasu dodeljuje joj se vrednost 1, a usuprotnom vrednost 0(nula). Ukupna vrednost dobijena na osnovu svihmerenih parametara je 5 za svaki uzorak, s’ tim da su od zavisnosti odpripadnosti svakog pojedinačno merenog parametara različitim klasama, iznjih su izvedene vrednosti izvedene u četiri klase.

Primer 1. Ako su izmerene vrednosti svih parametara takve, da sve imaju vrednosti koje odgovaraju I klasi vode , tada je mera pripadnosti jednaka 5 za I klasu, a 0 za sve ostale.

I klasa II klasa III klasa IV klasa5 0 0 0

Primer 2. Ako su za dva parametra izmerene takve vrednosti da pripadaju I klasi, a ostala tri pripadaju II klasi po izmerenim vrednostima, onda je mera pripadnosti za I klasu 2, za II klasu 3, a za III i IV klasu 0.

I klasa II klasa III klasa IV klasa2 3 0 0

Hi = - ∑ Vik/5 * log Vik/5 56mogucih kombinacija.

Hi – vrednost entropije u okviru svake kombinacije.

i= 1...56;

k= I, II, III, IV (odgovarajuća klasa);

matrica za svaku od mogućih kombinacija dimenzija 4x1 izgleda na sledeći način :

Vi = [ Vi I Vi II Vi III Vi IV ]

Važnost pravilnog određivanja kvaliteta površinskih voda

Godišnje 8700m3 vode postanovniku Evrope;

Prema podacima ,, World WaterDevelopment Report ’’ UNESCO2006, do 2015. godine 2,5 milijardeljudi neće imati mogućnost dakoristi ispravnu vodu za piće.

Više od pet miliona ljudi godišnjeumire od problema uzrokovanihzagađenom vodom, odnosno odposledica hidričnih infekcija;

8000 ljudi dnevno umre zbognedostatka ispravne vode za piće;

Konzumacijom mikrobiološkineispravne vode za piće svakih 8sekundi umre 1 dete u svetu.

Povećana industrijskaproizvodnja poslednjihdecenija je dovela dostrahovitog povećanjazagađenja vode, a samimtim je opteretila i smanjilakapacitet raspoloživih voda,što je gotovo potpunoonemogućilo razblaživanja ikapacitetesamoprečišćavanjapovršinskih voda.

Na osnovu podataka dobijenih istraživanjem kvalitetapovršinskih voda na teritoriji republike Srbije u 2007. godinipomoću kontrolnih monitoringa, možemo zaključiti da veći deoispitivanih opština i njihove okoline nemaju zadovoljavajućikvalitet vode, odnosno da u većini dominiraju II i III klasa, dokse I klasa vode retko gde može naći.

Česte promene kopncentracije određenih mikroorganizama, kaoi hemikalija ili organskih materija kao što su fosfati, aminijak iostali, zahtevaju česte i precizne provere nivoa kvaliteta vode.

Isto tako, povećano zagađenje voda otpadnim industrijskimvodama dodatno povećava potrebu da se ispitivanja o kvalitetuvrše tako da se sve veći broj mikrobioloških i drugih parametaraistovremeno koriste, jer samo njihov sumarni rezultat nam možedati pravu sliku o kvalitetu površinskih voda.

Nafta

Na strukturno mehanička svojstva i viskozitet nafte veliki

uticaj imaju sledeći sastojci:parafini(bela kristalasta

masa,nerastvorljiva u vodi, ali rastvorljiva u benzolu );

cerazini (smeša čvrstih ugljovodonika-naftena,aromata i

izoparafina). Parafini i cerezini su dobro rastvorljivi u nafti;

nafteni i aromati; asfaltno smolaste materije (složena

jedinjenjaod C,S,H,O,N); asfalteni( čvrste amorfne materije

tamne boje);u maloj količini:S ( 0.06%-2%), H2S,naftenske

kiseline, mineralne materije, F,Na,K,Ca,Si,Fe,Mg.

Fizičke osobine nafte Gustina- zavisi od hemijskog sastava, najčešće se kreće od 800-850

kg/m3 (ispod 800kg/m3 su lake nafte), a utvrđuje se u standardnim uslovima pri temperaturi od 15 celzjusa(288.14 K) i pritisku od 1.01325 bara (101.325 kPa).

Viskozitet nafte – je otpor fluida prema tečenju koji zavisi od temperature.sa porastom temperature viskozitet nafte opada i obrnuto.

Prirodni gas predstavlja smešu uglavnom ugljovodonika (metan,etan,propan, butan, pentan, heksan). Glavnu komponentu čini metan(90%), ugljen-dioksid, sumpor- vodonik, azot i ređe helijum.

U odnosu na tip ležišta iz kojih se pridobija gas razlikujemo prirodni gas iz gasnih ležišta, iz gaskondenzatnih ležišta i iz naftnih.

Prirodni gas

Fizičke osobine prirodnog gasa Gustinu prirodnog gasa nazivamo masom jedinice zapremine, gde

zapremina može biti definisana u normalnim uslovima kada je temperatura 0oC ili u standardnim kada je temperatura 15oC sa pritiskom od 101,325 kPa. Sa porastom temperature viskozitet gasa raste i obrnuto.

Uticaj naftne industrije na životnu sredinu Proizvodnja i eksploatacija nafte i prirodnog gasa predstavljaju jedan

od izvora zagađenja koji se mogu sresti na naftnim poljima, rafinerijama, skladištima derivata, benzinskim stanicama. Brojne havarije na morima i okeanima koje prouzrokuju izlivanje velikih količina sirove nafte i prerađevina negativno utiču na floru i faunu mora i okeana, kao i na kopnene ekosisteme.

Prema nekim procenama u svetu se godišnje prolije ili na neki način dospe uzemljište oko 8,8 m3 nafte. Sirova nafta i njeni derivati štetno deluju na živisvet, strukturu, kompoziciju i funkcionisanje ekoloških zajednica iekosistema jer sadrže jedinjenja koja imaju mutageni i kancerogeni efekat.

Negativno dejstvo nafte ne floru ogleda se u smanjenju količine kiseonika,visokom sadržaju soli i rastvorenih ugljovodonika.

Čestice nabušenog materijala po odvajanju od isplake, nakon njenogizlaska iz bušotine sadrže 10-15% ugljovodonika nafte. Izveden je jedaneksperiment mešanja poljoprivrednog zemljišta koje pre toga nikada nijebilo zagađeno ugljo-vodonicima nafte sa česticama koje su ih sadržale.

Pokazalo se da je nakon 270 dana eksperimenta došlo do degradacije 75%ugljovodonika od strane bakterija i gljiva.

Tom prilikom je zaključeno da neorganski deo čestica nabušenog materijalanije imao uticaj na stepen i brzinu biodegradacije ugljovodonika. Danas seteži da se maksimalno smanji negativan uticaj deponovane otpadne isplakena životnu sredinu pa se isplaka čisti što bolje od nabušenog materijala,potom se zasebno sanira.

Biotehnologije Tehnike koje se primenjuju u sanaciji lokaliteta zagađenih organskim i

neorganskim zagađivačima zasnivaju se uglavnom na skupim metodama sanacije koje podrazumevaju tretmane za ekstrakciju zagađivača ili deponovanje zagađenog zemljišta u poljskim uslovima. Biotehnologije su se pokazale kao definitivno jeftinija varijanta.

Bioremedijacija Biotehnologija koja se zasniva na procesu biološke dekontaminacije, primenjuje se sa

uspehom za prečišćavanje vodenih ekosistema zagađenih ugljovodonicima nafte kao iza sanaciju zagađenog zemljišta.

Proces bioremedijacije predstavlja proces biološke razgradnje ugljovodonika pomoćumikroorganizama uz omogućavanje najboljih uslovakoji su potrebni da bi uspešnijeobavili taj proces. Može se predstaviti i kao menadžment životne sredine sa ciljempodsticanja razlaganja organskog zagađenja pomoću mikroorganizama.

Razlaganje organskih zagađujućih materija u zemljištu zavisi od aktivnostizemljišne mikroflore. Sirova nafta i njeni derivati različito deluju na različitevrste mikroorganizama. Uticaj može biti inhibitoran, smrtonosan,indiferentan dok neki mikroorganizmi mogu koristiti ugljovodonike nafte iderivata kao izvor ugljenika i energije za svoj rast i razvoj.

Ti mikroorganizmi pripadaju rodovima bakterija:Pseudomonas Nocardia

Acinetobacter Aeromonas

Mycobacter Sphingomonas

Rhodococus Arthrobacter

Baccilus Bacterium

Agrobacterium radiobacter Flavobacterium

Mycrococcus

Neke vrste ovih rodova su halotolerantne pa imajuadaptabilnu prednost u zemljištima koja su poredugljovodoničnog zagađenja opterećena i povećanomkoncentracijom soli.

Bioremedijacija omogućava trajno uklanjanje zagađujućih materija izživotne sredine.

Mikroorganizmi, prvenstveno bakterije i gljive imaju prirodni potencijal darazlažu ugljovodonike jer je ugljenik poreklom iz organske materije, bitanizvor energije koja je osnova mnogih ekoloških procesa u prirodi.

Osnovni mikrobiološki proces razgradnje organskih jedinjenja u aerobnimuslovima-biodegradacija može se predstaviti jednačinom:

MOOrganska materija CO2+H2O+još MO

Kiseonik

Ugljovodonici nafte se veoma razlikuju po pristupačnosti za mikrobiološku degradaciju.

Najpodložniji su n-alkani, ciklični alkani, aromatična jedinjenja, porfirini, asfalteni i rezini i na kraju polarna aromatična jedinjenja. Alkil grupe ovih jedinjenja povećavaju otpornost ovih jedinjenja na dejstvo mikroorganizama.

Posebno opasna komponenta nafte su policikličnana aromatična jedinjenja koja seoznačavaju kao – PAH-ovi.

Pojedina jedinjenja ove grupe mogu imati mutageni ,kancerogeni i toksični efekatkako na živi svet ,tako i na čoveka.

Njihovo razlaganje u prirodi traje i po nekoliko godina, uzrok njihove otpornosti nadejstvo mikroorganizama je stvaranje čvrste veze sa česticama zemljišta.

Površinski aktivne materije –biosurfaktanti omogućavaju rastvaranje i emulziju PAH-ova i njihovu asimilaciju od strane mikroorganizama.

Pravci korišćenja prirodnog potencijala mikroorganizama

Postoje 3 pravca korišćenja prirodnog potencijala mikroorganizama u životnoj sredini:

Prvi je osnovna bioremedijacija – zasniva se na monitoringu zagađene sredine, drugi je biostimulacija prirodnih procesa biodegradacije tako što se stimulišu autohtone populacije mikrorganizama.

Biostimulacija se primenjuje kada u sredini postoji populacija mikroorganizama sposobna za razlaganje određenog tipa zagađenja, ali uslovi sredine nisu dovoljni da bi mikroorganizmi postigli odgovarajuću brzinu degradacije.

Treći pravac je biopovećanje. To podrazumeva dodavanje specijalno adaptiranih mikroorganizama u zagađenu sredinu. Biopovećanje se primenjuje u slučajevima kada usled velike toksičnosti u ekosistemu autohtoni mikroorganizmi nisu u stanju da razlažu organske materije ili u ekosistemima sa niskom temperaturom .

KRITIČNI LIMITIRAJUĆI FAKTORI KOJI UTIČU NA BIODEGRADACIJU Prekomerna količina zagađujućih materija ili prisustvo toksičnih

supstanci ( teških metala)

Nedostatak kiseonika

Neadekvatna pH vrednost

Nedostatak hranljivih materija

Nedostatak vlage

Neodgovarajuća temperatura

Mehanizam degradacije nafte je oksidativnog karaktera,tako da su aerobni uslovi neophodni za odvijanje degradacije. U sredinama gde su prisutni ugljovodonici nafte mikroorganizmi nemaju nedostatak elektron donora, već elektron akceptora kao što su kiseonik, nitrati itd.

Za nesmetan rast i razvoj mikroo zahtevaju i elemente kao što su azot i fosfor.

Rast bakterija normalno se odvija na dodirnoj površini vode i ugljovodonika, zato je veoma vazan balans količine vode u zemljištu.pri malom sadržaju vode rast će biti inhibiran, a pri velikom dostupnost kiseonika i hranljivih materija biće limitirana.

Temperatura je ključan faktor za biodegradaciju.porast temperatureubrzava metabolizam mikroorganizama što utiče povoljno nabiodegradaciju.Pri aerobnim uslovima optimalna temperatura je od 15-do 40 stepeni.

pH vrednost u zemljištu je varijabilna, sklona ekstremnimvrednostima što može negativno uticati na mikroorganizme.Optimalne vrednosti za biodegradaciju su od 6.5-7.5.

Bioremedijacija je danas široko primenjivana u svetu kaoekonomičan i uspešan metod u saniranju organskog zagađenja uživotnoj sredini, dok je praktično nemoćna u slučajevima zagađenjateškim metalima.